缓解氧化胁迫的组合物 【技术领域】
本发明涉及一种能缓解体内氧化胁迫的抗氧化组合物。
背景技术
近几年，体内氧化胁迫(oxidative stresss)，即活性氧物质(active oxygenspecies)(羟基自由基、烷氧基自由基、过氧羟基、过氧自由基、铁氧复合物、过氧化物、过氧化氢、氢过氧化物、单态氧和臭氧)或者自由基(脂自由基等)对疾病的不良作用已研究清楚。最普遍的看法认为动脉硬化由血浆中的低密度脂蛋白(LDL)氧化引起。此学说认为氧化的LDL，即因氧化胁迫而发生脂氧化的LDL，引起巨噬细胞泡沫化而导致动脉硬化。许多研究给予了肯定的报道。此学说还强烈支持以下事实：丙丁酚(probucol)作为显示抗氧化活性的降胆固醇药对动脉硬化有效。除动脉硬化之外，氧化胁迫对癌发生、大脑缺血、肝病等均有作用。另外，已经有对许多疾病，如糖尿病、神经疾病、肾病、肝硬化、关节炎、早熟性视网膜病、眼的葡萄膜炎、视网膜锈病、老年白内障、放射治疗的副作用所致衰竭、石棉病、吸烟所致支气管衰竭、抗癌药物副作用所致衰竭、脑水肿、肺水肿、脚水肿、脑梗塞、溶血性贫血症、早衰症、癫痫(spilepsy)、阿尔茨海默病、唐氏综合征、帕金森病、眼口生殖器病(Behect′s disease)、克隆氏病(Crohn′s disease)、川崎病、韦伯克里斯丁症(Weber-Christian disease)、胶原病、进行性全身硬化症、疱疹性皮炎、免疫缺陷综合征等的报道。虽然引起氧化胁迫的活性氧物质对生物防御本身是必要的并且是必需的，但是与膳食习惯变化相伴的体内抗氧化物质的减少，或者易产生自由基释放源的脂类量的增加，常引起过度氧化胁迫。根据许多研究，几乎可以肯定氧化胁迫是许多疾病地引发物或恶化因素。人们从很早就开始研究抗氧化剂(自由基净化剂)消除上述疾病中氧化胁迫的效力，并开发出具有消除自由基能力的抗炎剂。此外，一种表现抗氧化功能的新物质(Radicut)最近被许可作为药物。因此，可以认为明显的是，具有抗氧化功能的物质在缓解氧化胁迫方面是有用的。然而，由于所述物质是药物，故并不是每个人都能使用它。便于使用的物质的例子包括用作添加剂的抗氧化剂等。即，所述例子包括：维生素E、维生素C、皮质醇、β-胡萝卜素、维生素A、BHA(2，6-二-叔丁基-4-甲氧基酚)、BHT(2，6-二-叔丁基-4-甲基酚)、7，8-苯并黄酮、铜、3，5-二异丙基水杨酸酯等。但是，这些例子的效力仍不清楚。相反地，据报导，为增加效力而大剂量施用这些抗氧化剂会导致副作用。例如，关于维生素E，最近报道了肾透析患者的临床检验结果(Lancet，356，1213-1218，2000)。由循环疾病所致的肾透析患者的死亡率是不进行肾透析的患者的5到20倍，氧化胁迫被认为是此结果的一个因素。此项报告研究结果显示，通过对患者以日剂量800IU(为通常剂量的80到100倍)施用维生素E，循环疾病并发率减少了10％到20％。同时，此项报告显示，作为维生素E的一种副作用，脑出血的风险增加了63％，并且两名患者死于出血性疾病。此报告中指出，由于使用维生素E，由氧化胁迫引起的循环疾病并发率可以明显地减少。该报告进一步显示了维生素E的副作用风险，而且揭示需要从其副作用角度进一步研究维生素E的应用。谈到大剂量施用维生素E的副作用，在1985年由于许多新生婴儿死亡，美国胎儿和新生儿科学委员会建议停止大剂量施用维生素E。同时，口服的副作用比如败血症、坏死性结肠炎等，认为是由于维生素E过量用药。并且，静脉注射的副作用认为是由于与用于悬浮维生素E的表面活性剂的协同作用(胎儿和新生儿科学委员会，76，315，1985，D.L.Phelps，Amer.J.Clin.Nutr.，46，187，1987)。此外，对维生素C和维生素A的体内效力也产生了一些质疑，并且其副作用也被提出(Kunihiko Sato，Jikken Igaku(ExperimentalMedicine)，4，1116，1986；Y.Oyanagi，Biochem.Pharmacol.，25，1473，1976)。这样，在现在的情况下，有许多在体外显现强抗氧化活性，而在体内不一定显现有效活性的例子。使用这种抗氧化剂治疗的一个重大问题是，虽然可以期望抗氧化剂能缓解氧化胁迫、抑制疾病发生或者疾病恶化，但是其可能显示效力的剂量，即大剂量会导致高概率的副作用。因此，一种具有高安全性并且可被安全使用的缓解体内氧化胁迫的物质(抗氧化剂)仍未被发现。
发明概述
本发明的目的是提供一种具有良好安全性的抗氧化剂，其能缓解体内氧化胁迫。
作为解决上述问题的研究结果，发明人发现具有高安全性的还型原辅酶Q和氧化型辅酶Q有缓解体内氧化胁迫的抗氧化效力。
即，本发明涉及一种缓解氧化胁迫的组合物，其含有作为活性成分的辅酶Q。
发明详述
本发明的缓解氧化胁迫的组合物含有作为活性成分的辅酶Q，如化学式(1)和/或化学式(2)所示：
(其中n代表整数1到12)
(其中n代表整数1到12)
辅酶Q是分布在从细菌到哺乳动物的广泛多种生物活体中的一种基本成分。众所周知，辅酶Q是存在于有机细胞线粒体电子传递链中的一个组分。并且已知，辅酶Q在线粒体中参与氧化/还原循环，从而在电子传递链中行使传递组分的功能，还原型辅酶Q在体外显示抗氧化功能。人的辅酶Q主要由辅酶Q10组成，在它的侧链中有10个重复结构。还原型辅酶Q10在体外显示抗氧化活性，氧化型辅酶Q10不显示抗氧化活性。但是，氧化型辅酶Q10在还原酶作用下在体内可被转换为还原形式。
辅酶Q10的高安全性被认为是其重要特性。据报道，在大鼠的慢性毒性试验中，在日剂量1200mg/kg/d、连续52个星期的给药过程中没有观察到毒性效应(K.D.Williams等，J.Agric.Food Chem，47，3756-3763，1999)。对人(体重50公斤)给药时，将日剂量1200mg/kg/d转换成60g/d。由于在美国和欧洲作为健康食品使用的辅酶Q10常规剂量是100到300mg/d，所以辅酶Q10认为是具高安全率的添加材料。
辅酶Q由化学式(1)和/或化学式(2)所示：
(其中n代表整数1到12)
(其中n代表整数1到12)
氧化型辅酶Q如化学式(1)所示，还原型辅酶Q如化学式(2)所示。
如化学式(1)和(2)所示，侧链上有1到12个重复单元(每个化学式中的n)的辅酶Q可以在本发明中使用。尤其优选使用侧链上有10个重复单元的辅酶Q，即辅酶Q10。
制备氧化型辅酶Q和还原型辅酶Q的方法无特别限制。例如，可行的方法包括通过传统已知方法，如合成、发酵或者从天然来源中提取来制备辅酶Q，然后从层析洗脱物中浓缩氧化型辅酶Q级分或还原型辅酶Q级分。氧化型辅酶Q可以通过已知的方法制得。另一方面，当想要得到还原型辅酶Q时，按照传统方法中将辅酶Q还原为还原型辅酶Q的要求，在辅酶Q中加入常用的还原剂如硼氢化钠、氢硫化钠(亚硫酸氢钠)等，然后将还原型辅酶Q通过层析浓缩。还原型辅酶Q也可以通过使已有的高纯度辅酶Q与还原剂反应的方法得到。
在本发明中，还原型辅酶Q和氧化型辅酶Q可以单独使用，或者使用氧化型和还原型的混合剂。在辅酶Q10的应用中，还原型和氧化型的混合剂比单独的氧化型有更高的口服吸收性(WO98/07417)，因此含有还原型的辅酶Q10更适宜作口服剂。在这种情况下，从口服吸收性的角度讲，还原型辅酶Q10在辅酶Q10总量中的比率优选为20wt％或更多，更优选为40wt％或更多，最优选为60wt％或更多。虽然比率的上限没有被限制，但是其上限通常为99wt％或更少。
虽然本发明组合物中的辅酶Q总含量没有被特别地限制，但是从疗效的角度讲，含量优选为从0.001wt％到99wt％，更优选为从0.01wt％到20wt％。
本发明的组合物，除辅酶Q之外，可以包括任何在医学上或者食品卫生法中可接受的添加剂。当组合物被用作对抗各种疾病之一的对策时，组合物可以与用于某一疾病的药物联合使用。此外，可以加入另外的抗氧化剂、健康食品材料、添加材料和维生素。由于还原型辅酶Q已知具有再生维生素E的能力，所以还原型辅酶Q和维生素E的组合物期望可以显示协同作用。
本发明组合物的给药形式可以是液体或者固体，并且给药方式可以是任何方式，比如口服、注射给药、鼻滴剂、眼滴剂或栓剂、食用含辅酶Q的食物等。通常，从剂量的角度讲，口服是有效的。但是，当组合物被用于局部疾病或者当口服有困难时，本发明组合物的除口服之外的任何给药方式都可以考虑。可以想到的所述给药方式的例子包括：以预防糖尿病性视网膜病为目的的眼滴剂给药，对口服营养物有困难的患者、老年人或婴儿采用栓剂给药，对皮肤病采用外用制剂给药等。但是，给药方式并不限于这些例子。
本发明的组合物可以通过加入辅酶Q作为活性成分和根据需要添加各种添加剂来制备。
在本发明组合物的口服给药中，人每公斤体重的辅酶Q剂量优选为0.1mg/d到500mg/d，更优选为1mg/d到100mg/d，最优选为2mg/d到75mg/d。
本发明组合物具有缓解体内氧化胁迫的抗氧化功能。辅酶Q的体内抗氧化功能是第一次由本发明公开。因此，本发明组合物对治疗和/或预防由氧化胁迫引起的疾病是有效的。
如上所述，作为辅酶Q一种类型的辅酶Q10具有高安全性，因此体内使用含辅酶Q10的组合物没有副作用的危险。这一性质是已知具有相同抗氧化功能的维生素E所不具有的，因此此性质可以看作本发明组合物的优良特性。
【附图说明】
图1是柱图，显示以还原型或氧化型辅酶Q10给药SD大鼠后，大鼠尿中8OH-dG的量，其中尿中的8OH-dG量如纵标所示，图中还示出n＝3时的平均值±SD数据，*表示在检验显著性差异的student t检验中相对于有5％风险率对照组的显著性。
图2是柱图，显示以还原型或氧化型辅酶Q10给药GK大鼠后，大鼠尿中的8OH-dG量，其中尿中的8OH-dG量如纵标所示，n＝4时的平均值±SD数据也已显示。在图中，“Cont.”表示对照组，“Red.”表示还原型辅酶Q10给药组，“Ox”表示氧化型辅酶Q10给药组，“VE”表示维生素E给药组。在图表中，给药2周后的测定值显示在左半边，给药4周后的测定值显示在右半边。在图表中，**和*分别显示在检验显著性差异的student t检验中相对于有1％和5％风险率对照组的显著性。
图3是柱图，显示以还原型或氧化型辅酶Q10给药KK-Ay小鼠后，小鼠尿中的8OH-dG量，其中尿中的8OH-dG量如纵标所示，图中还显示n＝11时的平均值±SD数据，*显示在检验显著性差异的student t检验中相对于有5％风险率对照组的显著性。
实现发明的最佳方式
虽然本发明将会在下面结合实施例作进一步的详细描述，但是本发明并不被限制到所述实施例。
缓解体内氧化胁迫的效力由作为高效氧化胁迫标记物的尿中的8-羟基脱氧鸟苷(8OH-dG)来评价。此物质由氧化胁迫引起的核酸损伤产生，并且未经进一步的新陈代谢就排入尿中。因此认为体内氧化胁迫程度和排出的8OH-dG量之间有着密切相关性。尿中该物质的量减少意味着体内氧化胁迫减少，和对核酸损伤的预防。
(实施例1)在正常大鼠中缓解氧化胁迫的效力
氧化型辅酶Q10或还原型辅酶Q10(含约2％氧化型辅酶Q10)的大豆油溶液对SD大鼠(6周龄，雄性)口服给药4周，给药量100mg/kg/d。4周后收集尿液，尿中的8OH-dG量采用ELISA试剂盒(日本老化制御研究所)测定。结果如图1所示。在氧化型辅酶Q10给药组，尿中的8OH-dG量显著减少到约为溶剂对照组(尿中的8OH-dG假定为100％)的60％。在还原型辅酶Q10给药组，尿中的8OH-dG量显著减少到约为溶剂对照组的40％。
(实施例2)在先天性糖尿病大鼠中缓解氧化胁迫的效力
还原型和氧化型辅酶Q10体内缓解氧化胁迫的效力使用由体内氧化胁迫诱发脾组织变性的先天性糖尿病GK大鼠来评价。GK大鼠(5周龄，雄性，每组4只)自由摄取含0.1wt％还原型辅酶Q10(含约2wt％氧化型辅酶Q10)或氧化型辅酶Q10的饲料(CE-2，日本CLEA INC.生产)。在对照组中，大鼠自由摄取不含辅酶Q10的饲料。2周和4周后收集尿液，尿中的8OH-dG量采用实施例1中相同的方法测定。结果如图2所示。在还原型辅酶Q10给药组，给药2周后测定的尿中的8OH-dG量明显减少到约为对照组(尿中的8OH-dG假定为100％)的40％，并且给药4周后测定的尿中的8OH-dG量保持在同一水平。在氧化型辅酶Q10给药组，给药2周后测定的尿中的8OH-dG量减少到约为对照组的58％，并且给药4周后测定的尿中的8OH-dG量减少到约为对照组的52％。氧化型辅酶Q10给药组尿中的8OH-dG量虽然比还原型辅酶Q10给药组多，但比对照组明显地减少。
(参考例1)维生素E在先天性糖尿病大鼠中的缓解氧化胁迫的效力
一种典型的抗氧化剂—维生素E缓解氧化胁迫的效力在与实施例2相同的试验体系中用GK大鼠来评价。如同辅酶Q10，维生素E以0.1wt％比例与饲料混合，其获得的食料由GK大鼠自由摄取。喂食2周和4周后测定尿中的8OH-dG量。结果如图2所示。在维生素给药组，给药2周后测定的尿中的8OH-dG量减少到约为对照组的80％，并且其只显示下跌趋势。给药4周后测定的尿中的8OH-dG量明显减少到51％。相比于实施例2的辅酶Q10给药组，2周后参考例1的缓解效力比实施例2中还原型和氧化型的效力都低，4周后与实施例2中氧化型辅酶Q10的效力在同一水平，而低于实施例2中还原型辅酶Q10的效力。此结果说明与辅酶Q10相比，维生素E需要更多的时间表达抗氧化活性。
(实施例3)在先天性糖尿病小鼠中缓解氧化胁迫的效力
还原型和氧化型辅酶Q10缓解氧化胁迫的效力的剂量依赖性使用GK大鼠所采用的相同方法来评价，不同在于使用KK-Ay小鼠，该小鼠患有先天性糖尿病，并且其血糖水平比GK大鼠高。使用的KK-Ay为5周龄雄性小鼠，每组11只进行评价。氧化型辅酶Q10或还原型辅酶Q10(含约2wt％氧化型辅酶Q10)分别以0.02％、0.1％和0.5％重量比与纯饲料(日本CLEA INC.生产)混合，然后每种混合物由KK-Ay小鼠自由摄取。在对照组，不含辅酶Q10的纯饲料由大鼠自由摄取。供给4周后收集尿液，尿中的8OH-dG量采用与实施例1相同的方法测定。结果如图3所示。与对照组相比，还原型辅酶Q10和氧化型辅酶Q10都显示了剂量依赖型缓解氧化胁迫的效力。在还原型辅酶Q10给药组，0.02wt％剂量的缓解效力低(为对照组的82％)，但在0.1wt％或更高的剂量，缓解效力明显(0.1wt％剂量：为对照组的73％，0.5wt％剂量；为对照组的56％)，在氧化型辅酶Q10给药组，观察到不具有显著性差异的剂量依赖性缓解效应，在0.5wt％剂量时尿中的8OH-dG量为对照组的78％。
如上所述，使用正常大鼠、先天性糖尿病大鼠和先天性糖尿病小鼠确认了辅酶Q10体内缓解氧化胁迫的效力。并且在每个试验中，还原型的效力都比氧化型的效力高，预计还原型辅酶Q10的效力是有用的。
并且，实施例2中使用的GK大鼠已知具有被氧化胁迫损害的脾组织，于是缓解氧化胁迫的保护效力通过辅酶Q10防止GK大鼠脾组织变性来评价。
(实施例4)对先天性糖尿病大鼠的组织保护效力
使用与实施例1相同的试验体系，评价氧化型辅酶Q10和还原型辅酶Q10(含约2wt％氧化型辅酶Q10)对GK大鼠脾组织变性的保护效力。作为对照，口服不含辅酶Q10的大豆油溶液。在辅酶Q10给药7周后，从每只大鼠中取出脾，其组织变性程度通过组织病理学评价。结果如表1所示。
表1 表现 例数 对照组还原型辅酶Q10氧化型辅酶Q10 维生素E 正常 0 0 0 0胰岛纤维化1+ 0 3 2 2胰岛纤维化2+ 4 1 2 2
胰岛纤维化＝Langerhans′胰岛组织纤维化
观察脾中已知分泌胰岛素的Langerhans′胰岛组织的纤维化。在对照组，所有4例中都观察到+2程度的纤维化(比+1程度高)。在还原型辅酶Q10给药组，在3例中观察到+1程度的纤维化，在1例中观察到+2程度的纤维化。即，观察到减少纤维化的趋势。在氧化型辅酶Q10给药组，在2例中观察到+1程度的纤维化，在2例中观察到+2程度的纤维化。即，与对照组相比，由氧化胁迫引起的组织变性减少了。但是，氧化型辅酶Q10给药组的保护效力略低于还原型辅酶Q10给药组。
(参考例2)维生素E对先天性糖尿病大鼠的组织保护效力
维生素E的组织保护效力使用与实施例4相同的方法评价。结果，如表1所示，在2例中观察到+1程度的纤维化，在2例中观察到+2程度的纤维化。这些结果与氧化型辅酶Q10相同，并且与对照组相比，组织变性减少了。但是，维生素E的组织保护效力略低于还原型辅酶Q10给药组。
作为氧化型辅酶Q10和还原型辅酶Q10对GK大鼠脾组织变性的保护效力的评价结果，发现通过施用辅酶Q10使得组织变性减少，且还原型辅酶Q10的保护功能比氧化型辅酶Q10强。对GK大鼠脾Langerhans′胰岛组织纤维化的保护效力是由于体内氧化型辅酶Q10和还原型辅酶Q10引起氧化胁迫的缓解所致。所述结果表明辅酶Q10作为缓解氧化胁迫的物质(抗氧化剂)是有用的。作为评价典型现有抗氧化剂-维生素E的结果，并相比于辅酶Q10，观察到其具有减少8OH-dG量的活性和保护脾组织免遭纤维化的活性。但是，维生素E的这两种活性与氧化型辅酶Q10在同一水平或更低，并且明显低于还原型辅酶Q10。
如上所述，维生素E不确定地表现出对人的效力。但是，当剂量加大时，其副作用可能性增加，从而很难得到安全的效力。而辅酶Q10的高安全性已被证明，且辅酶Q10表现的体内抗氧化活性等于或者高于维生素E，并且其能显著缓解体内氧化胁迫。这样就决定了辅酶Q10是对各种由氧化胁迫引起或者导致恶化的疾病有用的抗氧化剂。
工业实用性
本发明的组合物含有辅酶Q作为活性成分缓解体内氧化胁迫，并且其对许多疾病和对维护健康表现了优良的作用。