涉及糖尿病和肥胖症的诊断及治疗的材料与方法 【发明领域】
本发明涉及用于糖尿病和相关肥胖症的诊断及治疗的材料与方法。发明背景
据说糖尿病影响到世界人口的大约5％。糖尿病的两种主要类型，称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，尽管它们的病理生理学相似但病原学完全不同。IDDM常在生命早期发生，是由于胰β-细胞的自身免疫破坏，导致β-细胞功能的部分或完全丢失。NIDDM在生命晚期更常见，一般超过40岁，全部糖尿病患者中大约85％是这一类型。尽管最好把NIDDM组认为是不均一的一系列疾病，但可识别出两种主要亚组，它们是非肥胖组和肥胖组，后者占病例的约30％[1]。
大约60年前，Himsworth[2]首先描述了对胰岛素的敏感性中变异性的概念。胰岛素耐受性，被定义为胰岛素对全身葡萄糖利用效果的不敏感性，它作为主要成分，具有肝葡萄糖产生的抑制作用，以及由肌肉通过糖原合成和葡萄糖氧化对葡萄糖负载的处置作用[3,4]。Reaven[5,6]已突出了胰岛素耐受性在NIDDM病理生理中地重要性，以及在胰岛素耐受性个体中增多的血管疾病的危险因素，他描述了术语“综合征X”下的一组危险因素，包括：葡萄糖不耐性、高循环胰岛素、紊乱的脂代谢和高血压。在发达国家NIDDM日益流行及与之相关的心脏疾病和中风结合在一起，使其成为西方世界中最具破坏性的疾病之一。
令人惊讶的是，尽管我们对胰岛素、细胞的复杂信号传导功能和对作为此激素多种作用基础的分子机理的理解，以及对突变胰岛素受体在胰岛素耐受性中作用的理解均显著提高，但标准教科书和最近的评论指出“然而，最常发生的NIDDM型的病原学和病理尚未充分明确[1]”；“联系肥胖和胰岛素耐受性的机理还不知道[7]”；以及“……对综合征X中成簇的心血管危险因素的生理、生化和分子基础的探索仍在继续[8]”。发明概述
已从对肌醇磷酸聚糖(IPG)两个家族的鉴定和部分表征描述出一种理解胰岛素作用和NIDDM的新见解，每一家族显示特异的拟胰岛素的特性，某些示于表1中。A型IPG刺激脂肪生成，抑制cAMP依赖的蛋白激酶，并修饰腺苷酸环化酶和cAMP磷酸二酯酶的活性，因此有助于cAMP的控制和cAMP调节的细胞内过程，这些过程传统地被胰岛素抑制。P型IPG激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDH P酶)、糖原合成酶磷酸酶和甘油-3-磷酸酰基转移酶等酶。主要磷蛋白磷酸酶的活化在葡萄糖处置的调节中起重要作用，其调节是经均为已知传统地由胰岛素调节的两个途径：PDH的氧化代谢和通过糖原合成的非氧化途径的贮存[见9-12]。
报道的肌醇磷酸聚糖在多种组织中出现，以及胰岛素对它们在体内和体外的释放的影响[10,12,13]，已引起对这些化合物在糖尿病的实验、遗传和临床形式的病理中所起作用的强烈兴趣。这些含肌醇的化合物在胰岛素信号传导中很重要的证据，来自于对分离的细胞的体外研究和应用IDDM(Ⅰ型)和NIDDM(Ⅱ型)糖尿病的动物模型的体内测定，包括以下发现：
(a)添加抗-IPG特异性抗体能阻断胰岛素的新陈代谢和促有丝分裂作用[14,Rademacher等人，未发表的观察]。
(b)在正常Wistar大鼠中抗-IPG抗血清抑制胰岛素和P型IPG对脂肪细胞甘油-3-磷酸酰基转移酶的刺激作用[15]。
(c)如通过酪氨酸磷酸化所测定的，不能合成IPG的突变细胞应答胰岛素，但不被刺激以显示至少某些激素的新陈代谢作用，尤其是糖原合成[16]。
(d)在脂肪细胞提取物中，聚糖通过需要蛋白磷酸酶1的机制促进了丝氨酸/苏氨酸去磷酸化，此磷酸酶调节糖原合成酶和磷酸化酶的活性[16,17]。
(e)在分离的大鼠肝细胞中，链脲菌素诱导的糖尿病对糖基磷脂酰肌醇依赖的胰岛素信号传统系统的损害[18]。
(f)糖尿病GK大鼠是被认为胰岛素耐受性Ⅱ型糖尿病的模型[9]，其在合成或释放功能性IPG中有缺陷，如由以下方面所显示，含手性肌醇的胰岛素介质损害的甘油-3-磷酸酰基转移酶的胰岛素诱导的活化[15]，以及胰岛素损害的骨骼肌糖原合成酶的活化[19]。
(g)手性肌醇向给予葡萄糖负载的正常鼠或向链脲菌素-糖尿病大鼠的注入，导致血浆葡萄糖的减少和糖原合成酶活性的升高：也报道了手性肌醇治疗对胰岛素耐受性恒河猴的阳性效果[20,21]。
IPG在人胰岛素耐受性Ⅱ型糖尿病的病理中重要的证据，主要地来自于已使用两种基本方法的研究(见表2)：
(a)使用气相色谱和质谱法对糖尿病受试者尿中游离的手性肌醇和肌醇含量的测定。
(b)使用生物测定方法，例如丙酮酸脱氢酶磷酸酶的激活、cAMP依赖的蛋白激酶的抑制，对肌醇磷酸聚糖介质在尿和组织提取物中的生物活性的测定。表2中给出了这些研究的主要发现。总之：
(a)游离手性肌醇。Kennington等人[12]和Suzuki等人[23]显示它在NIDDM受试者尿中减少，并在自发糖尿病恒河猴的尿中减少[24]。已报道在许多对人类患者的研究中，减少的尿排泄率直接与胰岛素耐受性相关联[22,25]。相反，Ostlune等人报道了增加的尿手性肌醇浓度[26]。这些报道之间的差异还未解决。
(b)P型IPG。在糖尿病患者的肌肉活检样本和血液透析液中发现尿排泄水平的减少，以及含手性肌醇的IPG的浓度减少[25]。
(c)游离肌醇。Kennington等人[22]和Ostlund等人[26]报道在研究中它在NIDDM受试者尿中升高。
(d)A型IPG。Asplin等人[25]使用cAMP依赖的蛋白激酶抑制的生物测定系统，报道了NIDDM受试者尿中未改变的A型IPG。
两种其它的一系列工作进一步支持了IPG在糖尿病患者的胰岛素信号传导系统中起重要作用的概念。
(a)报道在用胰岛素治疗的糖尿病患者中发现升高的手性肌醇血浆水平[Ostlund等人，26]。
(b)Prochazha等人[27]对Pima印第安人中胰岛素耐受性的遗传基础的研究，集中于对蛋白磷酸酶1(PP1)的遗传分析，它是糖原合成中的关键调节酶。他们的结论是，PP1催化b亚单位的结构基因看来不是负责PP1异常的主要遗传决定簇，这进一步支持了含肌醇的磷酸聚糖在胰岛素耐受性的病原学和紊乱的糖原代谢中的起主要作用的概念。
鉴于：(ⅰ)有增多的证据指向NIDDM中肌醇磷酸聚糖在胰岛素作用和胰岛素应答紊乱中的重要性；(ⅱ)P型IPG和A型IPG在酶调节中所起的主要作用，这些酶参与通过氧化和非氧化途径对葡萄糖的处置、脂肪生成的调节、三酰甘油形成和脂解、以及葡糖异生；(ⅲ)关于尿中P型IPG和A型IPG的生物活性种类的分歧且贫乏的数据；在对随机系列男性糖尿病患者的现场尿样本的代表性研究中进行关于尿IPG和NIDDM之间关系的详细研究被认为是重要的；(ⅳ)存在内源IPG的裂解和糖的饮食来源的事实，使关于尿中手性肌醇(Chiro-inositol)和肌醇(myo-inositol)测定的研究复杂化了。因此，假定P型IPG介质包含手性肌醇、A型IPG介质包含肌醇的此领域的现有技术研究，必须被谨慎说明，见Fonteles,MC,Huang,LC,Larner,J，糖尿病学(Diabetologia),39:731-734,(1996)，其中作者报道他们不正确地鉴定了P型IPG介质中的肌醇，它是右旋肌醇甲醚不是手性肌醇。由于不能通过糖类分析中使用的酸性条件使右旋肌醇甲醚转化为手性肌醇，所以这是此领域中一个错误鉴定的实例。
本发明源起于如下详述的、关于A型IPG和P型IPG水平、P型IPG对A型IPG的比例、以及一定形式的糖尿病和肥胖症发生之间的相关性的发现。
本发明除了其它的事物之外提供：
(1)通过测定血或尿中P型：A型介质的比例对Ⅱ型糖尿病(NIDDM)的诊断。
(2)使用P型和A型介质混合物对IDDM或消瘦Ⅱ型糖尿病(NIDDM)(BMI＜27)的治疗。
(3)用P型IPG介质和/或A型IPG拮抗物对肥胖Ⅱ型糖尿病(NIDDM)的治疗。
对肥胖Ⅱ型糖尿病的治疗包括施用A型IPG的拮抗物。我们在此显示(见图5B)男性肥胖Ⅱ型糖尿病患者释放2∶1单位比例的P∶A介质。A型IPG驱使葡萄糖变为脂肪而P型IPG驱使葡萄糖变为糖原用于能量消耗。在Ⅱ型糖尿病患者中，胰岛素对每3单位A型IPG刺激6单位P型IPG的释放。与此对比，消瘦型糖尿病患者或Ⅰ型(胰岛素缺乏的)或对照患者中，胰岛素对每一单位A型IPG刺激6单位P型IPG的释放。因此肥胖型糖尿病患者使三倍于正常对照或消瘦型糖尿病患者的葡萄糖变为脂肪。肌肉正常吸收80％的血糖，它是P型IPG应答组织。在Ⅱ型糖尿病患者中，少量的血糖进入肌肉，更多的变为脂肪，但被脂肪组织的去除效率较低，并且随后血糖浓度升高，升至糖尿病状态。然后这些患者通常血胰岛素增多，这使更多的葡萄糖变为脂肪，引起问题并形成恶性循环。
对于Ⅰ型糖尿病的治疗，大约6∶1的P∶A介质混合物可用于男性，大约4∶1的混合物用于女性。
因此，第一方面，本发明提供了诊断糖尿病的方法，此方法包括测定患者生物样本中P型和/或A型肌醇磷酸聚糖(IPG)的水平或比例。该比例的测定有助于把患者精确地划分为糖尿病组，允许根据组和/或患者个体需要制订对患者糖尿病的治疗，例如给患者施用适量的P型IPG或A型IPG，或它们的拮抗物，以修正患者中这些化合物的水平和/或比例。
在一个实施方案中，诊断糖尿病的方法包括以下步骤：
(a)用固相载体接触从患者获得的生物样本，在固相载体上已固定有具有对一个或多个P型IPG特异结合位点的第一种结合剂，和具有一个或多个A型IPG结合位点的第二种结合剂；
(b)用一个或多个标记的能与未占据的结合位点、已结合的IPG或占据的结合位点结合的显影剂接触固相载体；以及
(c)检测在步骤(b)中特异性结合的显影剂的标记，获得代表样本中P型IPG和A型IPG水平的值。
优选地，方法包括进一步的步骤：
(d)使用这些值获得样本中P型IPG和A型IPG的比例。
另外或选择地，可使用如下描述的用于P型IPG和A型IPG生物活性的一种或多种测定来检测样本中P型IPG和/或A型IPG的水平，及它们的比例。
在进一步方面中，本发明提供了P型或A型肌醇磷酸聚糖(IPG)、或者P型或A型IPG拮抗物在用于治疗糖尿病的药剂制备中的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了A型IPG拮抗物和/或P型IPG在用于治疗肥胖Ⅱ型糖尿病的药剂制备中的用途。如上所述，这些患者有一种形式的糖尿病，其特征在于减少的P型IPG∶A型IPG的比例。
在另一实施方案中，本发明提供了P型IPG和A型IPG在用于治疗IDDM或消瘦Ⅱ型糖尿病(NIDDM)的药剂制备中的用途。在此实施方案中，优选地，P型IPG∶A型IPG比例对男性患者是大约6∶1混合，对女性患者是大约4∶1混合。此用途中，对患者可分开施用P型IPG和A型IPG或配制在一起施用。如以上提到的，预期将根据患者中IPG的水平或比例对每一个体患者制订配方。在施用时可由医生或患者制订配方。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含与药学可接受的载体结合使用的A型IPG拮抗物和/或P型IPG。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含与药学可接受的载体结合使用的P型IPG和A型IPG的混合物。
另一方面，本发明提供了一种用于治疗肥胖Ⅱ型糖尿病的试剂盒，其包含P型IPG第一个容器和A型IPG拮抗物的第二个容器，用于同时或顺序施用。
另一方面，本发明提供了一种筛选P型或A型IPG拮抗物的方法，此方法包括：
(a)在用于P型IPG或A型IPG生物性质的测定中，在IPG和候选拮抗物可以竞争的条件下，将候选拮抗物与P型IPG或A型IPG接触；
(b)测定IPG的生物性质；以及
(c)筛选降低IPG生物活性的候选拮抗物。
现在将参照附图以举例但不限于此的方式描述本发明。附图简述
图1A显示了糖尿病受试者尿中A型IPG和P型IPG的含量图(按A型IPG含量的顺序排列)。
图1B显示了对照受试者尿中A型IPG和P型IPG的含量图(按A型IPG含量的顺序排列)。
图2显示了显示高A型IPG和高P型IPG组的糖尿病受试者尿中A型IPG和P型IPG的含量，及其HbA1值。
图3A，B显示了A型IPG和P型IPG与HbA1之间的相关性。
图4A，B显示了A型IPG和P型IPG与体重指数之间的相关性。
图5显示(A)糖尿病受试者中A型IPG和P型IPG与体重指数之间的关系，(B)作为体重指数的函数的A型IPG∶P型IPG的比例，和作为体重指数的函数的胰岛素敏感性(M值)。在(A)中，根据其体重指数(BMI-kgm2)将糖尿病受试者分为7组。显示了每一亚组A型IPG(·-·)和P型IPG(。-。)的平均值。对照组IPG的平均值以垂直柱显示。对照组的BMI是24±2.4(平均值±SD)。沿横坐标的箭头和数字显示在接受胰岛素治疗或二甲双胍、用或不用其它治疗的每一组中糖尿病受试者的数量。二甲双胍是为过重和肥胖NIDDM受试者所选的治疗。在(B)中，垂直虚线标记出肥胖定义的常规阈值(BMI＞27)。
图6A，B显示糖尿病(IDDM和NIDDM)受试者中收缩压与尿中A型IPG和P型IPG之间的关系。
表3a：给出了表示的两种模式：栏1,2，从10ml尿中提取的部分纯化的IPG对生物测定系统的刺激百分数，在分离的脂肪细胞中通过脂肪生成刺激的A型IPG[30]，和通过PDH磷酸酶激活的P型IPG[28]。这些结果可直接与Asplin等人[25]的数据对比。栏4,5中的结果以单位/mmol肌酸酐表示，一个单位定义为产生生物测定系统基础率50％刺激的量。结果显示为平均值±SEM以及中值与范围。分别用Fisher′s P检验或Mann Whitney检验进行统计分析。为对比，显示了一组10个正常女性的值。发明详述IPG
研究显示A型介质调节许多的胰岛素-依赖酶的活性，如cAMP依赖的蛋白激酶(抑制)、腺苷酸环化酶(抑制)和cAMP磷酸二酯酶(刺激)。相反，P型介质调节胰岛素-依赖酶的活性，如丙酮酸脱氢酶磷酸酶(刺激)和糖原合成酶磷酸酶(刺激)。A型介质模拟脂肪细胞上胰岛素的脂肪生成活性，而P型介质模拟肌肉上胰岛素的生糖原活性。当加至无血清培养基中的成纤维细胞中时，A型和P型介质都促有丝分裂。如果用EGF-受体转染细胞，介质刺激成纤维细胞增殖的能力增强。A型介质能刺激鸡耳蜗前庭神经节中的细胞增殖。
具有A型IPG和P型IPG活性的可溶性IPG组分已从多种动物组织中获得，包括大鼠组织(肝、肾、肌肉、脑、脂肪、心脏)和牛肝。在人肝和胎盘、疟原虫寄生的RBC和分枝杆菌属中也检测到A型IPG和P型IPG生物活性。抗-肌醇聚糖抗体抑制胰岛素对人胎盘细胞滋养层和BC3H1肌细胞的作用或抑制牛衍生的IPG对鼠隔和鸡神经节的作用的能力，提示许多结构特征的种间保守性。然而，重要的是注意到尽管现有技术包括某些生物组分中A型IPG和P型IPG活性的这些报道，但还未公开负责活性的试剂之纯化或表征。
在GB-A-9618930.3和GB-A-9618929.5中要求优先权的共同来决的专利申请中，我们描述了P型IPG和A型IPG的分离和表征。
A型IPG物质是含环多醇的糖类，也包含Zn2+离子和任选的磷酸，并具有调节脂肪生成活性和抑制cAMP依赖的蛋白激酶的特性。它们也抑制腺苷酸环化酶，当加至无血清培养基中EGF-转染的成纤维细胞时，可促有丝分裂，并刺激脂肪细胞中的脂肪生成。
P型IPG物质是含环多醇的糖类，也包含Mn2+和/或Zn2+离子及任选的磷酸，具有调节糖原代谢和激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶的特性。它们也刺激糖原合成酶磷酸酶的活性，当加至无血清培养基中的成纤维细胞时，可促有丝分裂，并刺激丙酮酸脱氢酶磷酸酶。
鉴于磷酸在A型IPG和P型IPG中的任选存在，称为“肌醇磷酸聚糖”或“IPG”中包括不存在磷酸的化合物。这些化合物另外可称为肌醇聚糖(IG)。
也发现A型IPG和P型IPG物质具有以下特性：1． 在使用4/1/1丁醇/乙醇/水作为溶剂的下行纸层析中迁移靠近起点。2． 物质中包含直接与活性有关的磷酸。3． 游离GPI前体耐受GPI-PLC的切割。4． 它们能结合于Dowex AG50(H+)阳离子交换树脂上。5． 它们能结合于AG3A阴离子交换树脂上。6． 活性耐受链霉蛋白酶。7． 可使用Dionex层析系统检测它们。8． 在C-18亲和树脂上部分保留P型IPG物质。
A型IPG和P型IPG物质可从人肝或胎盘获得，通过：
(a)通过热和酸处理肝匀浆进行提取，匀浆加工自在液氮中速冻的组织；
(b)离心和活性炭处理后，将所得的溶液与AG1-X8(甲酸盐形式)阴离子交换树脂作用过夜；
(c)收集用50mM HCl洗脱柱获得的有A型IPG活性的级分，或用10mM HCl洗脱柱获得的有P型IPG活性的级分，；
(d)中和至pH4(不超过pH7.8)，冷冻干燥该级分以分离物质。
(e)使用4/1/1丁醇/乙醇/水作为溶剂进行下行纸层析。
(f)使用高电压纸电泳在吡啶/乙酸/水中纯化。
(g)使用Dionex阴离子交换层析纯化，或使用Vydac 301 PLX575HPLC层析纯化和分离。
在所述专利申请中提供了用于获得这些IPG的方法的更多细节，其内容在此引入作为参考。拮抗物
如以上提到的，P型或A型IPG拮抗物包括具有一个或多个以下特性的物质：
(a)能抑制P型或A型介质释放的物质；
(b)能通过IPG结合物质(例如抗体或特异性结合蛋白质)降低P型IPG或A型IPG水平的物质；和/或
(c)能降低P型IPG或A型IPG作用的物质。
在一个实施方案中，IPG拮抗物是特异性结合蛋白质。可通过筛选生物样本中结合IPG的蛋白质获得自然发生的特异性结合蛋白质。
在另一实施方案中，拮抗物是能特异性结合P型IPG或A型IPG的抗体。在本领域中已很好地建立了多克隆和单克隆抗体的产生方法。单克隆抗体可用重组DNA技术的方法产生，以产生保留原始抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这些技术包括将编码一种抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDR)的DNA引入到不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。见例如，EP-A-184187、GB-A-2188638或EP-A-239400。产生单克隆抗体的杂交瘤可经过基因突变或其它改变，这可能或不能改变所产抗体的结合特异性。
可使用本领域标准的技术获得抗体。产生抗体的方法包括用蛋白质或其片段免疫哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊或猴)。可使用本领域中已知的多种技术从免疫的动物中获得抗体，并优选地使用与目的抗原结合的抗体来筛选。例如，可使用Western印迹技术或免疫沉淀法(Armitage等人，自然(Nature),357:80-82,1992)。抗体和/或产生抗体的细胞从动物中的分离可伴随着杀死动物的步骤。
作为对用肽免疫哺乳动物的替代或补充，可从表达免疫球蛋白可变区的重组产生文库中获得对蛋白质特异的抗体，例如使用在其表面显示有功能的免疫球蛋白结合区的λ噬菌体或丝状噬菌体；例如见WO92/01047。文库可以是天然的，由来用任何蛋白质(或片段)免疫过的生物获得的序列构建，或使用从接触过目的抗原的生物获得的序列来构建。
可用许多方式修饰根据本发明的抗体。实际上应将术语“抗体”解释为包括任何含具有所需特异性的结合结构域的结合物质。因此本发明包括抗体片段、衍生物、功能相同物和抗体同系物，包括合成分子和形状模拟能结合抗原或表位的抗体的分子。
能与抗原或其它结合伴侣结合的抗体片段的实例是由VL、VH、C1和CH1结构域组成的Fab片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段；分离的CDR区和F(ab′)2片段，包含两个通过二硫键在绞链区连接的Fab片段的二价片段。也包括单链Fv片段。
本发明中也包括人源化抗体，其中非人来源的CDR被移植于人构架区，一般有某些构架氨基酸残基的改变，以提供比亲代非人抗体免疫原性降低的抗体。
可对产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行基因突变或其它改变。本领域熟练的技术人员将进一步理解单克隆抗体可经过重组DNA技术的方法，以产生保留原始抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这些方法可包括将编码一种抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDR)的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。见例如，EP-A-184187、GB-A-2188638或EP-A-239400。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023中有描述。
能产生具有所需结合特性的抗体的杂交瘤落在本发明的范围内，如包含编码抗体(包括抗体片段)的核酸并能表达它们的真核或原核宿主细胞。本发明也提供了抗体产生的方法，包括在能产生抗体、优选地分泌抗体的条件下培养产生抗体的细胞。
如上所述的抗体也可用于本发明的诊断方面，方法是用能直接或间接产生可检测、优选的是可测定信号的标记或报告分子标记抗体。报告分子的连接可以是直接的或间接的、共价的(例如通过肽键)或非共价的。经肽键的连接可作为编码抗体和报告分子的基因融合体重组表达的结果。
一种较好的模式是每个抗体与具有不同的光谱吸收或光谱发射特性的单个荧光染料、磷光体或激光染料共价结合。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德克萨斯红。合适的产色染料包括二氨基联苯胺。
其它报告分子包括大分子胶体颗粒或颗粒材料如有色、磁性或顺磁性的乳胶珠，以及能直接或间接引起可检测信号以便视觉观察、电检测或用其它方式记录的生物或化学活性剂。这些分子可以是例如催化如显色或颜色改变或引起电性质改变的反应的酶。它们可以是分子激发的，以使能量状态之间的电子跃迁导致特征性的光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器协同使用的化学实体。可使用生物素/亲和素或生物素/链霉抗生物素和碱性磷酸酶检测系统。
在另一实施方案中，IPG拮抗物是合成的化合物。它们可通过常规化学技术或使用组合化学产生，然后筛选IPG拮抗物活性。这些化合物可用于它们本身或用于模拟设计，提供作为药物发展的候选先导化合物。在某些地方合成组合物是期望的，如当它比较容易合成或具有使其适于作为药物施用的特性时，例如如果肽拮抗物在消化道中被蛋白酶降解，则它不是合适的用作口服组合物的活性剂。模拟设计、合成和测试通常用来避免用于目的特性的大量分子随机筛选。单克隆抗体的产生
从大鼠肝中通过顺序薄层层析(TLC)纯化的肌醇磷酸聚糖(IPG)用来以常规方法免疫新西兰兔和Balb/c鼠。
免疫后，使用小鼠脾细胞(5×106细胞/ml)与突变骨髓瘤细胞(106细胞/ml)融合的方法制备单克隆抗体。使用的骨髓瘤细胞系缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶。杂交瘤的筛选方法基于非竞争固相酶免疫测定，其中抗原(IPG)固定于固相上。添加培养上清液，筛选阳性杂交瘤细胞。
通过有限稀释法制备单细胞克隆。筛选三种单克隆抗体(2D1、5HG和2P7)的杂交瘤。使用EK-5050试剂盒(Hyclone)检测所有单克隆抗体都是IgM。
为检测全部单克隆抗体识别的IPG，使用非竞争固相酶免疫测定。使用F96Polysorp Nunc-Immuno板用于测定。对于固定特定抗原的检测处建议使用Polysorp表面。
稀释至1∶800的固定化抗原(IPG)从组织培养上清液、腹水中以及使用纯化的单克隆抗体时捕获单克隆抗体。
检测方法使用抗-鼠IgM、生物素化全抗体(来自山羊)和链霉抗生物素-生物素化的辣根过氧化物酶复合物(Amersham)、ABTS和用于ABTS的缓冲液(Boehringer Mannheim)。
使用相同的免疫测定评估多克隆抗体。在此测定中，检测方法使用抗-兔Ig、生物素化的种群特异的全抗体(来自驴)。
可使用以下方法纯化抗体。为纯化多克隆IPG抗体使用快速蛋白液相层析(Pharmacia FPLC)系统，其带有梯度编程器GP型IPG250 plus和高精密泵P型IPG500。
使用HiTrap蛋白质A亲和柱从兔血清中纯化多克隆IPG。使用Micro BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)进行蛋白质定量。
以两步纯化单克隆IgM抗体。硫酸铵沉淀选作第一步的方法。用硫酸铵(50％饱和)处理组织培养上清液。第二步之前将在PBS中稀释的沉淀转移至透析管。
因为硫酸铵沉淀不适于单步纯化，所以随后进行凝胶过滤层析，即PBS中的抗体溶液流入Pharmacia Sepharose4B柱。在Perkin-Elmerλ2UV/VIS分光光度计上读取220-280nm处的吸光度，进行蛋白质定量。夹心ELISA方案
以下方案展示了用于对生物液体(如人血清)中肌醇磷酸聚糖(IPG)定量的间接的、非竞争的、固相酶免疫测定(夹心ELISA)。
测定中，将单克隆IgM抗体固定于固相。免疫测定中使用组织培养上清液、通过向腹膜注射杂交瘤细胞诱导腹膜肿瘤的小鼠腹水和纯化的单克隆抗体。F96 Maxisorp Nunc-Immuno板用于这些测定。蛋白质特别是糖蛋白如抗体与塑料结合时建议使用Maxisorp表面。
固定化的抗体从测试样本(人血清或用作阳性对照的IPG)中捕获抗原。
需要桥连抗体(从兔中纯化的多克隆IPG抗体)连接生物素化的抗-抗体与抗原。
检测方法使用抗-兔Ig、生物素化的种群特异的全抗体(来自驴)和链霉抗生物素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(Amersham)、ABTS和用于ABTS的缓冲液(Boehringer Mannheim)。
ELISA测定可如下进行：
1．在所有步骤中加入100μl/孔。
2．在F96Maxisorp Nunc-Immuno板中加入1∶100稀释于PBS的单克隆抗体。4℃温育至少2天。
3．用PBS洗三次。
4．加入溶于蒸馏水(1∶9)的ELISA封闭剂(Boehringer Mannheim)，室温2小时。
5．用PBS-吐温20(0.1％)洗三次。
6．加入纯化的多克隆抗体(1∶100稀释于PBS中),4℃过夜。
7．用PBS-吐温20(0.1％)洗三次。
8．加入抗-兔Ig、1∶1000稀释于PBS的生物素化的种群特异的全抗体(来自驴)(Amersham)，室温1小时30分钟。
9．用PBS-吐温20(0.1％)洗三次。
10．加入1∶500稀释于PBS的链霉抗生物素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(Amersham)，室温1小时30分钟。
11．用PBS洗三次。
12．向ABTS(BM)的缓冲液中加入2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6))二铵盐晶体(ABTS)(Boehringer Mannheim),ABTS的缓冲液加于蒸馏水中(1∶9v/v)。1mgABTS加入1ml稀释的ABTS缓冲液中。
13．5-15分钟内使用405mm滤片在Multiscan Plus P2.01中读取吸光度。药物组合物
本发明的介质和拮抗物可配制在药物组合物中。除一种或多种介质或拮抗物外，这些组合物可包括，药学可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或其它本领域熟练的技术人员熟知的物质。这些物质应该是无毒的，且不应干扰活性成分的效能。载体或其它物质的准确性能取决于施用的途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、经鼻、肌肉内、腹膜内途径。
用于口服的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包含固体载体如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体如水、石油、动物或蔬菜油、矿物油或合成油。可包含生理盐水溶液、右旋糖或其它糖溶液或乙二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内、皮肤或皮下注射或在病患部位注射，活性成分将是适于肠胃外的水溶液形式，其不含致热原并有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能使用例如等渗载体如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制备合适的溶液。如需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其它添加剂。
无论它是根据本发明的用于个体的多肽、抗体、肽、小分子或其它药物有用的化合物，优选地以“预防有效的量”或“治疗有效的量”施用(尽管有时也可认为预防是治疗)，只要足以显示对个体有效。施用的实际量、施用率和时程，依赖于受治疗者的自然状况和疾病的严重程度。治疗处方，例如剂量等的决定，在全科医师和其他医生的职责内，一般考虑所治疗的疾病、个体患者的状况、递送部位、施用方法和其它医师已知的因素。在Osol,A.1980年编写的《Remington药物科学》(Remington′sPharmaceutical Sciences)第16版中能发现如上提及的技术和方案的实例。
可单独或与其它治疗结合、根据治疗状况同时或顺序施用组合物。诊断方法
测定个体生物样本中分析物浓度的方法在本领域众所周知，并能在本发明的内容中使用，以测定患者生物样本中P型和A型肌醇磷酸聚糖(IPG)的比例。随后这又允许医生决定患者所患的糖尿病亚组，以优化治疗方法，在肥胖Ⅱ型糖尿病的病例中，避免或改善综合征X的症状。在以下的实验部分中描述了诊断方法的实例。
优选的诊断方法依赖于P型IPG和A型IPG比例的测定。这些方法能使用生物样本如血、血清、组织样本或尿。
用于测定P型IPG和A型IPG浓度的测定方法一般使用具有能特异性结合一个或多个P型IPG或A型IPG的结合位点(优于其它分子)的结合剂。结合剂的实例包括抗体、受体和能特异性结合IPG的其它分子。方便地，将结合剂固定于固相载体，例如在确定的位置，以使其在测定中容易操作。
通常在适当条件下用结合剂接触样本，以使样本中存在的P型IPG和A型IPG能与结合剂结合。然后使用显影剂测定结合剂结合位点的占据部分。一般地，显影剂是经标记的(例如用放射性的、荧光的或酶标记)，以便能使用本领域众所周知的技术检测它们。因此，能用闪烁计数器或其它放射计数装置检测放射性标记，用激光和聚焦显微镜检测荧光标记，用酶标记对底物的作用检测酶标记，一般是产生颜色变化。显影剂能用于竞争性方法，其中显影剂与分析物竞争占据结合剂的结合位点，或用于非竞争方法，其中标记的显影剂与被结合剂结合的分析物结合、或结合于占据的结合位点。两种方法都提供了被分析物占据的结合位点数量、及样本中分析物浓度，例如通过与使用含已知浓度分析物的样本获得的标准来比较。在优选的实施方案中，这些结果然后能被用来测定P型IPG∶A型IPG比例。A．目的
鉴于肌醇磷酸聚糖对(ⅰ)理解胰岛素信号传导系统，(ⅱ)胰岛素耐受性、NIDDM和综合征X的病原学，(ⅲ)作为胰岛素耐受性糖尿病早期检测的标记，和(ⅳ)作为NIDDM的潜在治疗剂等的潜在的重要性，已进行研究测定正常男性受试者和男性糖尿病患者(包括IDDM、NIDDM(消瘦型和肥胖型))的尿肌醇磷酸聚糖水平，所使用的生物测定方法中应用已知被这些胰岛素介质激活的、很好地建立的系统的刺激(见以下实验部分)。
测定尿样本中P型IPG和A型IPG的浓度和比例，与大学伦敦医院(University College,London Hospitals)的临床数据进行比较，目的是收集关于IPG变化与糖尿病类型和严重程度的标记之间可能的联系的信息。临床参数包括：HbA1、尿肌酸酐和蛋白质、血压、体重指数(重量kg/高度m2)、并发症(例如心血管、肾、视网膜、神经)、年龄和治疗。已知医院中治疗的持续时间，但糖尿病总持续时间的有力证据不总是可得到的或可靠的，未包括于此。
随机选择的30名糖尿病受试者和大约相同数量的非糖尿病对照男性受试者的代表性研究，未揭示是否观察到的在临床标记和IPG变化之间的相关性代表原因、结果或巧合。然而，预料此数据将提供：
(a)关于糖尿病男性受试者中生物活性尿IPG变化的浓度和方向的额外信息-现在某些争论的问题；
(b)导致更好地理解综合征X的生化基础的新信息；
(c)考虑用IPG治疗胰岛素耐受性糖尿病的基本原理的起始点。B． 实验1． A型IPG和P型IPG活性的测定：
使用特异的生物测定方法研究尿提取物中P型IPG和A型IPG的活性。使用PDH磷酸酶的激活测定P型IPG[28]。如Lilley等人所述[28]从牛心中制备PDH复合物和PDH磷酸酶(金属依赖的形式)，使用这些作者描述的二步系统的分光光度计改变型进行磷酸酶活化的测定。此测定被认为是P型IPG的特有的特征(见Larner等人[29])。通过脂肪生成的刺激测定A型IPG，测定方法是将[U-14C]葡萄糖掺入用Rodbell方法[30]从附睾脂垫中分离的脂肪细胞的脂质中。发现A型IPG对此生物测定有高度特异性。
获得了加入的IPG和PDH磷酸酶活性(P型IPG)的刺激及完整脂肪细胞中的脂肪生成(A型IPG)之间的直线关系；这种关系至少具有高达+250％的刺激。这些发现提供了定义、并用于目的为比较不同组织和尿样本中IPG产量的单位的基础。加入的IPG和相应百分数变化之间的线性，已由其他人观察到(见Lilley等人[28]和Newman等人[31])，尽管Asplin等人[25]在其关于正常和糖尿病受试者尿中IPG的研究中未显示线性，一种用A型IPG特别标记的作用。2． 从尿中提取P型IPG和A型IPG
如Asplin等人[25]所述提取尿。冻干最终组分并贮存于-20℃。使用时，测定前迅速在水中重悬IPG组分，以使10μl重新溶解的IPG对应于10ml尿。考虑到在受试者的不同组中可排泄高的和变化的IPG的量之可能性，并为了保证树脂的容量足以负载过量上样，进行预试验运行以测定树脂与起始尿体积的最佳比例。获得的回收线性高达每18g树脂100ml尿。此研究中，考虑到IPG含量的变化，保持50ml尿与18g树脂的比例。3． 结果的表示
一单位IPG定义为引起测试系统基础水平中50％激活的量。
在两个不同的基础上给出了尿中IPG的产量：
(ⅰ)10μl终尿提取物对测试系统的刺激百分数，允许直接与Asplin等人[25]的数据对比。
(ⅱ)每1mmol肌酸酐中IPG的单位。
以平均值±SEM和中值与值范围形式给出结果。4． 实验设计
用门诊部收集的随机现场样本进行代表性的研究。患者包括单独用饮食、磺酰脲(sulphonylureas)、二甲双胍、胰岛素或任何这些治疗的组合控制的NIDDM受试者。只得到了有限数量的IDDM受试者。本调查中，使用了男性受试者，这避免了由不同年龄的妇女中变化的激素分布，尤其是使用或不使用HRT或避孕药引起的复杂化。避免男性/女性调查的混合被认为是重要的，因为此实验室的分离的研究显示女性尿中P型IPG/A型IPG比例显著低于男性，主要与她们的较高的A型IPG浓度有关(见表3A)。除尿中P型IPG和A型IPG的测定外，以下临床数据是可用的：尿：肌酸酐，蛋白质血：HbA1
生物数据：年龄，重量和高度(用于BMI的计算)，血压，并发症(例如心血管、肾、神经病)，种族来源
治疗：胰岛素，磺酰脲，双缩胍，饮食，(单独或组合)。
糖尿病中肌醇磷酸聚糖的变化与如HbA1显示的糖血控制的程度相关，与基础代谢指数(BMI)显示的肥胖相关，与年龄和血压相关。C． 结果1． 糖尿病和对照受试者尿中的肌醇磷酸聚糖：
表3A显示了男性糖尿病受试者和非糖尿病对照的尿中P型IPG和A型IPG的浓度。以平均值±SEM和中值与其范围形式给出结果。将糖尿病组作为组合整体的最显著的差异，是相对于对照组的尿中A型IPG的升高和未改变的P型IPG。作为每毫升尿的浓度和每毫摩尔肌酸酐的单位这些差异都是显著的；P型IPG/A型IPG的比例落入糖尿病组。表3B显示了与糖尿病和对照受试者相关的生物数据。
本结果与Asplin等人[25]的结果相反，他们根据较小的研究报道，NIDDM糖尿病中A型IPG不变而P型IPG减少。这些作者注意到其实验中对P型IPG(pH2.0组分)的剂量反应曲线的非线性(用PDH磷酸酶刺激测定)；在此处报道的研究中未遇到这些问题。在用来测定A型IPG的生物测定系统中也有差异，Asplin等人[25]使用cAMP依赖的蛋白激酶的抑制，而本报道基于在分离的脂肪细胞中A型IPG对脂肪生成的激活。
表3A也包括非妊娠妇女尿中IPG浓度的数据，对照组来自关于正常、先兆子痫和糖尿病的妊娠妇女中尿IPG的个别研究。相对于对照男性受试者，妇女的较高A型IPG值和P型IPG/A型IPG比例的较低值是高度显著的；与两组中P型IPG基本相同相反。这些数据强调研究糖尿病变化中分开估计男性和女性尿IPG的重要性(参见[22],[25],[32]中的报道)。
糖尿病，尤其是NIDDM中[1,4,33-35]根本原因的异质性，导致有关糖尿病受试者数据的复验，以决定是否：
(a)糖尿病受试者中A型IPG和P型IPG之间存在恒定或变化的关系。
(b)在IPG分布图和糖血症对照(HbA1)肥胖程度的标记、和高血压、涉及综合征X的所有重要因素之间能发现相关性。
(c)治疗和IPG分布图之间是否存在相关性。2． 糖尿病受试者中A型IPG和P型IPG之间的关系
考虑到在糖尿病受试者尿A型IPG中发现的非常显著的变化，我们的第一个方法以A型IPG数量的递减顺序检查结果(见图1A)。明显的是系列中A和P型IPG的浓度和比例中都存在主要差异。此外，显示这些介质之间存在粗略的倒数关系，能区分出显示高A型IPG/P型IPG比例或相反地有高P型IPG/A型IPG比例的亚组。系列中存在等级，极端的组被中间组分开。图1B中显示了类似呈现的对照组的可比数据。清楚的是对照组具有较窄的IPG浓度范围，呈现为更均一的样本，没有糖尿病组中可见的高A型IPG或高P型IPG的极端。值得注意的是对照受试者接近于糖尿病分布图中见到的中间组(见图1A)。
通过概述高于在相对均一的对照非糖尿病组中所观察值的A型IPG或P型IPG的值，进一步强调了糖尿病受试者内亚组的差异。显示并框入了那些尿A型IPG或P型IPG含量高于最大对照值的受试者(图2)。定义为高A型IPG组和高P型IPG组的糖尿病亚组，被认为代表了正常值之外应受特殊检查的受试者。3． 糖尿病状况的标记和IPG之间的相关性：3.1 HbA1和糖尿病高A型IPG高P型IPG组之间的关系
表示持续的高血糖水平的高HbA1值可作为第一个近似值，可用作葡萄糖摄取、葡糖异生的肝产生和全身利用的净效应，因此是葡萄糖不耐性的指标、综合征X的特征。
当检查HbA1与A型IPG和P型IPG尿浓度之间的相关性时，HbA1与尿A型IPG之间显示正相关，与P型IPG的负相关相反；这些关系显示于图3A,B中。高A型IPG组与显著升高的HbA1值11.6±0.5(平均值±SEM)相关，而高P型IPG组有较低的HbA1平均值10.0±0.3，两组间的差异是显著的(P＜0.01)(见图2)。由这些结果，建议尿中有高A型IPG的糖尿病患者显示综合征X的一种特征，即葡萄糖不耐性和相关胰岛素耐受性。相反，有高P型IPG值和较低HbA1值的糖尿病受试者可能具有更有效的经丙酮酸脱氢酶参与的氧化途径的葡萄糖处理率和经糖原合成的贮存速率，和/或减少的肝葡萄糖产生，已知所有系统均被IPG-型部分地调节，因此具有更好的血糖调节、对葡萄糖较少的不耐性和平行的较低的HbA1。3.2 糖尿病中肥胖(BMI)与A型IPG和P型IPG之间的关系：
识别出NIDDM的两个主要亚组，即肥胖组和非肥胖组，后者占病例的大约30％[1]。因此，检查是否糖尿病受试者的尿IPG显示与经计算体重指数评估的肥胖程度相关是令人感兴趣的。BMI值高于27的受试者是过重，超过30的受试者为肥胖[36]。
糖尿病受试者中尿P型IPG和BMI之间存在强烈的负相关(P＜0.01)，与A型IPG正相关(图4A,B)。当具有十分相似的BMI值的4或5个个体分组与尿A型IPG和P型IPG浓度一起显示时，尤其是当数据呈现为BMI对P型IPG/A型IPG的比例时，更清楚地看到变化的分布图。图5A,B显示了这些结果。
这些图表的最显著特征是消瘦受试者尿中具有高P型IPG和低A型IPG，而肥胖受试者事实相反。观察到每一IPG的曲线在BMI值大约27处交叉也是显著的，临床医生认为27以上的数字的患者过重，BMI为30或更多的患者被分类为肥胖。
如图5A显示，用胰岛素治疗的9名患者之中的8名，包括IDDM组和接受胰岛素的3名NIDDM患者，落在BMI值为27的阈值以下的正常或消瘦段。大多数BMI值超过27的糖尿病患者接受二甲双胍治疗，用或不用其它药物或饮食；这反映了用双缩脲、二甲双胍对过重或肥胖糖尿病患者的优选的治疗[37,38]。
当与文献[36]的数据对比时，进一步强调了图5A给出的本结果的临床意义，也显示于图5B中。Ferrannini[36]报道的调查将正常和肥胖患者中肌肉的葡萄糖利用率与BMI相比，显示了在27处的非常确实的交叉，这将葡萄糖利用率的降低与肥胖明显相关。联系这两个图(图5A,B)的数据，推测肌肉的葡萄糖利用率与P型IPG对A型IPG的比例相关。这导致一个重要结论，肥胖NIDDM受试者中葡萄糖不耐性的程度直接与IPG分布相关，低P型IPG与肥胖和未很好控制的血糖值都相关。3.3糖尿病中高血压与A型IPG和P型IPG之间的关系：
图6A,B中显示了收缩压对两型IPG浓度的单个值，从中能看到血压最高的受试者具有最低的P型IPG值，而约120的收缩压正常的受试者具有正常范围之内的P型IPG值(图6A)。相反，A型IPG和收缩压之间有正相关(图6B)。两个相关性都是显著的。
因为收缩压与年龄和如本研究显示的尿P型IPG都相关，有必要证明年龄不是P型IPG/血压联系中的混淆因素。简单部分相关的分析证明P型IPG和不依赖于年龄因素的血压之间有显著相关性。D．讨论1．糖尿病人尿中生物活性形式的IPG的水平：
关于男性IDDM和NIDDM患者尿中生物活性形式的肌醇磷酸聚糖代表性的本调查，通过提供P型IPG和A型IPG浓度和比例、和糖血症控制程度、收缩压、肥胖和治疗之间联系的证据，提高了对IPG和临床糖尿病之间关系的认识。也记录了男性和女性非糖尿病对照受试者之间的差异。
临床调查[32,40]已报道在Ⅱ型糖尿病恒河猴[22]和Ⅱ型糖尿病GK大鼠模型[23]中尿手性肌醇排泄和体内胰岛素耐受性间有显著相关性。胰岛素耐受性与肥胖间的联系也已明确确立[36]。因此，显示NIDDM患者中低IPG-P/IPG-A比例与肥胖相关的本观察，完全与A型IPG和肥胖的重要性的概念一致。本数据与已报道的调查[32]间的差异强调了用来测定肌醇磷酸聚糖和病理生理变化之间联系之生物测定系统的使用的重要性。
最近的评述中，Craig等人[32]声明，总体上在一组Ⅱ型糖尿病患者中，糖化血红蛋白浓度和尿手性肌醇浓度之间没有显著相关性。本工作证明了HbA1与尿中A型IPG之间的显著正相关，以及HbA1与P型IPG的负相关(图3A,B)。图2中框入的数据突出了与高IPG-A/IPG-P比例相关的组和如HbA1揭示的低代谢对照。
必须强调，试图将假定的糖尿病状态介质的变化与通过生物测定系统测定尿A型IPG相关联，比通过肌醇排泄数据甚至更重要，因为肌醇是肾中葡糖醛酸循环的产物，此代谢途径已知在实验糖尿病肾脏中被增强，在早期糖尿病中将进一步被肾生长所增强[41]。
如果肥胖、升高的HbA1(值＞11)和低P型IPG和/或低IPG-P/IpG-A比例之间的关系在更广泛的研究中被确定，那么，基于临床护理对患者的常规临床监视，将确立一种用于筛选带有此推定的第二信使系统中的可能缺陷的患者的基础。2． 肌醇磷酸聚糖和综合征X：
糖尿病受试者中尿P型IPG和A型IPG与HbA1之间、肥胖与血压之间显示的相关性，提供了推测NIDDM中肌醇磷酸聚糖和综合征X之间联系的基础(表4)。这种推测开始于这样一个前提，尿IPG的浓度是这些胰岛素介质循环中的水平的指示物，且因此，低尿IPG-P/IPG-A比例或相反地，高IPG-A/IPG-P比例反映于血浆水平，并且显示出器官和组织所处内环境中的变化。
总之，如表5A部分显示，提出从正常受试者和消瘦型糖尿病患者的高P对A比例到肥胖NIDDM患者的低P/A比例的转变是肥胖综合征中的关键因素。B部分显示了基于此推测的胰岛素介质对酶系统的已知效应，低P型IPG对葡萄糖代谢方面的预期效应。其包括：(ⅰ)葡萄糖转化为糖原的减少，(ⅱ)抑制的丙酮酸氧化，和(ⅲ)肝产生的葡萄糖增加和(ⅳ)增多的肝葡萄糖6-磷酸酶。这些变化将共同抑制肌肉处置葡萄糖负载的能力，这是一种主要的紊乱，因为肌肉通常占葡萄糖利用的约70％。这种效应与无法抑制肝葡糖异生和葡萄糖6-磷酸酶一起，有助于提高作为综合征X的主要特征的血糖水平和葡萄糖不耐性。
主要的高A型IPG的平行效应将与低P型IPG的效应混合，如上所述(表5,C部分)。首先，A型IPG刺激脂肪细胞中的脂肪生成，激活乙酰辅酶A羧化酶，于是增强了脂肪合成。其次，通过激素-诱导的脂解的抑制(作为减慢cAMP应答的结果效应)，预期升高的A型IPG将脂肪生成和脂解间的平衡推向脂合成和贮存，引起肥胖和紊乱的脂代谢，这又是综合征X的特征。胰岛素耐受性NIDDM个体的异常脂血症(dyslipidemias)中的辅助因子可归于糖尿病中减少的肾上腺功能[42]，后者是与改变的cAMP调节相关联的效应。
IPG在激活磷酸酶中的作用参与丙酮酸脱氢酶的调节、糖原合成P型IPG，并通过cAMP依赖的蛋白激酶和腺苷酸环化酶的抑制以及低KmcAMP磷酸二酯酶的激活，参与cAMP相关系统的调节，因此经A型IPG对激素-诱导的cAMP积累施加控制影响[10,43,44]，将这些居于新陈代谢调节中心的推测的第二信使或介质置于蛋白质磷酸化/去磷酸化的循环过程中，恒定的循环作为快速激素应答的背景是十分重要的[45]。
显示尿中P型IPG浓度与收缩压之间存在强烈负相关，以及存在显著但较少标明的与A型IPG的正相关(图6A,B)的本观察，根据高血压作为综合征X的一个因素的重要性[5,6]，和大约40％的NIDDM个体有高血压并有增多的心血管疾病的危险的事实[46]需要更详细的思考。
出现了关于IPG与影响血压的系统直接或间接地相关的方式的问题。最近评论了与血压调节相关的两个主要系统中NIDDM的紊乱，这是交感神经肾上腺系统的作用[42]，和内皮-衍生的一氧化氮系统(EDNO)的潜在作用[47]。由内皮细胞NO产生中P型IPG的参与是特别有吸引力的假说。
Baron[47]提供了EDNO系统与胰岛素作用有联系的证据，这是根据以下观察：
(a)胰岛素产生骨骼肌中特异增长的血流。
(b)肌肉摄取葡萄糖的胰岛素刺激与血管舒张增加相关联。
(c)胰岛素介导的血管舒张通过NO释放发生，NO的释放通过使用NO合成酶活性的抑制剂所指示。
(d)胰岛素对乙酰甲胆碱(一种引起EDNO合成和释放的乙酰胆碱-型化合物)的剂量应答曲线的作用，向左侧偏移，这与胰岛素调节EDNO的合成/释放一致。证据提示胰岛素引起胰岛素敏感个体，但不是胰岛素耐受性受试者中的EDNO产生增加，导致内皮是胰岛素靶组织的建议[47]。
(e)因此，肥胖症中的胰岛素耐受性可在由内皮细胞释放NO的水平上，导致胰岛素存在时减弱的血管舒张。这种减弱随后将导致相关的胰岛素-介导的葡萄糖摄取率的减少，并增强加压的敏感性[47]。这种假说将把综合征X的主要方面与普遍存在的一氧化氮信号传导系统联系起来[48]。
Baron[47]推测的顺序中P型IPG所起作用的问题有待解决，尽管P型IPG作为推测的胰岛素第二信使的作用与本数据一起，强烈提示IPG是此完整系统的一部分。锰与P型IPG的结合在本文中是令人感兴趣的，不仅因为鸟苷酸环化酶系统对锰的需要(这与NO起始的平滑肌弛缓信号中cGMP的产生相关联)，而且因为锰和NO间形成的加合物[49]，也许特别参照蛋白磷酸酶-1的调节[50]提示P型IPG在转运和/或螯合此细胞信号传导分子中的可能的作用。
本数据连同病理生理状态中内皮细胞功能重要性的新概念，使人们的注意力集中于IPG作为综合征X病原学的中心因子的可能意义。3． 胰岛素和IPG在NIDDM治疗中的用途：
糖尿病患者的治疗是持续讨论的课题，也许对于NIDDM患者最为受到关注；已进行许多预期研究以评估最好的治疗方案[见38]。就通过注射胰岛素治疗而言，批评包括以下事实，这种施用方法引起高外周胰岛素水平，可能引起脂代谢中的异常和血管并发症，向门脉循环释放和向肝送递的生理途径是旁路的[51]。Kubot等人[52]的最近研究提供证据证明在门脉负载的葡萄糖处置上的门脉胰岛素送递比外周送递占优势，这个问题是某些争论的主题[见52]。IPG的口服施用将具有门脉送递的潜在优点，因此接近推测的胰岛素作用介质和摄入的葡萄糖负载的处置之间更正常的生理关系。
其次，当施用相对高水平的胰岛素以达到可接受的血糖控制水平时，如在严重胰岛素耐受性中，存在胰岛素与IGF-Ⅰ受体的交叉反应性引起的组织不适当刺激的危险[53]。微黑棘皮症的皮肤病变的出现和卵巢细胞膜增生与雄激素过多症据报道与胰岛素耐受性相关联；卵巢细胞具有能传导类固醇生成增加信号的胰岛素和IGF-Ⅰ受体[53]。O′Rahilly和Moller[53]报道，尽管胰岛素受体突变在典型NIDDM患者中不常见，但治疗有与这些突变相关的严重胰岛素耐受性的个体存在实际问题，他们引用了IGF-Ⅰ用作某些病例治疗的用途。
几十年来，一个家族的药物磺酰脲已是治疗NIDDM的主要治疗剂；并且，在美国当双缩胍、苯乙基二胍从市场中退出时[54]，磺酰脲是仅有的用于NIDDM治疗的一种化合物，尽管最近食品与药品管理局批准双缩胍、二甲双胍在美国应用[55]。普遍认为NIDDM的代谢紊乱是胰岛素耐受性和减弱的胰岛素分泌之间相互作用的结果[55,56]。有证据表明磺酰脲在引起胰脏释放胰岛素速率的急性刺激，和增加的葡萄糖摄取和胰外组织的利用中起作用，并有关于在动物和人中磺酰脲增强肌肉和脂肪组织中基础及胰岛素-刺激的葡萄糖输送和代谢的证据(见Muller等人[57])。观察到磺酰脲药物glimpiride刺激糖基磷脂酰肌醇锚定的血浆-膜蛋白质从3T3脂肪细胞释放，在本文中尤其令人感兴趣，因为这种有效的胰岛素-模拟药物显示具有与推测的肌醇磷酸聚糖的胰岛素第二信使系统的共同特征[9-12,58]。然而，重要的是注意到glimpiride末曾显示诱导游离GPI(IPG的前体)的裂解。
关于从细胞膜释放肌醇磷酸聚糖前体中胰岛素和磺酰脲之间作用的可能共同位点的证据，在某些测定中，增强了肌醇磷酸聚糖对NIDDM治疗具有潜在治疗用途的观点。本发明的重要性，在于建议用IPG自身对糖尿病治疗作为使用药物释放IPG前体的替代，也许被最近评论中的叙述指出，“带有明显NIDDM患者对许多胰岛素促分泌素的应答减少，包括葡萄糖和非葡萄糖刺激物，如磺酰脲、精氨酸和亮氨酸。用磺酰脲治疗的患者有高的主要和次要的失败率”[56]。因此，基于此研究，肌醇磷酸聚糖和/或其前体，可通过血糖标准化在用磺酰脲治疗不能充分应答的患者中更有效。
双缩胍、二甲双胍是用于治疗NIDDM、胰岛素耐受性和肥胖糖尿病患者的广泛选用的治疗方法[37]。尽管此药物减少空腹葡萄糖水平并减少肝葡萄糖产生[37,55]，对使P型IPG排泄的模式恢复至正常是明确无效的，本调查中此标记仍显著低于对照值(图5A,B)。二甲双胍使P型IPG恢复至正常值的明显无效，可承受用此类化合物发现的乳酸中毒，这在现已退出的双缩胍、苯乙基二胍是最明显可见的。尽管当将二甲双胍给予没有肝或肾疾病的所选患者时，乳酸中毒是相对次要的问题，但它仍被认为是某些个体中潜在危险的因素[37,55]。根据本工作，建议不适当的低P型IPG可与PDH磷酸酶活性的减少和活化PDH活化的非活性形式中的有关改变相关，导致糖酵解途径中产生的丙酮酸向乳酸的转变。
根据常规治疗的当前问题(其中一些已列出)，出现了关于考虑IPG或前体或化合物的拮抗物作为糖尿病治疗辅助剂的应用的情况。应用IPG的积极方面是分子量小且热、酸稳定性；因此，这些化合物将适于口服，通过肝门脉循环向肝的送递可避免某些与外周组织胰岛素过载相关的问题[51,52]。
可能P型IPG和A型IPG之间存在精细平衡，初步数据提示在对激素刺激物的应答中这是组织特异的[13]。这些第二信使的结构和功能的认识，提供了对糖尿病理解和治疗的新途径。表1．肌醇磷酸聚糖的一些性质
P型IPG A型IPG化学成分
多醇 环多醇
糖类 糖类
磷酸 磷酸
金属(Mn2+/Zn2+) 金属(金属(Zn2+)分离AG1-X8 pH2.0 pH1.3生物活性激活： 丙酮酸DH P′酶 脂肪生成
糖原合成酶 乙酰辅酶A羧化酶
低-Km cAMP
磷酸二酯酶抑制： cAMP-PK cAMP-PK
G6P磷酸酶 腺苷酸环化酶代谢效应 通过氧化(PDH)和糖原 脂质增加
合成(肌肉使用的70％
的葡萄糖负载)肌肉对 较低的cAMP-儿茶酚胺对例
葡萄糖利用的增加 如脂解的中和作用
↓
共同促进了由磷酸化-去磷酸化循环调节的酶的去磷酸化表2报道的NIDDM受试者尿中游离手性肌醇和肌醇的变化(由衍生产物的GC/MS评估)手性肌醇 NIDDM受试者尿中减少 正常89： NIDDM1.8μmol/天[22] 正常96： NIDDM32μmol/天[23] NIDDM受试者尿中升高 正常2.1： NIDDM12μmol/天[26]肌醇 NIDDM受试者尿中升高 正常176： NIDDM444μmol/天[22] 正常86： NIDDM825μmol/天[26]报道的NIDDM受试者尿中P型IPG和A型IPG的介质活性的变化(由生物测定-PDH P′酶、cAMP PK评估)P型IPG(含手性肌醇) NIDDM受试者尿中减少[25]A型IPG(含肌醇) NIDDM受试者尿中不变[25](注意：仅有9名对照和4名NIDDM受试者，测定非线性)[22]Kennington等人．1990；[23] Suzuki等人．1994；[25]Asplin等人．1993；[26]Ostlund等人．1993。表3a．正常和糖尿病(IDDM和NIDPM)男性受试者尿中A型IPG和P型IPG的含量组 A型IPG P型IPG P型IPG/ A型IPG P型IPG 肌酸酐 (由10ml尿的刺激百分数) A型IPG (单位/mmol 肌酸酐) (mmol/L) 在糖尿病和对照男性受试者组中尿A型IPG和P型IPG表示为平均值±SEM对照(27) 29.2±3.7 89.3±8.3 3.06 7.86±1.56 21.6±2.54 9.96±0.93糖尿病(30) 67.5±11.1 98.6±12.1 1.46 24.7±4.8 31.1±4.5 7.37±0.56Fisher′sp ＜0.01 NS ＜0.01 NS ＜0.05表示为中值和范围对照(25) 25(71-5) 82(172-7) 4.2(15.8-0.2) 4.88(33.2-1.0) 16.8(62.1-8.3) 8.5(20.8-3.2)糖尿病(30) 48(265-2) 81(308-30) 1.3(18-0.2) 13.5(107-3.1) 25.2(139-6.6) 6.6(11.75-2.8)Mann-Whitney检验 NS ＜0.001 NS ＜0.05 非糖尿病女性受试者组中尿A型IPG和P型IPG表示为均值±SEM对照女性 997.8±11.8 68.2±12.3 0.70 32.7±6.02 18.8±1.96 7.11±0.8110)Fisher′sP ＜0.001 NS ＜0.001 NS ＜0.05男性对女性表3b．生物数据-对照和糖尿病受试者 对照(非糖尿病) 糖尿病(IDDM和NIDDM)受试者数 27 30年龄(岁) 51.5±14.6(29-69) 59.7±12.2(28-82)体重指数 24.7±2.4(22.3-30.8) 28.0±3.9(21.9-38.5)肌酸酐(mmol/L) 9.85±4.6(3.24-20.8) 7.19±3.0(2.84-15.6)HbA1 未测(正常范围5-8) 10.8±1.6(8.5-14.7)收缩压 未测 139±15(111-172)舒张压 未测 80±9(57-97)种族来源 25/2 19/11高加索人/亚洲人治疗单独胰岛素 - 6胰岛素±另一种 - 3二甲双胍±另一种 - 11磺酰脲±另一种 - 10值以平均值±SD及括号内显示的范围的形式给出。表4．胰岛素耐受性和肥胖“联系肥胖和胰岛素耐受性的机理还不知道”[Walker．肥胖、胰岛素耐受性和其与NIDDM的联系。1995]至少30％的NIDDM患者是肥胖的(体重指数BMI＞30)并且有增多的危险或心血管疾病。“综合征X”危险因素组：胰岛素耐受性葡萄糖不耐性高循环胰岛素紊乱的脂代谢高血压[Reavan．人疾病中胰岛素耐受性的作用。1988；Walker,1995]表5．A．肥胖NIDDM受试者的特性及P型IPG和A型IPG的变化肥胖 低P 高A升高的HbA1 低P 高A(肥胖+升高的HbA1表示葡萄糖不耐性)高血压 低P 高AB．低P型IPG对新陈代谢途径的作用葡萄糖糖原 降低丙酮酸氧化 降低 葡萄糖不耐性肝葡萄糖产生 升高C．高A型IPG对新陈代谢途径的作用脂肪生成 升高乙酰辅酶A羧化酶 升高 脂肪增加升高的cAMP 降低 合成和脂解 降低 贮存参考文献：
1．Bennett,P.H.,Bogardus,C.,Tuomilehto,L．和Zimmet,P.1992.NIDDM的流行病学和自然史：非肥胖和肥胖。在：《糖尿病的国际教科书》(International Textbook of Diabetes mellitus.)Alberti,K.G.M.M.,DeFronzo,R.A.,Keen,H．和Zimmet,P．编，147-169页，John Wiley &Sons Ltd.
2．HimsWorth,H.P.1936．糖尿病：胰岛素-敏感和胰岛素-不敏感型的鉴别。柳叶刀(Lancet I.)127-130.
3．DeFronzo,R.A.1988．三个一组：β细胞、肌肉、肝：负责NIDDM的共同作用。糖尿病(Diabetes)37:667-687.
4．DeFronzo,R.A.,Bonadonna,R.C．和Ferrannini,E.1992 NIDDM的病理。平衡综述。糖尿病护理(Diabetes care),15:318-368．
5．Reaven,G.M.1988．减肥讲座。人疾病中胰岛素耐受性的作用。糖尿病，37:1595-1607.
6．Reaven,G.M.1995．人疾病中胰岛素耐受性的病理生理学。生理评述(Physiol.Rev.)75:473-486.
7．Walker,M.1995．肥胖、胰岛素耐受性和与非胰岛素依赖的糖尿病的联系。代谢(Metabolism),44(Suppl.3):18-20.
8．Williams,B.1994．胰岛素耐受性：未来事物的形式。柳叶刀，344:521-524.
9．Larner,J.,Huang,L.C.,Tang,G.,Susuki,S.,Schwartz,C.F.W.,Romero,G.,Roulidis,Z.,Zeller,K.,Shen,T.W.,Oswald,A.S.，和Lutterell,L.1988．胰岛素介质：结构和生成。Cold Spring HarbourSymp.53:965-971.
10．Romero,G．和Larner,J.1993．胰岛素介质和胰岛素作用机理。药学进展(Adv.Pharm.)24:21-50.
11．Romero,G.1991．肌醇聚糖和细胞信号传导。细胞生物学国际报告(Cell International Reports.)15:827-852.
12．Rademacher,T.W.,Caro,H.,Kunjara,S.,Wang,D.Y.,Greenbaum,A.L.和McLean,P.1994．肌醇磷酸聚糖第二信使。巴西医学生物学杂志(Brazilian J.Med.Biol.)27:327-341.
13．Kunjara,S.,Caro,H.N.,McLean,P．和Rademacher,T.W.1995．肌醇磷酸聚糖的组织特异的释放。在：Svasti,J．等人(编)《生物聚合物和生物产物：结构、功能和应用》(Biopolymers and bioproducts:Structure,function and applications)曼谷，泰国Samakkhisan(Dokya).PublicCo.Ltd.301-306.
14．Romero,G.,Gamez,G.,Huang,L.C.,Lilley,K．和Lutterell,L.1990．在完整BC3H1细胞中抗肌醇聚糖抗体选择性阻断胰岛素的某些作用。美国国家科学院学报(Proc.NatlAcad.Sci.USA.)87:1476-1480.
15．Varese,R.V.,Standaert,M.C.,Yamada,K.,Huang,C.,Zhang,C.,Cooper,D.R.,Wang,Z.,Yang,Y.,Susuki,S.,Toyota,T．和Larner,J.1994含手性肌醇的胰岛素介质对甘油3-磷酸酰基转移酶的胰岛素-诱导的激活，在胰岛素耐受性、Ⅱ型糖尿病Goto Kakizaki鼠的脂肪细胞中缺陷。美国国家科学院学报91:11040-11044.
16．Lazar,D.F.,Knez,J.J.,Medoff,M.E.,Cuatracasa,P．和Saltiel,A.P.1994．在人红白血病细胞中胰岛素对糖原合成的刺激需要糖基磷脂酰肌醇的合成。美国国家科学院学报。91:9665-9669.
17．Misek,D.E．和SaltielA.R.1994．布氏锥虫糖基磷脂酰肌醇衍生的肌醇磷酸聚糖促进鼠附睾脂肪细胞中的蛋白质去磷酸化。内分泌学(Endocrinology),135:1869-1876.
18．Sanchez-Arias,J.A.,Samper,B.,Mato,J.M．和Feliu,J.E.1992．链脲菌素-诱导的糖尿病对分离的鼠肝细胞中糖基磷脂酰肌醇-依赖的胰岛素信号系统的损害。内分泌学，131:1727-1733.
19．Viilar-Palasi,C．和Farese,R.V.1994.Goto-Kakizaki(G/K)鼠中损害的胰岛素对骨骼肌糖原合成酶的激活。糖尿病学(Diabetologia),37:885-888.
20．Ortmeyer,H.K.,Huang,L.C.,zhang,L.,Hansen,B.C．和Larner,J.1993．手性肌醇缺陷和胰岛素耐受性。Ⅱ．D-手性肌醇施用在给予葡萄糖负载的链脲菌素-糖尿病鼠、和自发胰岛素耐受性恒河猴中的急性效果。内分泌学,132:646-651.
21．Huang,L.C.,Fonteles,M.C.,Houston,D.B.,Hang,C.，和Larner,J.1993．手性肌醇缺陷和胰岛素耐受性。Ⅲ．正常和链脲菌素-糖尿病鼠体内两种肌醇磷酸聚糖胰岛素介质的急性生糖原和低血糖效应。内分泌学，132:652-657.
22．Kennington,A.S.,Hill,C.H.,Craig,J.,Bogardus,C.,Raz,I.,Ortmeyer,H.K.,Hansen,B.C.,Romero,G．和Larner,J.1990．非胰岛素依赖糖尿病中的低尿手性肌醇排泄。新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)323:373-378.
23．Suzuki,S.,Tanada,Y.,Hirai,S.,Abe,S.,Sosaki,A.,Suzuki,K.,Toyata,T.1991．在：《肥胖和糖尿病研究和临床工作中的新方向》(NewDirections in Research and Clinical Works for Obesity and Diabetesmellitus.)Angei,A.,Hotta,N．编，197-203页。Elsevier.
24．Ortmeyer,H.K.,Bodkin,N.L.,Lilley,K.,Larner,J．和Hanson,B.C.1993．自发糖尿病恒河猴中的手性肌醇缺陷和胰岛素耐受性。内分泌学，132:640-645.
25．Asplin,I.,Galasko,G．和Larner,J.1993．手性肌醇缺陷和胰岛素耐受性：从尿中分离的含手性肌醇和肌醇的胰岛素介质、血液透析液、与对照和Ⅱ型糖尿病受试者肌肉的比较。美国国家科学院学报90:5924-5928.
26．Ostlund,R.E.,McGill,J.B.,Herskowitz,I.,Kipnis,D.M.,Santiago,J.V．和Sherman,W.R.1993．糖尿病中的D-手性肌醇代谢。美国国家科学院学报90:9988-9992.
27．Prochazka,M.,Mochizuki,H.,Baier,L.J.,Cohen,P.T.W.，和Bogardus,C.1995.1型蛋白磷酸酶催化的b亚单位基因的分子和键分析：对于在Pima印度人胰岛素耐受性中主要作用的证据的缺乏。糖尿病学，38:461-466.
28．Lilley,K.,Zhang,C.L.,Villar-Palasi,C.,Larner,J．和Huang,L.1992．胰岛素介质对丙酮酸脱氢酶磷酸酶的刺激。生物化学生理(Arch.Biochem.Biophys.)296:170-174.
29．Larner,J.,Huang,L.C.,Suzuki,S.Tang,E.,Zhang,C.,Schwartz,C.F.W.,Romero,G.,Luttrell,L．和Kennington,A.S.1989．胰岛素介质和丙酮酸脱氢酶复合物的控制。纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)573:297-305.
30．Rodbell,M.1964．分离的脂肪细胞的代谢。生物化学杂志(J.Biol.Chem.)239:375-380.
31．Newman,J.D.,Armstrong,J.,McD．和Bornstein,J.1985．用可溶丙酮酸脱氢酶磷酸酶对胰岛素介质活性的测定。内分泌学，116:1912-1919.
32．Craig,J.W.,Larner,J．和Asplin,C.M.1994．手肌醇缺陷和胰岛素耐受性。在：《糖尿病的分子生物学》，第二部分，Draznin,B．和LeRoith,D.编，Humana Press Inc.Totowa.NJ.
33．Serrano,J.,Mateo,C.M.和Caro,J.F.1992．胰岛素耐受性：细胞和分子机理。在：《内分泌学和新陈代谢的最新进展》第4卷，167-183页。
34．Moller,D.E.和Flier,J.S.1991．胰岛素耐受性-机理、综合征和意义，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)325:938-948.
35．Krentz,A.J.和Nattrass,M.1996．胰岛素耐受性：多层面的新陈代谢综合征。使用低剂量胰岛素输入技术获得的理解。糖尿病药物(DiabeticMedicine),13:30-39.
36．Ferrannini,E.1995．肥胖症的生理和新陈代谢后果。代谢(Metabolism),44:(suppl.3)15-17.
37．Defronzo,R.A.和Goodman,A.N．和多中心二甲双胍研究组1995.二甲双胍在非胰岛素依赖糖尿病患者中的效能。新英格兰医学杂志，333:541-549.
38．英国预期糖尿病研究(UKPDS).13：随机分配饮食、磺酰脲、胰岛素或二甲双胍在随访三年的新诊断的糖尿病患者中的相对效能。1995.B,M.J.310:(6972):83-88.
39．Snedecor,G.W.1964．统计方法。第五版。Iowa State UniversityPress,Ames Iowa，美国。
40．Suzuki,S.,Kawasaki,H.,Satoh,Y.,Ohtomo,M.,Hirai,M.,Hirai,A.,Hirai,S.,Onoda,M.,Matsumoto,M.,Hirokio,Y.,Akai,H.,Craig,J.,Larner,J．和Toyota,T.1994．尿手性肌醇排泄是日本Ⅱ型糖尿病中胰岛素敏感性的指数标记。糖尿病护理(Diabetes Care.)
41．Sochor,M.,Baquer,N.Z．和McLean,P.1985．糖尿病中的葡萄糖过-和低-利用。鼠肾和肝中葡萄糖代谢的酶活性变化的比较研究。分子生理学(Molecular Physiol.)2:51-68.
42．Reaven,G.M.,Lithel,H.和Landsberg,L.1996．高血压和相关代谢异常-胰岛素耐受性和交感神经肾上腺系统的作用。新英格兰医学杂志，334:374-381.
43．Machicao,F.,Mushaek,J.,Seffer,E.,Ermel,B．和Haring,H.U.1990：甘露糖、葡糖胺和肌醇单磷酸抑制胰岛素对脂肪生成的作用。肌醇寡糖在胰岛素作用中作用的进一步证据。生物化学杂志(Biochem.J.)266:909-916.
44．Martiny,L.,Antonicelli,F.,Thuillez,B.,Lambert,B.,Jacquemin,C．和Haye,B.1990．促甲状腺素对甲状腺细胞产生肌醇磷酸聚糖的控制。细胞信号传导(Cell Signalling)2:21-27.
45．Brautigan,D.L1994蛋白磷酸酶。激素研究最新进展(Recent Prog.Hormone Res.)49:197-214.
46．Panzram,G.,1987.2型(非胰岛素依赖的)糖尿病的死亡率和存活率。糖尿病学，30:123-131.
47．Baron,A.D.1996．葡萄糖代谢和人骨骼肌中灌流的偶联。内皮衍生的一氧化氮的潜在作用。糖尿病，45(suppl.1):S105-S109.
48．Moncada,S.和Higgs,A.1993．疾病的机理：L-精氨酸一氧化氮途径。新英格兰医学杂志，329:2002-2012.
49．Cotten,FA.和Wilkinson,G.1972．高级无机化学。第三版，Interscience publishers.New York,London.
50．Cohen,P.1989．蛋白磷酸酶的结构和调节。生物化学评论年报(Annu.Rev.Biochem.)58:453-508.
51．Alberti,K.G.M.M.和Press,C.M.1982．糖尿病并发症的生物化学。231-270页。Keen,H.和Jarret,J．编，J.Publishers Edware ArnoldLtd,London.
52．Kubota,M.,Yamasaki,Y.,Sekiya,M.,Kubota,M.,Morishima,T.,Kishimoto,R.,Shichiri,M．和Kamada,T.1996．在门脉送递的葡萄糖的处理中，门脉胰岛素送递优于外周送递。代谢，45:150-154.
53．O′Rahilly,S.和Moller,D.E.1992．胰岛素耐受性综合征中的突变胰岛素受体。临床内分泌学(Clinical Endocrinology),36:121-132.
54．Williams,R.H．和Palmer,J.P.1975．告别治疗糖尿病的苯乙基二胍。国际医学年报(Ann.Intern.Med),83:567-568.
55．Sturnvoll,M.,Nurjhan,N.,Perriello,G.,Dailey,G．和Gerich,J.E.1995．二甲双胍在非胰岛素依赖糖尿病中的代谢作用。新英格兰医学杂志，333:550-554.
56．Polansky,K.S.,Sturis,J．和Bell,G.I.1996．非胰岛素依赖糖尿病-(细胞补偿胰岛素耐受性的遗传程序失败。新英格兰医学杂志，334:777-783.
57．Muller,G.,Dearey,E.A.和Punter,J.1993．磺酰脲药物，glimepiride，刺激糖基磷脂酰肌醇锚定的血浆-膜蛋白质从3T3脂肪细胞中的释放。生物化学杂志，289:509-521.
58．Romero,G.,Lutterll,A.,Rogol,A.,Zeller,K.,Hewlett,E．和Larner,J.1988．膜蛋白质的磷脂酰肌醇聚糖锚；胰岛素介质的潜在前体。科学(Science)(Wash.DC)240:509-512.