一种利用废菌丝体提取麦角固醇的方法 本发明涉及一种利用废菌丝体提取麦角固醇的方法。
麦角固醇是一种重要的医药化工原料，如用于制备“可的松”、“激素黄体酮”等，最大的用途是生产维生素D2，麦角固醇经紫外线光照可转化为维生素D2。
麦角固醇存在于许多微生物中如酵母、霉菌中。目前麦角固醇工业化生产主要采用发酵法，发酵菌株主要为酵母、曲霉菌等，如国外Guan(GuanJ et al,Pesticide Biochemistry and Physiology,1992,42:262-270)及国内张博润(《微生物通报》，1993,2(6):335-338)等都采用酵母发酵生产麦角固醇。酵母发酵后收集酵母，经皂化、萃取、结晶等工艺得到麦角固醇晶体。用酵母发酵法生产麦角固醇的主要缺点是生产设备投资高，生产成本高产品纯度低。如我国目前麦角固醇的生产成本高达2500元/公斤，纯度仅为75％。因此我国用于维生素D2生产的麦角固醇主要依靠进口。
我国每年柠檬酸发酵工业产生废菌丝体高达40万吨，青霉素废菌丝体5万吨，目前主要是作为废物抛弃。既造成环境污染，又造成资源的浪费。
本发明的目的是利用上述青霉素、柠檬酸和乳酸发酵后的废菌丝体提供一种工艺简单、低成本、易于工业化的提取麦角固醇的方法。
本发明的要点如下：
本发明为一种利用青霉素、柠檬酸和乳酸发酵后废菌丝体提取麦角固醇的方法，依次包括以下步骤：
(1)细胞破碎：其目的是使细胞破碎，以除去细胞胞内的杂质，如核酸、蛋白质，有利于麦角固醇的提取，从而提高产品的纯度。可以采用碱或酸处理，破碎细胞壁。具体步骤为：将青霉素发酵地青霉菌、柠檬酸发酵的黑曲霉菌或乳酸发酵的根霉菌菌丝体与稀碱溶液或酸溶液混和，所用的稀碱溶液没有特别要求，可以是氨水、氢氧化钠或氢氧化钾稀溶液；所用的酸溶液可以是盐酸、硫酸等。酸或碱的重量百分浓度最好在1-10％，加入量使碱或酸与菌丝体的重量比为：0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，搅拌10分钟-4小时，收集菌丝体，可采用离心或过滤的方法收集菌丝体。
(2)皂化：该步骤的主要目的是除去菌丝体中的脂肪酸。将步骤(1)中收集的菌丝体与碱-醇溶液混和，在50-100℃下，搅拌30分钟-4小时，反应最好在回流或密闭条件下进行，以减少醇的损失。所用的碱-醇溶液由重量百分浓度为10-50％的碱溶液与醇混和制得，醇与碱溶液的体积比为0.5∶1-2∶1，采用的碱没有特别要求，采用的醇为C1-C6的醇，如甲醇、乙醇和丙醇等。
(3)麦角固醇萃取：将步骤(2)反应后的溶液与有机溶剂萃取剂混和，所用的有机溶剂为C1-C20的烷烃、烯烃、炔烃、芳香烃或上述烃的混合物，最好用C4-C10的烷烃，萃取剂与溶液体积比为0.5∶1-10∶1，搅拌萃取，萃取温度20-60℃，萃取时间为30分钟-4小时。收集有机溶剂相，可采用静置分层或离心萃取器收集。为提高收率，本萃取可进行2-3次。
(4)结晶干燥：将步骤(3)收集到的有机相蒸发浓缩，浓缩可采用真空浓缩或常压浓缩，浓缩比(初始液与浓缩液体积之比)为2-10。将浓缩液冷却结晶，结晶温度在-10℃-10℃，结晶时间为2-20小时，过滤收集晶体，干燥后可得到麦角固醇产品，干燥最好采用真空干燥。为提高纯度，干燥前的结晶过程可重复1-2次。
本发明以青霉素、柠檬酸和乳酸发酵后废菌丝体为原料提取麦角固醇的方法工艺简单、成本低、易于工业化。得到的麦角固醇纯度可与国外进口产品媲美，且原料充裕易得，若将我国每年柠檬酸发酵工业产生的40万吨废菌丝体、5万吨青霉素废菌丝体用于提取麦角固醇，可得到麦角固醇100吨以上。纯度可达90％以上，生产成本1500元/公斤。本发明的方法不仅工艺简单，产品质量稳定，纯度高，大大地降低了成本。更主要的是与此同时可以变废为宝，减少环境污染和资源浪费。
采用本发明废菌丝体提取的麦角固醇与酵母发酵麦角固醇产品质量与成本比较如下： 麦角固醇 酵母发酵 菌丝体提取得率(重量％) 1％ 0.3-0.7％纯度(重量％)78％(国内)，90％(国外SIGMA公司) 92％光转化维生素D2转化率(重量％) 72 78成本(元/公斤) 2500 1500
下面结合实施例对本发明的方法做进一步描述(以下实施例中所提到的溶液浓度均为重量百分浓度)：
实施例1：青霉素发酵菌丝体1公斤，加12升1％氢氧化钠溶液，在70℃下搅拌30分钟，离心除去上清液，在菌丝体中加入6倍体积的乙醇-氢氧化钠溶液(醇-碱溶液制备所用氢氧化钠溶液的重量百分浓度为20％，乙醇和氢氧化钠溶液体积比为2∶1)，在70℃下皂化3小时后，加入2倍体积的正己烷，在室温下萃取2小时，静置分层，取有机相，浓缩4倍，冷却到0℃结晶5小时，过滤收集麦角固醇晶体，得到4克麦角固醇，采用高效液相色谱HPLC分析产品的纯度为90％。
实施例2：柠檬酸发酵菌丝体10克，加入100ml1％氢氧化钾溶液，在60℃下搅拌3小时，离心除去上清液，加入4倍体积的甲醇-氢氧化钾溶液(醇-碱溶液制备所用氢氧化钾浓度为30％，甲醇和氢氧化钾溶液体积比3∶1)，在90℃下皂化2小时，加入2倍体积正庚烷，在40℃搅拌萃取2小时，离心收集有机相，浓缩6倍，冷却到-10℃结晶3小时，离心收集晶体，得到300毫克麦角固醇，纯度为82％。
实施例3:1公斤乳酸发酵菌丝体，加入12升1％氢氧化钠溶液在100℃下搅拌3小时，离心除去上清液。在菌丝体中加入5倍体积的乙醇-氢氧化钠溶液(醇-碱溶液制备所用氢氧化钠的重量百分浓度为25％，乙醇和氢氧化钠溶液体积比为1∶1)，在80℃下，皂化2小时后在菌丝体中加入10倍体积的石油醚(所用的石油醚沸程为60-90℃)，分3次萃取，每次加入3-4倍体积的石油醚，在40℃萃取4小时，静置2小时，收集石油醚相。浓缩6倍后，冷却到4℃结晶5小时，过滤得到麦角固醇，纯度达82％。通过重结晶麦角固醇纯度可达94％。
实施例4：青霉素发酵新鲜菌丝体1公斤，加10升4％盐酸溶液，在70℃下搅拌60分钟，离心除去上清液，用氢氧化钠溶液洗涤菌丝体至滤液pH为7.0-9.0，在菌丝体中加入6倍体积乙醇-氢氧化钠溶液(醇-碱溶液制备所用氢氧化钠浓度为20％，乙醇和氢氧化钠溶液体积比为1.5∶1)，在70℃下皂化3小时，加入2倍于溶液体积的正戊烷和正庚烷的混合物，在室温下萃取2小时，静置分层，取有机相，浓缩4倍，冷却到0℃结晶5小时，过滤收集麦角固醇晶体，得到5克麦角固醇，纯度90％。
实施例5：青霉素发酵菌丝体10公斤，加入100升10％氢氧化钠溶液，在70℃下搅拌100分钟，在破碎液中加入100升乙醇-氢氧化钠溶液(醇-碱溶液制备所用氢氧化钠浓度为20％，乙醇和氢氧化钠溶液体积比为2∶1)，在80℃下皂化3小时后，加入200升正己烷，在室温下萃取2小时，静置分层，取有机相，用200升正己烷再次萃取溶液相，合并两次正己烷萃取液，浓缩到25升，冷却到-5℃结晶3小时，过滤收集麦角固醇晶体，得到65克麦角固醇，纯度75％。将65克麦角固醇溶解在10升正己烷中，过滤后将溶液冷却结晶，-5℃结晶3小时，可得到56克麦角固醇晶体，纯度为95％。