水稻黄单胞菌hrp基因克隆和hrp基因调节基因 本发明水稻黄单胞菌hrp基因克隆和hrp基因调节基因，属农业生物技术领域，专用于农业生物技术育种和防治植物病虫害。
水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)包括两个致病变种：水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo)和水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pvoryzicola，简称Xooc)。水稻黄单胞菌hrp(hypersensitive response on nonhost plants andpathogenicity on host plants)基因决定该种病原细菌在非寄主植物(如烟草)上激发过敏反应(hypersensitive response，HR)和在寄主植物水稻(如汕优63)上的致病性(pathogenicity)。水稻黄单胞菌hrp基因成簇(cluster)排列，hrp基因簇调节基因位于hrp基因簇之外。水稻黄单胞菌hrp基因或其调节基因发生突变，则都会改变两致病变种激发非寄主产生HR和在寄主水稻上具致病性的能力。
水稻黄单胞菌既有其致病性，又有其诱导抗病性。水稻黄单胞菌hrp基因可激发非寄主植物产生HR和决定其对寄主水稻的致病性。HR是一种抗病表型。国外已对Erwiniaamylovora、Pseudomonas syringae、Ralstoria solanacearum和Xanthomonas caampestris中的hrp基因以及以据其进行的可能上述研究领域和应用开发领域进行了专利保护，国内仍未见水稻黄单胞菌中hrp基因克隆和hrp基因的报道。
本发明的目的是提供水稻黄单胞菌hrp基因克隆和hrp基因调节基因，用于克隆水稻黄单胞菌或其它植物病原细菌hrp基因和分析水稻黄单胞菌或其它植物病原细菌hrp基因结构与功能，并为用于农业生物技术育种和防治植物病虫害而构建遗传重组体提供基因资源。
本发明所提供的水稻黄单胞菌(X.oryzae)hrp基因包括： 1.水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo)hrp基因克隆pUHRX245 及其亚克隆：(1)Xoo的hrp基因克隆pUHRX245是以载体pUFR034+36.8-kb hrp基因片段构建而成 的。(2)36.8-kb hrp基因片段，经EcoRI酶切后构建于载体pUFR034上形成4个亚克隆 pHRE17、pUHRE13.5、pHRE3.3和pHRE3，分别含17.0、13.5、3.3和3.0-kb DNA 片段；经KpnI酶切后构建形成4个亚克隆pHRK20、pHRK6、pHRK5.8和pHRK3.8， 分别含20、6.0、5.8和3.8-kb DNA片段。(3)13.5-kb片段经BamHI酶切后构建得到pHRB2.3、pHRB5.2和pHRB6三个亚克 隆，所含插入DNA片段分别为2.3、5.2和6.0-kb。(4)6.0-kb片段经SacI酶切后构建成2个亚克隆pHRS2.7和pHRS3.3，分别含2.7-kb 和3.3-kbDNA片段。(5)3.3-kb片段经SacI和KpnI双酶切后构建成2个亚克隆pSK1.1和pSK2.2，分别含 1.1-kb和2.2-kb DNA片段。2.水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，简称Xooc)hrp基因克隆 pUHRS138及其亚克隆：(1)Xooc hrp基因克隆pUHR138是以载体pUFR034+39.3-kb hrp基因片段构建而成的。(2)39.3-kb hrp基因片段经EcoRI酶切后构建成3个亚克隆pHRE18.6、pHRE12.3和 pHRE8.4，分别含18.6、12.3和8.4-kb DNA片段；经EcoRI部分酶切后获得pE20.7 亚克隆，含20.7-kb(12.3+8.4-kb)DNA片段。(1)20.7-kb片段经KpnI部分酶切后构建成6个亚克隆pPK12.3、pPK8.4、pHRK6.6、 pHR5.7、pHRK5.2和pHRK3.2，分别含12.3(5.7+6.6-kb)、8.4(5.2+3.2-kb)、6.6、 5.7、5.2和3.2-kb片段。(2)6.6-kb片段经BamHI和KpnI双酶切后构建成2个亚克隆pBK2.1和pBK4.5，分 别含2.1和4.5-kb两个片段。4.5-kb片段上有3个SacI酶切位点和1个EcoRI酶 切位点。
本发明所提供的水稻黄单胞菌hrp基因的调节基因包括：1.来自Xoo hrp基因的调节基因hrpXoo，其核苷酸序列为：5′GAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCCGCAGGGACTGCAACACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGCGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCCATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACGCCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGACCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGAGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTGTCGCCACCGCGCTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCATGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGCCTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCATGCATCGCCGATCTGGCCGAGAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGGATCGTCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGTGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCATGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCGTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3’
其中，GAGCT：SacI酶切位点；AGAGAGAG；核糖体结合位点；CCGGC：转录起始位点；翻译起始位点；GGTACC：KpnI酶切位点；alpha-helix-turn-alpha-helix；终止密码子。2.来自Xooc hrp基因的调节基因hrpXooc，其核苷酸序列为：5’AGGACAGAGTGAGATTTTTTGATTTTTTCGGTCTCTTTCATTGACAAATTCCATTGAATCCGCTGCCTACAATCGTATGCGCCAGCGAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCTGCAGGGACTGCAGCACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGAGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCGATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACACCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGAGCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGTGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTATCGCCACCGCGTTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCACGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGACTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCTTGCATCGCCGATCTGGCCGAAAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGTATCGCCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGCGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCACGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCCTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3’
其中，GACAGA......ATGCGCC：启动子区域；GAGCT：SacI酶切位点；AGAGAGAG：核糖体结合位点；CCGGC：转录起始位点；翻译起始位点；alpha-helix-turn-alpha-helix；翻译终止密码子。3.来自Xooc hrp基因的调节基因hrpGXooc，其核苷酸序列为： 3′CTGCAGCGGTGAACTTGCTCAGCAGGCGGCTGTGCGATGTGCCGGGCTGAGACTTGGGCTGACAGCCTTGCTCATCGTTGTTGCATCTTTGTCTTGCAGCGCGAGCTCCAACTTGTAGCCATGCGAATACACGGCCCTGATGCGCACTGCGCCGTTGTGATTGCCGAGCTGCAGTTTCTTGCGCAGCTTGTAGATATGCTGCTCCATGGTGCGGTCGGTGAATTCGGTGTGGCTGCCCCAGACCGCCTTGGCCAGCTGGCAACGCCGGAAGCACACGCCGGGGCTGGAAAATAGCAGCCAGGCAATCGAAAACTCGCGTGCGGTCAGCACGATCGGCTTGCCGTGCAGATACACGGTATTTTCGTCGCGGAGCAACTGGTATGGACCAACGCTGAGTTGCTGCGTTTCCGGGCAGGCCGCCACCGGCGATAGCGCCAGGGCCGCGCGTACCTGCAATTCGTGCGAATTGAAGGGGAGCGCAAGCACCTCCTGCGCGCCCGCGCGATACCAGTCCAGGATGTCATTGGCGCAGTCGAAACGCCCGAGCACAATCAGCGGCGTGGGATGACCGCTATGGCAGCGCTGCCAGGCCAGCAGCGAGCTTTCGTCGGAGGCGACGCAACTGGCGTCGAAGACCAGTAACTCGCACGGCGAATGCCGCAACGAACGCAGGAGCTCCAGTTCATCGGAAAACACCGAGACATTGCGCGATAGCGGTGCGAGGCTGGCGTTGACCTGCGAGACCAGGCGGGCGTCCTGCGTCAACAGAAACGCCGATCCGTGTGCAAGGGGGCAAGGGATGTTCATCAGGTGGGCGTCCCGTGGCCGCGCGCAAACCACGCGTGGGCCGGATGCCGACGCCTGGCGTCCGACGCCAGGACAAAACCCATAGGGAGAGATCGATGCATCGTCGGACCAGTTGGTTGTCGGGGGGAGCGTCCGGCAGCGCCGGACAGATGCTATGTACCATTGCAACGAGGAAAAGTTTCACGCTTGCGAACGCTTCTTCGGGTTTGTGGGGGTTGGCTTTAACTCGCGCTCATCTTGGCGTAACGGAGCTCTTACATAGCGGGCATGTGGGCGTCGGCACTGCGCACATCCGCCAAGGTCTAGACCAACCTATTGCGATTCGTGCAATCGCGCGCATCTGGAATACATCGGTCAACAATTCGGGTGCGCGCTAGGTCTGCCGCTCATCATCAAGCCAGTGTCAGCGTGTGTGGTCACAAAATTGCAATGGCTGCGGCCAATAACGGTCAATGGCTGTGGAAGCGGCGCGTTCGCAGACGTTGTCCGAA-5′
其中，AAGG：核糖体结合位点；CGCGCGC：转录起始位点；翻译起始位点；翻译终止密码子。
本发明所提供的水稻黄单胞菌hrp基因克隆、亚克隆及其调节基因的优点和积极效果在于：依据水稻黄单胞菌hrp基因克隆、亚克隆及其调节基因，可以对其hrp基因的结构与功能进行分析，以揭示水稻黄单胞菌的致病机制、诱导抗病机制以及与水稻互作的分子机制。其实践价值表现在对农业生产中重大病害减灾手段的革新上，如依据本发明所提供的hrp基因克隆、亚克隆及hrp基因调节基因为基因资源，构建遗传重组体，如重组防病微生物、转基因植物、定向表达有机体等。
本发明所用水稻黄单胞菌Xoo(JXOIII)和Xooc(RS105)为公知公用菌株。
图1.Xooc基因文库构建流程示意图
图2.水稻黄单胞菌基因文库构建所用载体的物理图谱 E.EcoRI，Ss.Sacl，KKpnI，Sm.SmalI，B.BamHI，X.XbaI，S.SalI，P.PstI，Sp.SphI，H.HindIII，Bg.BglII。
图3.水稻白叶枯病菌(Xoo)hrp基因克隆pUHRX245所含36.8-kb hrp基因片段的限制性酶切图谱
图4.Xoo hrp基因克隆pUHRX245的亚克隆及其功能互补作用
图5.Xoo基因文库构建流程示意图
图6.水稻细条斑病菌(Xooc)hrp基因克隆pUHRS138所含39.3-kb hrp基因片段地限制性酶切图谱
图7.Xooc hrp基因克隆pUHRS138的亚克隆及其功能互补作用实施例1水稻白叶枯病菌hrp基因克隆、亚克隆和调节基因hrpXoo
1.水稻白叶枯病菌基因文库的构建构建流程图如图1。提取Xoo基因组总DNA，经EcoRI部分酶切后回收23-48-kb片段，以pUHR034质粒(物理图谱如图2)为载体，提取pUFR034质粒DNA，经EcoRI完全酶切后并去磷酸化。用T4DNA连接酶对去磷酸化的载体pUFR034与经EcoRI部分酶切而回收得到的Xoo基因组总DNA23-48 kb片段进行连接，得到多联体DNA。
提取溶源菌BHB2688、BHB2690中λ噬菌体蛋白，也称包装蛋白。用包装蛋白包装多联体DNA形成成熟的噬菌体颗粒。噬菌体可容纳的最大、最小DNA片段分别为52-kb和38-kb。pUFR034的大小为8.7-kb。因此，以pURF034为载体构建的Xoo文库的外源片段，最大为52-8.7＝43.3(-kb)，最小为38-8.7＝29.3(-kb)。
用成熟的噬菌体感染宿主菌S17-1，得到感染子。单菌落感染子(也称克隆)，其形式为S17-1/pUFR034∷Xoo基因组DNA片段。为便于书写，以后将根据含有某种性状的DNA片段的感染子重新命名，如本实验例中所得hrp基因表型的克隆，则命名为pUHRX245。
提取20个克隆中的质粒DNA，经EcoRI完全每切后计算外源插入片段的平均大小。本实施例中外源DNA片段大小平均为33-kb。根据公式N＝ln(1-p)/ln(1-f)，其中N为Xoo基因文库所需的克隆数，p为某个基因期望出现的概率，f为外源DNA片段平均长度与该物种染色体总长度的比例。以E.coli的染色体长度4×106bp估算Xoo的染色体长度为例。插入片段平均长度为33-kb，若期望其中某个基因出现的概率为99％，则Xoo基因文库的理论克隆数应为417个。本实施例中提出Xoo基因文库的克隆数为2000个，足以满足文库的容量要求。因hrp基因簇一般大小为23-25-kb，在载体pURF034上插入的平均大小为33-kb的DNA片段足以包含Xoo hrp基因簇。
基因组DNA和质粒DNA提取、纯化、酶切、回收、重组、连接、转化、电泳和包装蛋白的提取、包装、转染等技术均为公知，见文献(Larry Snyder and WendyChampness.(1997)Molecular Genetics of Bacteria.ASM.Press，Washington，D.C)。
S17-1、BHB2688和BHB2690以及质粒pUFR034均为已知和公用。
S17-1见文献(De Feyter，R.，C.I.Kado and D.W.Simon，R.，U.Priefer and A.Puhler.1983.A broad host range mobilization system for genetic engineering：transposonmutagenesis in gram negative bacteria.Biotechnology.1：784-791)。
BHB2688和BHB2690见文献(Priefer，U.et al.1984.Cloning with cosmidsIn：Advanced Molecular genetics.A.Puhler and K.N.Timmis(eds)Springer Verlag，pp.160-170.)。
质粒pUFR034见文献Gabriel.1990.Small，stable shuttle vectors for use inXanthomonas.Gene 88：65-72.。2.DES诱变水稻黄单胞菌获得hrp-基因突变体2.1 DES诱变Xoo获得hrp-基因突变体
Xoo野生菌株JXOIII(在寄主水稻汕优63上具致病性、在非寄主烟草NC89上可激发HR)在NA培养基上标记Rifampicin抗性(≥100ug/mL)，经水稻和烟草上检验后获得出发菌。出发菌在20mL NA+Rif(100ug/mL)中28℃、100rpm条件下振荡培养36h，4,000rpm离心10min收集菌体，0.2mol/L磷酸钠缓冲液(PBS，pH7.0)洗二次，后用1/5体积0.2mol/L PBS悬浮，加入16mL PBS，再加入200ul硫酸二乙酯(DES)，于28℃、100rpm条件下孵育30min，取其中200uL涂于NA+Rif100ug/mL的平板上。28℃下培养3-4d后挑选突变体。
突变体在NA+Rif(100ug/mL)中于28℃、100rpm条件下培养至对数生长期(＞108cfu/mL)。用去针头的注射器将突变体注射于烟草叶片背面的叶肉组织中，12-72h内观察接种部位有无HR。
将无HR的突变体培养至对数生长期(＞108cfu/mL)，剪叶法接种孕穗期水稻。每突变体接种5株水稻，每株只接种旗叶，12d后测量病斑长度。
将无激发烟草产生HR和在水稻汕优63无致病性的突变体在100mL NA中扩大生长至对数期，4,000rpm离心10min收集菌体。按下列方法制备细胞各组分：①细胞破碎液将收集的菌体用25ml去离子水悬浮，超声波(20kHz，Pulse on for 3.30sec.，Pulseoff for 3sec.)冰浴避光破碎菌体7min；②细胞破碎上清液细胞破碎液于4℃、10,000rpm离心10min，取上清液；③菌残体沉淀用5mL去离子水悬浮待测；④细胞破碎液上清液热处理将细胞破碎上清液热(100℃)处理10min冷却后待测；⑤细胞破碎液上清液蛋白酶K水解物将细胞破碎上清液用蛋白酶K处理(终浓度40ug/mL，37℃温浴15min)待测。将上述5种组分注射接种烟草，12-72h内观察HR反应。
Xoo经DES诱变和HR及致病性测定后发现，Xoo hrp-突变体JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482在烟草上失去激发HR的能力，并在寄主水稻上失去致病性(表1)。根据激发烟草产生HR的物质是否在胞内，把上述突变体分为两类。一类是JCM0066、JCM2322和JCM2482，其激发烟草产生HR的物质既不在胞内存在也不在胞外存在，这类突变体为harpin类蛋白缺乏突变体。另一类是JCM2211，其激发烟草产生HR的物质存在于细胞内，但不能泌出胞外。这类突变体为III型泌出通道突变体(表1)。2.2 DES诱变Xooc获得hrp-突变体
Xooc野生菌株RS105(在汕优63上具致病性、在烟草NC89上激发HR)在NA培养基上标记Rif抗性(≥100ug/mL)，经水稻和烟草检验后获得出发菌。出发菌在20mLNB+Rif(100ug/mL)中28℃、100rpm条件下振荡培养36h，4,000rpm离心10min收集菌体，0.2mol/L磷酸钠缓冲液PBS(pH7.0)洗二次，后用1/5体积0.2mol/L PBS悬浮，加入16mL PBS中，再加入200ul硫酸二乙酯(DES)，于28℃、100rpm条件下诱变30min，取其中200uL涂于PSA+Rif100ug/mL的平板上。28℃下3-4d后挑选突变体。
将突变菌株在NB+Rif(100ug/mL)中于28℃、100rpm条件下培养至对数生长期(＞108cfu/mL)。用无针头的注射器将突变菌株注射于烟草叶片背面的叶肉组织中，12-72h内观察接种部位有无过敏反应(HR)。将无HR的突变菌株按上述条件再培养至对数生长期(＞108cfu/mL)，针刺法接种于成株期的水稻叶片。每株突变体接种5株水稻，每株2叶，12d后测量病斑长度。
在烟草上无HR和在水稻汕优63上无致病性的hrp-突变株分别为M51、M55和M1005(表2)。将此3株hrp-突变体于100mL NB中培养至对数期(≥108cfu/mL)，4,000rpm离心10min收集菌体。按下列方法制备细胞各组分：①细胞破碎液将收集的菌体用25ml去离子水悬浮，超声波(20kHz，Pulse on 3.30sec for 3min，Pulse offfor 3sec)冰浴避光破碎菌体7min；②离心上清液细胞破碎液于4℃、10,000rpm离心10min，取上清液；③菌残体沉淀用5mL去离子水悬浮；④离心上清液热处理离心上清液热(100℃)处理10min；⑤离心上清液蛋白酶K水解物离心上清液用蛋白酶K处理(终浓度40ug/mL，37℃温浴15min)。将上述5种组分注射接种烟草叶片，12-72h内观察HR反应。
Xooc野生菌株RS105经DES诱变后获得的hrp-突变体M51、M55和M1005在烟草上失去激发HR的能力，并在寄主水稻上失去致病性(表2)。根据激发烟草产生HR的物质是否在胞内，把上述突变体分为两类。一类是M55和M1005，其激发烟草产生HR的物质既不在胞内存在也不在胞外存在，这类突变体为harpin类蛋白缺乏突变体。另一类是M51，其激发烟草产生HR的物质存在于细胞内，但不能泌出胞外。3.交叉互补法钓取Xoo基因文库中hrp基因克隆
以Xooc hrp-突变体M55为受体菌，以Xoo基因文库克隆为供体菌，采用交叉互补法，将Xoo基因文库400个克隆分别逐一与hrp-突变体M55进行两亲交配。将无菌硝酸纤维滤膜(2cm2)置NA平板上，用无菌牙签挑取少许在LB+Km 20ug/mL+Sp25ug/mL平板上生长的基因文库克降于滤膜上。受体菌在NB+Rif 100ug/mL中于28℃下培养至对数生长前期(107cfu/mL)，离心(4,000rpm，10min，RT)收集菌体，1/20体积LB悬浮菌体，40uL点于涂有供体菌的滤膜上。结合滤膜于NA上在28℃下培养36-48h。涂布滤膜上菌体于NB+Rif(75μg/mL)+Km(10～11μg/mL)的平板上，28℃下培养4-7d后，挑取接合子单菌落。将所得的接合子接种在NB+Rif(75ug/mL)+Km(12ug/mL)中于28℃、100rpm条件下培养至对数生长期(≥108cfu/mL)，无针头注射器法注射于烟草叶片的叶肉组织中，24h内观察测试烟草上的HR。将获得的能在烟草上激发HR的接合子，针刺法接种水稻叶片测定致病性。HR和致病性的测定结果表明，pUHRX245为Xoo hrp基因的阳性克隆(表2)。
交叉互补法为公知技术，见文献(王金生.(1999)分子植物病理学.中国农业出版社.北京)4.Xoo hrp基因克隆pUHRX245的亚克隆
载体质粒pUFR034多克隆位点上的单一酶切位点为：EcoRI、KpnI、SacI和BamHI(图2)
提取hrp基因克隆pUHRX245中DNA，经EcoRI完全酶切后除载体外产生17.0、13.5、3.3和3.0-kb四个片段(图3、图4)，说明pUHRX245中插入到pUFR034多克隆为点上的hrp基因片段大小为36.8-kb。对pUFR034进行EcoRI酶切并去磷酸化，在T4DNA连接酶的作用下，分别与回收的pUHRX245经EcoRI完全酶切的4个DNA片段相连接，转化宿主菌DH5α。根据lacZ是否失活选择白色菌落提取质粒DNA，再进行EcoRI完全酶切，确定所需DNA片段是否插入到载体pUFR034的多克隆位点。以据插入片段大小将所得亚克隆分别命名为pHRE3、pHRE3.3、pHRE13.5和pHRE17，分别含3.0、3.3、13.5和17.0-kb DNA片段。
同理，36.8-kb hrp基因片段经KpnI酶切后回收经KpnI酶切后产生的20.0、6.0、5.8和3.8-kb DNA片段，与经KpnI酶切并去磷酸化的pUFR034相连接，转化宿主菌DH5α。将所得克隆分别命名为pHRK3.8、pHRK5.8、pHRK6和pHRK20，分别含3.8、5.8、6.0和20.0-kb DNA片段。
对亚克隆pHRE13.5所含13.5-kb片段进行BamHI酶切，纯化后与经BamHI酶切并去磷酸化的载体pUFR034相连接，转化DH5α后得到pHRB2.3、pHRB5.2和pHRB6三个亚克隆，所含插入DNA片段分别为2.3、5.2和6.0-kb。
对亚克隆pHRB6所含6.0-kb片段进行SacI酶切，纯化后与经SacI酶切并去磷酸化的载体pUFR034相连接，转化DH5a后得到pHRS2.7和pHRS3.3两个亚克隆，所含DNA片段大小分别为2.7-kb和3.3-kb。
对亚克隆pHRS3.3所含3.3-kb片段进行SacI和KpnI双酶切，纯化后经与SacI和KpcI双酶切的pUFR034载体相连接，转化DH5α后得到2个亚克隆pSK1.1和pSK2.2，所含插入DNA片段分别为1.1-kb和2.2-kb。5.36.8-kb hrp基因片段的酶切图谱构建
依据以上36.8-kb各亚克隆和对pHRE17.0进行KpnI酶切，构建了如图3所示的限制性酶切图谱。6.功能互补法检测pUHRX245各亚克隆所含片段的功能性
提取以上各亚克隆中重组质粒，转化宿主菌S17-1后作为供体菌，以Xoo hrp-突变体JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482以及Xooc hrp-突变体M51、M55和M1005分别为受体菌，在硝酸纤维滤膜上进行两亲交配。供体菌在LB+km 20ug/mL+Sp25ug/mL培养基上划线，于37℃中培养36h后用灭菌牙签挑取少许于NA培养基的硝酸纤维滤膜(2cm2)上。受体菌在NB+Rif 100ug/mL中于28℃下培养至对数生长前期(107cfu/mL)，离心(4,000rpm，10min，RT)收集菌体，1/20体积LB悬浮菌体，40uL点于涂有供体菌的滤膜上。结合滤膜于NA上在28℃下培养36-48hr。涂布滤膜上菌体于NB+Rif(75(g/mL)+Km(10～11ug/mL)的平板上，28℃培养4-7d后，挑取接合子单菌落。将所得的接合子接种在NB+Rif(75ug/mL)+Km(12ug/mL)中于28℃、100rpm条件下培养至对数生长期(108cfu/mL)，无针头注射器法注射于烟草叶片的叶肉组织中，测试烟草上的HR。将获得的能在烟草上激发HR的接合子，针刺法接种水稻叶片测定致病性。
互补子的HR和致病性测定后发现，pUHRX245的亚克隆pHRE13.5、pHRE13.5的亚克隆pHRB6和pHRB6的亚克隆pHRS3.3能够交叉互补hrp-突变体M1005的在非寄主烟草上的HR和在感病寄主水稻上的致病性，并表现出水稻细条斑病的症状(表2、表3，图3)。这说明亚克隆pHRE13.5、pHRB6、和pHR3.3含有功能性片段，其大小分别为13.5、6.0和3.3-kb。
将pHRS3.3的亚克隆pSK1.1和pSK2.2按两亲交配法与hrp-突变体JCM0066、JCM2482、M51、M55和M1005进行功能互补，经HR和致病性测定后发现，该两亚克隆不能功能互补hrp-突变体M51、M55和M1005的HR和致病性，但亚克隆pSK1.1能够功能互补JCM0066和JCM2482两hrp-突变体的激发非寄主烟草产生HR的能力，说明亚克隆pSK1.1含有功能性片段(表3)。
将亚克隆pHRS3.3按两亲交配法功能互补Xoo hrp-突变体JCM0066和JCM2482，发现pHRS3.3能使hrp-突变体JCM0066和JCM2482恢复在非寄主烟草上激发HR的能力，说明pHRS3.3所含的3.3-kb为功能性片段(表3)。7.序列测定和目标基因分析
将pHRS3.3中所含3.3-kb DNA片段送宝生物技术(大连)有限公司进行序列测定。测定号为NJS057。
将3.3-kb DNA序列在Internet上输入GenBank，查新或与已知基因序列进行相似性或相同性比较。结果显示，3.3-kb中68-1581的序列与来自Xanthomonas campestrispv.vesicatoria中的hrpXv的相同性达90％，与来自X.citri中的hrpXct的序列相同性达90％(表4)。这表明，3.3-kb片段中含有目标基因，将此基因命名为hrpXoo。hrpXoo基因的核苷酸序列特征如下：5′GAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCCGCAGGGACTGCAACACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGCGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCCATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACGCCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGACCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGAGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTGTCGCCACCGCGCTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCATGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGCCTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCATGCATCGCCGATCTGGCCGAGAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGGATCGTCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGTGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCATGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCGTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3′其中，GAGCT：SacI酶切位点；AGAGAGAG：核糖体结合位点；CCGGC：转录起始位点；翻译起始位点；GGTACC：KpnI酶切位点；alpha-helix-turn-alpha-helix；终止密码子。
3.3-kb片段经SacI和KpnI酶切酶切位点分析发现，pSK1.1中所含1.1-kb片段缺少hrpXoo基因序列中的α-螺旋-转-α-螺旋序列。α-螺旋-转-α-螺旋序列是hrpXoo的特征。
表1.Xoo hrp-突变体和其细胞组分在烟草上的反应 菌株 菌悬液 破碎 离心上 热处理的 蛋白酶K处 菌残体
烟草 水稻 液 清液 离心上清 理的离心上JCM0066 - - - - - - -JCM2211 - - + + + - -JCM2322 - - - - - - -JCM2482 - - - - ND ND -JXOIII + 15.52cm* + + + - - CK - - - - - - -注：+示激发烟草产生HR；-示烟草上无HR；ND，未测定；*示病斑长度；ND，未测定。
表2.Xooc hrp-变体和功能互补子及其细胞组分在烟草上的反应 菌 株和 活菌体 细胞 离心上 菌残体 离心上清液 离心上清液蛋 接合子 烟草 水稻 破碎液 清液 热处理 白酶K处理
M51 - - + + - + -
M55 - - - - - - -
M1005 - - - - - - -M51/pUHRX245 + - + + - + -M51/pUHRS138 + - + + - + -M55/pUHRX245 + - + + - + -M55/pUHRS138 + - + + - + -M1005/pUHRX245 + 4.07a + + - + -M1005/pUHRS138 + 3.56a + + - + -
RS105 + 3.85a + + - + -
CK - - - - - - -+示在烟草上激发HR，-示在烟草上无HR。*-示无反应；*数字后无相同字母示差异达显著水平。
表3.Xoo hrp基因片段及其亚克隆对对水稻黄单胞菌
hrp-突变体的互补作用hrp基因片段及 hrp-突变体
亚克隆 Xoo hrp-突变体 Xoochrp-突变体
JCM0066 JCM2482 M51 M55 M1005 pUHRX245 NT NT + + + pHRE3 NT NT - - - pHRE3.3 NT NT - - - pHRE13.5 NT NT + + + pHRE17 NT NT - - - pHRK3.8 NT NT - - - pHRK5.8 NT NT - - - pHRK6 NT NT - - - pHRK20 NT NT - - - pHRB2.3 NT NT - - - pHRB5.2 NT NT - - - pHRB6 NT + + + + pHRS2.7 - - - - - pHRS3.3 + + + + + pSK1.1 + + - - - pSK2.2 - - - - -
*NT，未测；**-无HR；+HR
表4 3.3kb片段中hrpXoo基因序列与其它黄单胞菌中相关序列的相同性比较相关序列(基因) 长度(-kb) 同源序列起止位点 相同性Sequences Length(-kb) Start and stop sites Identity
Subject/ObjectX.c.pv.vesicatoria hrpXv 1806 68-1581/188-1701 90％X.citric hrpXct 1853 81-1581/153-1653 90％X.c.pv.zinniae 60(alpha-helix-turn-alpha-helix) 1292-1351/1-60 93％
表5.Xooc hrp基因克隆及其亚克隆对对水稻黄单胞菌
hr-p突变体的互补作用
hrp基因片段 hrp-突变体
及亚克隆 Xoo hrp-突变体 Xoochrp-突变体
JCM0066 JCM2482 M51 M55 M1005
pUHRS138 NT NT + + +
pHRE8.4 NT NT - - -
pHRE12.3 NT NT - - -
pHRE18.6 NT NT
pE20.7 NT NT + + +
pPK12.3 NT NT + + +
pPK8.4 NT NT - - -
pHRK6.6 NT NT + + +
pHRK5.7 NT NT - - -
pHRK5.2 NT NT - - -
pHRK3.2 NT NT - - -
pBK4.5 + + + + +
pBK2.1 - - - - -
*NT，未测；**-无HR；+HR
表6.pBK4.5中所携4.5-kb片段与其它黄单胞菌中相关序列的相同性比较
同源基因 长度(kb) 同源序列起始位点 同一性X.c.pv.vesicatoria hrpXv 1806 3346-4883/148-1686 90％X.citri hrpXct 1853 3346-4883/100-1638 90％X.c.pv.vesicatoria hrpG 1559 1866-3168/1406-35 87％实施例2水稻细条斑病菌hrp基因克隆、亚克隆和调节基因hrpXooc和hrpGXooc1.水稻细条斑病菌基因文库的构建构建流程图如图5，方法参见实施例1。2.DES诱变水稻黄单胞菌Xoo、Xooc获得hrp-基因突变体，方法同实施例1。3.功能互补法钓取Xooc基因文库中hrp基因克隆
以Xooc hrp-突变体M55为受体菌，以Xooc基因文库克隆为供体菌，采用功能互补法，将Xoo基因文库1000个克隆分别逐一与hrp-突变体M55进行两亲交配。将无菌硝酸纤维滤膜(2cm2)置NA平板上，用无菌牙签挑取少许在LB+Km 20ug/mL+Sp25ug/mL平板上生长的基因文库克隆于滤膜上。受体菌在NB+Rif 100ug/mL中于28℃下培养至对数生长前期(107cfu/mL)，离心(4,000rpm，10min，RT)收集菌体，1/20体积LB悬浮菌体，40uL点于涂有供体菌的滤膜上。结合滤膜于NA上在28℃下培养36-48h。涂布滤膜上菌体于NB+Rif(75μg/mL)+Km(10～11μg/mL)的平板上，28℃下培养4-7d后，挑取接合子单菌落。将所得的接合子接种在NB+Rif75ug/mL+Km12ug/mL中于28℃、100rpm条件下培养至对数生长期(≥108cfu/mL)，无针头注射器法注射于烟草叶片的叶肉组织中，24hr内观察测试烟草上的HR。将获得的能在烟草上激发HR的接合子，针刺法接种水稻叶片测定致病性。HR和致病性的测定结果表明，pUHRS138为Xooc hrp基因的阳性克隆(表2)。4.Xooc hrp基因克隆pUHRS138的亚克隆
载体质粒pUFR034多克隆位点上的单一酶切位点为：EcoRI、KpnI、SacI和BamHI(图2)
提取hrp基因克隆pUHRS138中DNA，经EcoRI完全酶切后除载体外产生8.4、12.3和18.6-kb三个片段(图6、图7)，说明pUHRS138中插入到pUFR034多克隆位点上的hrp基因片段大小为39.3-kb。对pUFR034进行EcoRI酶切并去磷酸化，在T4DNA连接酶的作用下，分别与回收的pUHRS138经EcoRI完全酶切的3个DNA片段相连接，转化宿主菌DH5α。根据lacZ是否失活选择白色菌落提取质粒DNA，再进行EcoRI完全酶切，确定所需DNA片段是否插入到载体pUFR034的多克隆位点。以据插入片段大小将所得亚克隆分别命名为pHRE8.4、pHRE12.3和pHRE18.6，分别含8.4、12.3和18.6-kb DNA片段(图7)。
对pUHRS138进行EcoRI部分酶切，回收后与经EcoRI完全酶切并去磷酸化的载体pUFR034相连接，转化宿主菌DH5α。根据lacZ是否失活选择白色菌落提取质粒DNA，再进行EcoRI完全酶切，确定所需DNA片段是否插入到载体pUFR034的多克隆位点。以据插入片段大小将所得亚克隆命名为pE20.7，所含片段大小为8.4kb+12.3kb＝20.7-kb。
20.7-kb片段经Kpnl部分酶切和纯化后与经KpnI酶切并去磷酸化的pUFR034载体相连接，转化宿主菌DH5α。将所得克隆分别命名为pPK12.3、pPK8.4、pHRK6.6、pHR5.7、pHRK5.2和pHRK3.2，分别含12.3(5.7+6.6)、8.4(5.2+3.2)、6.6、5.7、5.2、3.2-kb片段。
对亚克隆pHRK6.6所含6.6-kb片段进行BamHI和KpnI双酶切，纯化后与经BamHI和KpnI双酶切的载体pUFR034相连接，转化DH5α后得到pHRB4.5和pHRB2.1两个亚克隆，所含插入DNA片段分别为4.5和2.1-kb片段(图7)。5.39.3-kb hrp基因片段的酶切图谱构建
依据以上39.3-kb片段各亚克隆和对pHRE18.6进行BamHI和KpnI酶切，构建了其限制性酶切图谱(图6)。6.功能互补法检测pUHRS138各亚克隆所含片段的功能性
提取以上各亚克隆中重组质粒，转化宿主菌S17-1后作为供体菌，以Xoo hrp-突变体JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482以及Xooc hrp-突变体M51、M55和M1005分别为受体菌，在硝酸纤维滤膜上进行两亲交配。交配方法、HR和致病性测定参见实施例1。
互补子的HR和致病性测定后发现，pUHRS138的亚克隆pE20.7、pPK12.3、pHRK6.6和pBK4.5能够交叉互补hrp-突变体M1005的在非寄主烟草上的HR和在感病寄主水稻上的致病性，并表现出水稻细条斑病的症状(表2、表5、图7)，这说明亚克隆pE20.7、pPK12.3、pHRK6.6和pBK4.5含有功能性片段，其大小分别为20.7、12.3、6.6和4.5-kb。7.序列测定和目标基因分析
将pBK4.5中所含4.5-kb DNA片段送宝生物技术(大连)有限公司进行序列测定。测定号为NJS100。
将4.5-kb DNA序列在Intemet上输入GenBank，查新并和与已知相关序列进行相似性或相同性比较。结果显示，4.5-kb中的同列片段与来自Xanthomonas campestrispvvesicatoria中的hrpXv和hrpG的同一性分别达90％和87％，与来自X.citri的hrpXct的同一性达90％(表6)。功能互补(表5、图7)和序列分析显示(表6)，4.5-kb片段中含有目标基因hrp X和hrpG。因此，将来自Xooc的hrp基因的调节基因分别命名为hrpXooc和hrpGXooc。hrpXooc基因的序列特征如下：5’AGGACAGAGTGAGATTTTTTGATTTTTTCGGTCTCTTTCATTGACAAATTCCATTGAATCCGCTGCCTACAATCGTATGCGCCAGCGAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCTGCAGGGACTGCAGCACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGAGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCGATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACACCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGAGCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGTGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTATCGCCACCGCGTTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCACGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGACTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCTTGCATCGCCGATCTGGCCGAAAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGTATCGCCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGCGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCACGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCCTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3’
其中，GACAGA......ATGCGCC：hrpXooc基因启动子区域；GAGCT：SacI酶切位点；AGAGAGAG：核糖体结合位点；CCGGC：转录起始位点；翻译起始位点；alpha-helix-turn-alpha-helix；翻译终止密码子。
hrpGXooc基因的序列特征如下：3′CTGCAGCGGTGAACTTGCTCAGCAGGCGGCTGTGCGATGTGCCGGGCTGAGACTTGGGCTGACAGCCTTGCTCATCGTTGTTGCATCTTTGTCTTGCAGCGCGAGCTCCAACTTGTAGCCATGCGAATACACGGCCCTGATGCGCACTGCGCCGTTGTGATTGCCGAGCTGCAGTTTCTTGCGCAGCTTGTAGATATGCTGCTCCATGGTGCGGTCGGTGAATTCGGTGTGGCTGCCCCAGACCGCCTTGGCCAGCTGGCAACGCCGGAAGCACACGCCGGGGCTGGAAAATAGCAGCCAGGCAATCGAAAACTCGCGTGCGGTCAGCACGATCGGCTTGCCGTGCAGATACACGGTATTTTCGTCGCGGAGCAACTGGTATGGACCAACGCTGAGTTGCTGCGTTTCCGGGCAGGCCGCCACCGGCGATAGCGCCAGGGCCGCGCGTACCTGCAATTCGTGCGAATTGAAGGGGAGCGCAAGCACCTCCTGCGCGCCCGCGCGATACCAGTCCAGGATGTCATTGGCGCAGTCGAAACGCCCGAGCACAATCAGCGGCGTGGGATGACCGCTATGGCAGCGCTGCCAGGCCAGCAGCGAGCTTTCGTCGGAGGCGACGCAACTGGCGTCGAAGACCAGTAACTCGCACGGCGAATGCCGCAACGAACGCAGGAGCTCCAGTTCATCGGAAAACACCGAGACATTGCGCGATAGCGGTGCGAGGCTGGCGTTGACCTGCGAGACCAGGCGGGCGTCCTGCGTCAACAGAAACGCCGATCCGTGTGCAAGGGGGCAAGGGATGTTCATCAGGTGGGCGTCCCGTGGCCGCGCGCAAACCACGCGTGGGCCGGATGCCGACGCCTGGCGTCCGACGCCAGGACAAAACCCATAGGGAGAGATCGATGCATCGTCGGACCAGTTGGTTGTCGGGGGGAGCGTCCGGCAGCGCCGGACAGATGCTATGTACCATTGCAACGAGGAAAAGTTTCACGCTTGCGAACGCTTCTTCGGGTTTGTGGGGGTTGGCTTTAACTCGCGCTCATCTTGGCGTAACGGAGCTCTTACATAGCGGGCATGTGGGCGTCGGCACTGCGCACATCCGCCAAGGTCTAGACCAACCTATTGCGATTCGTGCAATCGCGCGCATCTGGAATACATCGGTCAACAATTCGGGTGCGCGCTAGGTCTGCCGCTCATCATCAAGCCAGTGTCAGCGTGTGTGGTCACAAAATTGCAATGGCTGCGGCCAATAACGGTCAATGGCTGTGGAAGCGGCGCGTTCGCAGACGTTGTCCGAA-5′
其中，AAGG：核糖体结合位点；CGCGCGC：转录起始位点；翻译起始位点；翻译终止密码子。