注射用地龙冻干粉针剂及其制作方法 技术领域：本发明涉及一种注射用的地龙冻干粉针剂及其制作方法。
背景技术：心血管疾病常需要使用溶栓药物来治疗，来常常使用尿激酶等，使用过程中，经常出现出血和并症，对新形成血栓虽有抑制作用，但对陈旧血栓作用很差。近年来由于人们注意到了地龙全虫的溶栓作用，但是，由于提取物中的蛋白质种类十分复杂，确认其中的有效成分，并对有效成份进行纯化的难度非常大，该药品带来的热源、过敏源一直无法解决。
地龙俗称蚯蚓，是传统的中药，以息风化痰、活血通络之法而立，地龙味成性寒，入肝、脾、膀胱经，具有清热定惊、息风止痉，活血通络，利尿平喘等功用。因其咸寒入肝，其性善窜，尤以息风、止痉、通络之功见长。其能“祛风，治小儿惊风，口眼歪斜”。中风因痰瘀之邪痹阻脉络，气血运行不畅、滞而不通，而地龙尚能通利经脉，消瘀滞。肝肾阴虚则肝阳偏亢，风阳挟痰瘀上扰，故见头晕目眩，骤发半身不遂，语言蹇涩、口眼歪斜，用地龙平熄肝风，又可通经活络。由于地龙及不同方法提取物的成分复杂，副作用大，质量不稳定，多年来一直没有提供出可以作为注射剂的稳定成分。
脑栓塞属于中医学的“中风病”范畴。有关中风病的论述始见于《内经》，嗣后渐有″外风″、″内风″之论。中风的病因病机比较复杂，但纵观历代诸家之说，不外″风(肝风、外风)、火(肝火、心火)、痰(风痰、湿痰)、虚(阴虚、气虚)、气(气逆)、血(血瘀)六端，其病为本虚标实、上盛下虚之证。但证之临床，中凤病中经络尤以风痰瘀血痹阻脉络者多见。脏腑阴阳失调而致内风旋动，挟痰横窜脉络，故见半身不遂、偏身麻木：情志抑郁或暴怒血菀于上，而致痰瘀兼挟，阻于申焦，清阳不升、浊阴不降，或风痰挟瘀上扰清空，故头晕目眩。口舌歪斜、舌强语蹇，亦因风痰瘀血痹阻脉络而致。
中风病急性期虽有″本虚″之证，但仍以风阳、痰热、血瘀等″标实″之候为主。风挟痰、瘀，上壅清阳之府，横窜痹阻脉络，遂成中风病中经络之证。故按″急则治其标″的原则，治以″息风化痰，活血通络″。
发明内容：本发明地目的是提供一种注射用地龙冻干粉针剂及其制作方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
注射用地龙冻干粉针剂，其组成包括：地龙纤维蛋白的提取物，所述的地龙提取物中每毫克含有溶纤活性的蚓激酶8-12万单位，以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定时，其中分子量3万以上的50％，分子量2.3万以上的占90％。
上述的注射用地龙冻干粉针剂的制作方法，取新鲜地龙2400重量份，用捣碎机制成均浆，加入重量份数2000-2800的pH7.8 Tris-HCl缓冲液，然后加NaCl直到达到0.1M的浓度，捣碎成均浆，离心取上清液，加硫酸铵至70％饱和度，盐析，离心去盐，得到本产品的粗品。
上述的注射用地龙冻干粉针剂的制作方法，将所述的粗品经DEAE-DE52纤维素柱层析，收集含有纤溶活性的组分，透析去盐后冻干，将其用SephadexG75凝胶过滤，收集纤溶活性组分，透析，冻干得到精制品。
这个技术方案有以下有益效果：
1.本产品的地龙提取物中每毫克含有溶纤活性的蚓激酶8-12万单位，以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定时，其中分子量3万以上的50％，分子量2.3万以上的占90％，具有高纯度的特性，可以直接静脉给药，具有直接溶解血栓和激活溶栓的功能，不但对新产生的血栓有效果，对形成不足24小时的陈旧血栓也有效。通过家兔动静脉旁路血栓法，检测注射用地龙冻干粉针的抗栓作用，为临床应用提供可靠的依据。取家兔分组后麻醉，分离右颈动脉及左颈外动脉，在聚乙烯管中插入手术丝线，当一端插入左颈外静脉后，将管另一端插入右颈总动脉，开放血流。对照组在15分钟后中断血流，取血2ml测定优球蛋白溶解时间(ELT)，纤维蛋白原含量(FIB)及纤维蛋白降解产物(FDP)，并迅速取出丝线称重，而后将血栓在37℃恒温干燥24小时称干重。其它试验组则在15分钟后，分别静脉给予生理盐水、注射用地龙冻干粉针(待测药)、尿激酶，3小时后，按上述方法取血和血栓，并称湿、干重
表1 地龙冻干粉针对家兔体内血拴形成的影响
组别 例数 剂量 湿重(mg) 干重(mg)
对照组 8 69.25±2.04 21.88±1.83
生理盐水纽 8 84.31±3.61 28.21±1.02
地龙冻干粉针小剂量组 8 25ug/kg 63.59±9.60☆△ 19.54±3.67☆△
地龙冻干粉针中剂量组 8 50ug/kg 39.01±5.9☆△* 14.25±1.02☆△*
地龙冻干粉针大剂量组 8 100ug/kg 29.94±4.55☆△* 12.21±1.97☆△*
尿激酶 8 2×104u/kg 21.11±5.48*△ 8.91±2.07*☆
其中：*与对照组比较p＜0.01，☆大·中·小剂量组比较p\，0.05，△与生理盐水比较p＜0.01
表2 纤维蛋白原含量FIB
对照组 生理盐水组 待测药小剂量组 待测药中剂量组 待测药大剂量组 尿激酶
4.01±2.90 5.93±2.97 5.30±2.84* 3,75±1.83* 3.00±1.90* 2.64±1.02*
其中：*与生理盐水组比较p＞0.05
表3： 优球蛋白溶解时间ELT
数值 对照组 生理盐水组 待测药小剂量组 待测药中剂量组 待测药大剂量组 尿激酶
小于120 0 0 0 4 5 5
大于120 8 8 4 4 3 3
*与生理盐水组比较P＜0.01
表4： 纤维蛋白降解产物(FDP)
数值 对照组 生理盐水组 待测药小剂量组 待测药中剂量组 待测药大剂量组 尿激酶
小于5 8 8 5 1 1 0
大于等于5 0 0 0 4 1 1
小于20
大于等于20 0 0 3 3 6 7
试验结果表明，注射用地龙冻干粉针经小、中、大剂量组与生理盐水组比较有显著性差异(p＜0.01)。说明有抑制血栓进一步形成的作用；且中、大剂量组与对照组比较差异显著。说明此药除有抑制血栓形成外，还具有一定溶栓作用，各剂量组之间有剂量依赖关系。血FIB、ELT和FDP测量表明，注射用地龙冻干粉针对FIB的影响不明显，但中剂量与大剂量可使ELT显著缩短，大、中、小剂量可使FDP显著增多，表明其具有激活纤溶活性的作用。
二、目前的地龙药品中，由于处理工艺、原料等等原因，经测定不具有溶纤活性。本产品中含有大分子量的具有溶纤活性的蚯蚓激酶，与纤维蛋白具有特殊的亲和力，可以明显抑制血栓形成，化解陈旧血栓。
本实验观察了注射用地龙冻干粉针对大鼠动静脉旁路法体内血栓形成的影响，实验结果表明，注射用地龙冻干粉针明显抑制大鼠体内血栓形成。
地龙冻干粉针对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响：
取大鼠50只，随机分5组，注射用地龙冻干粉针(冻干粉针)高剂量组900ug/kg，中剂量组300ug/kg，低剂量组100ug/kg，空白对照组给等量生理盐水。各组大鼠均舌下静脉给药，药后5分钟，腹腔麻醉，实施手术。阳性对照药脉络宁注射液静脉滴注，药后5分钟，正中切开颈部皮肤，钝剥离分离右颈总动脉及左颈外静脉，将事先充满肝素生理盐水的聚乙烯管(分三段连结，在中段放入手术线)的一端插入左颈外静脉后，从聚乙烯管注入肝素，夹住管壁，将右颈总动脉近心端以止血夹阻断血流，眼科剪剪口，将聚乙烯管另一端插入右颈总动脉，结扎。5分钟后打开止血夹开放血流，血液从右颈总动脉经聚乙烯管返回左颈外静脉，开放血流15分种后，中断血流，迅速取下聚乙管，取出手术线，放在巳称重的滤纸上，称重，以总重量减去线重和纸重即血栓湿重，然后将滤纸放入干燥箱干燥后称重，以总重量减去线重和纸重即得血栓干重。实验结果见表1。
表1 地龙冻干粉针对大鼠血栓形成的影响
组别 例数 剂量ug/kU 血栓湿重mg 血栓干重mg
生理盐水组 10 2.4ml 84.5±23.3 27.6±6.9
脉络宁注射液 10 22.5ml 46.7±5.6***- 14.6±3.5***-
地龙冻干粉针低剂量组 10 100 40.6±10.1*** 16.4±3.6***
地龙冻干粉针中剂量组 10 300 33.5±14.1*** 13.9±2.2***
地龙冻干粉针高剂量组 10 900 38.4±15.7*** 14.5±4.7***
各用药组与生理盐水组比较***p＜0.001
实验结果表明：注射用地龙冻干粉针各剂量组及脉络宁组与生理盐水组间t检验，注射用地龙冻干粉针各剂量组与脉络宁组p＜0·001。
实验结论，统计结果分析表明，注射用地龙冻干粉针较脉络宁有明显抑制大鼠体内血栓形成的作用。
三、本工艺制作的本发明的产品毒副作用小，对肌体无损害，可以安全的用于临床
我们委托哈尔滨医科大学进行试验，观察不同剂量水平下注射用地龙冻干粉针在长期(12周)给药情况下，实验动物出现某些毒性反应、毒性反应严重程度与剂量之间的依赖关系，以及停药后组织形态和功能损害的发展和恢复情况，
注射用地龙冻干粉针长期(12周)毒性试验共设四组，每组6只家养杂种犬。空白对照组，每日静脉注射生理盐水20m1，2-4组分别为注射用地龙冻干粉针小、中、大三个剂量组，每日静脉注射地龙冻干粉针剂量份别为150ug/kg，750ug/kg、3750ug/kg。连续给药12周。其结果是，静脉注射地龙冻干粉针小、中、天三个剂量组与空白对照组比较，在体重增加、器官系数、血液学指标，血液生化指标、凝血象上基本相似，无统计学明显差异。病理组织学报告，亦末发现组织异常现象，同时心电导联检查也末见异常。因此证明注射用地龙冻干粉剂在剂量为150ug/kg至3750ug/kg时，连用12周，无明显毒性反应，后经两周恢复阶段观察，也未见延迟毒性反应。
注射用地龙冻干粉针对大鼠长期毒性试验摘要，采用Wistar大白鼠做注射用地龙冻干粉针长期毒性试验三个月。共设四个组：对照组、大量组·中量组、小量组。给药途径均为腹腔注射。给药剂量，大量组为1.6mg/kg：中量组为0.8mg/kg：小最组为0,4mg/kg，对照组为生理盐水10ml/kg：试验进行到三个月时，杀死一批对照组、大量组、中量组、小量组大白鼠，进行体重增长率、器官系数、血液细胞、血液生化指标及病理组织学检查。结果对照组与大量组、中量组、小量组的体重增长率、器官系数、血液细胞、血液化指均基本相同，无显著差异。病理组织学报告：注射用地龙冻干粉针大剂量组对肾脏有轻度损害，但是可恢复性病变，中、小剂量组未见到明显损伤。
四、本发明的工艺制作的本产品与纤维蛋白具有特殊的亲和力，经过高纯度的提纯，所得到的产品经生理生化检验，可以保证只有在纤维蛋白存在的情况下才起到溶栓作用，不会发生使用尿激酶等已有药品所产生的出血、溶血、致凝聚等副作用。并且，试验结果证明，本产品经试验均未出现现有药品使用中产生的过敏源、热源反应。注射试验用动物组织均未见上皮病变、皮下结缔组织充血、验证细胞浸润的刺激性反应，能够安全的进入注射用药领域。
实施例1：
注射用地龙冻干粉针剂，其组成包括：地龙纤维蛋白的提取物，所述的地龙提取物中每毫克含有溶纤活性的蚓激酶8-12万单位，提纯后的本产品以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定时，其中分子量3万以上的50％，其余分子量2.3万以上的占90％，其余为相近的低分子量的溶纤酶蛋白混合物。
实施例2：
实施例1所述的注射用地龙冻干粉针剂的制作方法，取新鲜地龙2400重量份，用捣碎机制成均浆，加入重量份数2000-2800，即几乎与地龙浆等重的pH7.8Tris-HCl缓冲液，然后加NaCl直到达到其中含NaCl量0.1M的浓度，捣碎成均浆，离心取上清液，加硫酸铵至70％饱和度，盐析，在4-7℃下以6000r/min下进行离心30分钟，取上清液，加硫酸铵至值70％饱和度，盐析，离心，取沉淀，透析去盐，得到本产品的粗制品。
Tris-HCl缓冲液是用0.01当量的三羟基氨基甲烷，用6N的稀盐酸调整pH值到7.8。
实施例3：
上述的注射用地龙冻干粉针剂的制作方法，可以将所述的粗制品经DEAE-DE52纤维素柱层析分离，收集含有纤溶活性的组分，透析去盐后冻干，将其用SephadexG75凝胶过滤，收集纤溶活性组分，透析，冻干得到精制品。其每毫克含有溶纤活性的蚓激酶8-12万单位，以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定时，具有三个峰值，其中分子量3万以上的50％，其余分子量2.3-3万之间三个峰值的溶纤活性蛋白和占蛋白总量的90％。纤溶活性测定活力每毫克含有10万单位。
本访法工艺简单，工艺参数要求低，适合大生产使用。