被修饰的肿瘤坏死因子 相关申请
本申请要求1997年1月15日递交的美国临时专利申请No.60/035,521的利益。
发明领域：
具体地讲，本发明涉及用分子量处于10,000到40,000之间的聚乙二醇修饰的肿瘤坏死因子和用如此修饰的肿瘤坏死因子治疗肿瘤的方法。
发明的背景：
恶性黑色素瘤(3期)是一种在被诊断出一年之内就使大多数患者致死的致死性疾病。黑色素瘤在美国的发生率正在快速增加，而在其他国家里如澳大利亚，它的发生率是更高的。对患有黑色素瘤的患者的有效治疗是非常急需的。
肾癌在当今的美国每年使大约13,000个人致死。这种癌症通常到晚期才被发现，对它的唯一一种治疗手段是手术切去发病的器官，该手段显著地影响患者的预后。所不幸的是，因为该种肿瘤是高度转移性地，所以对转移性病灶的完全切除是很困难的(如果不是不可能的话)。
结肠癌是最普遍的癌症之一，现今在美国它每年导致大约140,000个人死亡。尽管已经开发了许多可对它进行治疗的传统的化疗药物，但在过去的四十年间，长期存活率(定义为生存5年或以上的患者的百分率)却并没有值得重视的变化。进一步地，已开发出的所有传统的化疗药物都是高毒性的，有着极有害的并常常是致死性的副作用，并且，它们很贵。因此对此病的无毒且有效的治疗是非常急需的。
黑色素瘤、肾癌与结肠癌的一个特点是这些肿瘤能快速地产生对传统化疗的抗性。尽管患者在开始时可能对化疗有所反应，但药物-抗性肿瘤能快速发育并最终使患者致死。另外一个治疗这些肿瘤的途径是找出这些肿瘤的一个“致命弱点”，再开发出能选择性地治疗这些靶子的治疗方法。这样一个可能的靶子已经被识别。具体地说，人们已注意到所有这三种类型的肿瘤都需要转移性病灶的大量血管化以使肿瘤生长。因此人们可以预测，一个能抑制这些肿瘤血管化的治疗试剂可能给治疗这些肿瘤提供一个独特方法。
肿瘤坏死因子(TNF)是许多细胞因子中的一种，这些细胞因子是由白细胞和相关细胞产生的一组多样的蛋白，它们具有免疫激活作用。TNF当初就是因为它能使肿瘤坏死而命名的。据信至少有两种不同的TNF杀肿瘤机制。第一种是对肿瘤本身的直接作用。另外一种是，TNF能选择性地破坏肿瘤的血管化。在描述TNF的一篇早期文献中，Carswell与Old报道METH A肿瘤细胞在体外能完全抵抗TNF。J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72：3666-3670(1975)。然而，小鼠的METH A肿瘤在体内却对TNF异常敏感。据信这是因为TNF选择性地破坏了这些肿瘤的血管化。后来表明，一些未知因子被一些肿瘤释放出来，使得靠近它们的正常的血管内皮细胞对TNF的杀灭作用变得敏感。简言之，TNF杀死这些肿瘤不是通过直接杀死这些肿瘤细胞，而是通过杀死位于供应肿瘤生长所必须的血液、氧和其他营养的血管内的正常血管内皮细胞来起作用。
不幸的是，早期临床实验都努力把TNF开发成一种直接的杀肿瘤试剂。在这种情形下，需要注射大剂量的TNF，因为它很快地(少于20分钟)就离开循环。进一步地，这些大剂量的TNF诱发以血压陡降为特征的类“休克”症状。另外一种应用TNF的方法是将它加以配制，使之能保留在循环中，因此，TNF就有更多的时间与肿瘤的血管系统相互作用，就有足够的时间来破坏肿瘤的血液供应。
已经用聚乙二醇(PEG)对另外几种治疗蛋白进行了配制以使它们能循环更长时间并留在血管系统中。这些蛋白包括天冬酰氨酶、腺苷脱氨酶和超氧化物歧化酶。参见，例如，Harras，J.M.，“聚乙二醇化学：生物技术和生物化学应用”(“Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biochemical Aplications”)，Plenum出版社(1992)。一组日本研究者先前曾描述过TNF可以与某些PEG进行配制，得到的物质能充分地延长循环半衰期，并有较大的抗肿瘤活性。Tsutsumi，Y.等，日本癌症研究杂志(Jap.J.Cancer Res.)，85：9-12(1994)；Tsutsumi，Y.等，日本癌症研究杂志(Jap.J.Cancer Res.)，85：1185-1188(1994)；Tsutsumi，Y.等，日本癌症研究杂志(Jap.J.Cancer Res.)，87：1078-1085(1997)。这些研究者只是用分子量为5,000的PEG通过琥珀酸琥珀酰亚胺酯(succinimidyl succinate)连接体来与TNF上的伯胺结合。
本发明概要：
我们惊奇地发现，用平均分子量处于约10,000到约40,000之间，优选处于约20,000到30,000之间，的聚乙二醇(PEG)修饰TNF能显著地增加TNF的循环半衰期，也因而促进了TNF的杀肿瘤活性。例如，经过如此修饰，TNF的血清半衰期从短短的20分钟增加到15天，抗肿瘤的ED50从1000-3000IU降低到10-50IU。如此修饰的一个结果是，可以用较低剂量的TNF来有效地治疗肿瘤，所伴随的对患者的毒副作用较少。
因而，本发明涉及被修饰的TNF，其中所述的修饰包括使所述的TNF或直接地或通过一种生物相容的连接体，与一个或多个平均分子量处于约10,000到约40,000之间的PEG分子共价结合。优选地，TNF被5到12个PEG分子修饰，更优选地，是被大约5到9个PEG分子修饰。
本发明也涉及一种通过对患有肿瘤的患者给药有效治疗量的所述的被修饰的TNF来治疗所述患者的方法。
本发明进一步地涉及一种延长TNF的循环半衰期的方法，该方法包括使所说的TNF与大约5到12个其平均分子量处于约10,000到约40,000之间的PEG分子共价结合。
本发明进一步地涉及一种增强TNF的杀肿瘤活性的方法，该方法包括使大约5到12个其平均分子量处于约10,000到约40,000之间的PEG分子与所述TNF共价结合。
附图的描述：
图1是描绘TNF在小鼠血清中的循环半衰期的图：自身的TNF-α(空白圆圈)，SS5,000MW PEG-TNF-α(黑色圆圈)，和20,000MWPEG-TNF-α(空白三角)。
图2是描绘TNF在小鼠血清中的循环半衰期的图：自身的TNF-α(空白圆圈)，SS5,000MW PEG-TNF-α(黑色圆圈)，SS12,000MWPEG-TNF-α(黑色三角)，SS-20,000MW PEG-TNF-α(空白三角)，NHS12,000MW PEG-TNF-α(黑色四方形)，和NHS 20,000MW PEG-TNF-α(空白四方形)。
本发明的详细描述：
本文所用的“肿瘤坏死因子”或“TNF”要么是指自然衍生的蛋白质，如分离的人或小鼠的TNF蛋白质，要么是应用重组技术生产出来的蛋白质，如重组鼠TNF和重组人TNF。尽管TNF-α蛋白质是优选的，但术语“TNF”也包括TNF-β蛋白质。该术语也包括通过氨基酸的缺失或改变所致的但并不显著地破坏生物活性的变异蛋白质(如，作为并非限制的例子，缺失212-220氨基酸或在248、592、508位把赖氨酸改变成丙氨酸)。
“聚乙二醇”或“PEG”是指氧化乙烯和水的直链或支链缩合聚合物，用通用分子式H(OCH2CH2)nOH来代表。“聚乙二醇”或“PEG”连同其后面的数字后缀一同来表示它的大约平均分子量。例如，PEG5,000是指其平均分子量大约为5,000的聚乙二醇；PEG12,000是指平均分子量大约为12,000的聚乙二醇；PEG20,000是指平均分子量大约为20,000的聚乙二醇。这些聚乙二醇从几个商业渠道都可得到，并且就如上面所表明的那样，通常就用它们的平均分子量来表示。
“黑色素瘤”是一种从皮肤或其他器官(包括口腔、食道、肛门、阴道、小脑膜(leptomeningers)和/或结膜或眼睛)的黑色素细胞系统发展起来的恶性或良性肿瘤。术语“黑色素瘤”一词包括，例如，肢端—小痣(acral-lentginous)黑色素瘤、无黑色素的黑色素瘤、少年良性黑色素瘤、恶性小痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节黑色素瘤、甲床黑瘤和浅层扩散的黑色素瘤。
“患者”是指动物，优选指哺乳动物，更优选指人。
“生物相容性”是指通常地对生物学功能没有伤害和不会导致任何不可接受程度的包括过敏和疾病状态的毒性的物质或化合物。
“循环半衰期”是指在将经修饰的TNF注射到患者体内后到TNF的量被清除至血清初始峰水平的一半时的一段时间。循环半衰期可以在包括人和小鼠的任何相关的种中测定。
“共价结合”在此是指TNF蛋白和PEG分子直接或通过一个连接体连接的共价键。
依据本发明，TNF被平均分子量处于约10,000到40,000之间，优选地处于20,000到30,000之间的聚乙二醇修饰。一般情况下，分子量为30,000或更多的聚乙二醇难于溶解，因而配制产物的产量大大降低。聚乙二醇可以是支链或直链的，但优选地为直链的。
聚乙二醇可以通过生物相容性连接基团与TNF结合。如上所述，“生物相容性”表示化合物或基团是非毒性的，可以在体外或体内应用而并不引起伤害、病患、疾病或死亡。例如，PEG可以通过酯键、醚键、硫醇键或者酰胺键与连接基团相连。合适的生物相容性连接基团包括，例如，酯基、酰胺基、亚酰胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羟基、碳水化合物、顺丁烯二酰亚胺基(包括，例如，琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS)、丙酸琥珀酰亚胺酯(SPA)、羧甲酸琥珀酰亚胺酯(SCM)、琥珀酰亚胺琥珀酰胺(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧基、氧基羰基咪唑基(包括，例如，碳酸硝基苯酯(NPC)或碳酸三氯苯酯(TPC))、trysylate基、醛基、异氰酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基或伯胺。优选地，生物相容性连接基是酯基和/或顺丁烯二酰亚胺基，并且通过TNF蛋白上的伯胺与TNF相联。更优选地，联结基为SS、SPA、SCM、SSA或NHS，其中SS是最优选地。
另一个选择是，TNF可以通过氨基、硫氢基、羟基或羧基直接与PEG结合(即不用联结基)。
直接地或通过生物相容性连接体将TNF与PEG共价结合的方法，在文献中已有描述，例如，在Harras，J.M的“聚乙二醇化学：生物技术与生物化学应用”中，Plenum出版社(1992)，在此将该文献引入本文作参考。
优选地，TNF蛋白质与5到12个PEG分子共价结合。测定与蛋白结合的PEG分子数目的办法在本领域也已知，例如，参见Habeeb，A.F.S.A.，Anal.Biochem.，14：328-339(1966)；Harras，J.M.，同上。在此将这些文献引入本文作参考。与TNF结合的PEG分子的数目依据所使用的联结基种类、反应时间的长短和在反应中应用的TNF与PEG的摩尔比而变化。
正如本领域的技术人员所能认识到的那样，本发明的被修饰的TNF可以通过许多途径给药，例如，口腔内、鼻腔内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴管内、肿瘤内、肌肉内、间质内(interstital)、动脉内、皮下、眼内、滑膜腔内(intrasynoial)、经上皮、经皮给药。本发明的被修饰化合物的有效治疗量是能有效地抑制肿瘤生长的剂量，而且此剂量可因给药途径的不同而变化。一般来说，有效剂量应该是在约0.001到0.1mg/kg的范围内，每周给药一次。被修饰的TNF可用本领域已知的可药用载体和稀释剂来配制。例如，对于静脉内给药，被修饰的TNF可以在注射前与一种磷酸盐缓冲溶液或本领域技术人员所知的任何其他合适的溶液相混合。实验表明被修饰的TNF在治疗黑色素瘤、结肠癌、肾癌和乳腺癌时特别有效。
本发明在以下的实施例中得到进一步的说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限定本发明的范围。
在以下描述的实验中应用的TNF来源于小鼠和人。人的TNF(完整蛋白)在E.coli中产生，鼠的TNF与人TNF的变异体在Pichea pastoris中产生。采用那些与Pennica，D.等，自然(Nature)，312：724-729(1981)；Streekishna，K.等，生物化学(Biochemistry)，28：4117-4125(1989)中描述的相似的方法，在E.coli或Pichea中生产重组TNF。鼠TNF在E.coli或Pichea中产生。实施例1
TNF-α的比活性
在聚乙二醇化之前，用下面描述的L929细胞毒性测定试验来检测成熟的肿瘤坏死因子(TNF-α)(人工重组的)。TNF-α的比活性为每毫克106I.U.。对SDS-PAGE凝胶的密度测定显示该物质的纯度为99％。
将该物质(1ml，16.8mg/ml，以牛血清(BSA)做标准，按Peterson修正，用Bradford，M.M.，Anal.Biochem.，72：248-254(1976)中描述的方法测定浓度)用一个截止值为3,000kDa的Centricon浓缩至大约0.1ml，再用100mM(pH8.0)的磷酸盐缓冲液稀释至4ml，然后再浓缩至0.1ml。重复本步骤两次，把得到的物质最后收集在总体积为1ml的相同缓冲液中。
用上述的Bradford方法测定蛋白浓度。用BSA做标准，收集得到约0.6mg蛋白质。聚乙二醇化
用上面所引的Harras，J.M.叙述的一般方法来完成聚乙二醇化反应。把过量10到50摩尔的SS-PEG或NHS-PEG加入到TNF(1mg/ml，在100mM磷酸盐缓冲液中，pH7.2-7.5)中，在室温下混合l小时。所用的特定pH和摩尔比随PEG的反应活性而变，因而需凭经验确定。用一个截止值为100Kda的滤膜进行超微过滤，从而将PEG-TNF和未反应的PEG与TNF分开。在本实施例中涉及的每一修饰中，TNF都被5到9个PEG分子修饰。
PEG-TNF的纯度用SDS-PAGE测定，在此程序中被修饰的伯胺的百分数用S.J.Stocks(Anal.Biochem.154：232(1986))描述的florescamine来测定。SDS-PAGE的结果显示出只有很少(如果还有一些的话)天然的TNF-α在聚乙二醇化之后还保留在制剂中。PEG-TNF-α的体外活性
用L-929细胞毒性测定试验来测定PEG-TNF-α在体外的细胞毒性，方法如下所述，只是细胞的传代次数是未知的。TNF-α原料的比活性为1.5×106单位/mg或者大约为起始比活测量值的一半。比活性的差异归因于所使用的不同的蛋白测定方法和细胞的未知的传代数。
SS5,000MW PEG-TNF-α的比活性为0.7×106单位/mg，或者大约是天然物质比活性的一半。SS-20,000MW PEG-TNF-α的比活性为0.8×106单位/mg，与SS5,000MW PEG-TNF-α的值相接近。PEG-TNF-α的致死率
作为显示，给两只C57 b16小鼠(雌性，20-25g)腹膜内(i.p.)注射TNF-α或SS-PEG-TNF-α，监测小鼠的存活。应用的剂量为1、5和10千单位活性。
对于天然的TNF-α，得到以下结果：
10,000I.U.-两只小鼠在第二天早晨都死亡
5,000I.U.-一只小鼠在第二天早晨死亡；第二只小鼠呈明显的痛苦状(毛发皱起，很少运动)并于2天后死亡
1,000I.U.-一只小鼠在第二天早晨死亡；第二只小鼠呈明显的痛苦状(毛发皱起，很少运动)，在此2天后被安乐处死(euthanized)。
对于SS-PEG-TNF-α，所有的小鼠在所有的剂量下在注射后的2个星期内都保持良好的健康。行为正常，饮食亦正常。表皮未有变化(毛发未皱起)。所有的小鼠在注射后15天都被安乐处死。PEG-TNF-α血清半衰期的测定
用从Genzyme得到的ELISA测定人TNF。依制造商的建议使用试剂盒。向小鼠腹膜内注射TNF-α或PEG-α(100单位)，在图1所示的时间里从后眶(retro-obital)的放血中收集大约25μl血清。每组共有5只小鼠(雌性，C57 b16小鼠，20-25g)。
天然TNF-α(空白圆圈)被很快清除，仅有的一个基线上的数据是注射后30分钟。
SS5,000MW PEG-TNF-α(黑色圆圈)的半衰期为大约4天。20,000MW PEG-TNF-α(空白三角)的半衰期大于15天。
本实验用下列的处理组进行重复，结果示于图2：天然TNF-α(空白圆圈)；SS5,000MW PEG-TNF-α(黑色三角)；SS20,000MW PEG-TNF-α(空白三角)；NHS12,000MW PEG-TNF-α(黑色四方形)。对于不同处理组，血清半衰期分别是：对于NHS20,000MW PEG-TNF-α和SS20,000MW PEG-TNF-α为大于15天；对于SS5,000MW PEG-TNF-α大约为4天；对于SS12,000MW PEG-TNF-α大约为6天；对于NHS12,000MW PEG-TNF-α大约为8天；对于天然TNF-α为注射后30分钟。总之，每个PEG-TNF-α都表现出一个比天然TNF-α长的半衰期；然而NHS20,000MW PEG-TNF-α和SS20,000MW PEG-TNF-α比用低分子量PEG修饰的TNF-α有着显著的更长的半衰期(＞15天)。PEG-TNF-α的抗肿瘤活性
使用B16黑色素瘤模型。在胁腹皮下注射一百万个B16细胞到C57 b16小鼠(雌性，20-25g)体内。在开始治疗前让肿瘤生长一星期。每个处理组包括5只小鼠。
处理组包括：磷酸盐缓冲液对照(pH7.5)，溶于磷酸盐缓冲液(pH7.5)的天然TNF-α(10I.U.和100I.U.)，溶于磷酸盐缓冲液(pH7.5)的SS-PEG-TNF-α(10I.U.，100I.U.和1000I.U.)。在第7、14和21天分别腹膜内每星期注射一次0.1ml于小鼠体内。记录动物的存活。
在第二星期后(第一次处理后一星期)，对照组的肿瘤已非常可见。用SS-PEG-TNF-α处理的动物都没有出现生长的肿瘤。
在第22天，得到表1所示的结果：
表1 处理组 结果 对照 4只死，1只有大肿瘤 天然TNF-α 10I.U. 动物都死 100I.U. 4只死，1只有大肿瘤 5000MW SS-PEG-TNF-α 10I.U. 2只死，3只有大肿瘤 100I.U. 2只死，2只有肿瘤，1只没肿瘤 1000I.U.1只死，3只有小肿瘤，1只没有肿 瘤 20000MW SS-PEG-TNF-α 10I.U. 0只死，1只有小肿瘤，4只无肿瘤 100I.U. 都没有肿瘤 1000I.U. 都没有肿瘤
在180天后，得到表2所示的结果：
表2 处理组 存活时间 平均 对照组 18、18、20、21、24天 20.2天 天然TNF-α 10I.U. 17、18、19、21、21天 20.2天 100I.U. 16、18、19、19、23天 19.0天 5000MW SS-PEG-TNF-α 10I.U. 20、22、24、26、27天 23.6天 100I.U. 21、22、24、26、27天 35.0天 1000I.U. 21、49、53天；2只仍存活 20000MW SS-PEG-TNF-α 10I.U. 38天，4只仍存活 100I.U. 5只都存活 1000I.U. 5只都存活
这些结果表明，用PEG修饰的TNF不但可以降低TNF的致死性，而且，用分子量大约为20,000的PEG修饰的TNF还能令人惊奇地增加循环半衰期和令人惊奇地和显著地促进抗肿瘤活性。
因为几个原因使得结果令人惊奇。从未有人预测出用高分子量PEG修饰TNF能增加TNF的循环半衰期。其实一般来讲，是不能基于其分子量来预测蛋白质的清除速率的。用高分子量PEG修饰TNF不仅不降低，而且还事实上增强TNF的杀肿瘤活性，从高分子量修饰物可望带来额外的硬脂障碍这一点来看是令人惊奇的。进一步地，因为它使TNF的循环半衰期延长，我们可以预料被修饰的TNF比天然TNF具有更大的毒性，但事实却并非这样。
以下是在本实施例中应用的细胞毒性测定方法的描述：
A.材料
L929成纤维细胞ATCC#CCL1NCTC克隆929。
Dulbecco改进的基本培养基(DMEM)
胎牛血清(GIBCO Laboratories，Grand Island，NY#16000-010)
HEPES缓冲液1M，在生理盐水中(BioWhittaker，Inc.#17-737E)
硫酸庆大霉素(Bio Whittaker，Inc.#17-518E)
胰蛋白酶-EDTA 1X(GIBCO Laboratories，#25300-021)
胰蛋白酶兰染料(GIBCO Laboratories，#15250-012)
组织培养瓶，150cm2，75cm2，25cm2(Corning，Inc.，Corning，NY，#25120，#25110，#25100)
96孔细胞培养板，平底(Corning Inc.，#25861)
12道移液管(Titertek)
为移液管用的无菌滴头(Intermountain Scientific Corp.，Bountiful，UT，#P-3250-8)
无菌的试剂瓶(Costar Corp.，Cambridge，MA，#4870)
重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)(内部制备)
牛血清白蛋白，10％，在IMEM中(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN，#652237)
磷酸盐缓冲液(PBS)
Dulbecco磷酸盐缓冲液(D PBS)(GIBCO Laboratories，#310-4190)
微滴度板读数器(Molecular Devices Corp.，Menlo Park，CA，Emax)
B.L929成纤维细胞的繁殖
1.如下述在DMEM/10％FBS中每周传代两次以维持成纤维细胞。从培养瓶中吸出培养液，剩下贴壁的细胞。用5ml胰蛋白酶-EDTA洗涤单层细胞，吸出胰蛋白酶-EDTA。在37℃温育1到2分钟。加入15ml DMEM/FBS洗涤单层细胞并终止胰蛋白酶的酶解作用。
2.用锥虫蓝排斥反应来记数细胞并估测活性。在一个T75培养瓶中，接种1×106细胞到没有抗生素的30ml DMEM/FBS中，在37℃，5％CO2保湿温育箱中温育。
3.为了测定，在一个T150培养瓶中，接种2×106细胞到60mlDMEM/FBS中，将培养瓶温育3或4天直到细胞汇合(80-90％)。
C.TNF-α在体外的细胞毒性测定
第一天：准备细胞
1.用胰蛋白酶酶解细胞，并用DMEM/FBS稀释至终浓度为1.22×106细胞/ml。加入硫酸庆大霉素使其终浓度为50μg/ml。每个培养板要求2×106个细胞的细胞记数，从一个T150培养瓶中可得到1.75-2×107个细胞。
2.加150μl细胞悬液到96孔平底组织培养板的每一个孔中来平铺L929成纤维细胞。在37℃，5％CO2保湿培育箱中温育过夜。
第二天：加入样品
1.用倒置显微镜，在处理前检查每个孔中细胞的汇合情况。为了测定的可重复性，每孔都必需是相等的汇合。板上外部的孔不用作测量，因为在这些孔中细胞的生长是不均匀的。为了获得最好的灵敏度，细胞必须是75-90％的汇合。随着细胞传代次数的增加，细胞倍增的时间降低。可以相应调整细胞数/孔以得到正确的汇合度。
2.准备TNF-α标准的工作溶液，在使用前保存于4℃。
3.加150μl TNF工作溶液到第2与3列的第一孔中，加150μ1样品到第4到10列的第一孔中，加DMEM/FBS/庆大霉素到第1、11和12列中。用12道的微移液管，混合第一孔内的内容，再转移150μl到第二孔中去以做2倍的系列稀释。最后，混合第八孔(H行)内的内容并从每一孔中舍弃150μl。这时，每孔皆含有150μl。
4.把培养板在37℃，5％CO2保湿培育箱中温育20个小时。
第三天：
加入20μl 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)(25mg/ml，在pH7.4的磷酸盐缓冲液中)到培养板的每一个孔中，37℃温育4小时。此后去掉培养上清液，向每孔中加入150μlDMSO。用微滴度板读数器来测定每孔在570nm的吸收。表现出其A540最接近于对照的算术平均数的50％的孔被认为是代表L929细胞50％的溶解(1个单位)。
D.溶液
标准TNF-α(10μg)
在冰上解冻标准TNF-α，把它们以2μg/管的等份分装到带螺旋盖子的冷冻管中，贮存在-80℃。
标准TNF-α贮藏液(256ng/ml)
在一管标准TNF-α(2μg)中，加入7.81ml含1％白蛋白的D-PBS/庆大霉素，然后再按等份分装到1ml试管中，贮藏在4℃。溶液一般用6个月。
TNF-α工作溶液(0.8ng/ml)
在两个培养板上，加3.12μl贮藏溶液到997μl DMEM/FBS/庆大霉素中。(标准溶液在多孔培养板的第一孔中被1∶2稀释至终浓度0.4ng/ml)。在4℃保存直到使用。
磷酸盐缓冲液1L(PBS，1X)
溶解0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8g NaCl和1.14g Na2HPO4到900ml水中。调节pH至7.4Q.S.再移至1L高压灭菌器中。实施例2
制备出用PEG修饰的人TNF的另外样品(依据上述Harras描述的一般方法)并检测它们的血清半衰期和比活性保留。在每一例中，TNF被大约5到9个PEG分子修饰。数据(表3)令人惊奇地显示，用大约平均分子量为约10000到40000，优选地，为约20000到30000的PEG修饰的TNF表现出一个被显著增强的血清半衰期，同时还保留着高的比活性。
TNF不同配制物的半衰期用得自Genzyme公司(Cambridge，MA)的ELISA，依据制造商的建议来测定。血清样品用肝素化的50μl毛细管从后眶丛采集。在静脉内注射TNF或PEG-TNF配制物之前才收集处理前的样品。其他的血液样品在处理后的30分钟、24小时、3、7、12和15天收集。将样品离心，把得到的上清液贮存在-20℃以备检测。
表3 处理 血清半衰期(天) ％保留的比活性 SS-PEG5000TNF -α(2次试验) 4，4 55，58 SS-PEG12000 TNF-α(2次试验) 8，8 52，53 SS-PEG20000 TNF-α 16 56 SS-PEG30000 TNF-α 17 54 SS-PEG40000 TNF-α 17 55 SS-PEG5000TNF -α 5 51 SS-PEG20000 TNF-α 8 53 支链琥珀酰亚胺- PEG10000TNF- α 7 49 支链琥珀酰亚胺- PEG20000TNF- α 16 52 支链琥珀酰亚胺- PEG40000TNF- α 18 54实施例3
制备出另外的用PEG修饰的重组人TNF样品，测定其血清半衰期和比活保留。表4中的数据表明半衰期和比活性可随所用的连接体的不同而改变。
表4 处理(#PEG/TNF ) 血清半衰期 (天) ％保留的比活性 SCM-PEG5000TNF-α (5-9个PEG) 5 54 氨基酸的琥珀酰亚胺酯- PEG5000TNF-α (6-8个PEG) 4 55 环氧PEG8000TNF-α(伯 胺结合点)(10-20个PEG) 6 38 环氧PEG8000TNF-α(羟 基结合点)(10-20个PEG) 5 0 缩水甘油醚PEG5000TNF- α(15个PEG) 12 0 硝基苯基PEG5000TNF-α (6-9个PEG) 5 21 碳酸三氯苯酯PEG5000TNF -α(12-15个PEG) 5 11 PEG Tresylate5000TNF-α (10-12个PEG) 2 8 PEG醛5000TNF-α (1个PEG) ＜1 100 PEG醛20000TNF-α (1个PEG) 2 100 PEG异氰酸酯5000TNF-α (5-12个PEG) 9 19 PEG乙烯砜5000TNF-α (4个PEG) 3 12 PEG顺丁烯二酰亚胺5000 TNF-α(3个PEG) 3 43实施例4
做另外的试验来检测经PEG修饰的重组人TNF-α对用不同的肿瘤细胞侵染的小鼠的作用。这些试验中用的TNF是依照上述Harras描述的方法用SS-PEG20000来修饰的。将1×106肿瘤细胞注射小鼠体内，2星期后，每星期腹膜内注射一次PEG-TNF，共注射3个星期。治愈率被定义为比未治疗的动物存活长5倍的动物的百分数。结果列于表5，表明本发明的修饰的TNF在治疗黑色素瘤、肾瘤、结肠瘤和乳腺瘤时是有效的。
表5 肿瘤类型 细胞系 PEG-TNF的剂量 I.U. ％治愈率 黑色素瘤 B16 10 75 30 100 100 100 肾瘤 G401 10 80 30 80 结肠瘤 HT29 10 40 30 60 100 80 乳腺癌 MCF7 10 0 30 0 100 20 脑瘤 SW1088 100 0 白血病 L1210 100 0 肝细胞癌 Hep3B 100 0实施例5
通过试验来评价用PEG修饰的不同来源的TNF，结果如表6所示。
表6 TNF蛋白质 比活性 LD50 低血压 ED50 抗肿瘤 ED50 在Pichea中产生的 重组鼠TNF 2.1×107 IU/mg 20μg 1μg＞1000 IU 用SS-PEGMW 20000修饰的在 Pichea中产生的重 组鼠TNF 1.0×107 IU/mg 100μg 2μg 20IU 在大肠杆菌中产生 的重组鼠TNF 2.0×107 IU/mg 70μg 1μg＞3000 IU 用SS-PEGMW 20000修饰的在大 肠杆菌中产生的重 组鼠TNF 1.0×107 IU/mg 300μg 4μg 20IU 通过缺失212-222 位的氨基酸突变得 到的人TNF 2.1×107 IU/mg 60μg 1μg＞2000 IU 用SS-PEGMW 20000修饰的通过 缺失212-222位的 氨基酸突变得到的 人TNF 0.9×107 IU/mg 100μg 5μg 10IU 通过把248、592、 508赖氨酸转变为 丙氨酸突变得到的 人TNF 1.5×107 IU/mg 300μg 100μg＞1000 IU 用SS-PEG MW 20000修饰的通过 把248、592、508 赖氨酸转变为丙氨 酸突变得到的人 TNF 0.5×107 IU/mg＞1000μg＞100μg 5IU