用于生产生长抑素亚单位疫苗的基因工程体 本发明用于生产生长抑素亚单位疫苗的基因工程体，属于生物技术高科技研究领域，专用于生产生长抑素亚单位疫苗的基因工程。
动物生长除受遗传因素、饲料和环境条件等因素外，同时受一系列生长轴激素的调控。其中生长激素(GH)起着核心的作用。而GH又受生长激素释放因子(GRF)和生长抑素(SS)的双向调控；前者促进释放，后者抑制释放。早在80年代初期，Spencer等(1981、1986)、Lawrence等(1996)用SS偶联于蛋白质载体上，做成SS合成肽疫苗，用以免疫羊、牛、猪等，取得5～10％的增重效果。但他们用的都是合成肽疫苗，成本颇高，难以推广应用。
南京农业大学杜念兴教授自1986年开始主持农业部重点课题“生长抑素因素工程疫苗研究”，先后由曾义祥等(1989)、莫晓群等(1991)完成由大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达的二种SS基因工程疫苗，但由于表达水平太低，而未能开发应用。徐文忠等(1992)进一步将SS基因，连接于乙肝表面抗原(HbsAg)上，在痘苗病毒中表达，用以制备SS基因工程活载体疫苗，其表达产物SS/HBsAg融合蛋白，能组装成大小20nm左右的病毒样颗，具有良好的免疫原性。现已由国家科委生物工程开发中心立项，由南京农业大学与农业部兽医成都药械厂合作进行中试。该疫苗简称激生1号疫苗，至1999年2月止已试生产激生1号鸡胚冻干疫苗11批，发出进行田试验的11000头剂。经返回信息：猪2213头、羊2096头、牛55头。结果表明，该疫苗给猪、羊、牛免疫均十分安全，未见有不良反应。个别猪场进行屠宰测定，证明免疫猪肉质优良，各种组份与对照猪无差异。猪免疫1次可持续增重2～3个月，增重自5～20％不等，平均在10％以上。
所有在猪和羊的试验中均反映以免疫后第2个月增重最快。第3个月已有下降趋势。因此提出在初免后，2个月时应加强免疫。
激生1号疫苗是一种以痘苗病毒为载体的活苗，不适于作加强免疫之用。
本发明地目的是构建能高效表达SS融合蛋白的基因工程菌，用以生产能促进家畜生长的SS基因工程亚单位疫苗(新的激生系列疫苗)。这一新的激生疫苗优于目前正在中试的激生1号疫苗之处在于：1)由大肠杆菌表达，适于大规模机械化生产，成本低廉；2)可用于多次加强免疫，以进一步提高免疫效果；适用于生长期较长的肉牛或乳牛、乳羊以提高乳产量；3)除适用于各种家畜外，还适用于各种家禽，给蛋禽免疫可增加蛋产量。
本发明所提供的用于生产生长抑素亚单位疫苗的基因工程体，是通过以下实施方案获得的：
先合成两端含有Kph I(K)和Pst I(P)酶切位点的SS基因，将其插入pThioHis A质粒的相应位点，构建成SS-K/P质粒，转化感受态大肠杆菌后，获得能表达SS-K/P融合蛋白的工程菌；然后再从SS-K/P质粒，用Kpn I(K)和Nsi I(N)切出SS基因，将其插入pThioHis质粒的相应位点，构建成SS-K/N质粒，转化后获得能表达SS-K/N融合蛋白的工程菌；再从SS-K/N质粒，用Nco I(N)和Sac 1(S)将SS基因切出，将其插入PET 32a质粒的相应位点，构建成SS-N/X质粒，转化后获得能表达SS-N/X融合蛋白的工程菌；同样从SS-K/N质粒，用Nco I(N)和Sac I(S)将SS基因切出，将其插入PET-32C质粒的相应位点，构建成SS-N/S质粒，转化后获得能表达SS-N/S融合蛋白的工程菌；从SS-K/N质粒，用Bam HI(B)和Xho I(X)将SS基因切出，将其插入PT7ZZa质粒的相应位点，构建成SS-B/X质粒，转化后获得能表达SS-B/X融合蛋白的工程菌；再从SS-K/N质粒，用Bam HI(B)和Eco RI(E)将SS基因切出，将其插入PT7ZZa质粒的相应位点，获得能表达SS-B/E融合蛋白的工程菌。
SS是由10个氨基酸组成的短肽，共遗传保守性很强，各种鸟类和哺乳动物之间无种属差异。因其分子量较小，必需与载体蛋白连接形成SS-载体融合蛋白才有免疫原性。因此只须构建能高效表达，即可用其表达产物制备SS亚单位疫苗，用于各种家畜和家禽的免疫。
本发明选择表达系统和最佳的插入位点是技术关键，为保证研究目标的顺利完成，采用了pThioHis、PET32和PT7Za 3个大肠杆菌高效表达系统，每个系统用2个插入位点，共构建6个可供选择的工程菌。
本发明还进一步研制了适用于多次免疫的SS基因工程亚单位苗。经2年努力，已构建了3个大肠杆菌表达系统，每个表达系统用2种插入位点，共获得6株高效表达的工程菌，其中PET32c表达系统的SS-N/S和SS-N/X2个工程菌表达水平均在30％左右。用SS-N/S和SS-N/X融合蛋白制成SS基因工程亚单位疫苗。分别免疫小鼠做实验小试；以载体蛋白(硫氧还蛋白)和生理苗水作对照。每组公母各10头，每周称重至第11周结束。结果对母鼠，这二种融合蛋白分别比硫氧还蛋白对照提高10.3％和15.6％；比生理盐水对照提高30.5％和36.9％。激生1号疫苗对小鼠免疫效果不明显。用SS-32C融合蛋白疫苗免疫仔猪，3个月可提高增重7.2％。免疫妊娠母猪，所产仔猪28日龄时体重比对照母猪所产仔猪增重19.6％，44日龄提高增重18％。用以免疫母羔羊，58天时，比接种硫氧还蛋白对照母羔羊增重15.6％，90天时，提高增重28.2％。
图1重组质粒SS-K/P的构建
图2重组质粒SS-K/N的构建
图3重组质粒SS-N/X构建
图4重组质粒SS-N/S的酶切镏定
图5重组质粒SS-B/X的构建
图6重组质粒SS-B/E的构建
图7SS-N/X融合蛋白在IPTG诱导后不同时间表达结果电泳图
泳道1 诱导后0h 泳道4 诱导后2h
泳道2 诱导后0.5h 泳道5 诱导后3h
泳道3 诱导后1h 泳道6 诱导后4h
图8SS-N/S融合蛋白的三级结构
硫氧还蛋白(紫色) SS(红色) 连接部分(橙色)
图9SS-N/X融合蛋白的三级结构
尾部(黄色) 硫氧还蛋白(橙色) SS(红色) 连接部分和尾部(绿色)
实施例；
1.PthioHis SS-K/P重组质粒的构建
1.1SS基因合成
以天然SS的基因序列为标准，将大肠杆菌使用频率较低的4个密码子(AAG、ACT、ACA和TGT)分别更换成使用频率较高的密码子(AAA、ACC和TGC)；并在SS基因的两端设计Kpn I和Pst I 2个酶切位点，以便插入，设计如下；
SS基因序列5′ CC ATG GCT GGC TGC AAA AAC TTC3′ CAT GGG TAC CGA CCG ACG TTT TTG AAGTTC TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGC CTG CA3′AAG ACC TTT TGG AAG TGG AGG ACG G5′
由中科院植生所基因合成室协助合成，并经PAGE纯化。2条合成的单链DNA按常规方法等摩尔混合，置90℃水浴中，自然冷却至室温退火，即成两端有粘性末端的SS基因。
1.2SS基因克隆
1.2.1表达系统来源pThioHis(His-Patch Thio Fusion TM)表达系统及Top10菌株购自Invitrogen Corporation，USA。
1.2.2pThioHis A质粒的提取参照[美]J.萨姆布鲁克等著，《分子克隆实验指南(第二版)》上介绍的方法进行。
1.2.3pThioHis质粒的酶切与回收取适量pThioHis A质粒进行Kpn I/PSTI(以下简称K/P)双酶切，0.7％的琼脂糖电泳回收酶切大片段，并用胶回收试剂盒纯化回收的大片段质粒。
1.2.4SS基因与质粒载体pThioHisA的连接与转化
因合成的SS基因片段末端无磷酸不能自连，为了提高连接效率，按摩尔数之比载体/插入片段＝1/100的比例相混合，用T4连接酶于16℃恒温水浴中连接过夜，连接体积10μl。次日取2～3μl连接液转化DH5a感受态细胞(感受态细胞的制备与连接方法均参照《分子克隆实验指南(第二版)》中的操作方法进行)。此转化的大肠杆菌即SS-K/P克隆株。(图1)
1.2.5SS-K/P克隆株的酶切鉴定
在上述DH5a氨苄平板上挑选8株大小适中的转化菌落，用碱裂解法小量抽提质粒，0.7％的琼脂糖电泳鉴定质粒大小，挑取与空载体质粒大小类似的质粒进行Nco I单酶切鉴定，对有此位点的质粒进一步进行Kpn I和Pst I双酶切，(然后加2μl 0.8M PH8.0的Tris缓冲液及1μl Pst I继续酶切2h)，酶切混合物用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定[参照A.Harwood(1996)的方法进行]。电泳完毕后将胶置于0.5μg/ml的EB染液中染色30～50，紫外灯下观察结果在该泳道的相应位置上有1条核酸带，证实所得到重组质粒含有插入的SS基因。
1.2.6SS-K/P克隆株的序列测定
挑选一株经酶切鉴定后基本正确的重组菌和合成的基因一起送宝生物工程(大连)有限公司帮助进行序列测定。上述经酶切鉴定和序列测定正确的克隆株，系用于克隆基因保存和扩增重组质粒之用，一般基因工程实验室多保存重组质粒，表达前重新转化用于高效表达的Top 10等感受态大肠杆菌。
2.pThioHis SS-K/N重组质粒的构建
2.1SS基因片段的制备
从上述SS-K/P质粒中，用Kpn I和Pst I双酶切出SS基因，参照Adrian J.Harwood(1996)介绍的方法，电泳回收此DNA片段。
2.2pThioHisA质粒的酶切片段制备
用碱裂解法小量制备质粒pThioHisA，利用Pst I酶切末端可与Nsi I酶切末端互补的特点，用Kpn I和Nsi I双酶切质粒pThioHisA，0.7％琼脂糖电泳回收酶切大片段，用胶回收试剂盒回收、纯化K/N酶切大片段，并取样电泳检查回收DNA的质量。
2.3SS-K/N的克隆与鉴定
按载体/插入段段＝1/3的比例将纯化的pThioHisA K/N片段与纯化的SS片段相混合，在10μl的反应体系，16℃恒温水浴中用T4 DNA连接酶连接14h，取2～3μl连接液转化DH5a感受态细胞。随机挑取数个转化菌落，扩增细菌，提取质粒，用Nco I单酶切检查是否存在该酶切位点(注：Nco I是合成SS基因时带上的一个酶切位点，而载体中无此酶切位点，故可用此酶来鉴定SS基因的存在)。此质粒即SS-K/N。(图2)
3.PET 32a SS-N/X重组质粒的构建
3.1表达系统来源
PET32表达系统购自Novagen公司。BL21、BL21(DE3)和BL21(DE3)Plys菌株均为本实验室保存。
3.2基因片段的制备
用Nco I/Xho I(简称：N/X)双酶切质粒SS-K/N，PAGE电泳，胶回收66bp的酶切小片段，用胶“压碎与浸泡”法回收并纯化小片段DNA。该小片段DNA即为要插入的含有SS的基因片段。
3.3PET-32a克隆载体的制备
用Nco I/Xho I双酶切载体质粒PET-32a，0.7％的琼脂糖电泳回收酶切大片段，胶回收试剂盒纯化胶回收的DNA，即为待克隆的载体DNA。
3.4SS-N/X质粒的构建
将纯化的SS DNA插入片段与载体DNA按3∶1(摩尔比)的比例相混合，用T4连接酶于16℃水浴中连接过夜，次日转化DH5α感受态细胞(图3)。第3天挑取单个转化菌落，37℃摇床中扩增，抽提质粒，用N/X双酶切鉴定是否存在插入的SS小片段DNA。(图3)
4.PET32C SS-N/S重组质粒的构建
4.1SS基因的制备
用Nco I/Sal I(简称：N/S)双酶切质粒SS-K/N，PAGE电泳，胶回收104bp的小片段，用胶“压碎与浸泡”法回收并纯化含SS的小片段DNA。
4.2PET-32c克隆载体的制备
用N/S双酶切PET-32c质粒DNA，0.7％的琼脂糖电泳回收酶切大片段DNA，用胶回收试剂盒纯化载体酶切大片段。
4.3SS-N/S质粒的构建
将纯化的SS-N/S酶切小片段与PET-32c N/S酶切大片段按3∶1(摩尔比)的比例混合，按同1.3.3同样的方法鉴定出含SS插主基因的重组质粒SS-N/S。(图4)
5.PT7ZZa SS-B/X重组质粒的构建
5.1表达系统来源：PT7ZZ表达系统；购自Royal Institute of Technology，Sweden菌种：DH5α和BL21(DE3)为本实验室保存。
5.2SS基因的制备：用BamH I/Xho I(B/X)和BamH I/EcoR I(B/E)分别双酶切质粒SS-K/N，PAGE电泳，胶回收95bp和106bp的小片段DNA，用胶“压碎与浸泡”法回收并纯化小片段DNA(Harwood，1996)。这两种小片段DNA即为要插入的含有SS基因的DNA片段。
5.3PT7ZZa克隆载体的制备：分别为B/X和B/E双酶切载体质粒PT7ZZa，0.7％的琼脂糖电泳回收酶切大片段，用胶回收试剂盒纯化胶回收的DNA，即可分别得到待克隆的载体DNA-B/X和DNA-B/E。
5.4SS-B/X和SS-B/E质粒的构建：分别将纯化的SS-B/X和SS-B/E DNA插入片段与相应载体DNA按3∶1(摩尔比)的比例相混合，用T4 DNA ligase于16℃水浴中连接过夜，次日转化DH5α感受态细胞，第3天挑取单个转化菌落，37℃摇床中扩增，抽提质粒，分别用B/X和B/E双酶切鉴定是否存在插入的SS小片段DNA。(图5、图6)
本发明所提供的工程体SS融合蛋白表达如下：
1.pThioHis系统SS-K/P和SS-K/N克隆株的表达
1.1SS-K/P和SS-K/N质粒转化宿主菌：取大肠杆菌Top 10菌种划LB平板，挑大小适中的单菌落做感受态细胞，将经鉴定带有SS基因的上述重组质粒分别转化Top 10感受态细胞，获得2株能高效表达的工程菌。
1.2 SS-K/P和SS-K/N融合蛋白的表达：参照His-Patch ThioFusio TM ExpressionSystem操作手册中的方法进行。挑取大小适中的SS-K/P新转化菌落于3ml LB中，37℃摇床中过夜(转速250rpm，下同)，次日按5％的量接种于含30ml LB的150ml的三角瓶中，于37℃摇床中扩增至OD600达0.5时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导。并分别于诱导时和诱导后0.5、1、2、3、4、5h时取样进行10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。具体方法按Hermann Schagger等(1987)报道的(Tricine-Sodium电泳缓冲系统)方法进行。电泳结束后，凝胶经考马斯亮蓝(R250)染色，脱色后用凝胶灰度扫描仪测定表达产物的相对含量。
2.PET 32系统SS-N/X和N/S克隆株的表述
2.1SS-N/X表达菌株的构建：将鉴定正确的SS-N/X和SS-N/S质粒分别转化表达宿主菌BL21(DE3)Plys感受态细胞，所得转化菌株即为表达用菌株。
2.2SS-N/X融合蛋白的表达
取单个新鲜转化菌落于含3ml LB培养基的试管中扩增菌种(37℃摇床中过夜)，次日转接于含30ml LB培养基的三角瓶中，于37℃摇床中培养至OD600达0.5～0.6时，加入0.5mM的IPTG进行诱导。分别于诱后0、0.5、1、2、3、4h时取样0.5ml，离心，弃上清，沉淀加20ul ddH2O悬浮，再加等量2X上样缓冲液，混匀，100℃水浴3～5min，离心后按7ul/孔的量上样，进行10％的SDS-PAGE电泳。电泳完毕后用考马斯亮兰染色，再经脱色后用凝胶成像处理系统进行条带灰度扫描。全泳道扫描测定表达目的蛋白与总蛋白之比；目的蛋白条带扫描，比较目的蛋白条带间的相对含量。(图7)
3.PT7ZZa系统SS-B/X和SS-B/E克隆株的表达
3.1SS-B/X和SS-B/E表达菌株的构建：将鉴定正确的SS-B/X和SS-B/E质粒分别转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，所得转化菌株即为表达用菌株。
3.2SS-B/X和SS-B/E融合蛋白的表达：
分别取单个新鲜转化菌落于含3ml LB培养基的试管中扩增菌种(37℃摇床中过夜)，次日转接于含30ml LB培养基的三角瓶中，于37℃摇床中培养至OD600达0.5～0.6时，加入0.5mM的IPTG进行诱导。分别于诱后0、0.5、1、2、3、4h时取样0.5ml，离心，弃上清，沉淀加20ul ddH2O悬浮，再加等量2倍浓度上样缓冲液，混匀，100℃水浴3～5min，离心后按7ul/孔的量上样，进行10％的SDS-PAGE电泳。电泳完毕后用考马斯亮兰染色，再经脱色后用凝胶成像处理系统进行条带灰度扫描。全泳道扫描测定表达目的蛋白与总蛋白之比；目的蛋白条带扫描，比较目的蛋白条带间的相对含量。
结果分析：1.6株能高效表达的重组质粒
成功地构建了3个大肠杆菌表达系统，2个插入位点共6株表达质粒。经双酶鉴定和序列测定，证实插入已正确。质粒经保存后，多次转化大肠杆菌，均能稳定表达，稳定性好。见表1
表1 表达SS融合蛋的6株重组质粒 表达系统SS基因插入位点 重组质粒 酶切鉴定 序列测定 稳定性 表达水平 PthioHisA KpnI/PstI SS-K/P 正确 完全符合 好 较差 KpnI/NsiI SS-K/N 正确 — 好 尚高 好 NcoI/XhoI SS-N/X 正确 — 好 高 NcoI/SalI SSN/S 正确 — 极高 PT7ZZa BamHI/Xho I SS-B/X 正确 — 好 尚高 BamHI/EcoRI S-B/E 正确 — 好 高—未做
2.影响SS融合蛋白表达的因素和基因表达的最适条件
2.1最佳表达培养基的选择
分别选择LB、2YT和TB三种常用培养基对SS-K/P进行表达试验，菌种扩增和诱导后培养均在37℃摇床中进行。诱导时OD600分别为0.5138，0.4167和0.6383。诱导后继续培养3h结束，并分别取等量样品上10％SDS-PAGE，电泳结束后，经考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后，用凝胶灰度扫描仪对表达蛋白进行相对含量测定。
结果显示，SS-K/P融合蛋白在TB培养基中表达效果最好，LB居中，2YT培养基表达效果最差。从培养基的营养水平来看，TB＞2YT＞LB，但在2YT中菌体的生长速度和表达产量均较低，提示该培养基不适合Top 10菌株的生长和表达。TB培养基与另两种培养基相比突出的表现在酵母提取物用量较高(24g/L)，另外还添加了甘油和磷酸盐缓冲液，这种配方使营养成份更加全面丰富。另外还有一个重要的有利于重组菌生长和表达的原因：甘油作为碳源在代谢过程中不易产生对细胞生长和表达有严重损害作用的乙酸盐，但可产生酸，中和了蛋白胨代谢产NH+4造成的PH升高，使PH保持相对稳定，有利于细胞的生长和蛋白的表达。
2.2最佳诱导OD600值的选择
表达菌株培养后，以生长后细菌混度(OD600)为指标，工程菌(SS-K/P)接种后于30℃摇床中培养至不同的OD600值时诱导。诱导后置37℃摇床中继续培养4h结束。按同样的方法设一pThioHis A载体对照。最后各组样品统一上10％的SDS-PAGE电泳，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝(R250)染色，脱色后，用凝胶灰度扫描仪全泳道扫描测定表达目的蛋白与总蛋白之比；目的蛋白条带扫描，比较目的蛋白条带间的相对含量。
结果SS-K/P-硫氧还蛋白和SS-K/N-硫氧还蛋白均在OD6000.4～1.4之间的不同时间诱导对表达产量无明显的影响，但以OD600在0.5～0.6左右时诱导为最佳。与载体pThioHisA中硫氧还蛋白的表达量相比，SS-K/P和SS-K/N2种融合蛋白的表达产量稍低一些。
由实验结果还看出，OD600值在0.4～1.4的一个较广的范围内用IPTG诱导，SS融合蛋白的表达产量并无太大的变化，提示对OD600值的要求并不太严格。但以OD600值在0.5～0.6之间诱导表达产量为最高，提示这一OD值应视为最佳诱导时间。
2.3IPTG诱导后最佳收获时间的选择
当工程菌在LB培养基上，37℃摇床培养至OD5.0～6.0用1mM IPTG诱导后不同时间收获，电泳后用灭变扫描法测表达蛋白的相对含量，结果SS-K/P和SS-K/N均在IPTG诱导后4h表达量最高，在4～5h基本保持稳定，SS-N/X和SS-N/S均在诱导后3h达高峰，5h后稍有下降。SS-B/X和SS-BE亦已诱导后2～3h达最高。
由实验结果可看出，虽然SS-硫氧还蛋白融合蛋白在IPTG诱导2h以后与总蛋白的比值增长较为缓慢，但单位体积中融合蛋白的绝对量却仍有明显的增长，至4h时方达高峰，5h时稍有下降。因此，IPTG诱导后4h(37℃)应为最佳收获菌作时间。
2.4IPTG和乳糖最适诱导剂量
取8个内盛40ml LB培养基的200ml三角瓶，按2％的量接种新鲜培养SS-N/S表达菌种，37℃摇床中培养至OD6000.5～0.6时，分别用1Mm、0.5mM、0.1mM、0.05mM的IPTG和2％、1％、0.5％的乳糖进行诱导，继续培养4h，然后分别取样0.5ml菌体。用乳糖诱导的3个组再继续培养4h(共8h)，然后取出，分别取样0.5ml菌体。处理后，电泳，并进行条带灰度扫描。
结果显示IPTG在1～0.05mM对SS融合蛋白表达产量的影响并不太大，但单位体积内的表达产量以0.5mM时为最高。乳糖诱导的效果明显低于IPTG，以2％乳糖诱导效果最好，可达0.05mMIPTG诱导结果的74％。将乳糖诱导的时间延长至8h可显著提高乳糖诱导的效果，2％的乳糖可达到同IPTG同样的诱导效果，1％和0.5％的乳糖也可接近IPTG的诱导效果。0.05mM完全可以达到有效的诱导效果。
2.5低温培养对SS融合蛋白表达的影响
SS-N/X和SS-N/S在26℃和30℃条件下培养，诱导后6h菌体，超声裂解，离心后沉淀恢复到原体积，上清与沉淀取等量样品，用10％SDS-PAGE测定，条带用灰度扫描定量。先设定同种蛋白中某一条带的光密度值为100，对其他条带进行相对定量，再将其换算成超声裂解原液中可溶性蛋白(上清中)与包涵体蛋白所占百分比。在26℃条件下表达，SS-N/S可溶性融合蛋白占39.8％，不可溶性融合蛋白占60.2％；而SS-N/X融合蛋白的不可溶部分仅占24.1％，可溶性蛋白达到75.8％。显示SS-N/X融合蛋白的水溶性远远高于SS-N/S融合蛋白。30℃的低温条件下诱导表达，SS-N/X融合蛋白主要为可溶性的，占75.8％沉淀中仅占24.2％；而SS-N/S融合蛋白则主要以包涵体的形式存在，包涵体占81.1％，而可溶性蛋白仅占18.9％；32℃载体所表达的硫氧还蛋白则居二者中间，可溶性蛋白与包涵体蛋白几乎等比例出现。在此温度下诱导，SS-N/S还可超量表达，SS-N/S融蛋白的表达量可达总菌体蛋白的40.9％。
3.对SS基因工程亚单位苗6株候选克隆株的评估
3.1pThioHis系统的SS-K/p和SS-K/n的开发前景
SS-K/P和SS-K/N2种融合蛋白主要为水溶性蛋白，沉淀中几乎不存在该蛋白。良好的水溶性有利SS形成正确的空间结构，即有利于抗原决定簇的形成。超声裂解上清液中SS抗原性的测定结果显示，SS-K/P和SS-K/N两种融合蛋白均有很强的抗原性，说明SS的抗原决定簇是暴露在融合蛋白表面的，可推测用该融合蛋白免疫动物应具有良好的免疫原性，可刺激机体产生抗SS的抗体。另外，该融合蛋白水溶性好也为对该融合蛋白进行提取纯化和疫苗制备提供了方便条件。
3.2PET32系统的SS-N/S和N/X的开发前景
本系统的2个克隆株因其表达水平高，因而是SS亚单位苗的首选的候选株，但二者均能形成包涵体，水溶性较差。按一般规律，降低温度可提高融合蛋白的水溶性，但我们的多次表达实验证明，在较低温度(26℃～30℃)下表达时PET-32a表达系统所表达的SS-N/X融合蛋白水溶性增加较为明显，而PET-32C表达系统所表达的SS-N/S融合蛋白的水溶性增加并不明显，而且空载体32C本身所表达的硫氧还蛋白也有近一半为包涵体表达。这说明SS-N/S融合蛋白的性质受温度的调控较小，而主要与表达系统本身的性质有关。但在低温下SS-N/S可超量表达SS融合蛋白，其表达量可达菌体蛋白的40.94％。超量表达是宿主菌在多种条件都适宜的情况下，对目的蛋白表达水平的一种最佳发挥，在一般情况下是很难达到的。低温有利于质粒的稳定，可能同时也有利于宿主菌各种生理功能的协调发挥。如果能把这一超量表达条件稳定下来，无疑会大大提高融合蛋白的表达产量，将来生产该疫苗时也就会大大提高经济效益。
3.3PT7ZZa系统的SS-B/X和SS-B/E的开发前景
SS-B/X和SS-B/E两种融合蛋白的水溶性均很高，这有利于该二种融合蛋白的分离和纯化，加之本系统所表达的载体蛋白为SPA，它和多种动物的IgG有高亲合性，可用以快速纯化表达产物——SS-SPA。有利于下一步SS基因工程亚单位疫的制备，开发前景良好。
4.SS基因工程亚单位疫苗的动物促生长试验
4.1小白鼠免疫增重试验
以SS-N/X和SS-N/S2种融合蛋白，加不完全福氏佐剂1∶1混合，高速匀浆制成SS亚单位疫苗，实用用Blab/C纯系21日龄断乳小鼠100只，分5个组，每组公、母各10只，第1组为注射SS-N/X亚单位苗免疫组，第2组为注射SS-N/S亚单位苗免疫组，第3组为注射空载体(硫氧还蛋白)对照组，第4组为生理盐水对照组，第5组注射激生1号苗作为对照。各皮下注射0.2ml。免疫前称重，免疫后每周称重1次，共观察称重11周。
结果在接种后第1周，所有接种SS亚单位苗免疫组和空载体对照组均反应强烈，皮毛粗乱，精神不振，普遍减食，所有试验鼠均不增重。第2周开始，反应消失，增重迅速，很快赶上盐水对照和1号苗对照，至11周试验结束。试验组母鼠增重十分明显，SS-N/X组比空载体对照增重10.28％，比盐水对照增重30.54％；SS-N/S组比空载体对照增重15.63％，比盐水对照增重36.88％。而激生1号苗仅比盐水对照增重2.79％，增重不显著。
4.2免疫怀孕母猪，观察对所产仔猪的影响
选择品种、年龄、体重均相近的初产母猪4头，随机分为两组，于分娩前30天左右分别于耳根背部皮下注射实验疫苗和空载体对照疫苗。注苗后观察母猪的反应，分娩后称仔猪的初生重、28日龄体重和44日龄断乳体重。疫苗制备方法同7.2。结果见表3。
表3免疫母猪后所产仔猪增重比较(kg/头) 组 别 实验组(n＝15) 对照组(N＝18) 增重率(％) P值 出生增重 1.14±0.190 1.18±0.23 -3.38 ＞0.05 28天增重 4.64±0.914 4.15±0.723 11.81 ＞0.05 44天增重 8.87±1.265 7.52±2.142 17.95 ＜0.05
结果表明，给怀孕母猪免疫不影响仔猪初生重，而至44d断乳时，以空载体对照增重18％(P＜0.05)。
4.3 羔羊免疫增重试验
选择2-3月龄的双胞胎羔羊，随机将两只羔羊分为实验羊和对照羊，并适当照顾性别平衡。每只羔羊注苗2ml，并分别于注苗后0、58和92天称体重。结果表4。
表4母羔羊增重试验(kg/头) 组别 载体对照 (n＝11) 实验组(n＝11) 增重率(％) P值 初始重量 16.75±2.711 16.636±2.656 - - 58天增重 10.10±0.738 11.68±0.717 15.64 ＜0.01 90天增重 13.90±1.125 17.82±2.658 28.2 ＜0.01—未计算
实验结果显示：对母羔羊的增重效果非常明显，58天增重15.64％(P＜0.01)，90天增重28.2％(P＜0.01)。该实验虽仅免疫了一次，但增重效果却达到甚至超过了国外用SS合成肽疫苗，反复多次免疫羊的增重效果(Laarveld et al，1986；Mears，1990 and 1995；Sunet al，1990)。这说明用基因工程方法表达的SS融合蛋白具有较强的免疫原性，一次免疫即可达到明显促进母羊增重的目的。