新的苦丁萘提取物及其用途 【发明领域】
本专利涉及含苦丁萘总皂苷至少40％的苦丁茶提取物，含它们的组合物及它们在降低哺乳动物体重上的用途。
背景技术
苦丁苯是一种可作为药用成份的植物，通常以其嫩叶或叶作为药用成份。现代研究表明，苦丁茶具有降低血浆胆固醇和甘油三酯作用。苦丁茶含有许多成分，其中苦丁茶总皂苷是苦丁茶中的成份且包括三种苦丁内酯苷元的糖苷混合物，三种苦丁内酯苷元分别为α-苦丁内酯，β-苦丁内酯和γ-苦丁内酯。
以上三种苦丁内酯及其糖苷的氢谱和碳谱等结构鉴定数据参见文献phytochemistry vol 41，No.3.871-877，1996；以上三种苦丁内酯的混合物具有UV210-260nm最大吸收的特征。但苦丁茶总皂苷，尤其是含至少40重量％苦丁茶总皂苷的苦丁茶提取物的生物活性至今未见报道。
发明内容及发明的实施方式
本发明人经研究现已发现含至少40重量％苦丁茶总皂苷的苦丁茶提取物在降低哺乳动物体重方面显示出出人意料地效果，本发明基于上述发现得以完成。
本发明涉及一种苦丁茶提取物，其包括至少40重量％的苦丁茶总皂苷。
本发明进一步涉及用于降低哺乳动物的苦丁茶提取物，其包括至少40重量％的苦丁茶总皂苷。
本发明还涉及组合物，其包括至少40重量％苦丁茶总皂苷的苦丁茶提取物及载体或赋形剂。
本发明还涉及含至少40重量％苦丁茶总皂苷的苦丁茶提取物在制备用于降低哺乳动物体重地产品中用途。
本发明还涉及降低哺乳动物体重的方法，其包括将有效量的含至少40重量％苦丁茶总皂的苦丁茶提取物给予需要的哺乳动物。
本发明还涉及含至少40重量％苦丁茶总皂苷的苦丁茶提取物的制备方法，其包括：
a)用水，C1-4烷基醇或水与C1-4烷基醇的混合液提取苦丁茶叶；
b)用大孔树脂处理a)中所得的苦丁茶叶提取物。
本发明还涉及含至少40重量％苦丁茶总皂苷的苦丁茶提取物，该提取物是如下制备的：
1.用水，C1-4烷基醇或水与C1-4烷基醇混合物处理苦丁茶叶；
2.将1中得到的苦丁茶提取物加到大孔树脂中，用不同浓度乙醇溶液洗脱。
根据本发明，术语“哺乳动物”包括人。
根据本发明，术语“C1-4烷基醇”包括甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，异丁醇或叔丁醇。
根据本发明，本发明的苦丁茶-提取物优选含50-90重量％苦丁茶总皂苷，更优选50-70重量％苦丁茶总皂苷，更优选60-70重量％苦丁茶总皂苷。
根据本发明，本发明中所述的苦丁茶总皂苷是三种苦丁内酯苷元的糖苷混合物，其包括一个共同结构单元，即28，20β-内酯-乌索烷，其更详细描述可见Phytochemistry Vol.41，No.3，871-877，1996。
根据本发明，本发明的苦丁茶提取物如下制备：首先用水或C1-4烷基醇或C1-4烷基醇与水混溶的有机溶剂提取苦丁茶的叶，过滤，滤液经过浓缩、浓缩液加到大孔树脂上、然后用与水混溶的不同比例有机溶剂如乙醇洗脱。
更具体的讲，本发明中的苦丁茶水提物是在50-100℃用水或者C1-4烷基醇或C1-4烷基醇如乙醇与水混溶的溶液浸泡或煎煮粉碎或未粉碎的苦丁茶叶。过滤，浓缩，浓缩物加到D101或HP20大孔树脂柱上，用水先洗涤，再用与水混溶从10％-100％的不同比率的有机溶剂如乙醇进行梯度洗脱，将洗脱所得的馏分按工业许可的干燥途径如喷雾法干燥得到干燥物，此干燥物中苦丁茶总皂苷含量以紫外分光光度法测定的苦丁茶总皂苷含量在40～95％。
根据本发明，本发明的苦丁茶提取物可以单独使用或以组合物形式使用。组合物中可添加适宜的赋形剂或载体。本发明的苦丁茶提取物或含它的组合物可以适宜剂型形式使用，如口服液、片剂、胶囊剂、散剂等。
下面的实施例用于进一步说明本发明，但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1
苦丁茶总皂苷提取物的制备
将苦丁茶叶10Kg投入到多功能提取罐中，加入10倍量的60％乙醇水溶液，加热煎煮二次，每次1小时。提取液过滤后合并滤液，回收乙醇后加入到浓缩罐中进行减压浓缩至每毫升溶液中包含苦丁茶叶量为1g。将提取液按苦丁茶叶量∶D101大孔树脂量＝1∶12的比例上柱。先用纯水洗涤至洗脱液变为无色，水用量为柱体积的4倍，再用60％乙醇水溶液洗脱至洗脱液中无苦丁茶皂苷(用TLC法和对照品比较，在对照品位置不出现和对照品相同的色谱信号)。将醇洗脱的馏分合并，减压浓缩至比重为1.10。将浓缩液进行喷雾干燥或真空干燥，得苦丁茶提取物干燥粉0.5Kg，得率5％，其中苦丁茶总皂苷含量64％，苦丁茶总皂苷含量测定采用紫外分光光度法测定，具体地讲，取苦丁茶的大孔树脂乙醇洗脱后的干燥粉适量，精密称定，50％甲醇定容，取一定量，挥干，残渣加入浓硫酸，80℃水浴30分钟，在272nm下测定，对照品以α-苦丁内酯3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1-3)-[α-L-鼠李吡喃糖基(1-2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷为对照。
实施例2
含实施例1苦丁茶提取物的胶囊制备
将实施例1苦丁茶提取物的干燥粉进行微波灭菌处理，灭菌后的粉末填充入胶囊，即得。
实施例3
口服液制备
按实施例1所述步骤，将苦丁茶的大孔树脂乙醇洗脱液回收乙醇至无醇味后，调整至一定密度，加入矫味剂如甜味剂及其它辅料，灭菌，检验合格后灌装。
实施例4
颗粒剂制备
将实施例1苦丁茶提取物的干燥粉100g与其它生理上可以接受的药用赋形剂淀粉或糊精5g，混合均匀，制粒，灭菌，检验合格后分装。
实施例5
实施例1所得64％苦丁茶总皂苷提取物(今后简称实施例1苦丁茶提取物)对胰脂肪酶的抑制作用
将所得的提取物按以下方法进行脂肪酶抑制实验。
采用酸硷滴定法，使用Mettler Toledo 320 PH计。底物：1ml三丁酸甘油酯加入到29ml的Tirs-HCl缓冲液中(PH＝7.0)。缓冲液含有100mM氯化钠，5mM氯化钙，和4mM牛磺脱氧胆酸钠。加1ml纯水，搅拌溶液之后加入210个单位的溶解在测试缓冲液中的胰脂肪酶(Sigma 100,000单位)。通过0.02M氢氧化钠滴定，使测试系统恒定在PH＝7.0，监控10分钟脂肪酶分解三丁酸甘油酯释放三丁酸的情况，把该结果作为空白对照。酶活性表示每克酶每分钟加入的硷的毫克当量。在随后的测试中，缓冲液中分别加入1ml实施例1制备的64％苦丁茶总皂苷和苦丁茶水提物(苦丁茶总皂苷含量12％)混匀，调PH＝7.0。以后的测试与上述步骤相同。胰脂肪酶的抑制率用下面公式表示：
抑制率＝(空白组硷消耗量-加药物后硷消耗量)/空白组硷消耗量×100％
实验结果见表1：
表1：苦丁茶水提液及实施例1苦丁茶总皂苷对胰脂肪酶的抑制作用 抑制剂 水提液 实施例1苦丁茶总皂苷 抑制率％ 16 91
食物中的脂肪主要是甘油三酯(中性脂肪)，占90％以上，它的消化主要在小肠内由胰脂肪酶完成。胰脂肪酶将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油，之后才能被人体吸收。实验结果显示，实施例1苦丁茶提取物具有显著抑制胰脂肪酶活性的作用。
实施例6
实施例1苦丁茶提取物对营养性肥胖大鼠的降脂和降体重作用。
样品：按实施例1制备而成的苦丁茶提取物，其中苦丁茶总皂苷含量64％。用蒸馏水为溶媒配制，灌胃给予。高剂量500mg/Kg体重，中剂量250mg/Kg体重，低剂量125mg/Kg体重。阳性对照组为奥利司他100mg/Kg，阴性对照组用蒸馏水给予。
实验动物：浙江省医学科学院实验动物中心提供雄性SD大鼠，体重60-90克。
高脂饲料：70％基础饲料、10％猪油、10％蛋黄粉、10％奶粉混合制成。
实验方法：取雄性SD大鼠80只，高脂饲料组(70只)和普通饲料组(10只)，10只/组，自由进食、饮水，喂养50天左右，两组体重差异明显(P＜0.05)，肥胖模型形成。然后从肥胖模型组中选取体重较大且接近的大鼠60只，称重后分成5组，12只/组，连续喂养高脂饲料30天，将大鼠处死，称体重及体内脂肪湿重，计算脂体比。实验数据统计采用Excel-2000作方差分析。结果见表2、3、4。
表2：造模前后大鼠体重的变化(X±SD)组别 鼠数 只 始重 (g) 终重 (g) 增重 (g)普通饲料组高脂饲料组 10 0 81.3±8.6 81.7±8.8 216.8±23.7 315.4±43.8 135.5±21.7 233.7±37.9P值 1.00 0.00 0.00
表2结果显示，造模结束时，高脂组和普通组体重有显著性差异(T检验，P＜0.05)，肥胖模型造模成功。
表3：给药30天对大鼠体重的影响(X±SD)组别剂量mg/Kg 鼠数 只 试验前体重 (g) 试验后体重 (g) 增重 (g)空白对照组奥利司他组高剂量组中剂量组低剂量组100500250125 12 12 12 12 12 322.4±47.6 322.6±45.3 322.1±45.1 322.8±41.5 322.1±39.7 437.7±52.4 370.4±50.9*** 356.4±52.5*** 380.1±61.8*** 363.0±66.3* 115.3±18.7 47.8±15.6*** 34.5±16.1*** 57.3±19.5*** 45.9±22.4**代表与对照组比较P＜0.05；**代表与对照组比较P＜0.01；***代表与对照组比较P＜0.001
表3结果显示，给予本发明实施例1苦丁茶提取物组的大鼠体重较对照组有明显减轻，差异有显著性(P＜0.05)。
表4：给药30天对大鼠体内脂肪的影响(X±SD)组别 剂量 mg/Kg 鼠数 (只) 试验后体重 (g) 体内脂肪湿重 (g) 脂体比 (脂肪/100g体重)空白对照组奥利司他组高剂量组中剂量组低剂量组 100 500 250 125 12 12 12 12 12 437.7±52.4 370.4±50.9 356.4±52.5 380.1±61.8 403.0±66.3 12.28±2.74 8.17±1.46** 6.44±1.23*** 8.86±1.69** 10.19±2.53 2.81±0.61 2.21±0.49* 1.81±0.39*** 2.33±0.54* 2.03±0.79*代表与对照组比较P＜0.05；**代表与对照组比较P＜0.01；***代表与对照组比较P＜0.001。
表4结果显示，给予本发明实施例1苦丁茶提取物组的大鼠体脂湿重和脂体比与对照组比较有明显减少，差异有显著性(P＜0.05)。
实施例7
苦丁茶水提物和实施例1苦丁茶提取物对营养性肥胖大鼠的减肥作用。
样品：按实施例1制备而成的苦丁茶总皂苷，其中苦丁茶总皂苷含量64％。用蒸馏水为溶媒配制，灌胃给予。苦丁茶水提取物为苦丁茶加热水(80-100℃)浸泡24h的上清液浓缩烘干而成，剂量为1000mg/Kg体重，实施例1苦丁茶提取物中剂量250mg/Kg体重，低剂量125mg/Kg体重。阳性对照组为奥利司他100mg/Kg，阴性对照组用蒸馏水给予。
表5：给药30天对大鼠体内脂肪的影响(X±SD)组别 剂量 mg/Kg 鼠数 只 试验后体重 (g) 体内脂肪湿重 (g)空白对照组奥利司他组水提组中剂量组低剂量组 100 1000 250 125 12 12 12 12 12 418.3±47.5 367.18±48.1 406.2±47.9 351.1±49.5 372.00±42.6 13.7±1.89 9.45±1.55** 12.89±1.09 9.08±2.04** 9.07±2.68****代表与对照组比较P＜0.01
表5结果显示，给予本发明实施例1苦丁茶提取物组的大鼠体脂湿重与对照组比较有明显减少，差异有显著性(P＜0.01)，而水提组体脂湿重与对照组比较无明显减少，差异无显著性。