一种治疗肺癌的中药组合物及其制备方法和质量控制方法 【发明领域】
本发明涉及一种中药组合物，特别涉及用于治疗肺癌的中药组合物，同时涉及该组合物的制备方法和质量控制方法。
背景技术
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。近半个世纪来许多国家和地区肺癌的发病率和死亡事都在逐年增加，在男性公民中尤为明显。本病病因目前尚未完全明确，但是根据流行病学资料表明，本病与吸烟、大气污染和某些职业性因子如石棉、砷、铬、沥青及某些放射性物质有密切关系，内分泌紊乱可能超综合作用。现代医学对本病主要采用手术、放疗和化疗等方法，手术切除是各种治疗方法中疗效最佳的一种，然而，大约90％的肺癌病人在确诊时已无手术条件，在可手术治疗的20％病例中，五年生存率也要下降，后期也要复发，五年生存率很低。中医是中国几千年传统医学的宝贵财富，在现代科技条件下，发掘、研究，利用中医方法，研制利用中药治疗肺癌，不仅必需而且可能。
【发明内容】
本发明的一个目的在于公开一种新的治疗肺癌的中药组合物；本发明的另一个目的在于公开制备一种新的治疗肺癌中药组合物的方法；本发明目地还在于公开一种新的中药组合物的质量控制方法。
本发明药物组合物的原料药组成及配比如下(按重量份)：
熟大黄180-350重量份 急性子180-400重量份 水蛭80-280重量份
全 蝎30-150重量份 蜈 蚣30-150重量份 细辛30-150重量份
牡 蛎450-700重量份 瓜 萎150-350重量份 人参100-300重量份
补骨脂150-350重量份 金钱白花蛇10-100重量份。
本发明药物组合物的原料药组成及配比优选如下(按重量份)：
熟大黄210-270重量份 急性子210-270重量份 水蛭100-150重量份
全 蝎40-80重量份 蜈蚣40-80重量份 细辛40-80重量份
牡蛎500-580重量份 瓜 萎200-280重量份 人参140-200重量份
补骨脂200-260重量份 金钱白花蛇10-60重量份。
本发明药物还可加入常规的药物赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。
本药物组合物的制备方法：
金钱白花蛇粉碎成细粉备用；人参、补骨脂加60-90％乙醇，浸泡0.5-1.5小时后，加热回流1.5-3小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至55-65℃下相对密度重1.20-1.25，备用，药渣与余下的除金钱白花蛇之外的熟大黄等八味，加水煎煮3次，第一次0.5-1、5小时，第二，三次分别为0.3-1小时；合并煎液，滤过，滤液浓缩至55-65℃下相对密度1.20-1.25，与上述浓缩液混合均匀，加入金钱白花蛇细粉，最后经过常规工序直接或加入药学上可接受的赋型剂或者增溶剂制成临床可接受的剂型，如胶囊、片剂、口服液体制剂、颗粒剂等，优选胶囊剂。
本组合物制成药剂的质量控制方法包括鉴别和/或含量测定。
鉴别方法包括下列方法中的一种和/或几种：a.取本组合物制剂0.7g，研细参加甲醇15-30ml浸渍0.8-1.5小时，滤过，取滤液5ml，蒸干，加水使溶解，再加盐酸，置水浴上加热25-35分钟，立即冷却，用乙醚分2次提取，每次15-25ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇0.5-1.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材，同法制成对照药材溶液；再取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层板上，在25～85℃下以14-16∶4-6∶0.5-1.5比例的石油醚-甲酸乙醋-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨气中熏后，日光下检视，斑点变为红色；b.取本组合物制剂3.5g，研细、加氯仿15-25ml，浸渍0.6-1.5小时，滤过，滤液置水浴上蒸至约2ml，作为供试品溶液；另取补骨脂素，异补骨脂素对照品，加氯仿制成每1ml含2mg的混合溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～8μl，对照品溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7-9∶1-3的正己烷一醋酸乙酯为展开剂，展开，取出；晾干，喷以8-12％氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；c.取本组合物制剂3.5g，研细、加氯仿15-25ml，浸渍0.6-1.5小时，滤过，得滤渣，置水浴上挥干溶剂，加水研磨使溶解，离心，取上清液，用水饱和的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，加氨试液三倍量，摇匀，放置分层，取上层液，再加水，摇匀，放置分层；取上层液置水浴上蒸至近干时，加入中性氧化铝0.5-1.5g，拌匀、蒸干，加于中性氧化铝柱(100～220目，5g，内径9～10mm)的上部，用30-50％甲醇50-70ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂甙Rg1、Re、Rb1，对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～8μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60-75∶30-40∶8-12氧仿-甲醇-水8-15℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在90-110℃烘数分钟，分别置日光及365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显三个相同颜色的斑点，紫外光灯下，显三个相同颜色的荧光斑点。
含量测定：照高效液相色谱法，色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-用磷酸调PH为3.00的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，流动相组成比例为70-90∶15-25，检测波长289nm，理论塔板数按大黄素计算应不低于4000；对照品溶液的制备：精密称取大黄素对照品适量，加甲醇定量稀释至每1ml含10μg溶液；供试品溶液的制备，取装量差异项下的内容物，研匀、精密称取0.15g，置圆底烧瓶中，加水5ml，盐酸0.5ml，置水浴上回流25-40分钟，冷却，用乙醚萃取三次，合并乙醚液，室温挥干，残留物用甲醇溶解转至10ml量瓶中，并稀释至刻度，滤过，续滤液备用；测定法：吸取对照品溶液和供试品溶液各5～10μl注入液相色谱仪测定，记录色谱图，按峰面积值用外标法计算含量，本组合物物制剂每单位量含大黄素按干燥品计不得少于0.050-0.070mg。
所述每单位量是指相当原药材20g的成品药剂量。
本发明组合物治疗肺癌具有能抑制肿瘤生长、抗转移、增强免疫功能的作用；该组合物毒性甚小，临床应用安全可靠，本发明组合物制备方法先进，有效成份得到充分释放。
下面实验例用于进一步说明本发明。下列材料与仪器适用于实施例1-4。
1.药物：本组合物制剂瘀毒清(YDQ胶囊)主要成份为熟大黄，水蛭，瓜萎，蜈蚣，全蝎，牡蛎，人参等，经水煎、浓缩，干燥而成干粉，每克干粉相当于5克生药，全部试验均按干粉计算给药量。同北京东亚传统医药研究开发中心提供。批号：971212。参莲胶囊：吉林省通化生化制药厂生产，批号96001；顺氨氯铂(CDDP)：济南齐鲁制药厂生产，批号：Q1014。环磷酰胺(cy)：上海第十二制药厂生产，批号：940120。
2.动物：选用符合等级动物标准要求的SPF三级裸鼠，近交系纯种动物进行试验。三级K.M种小鼠，质量合格证：京动管质字(1994)第079号；三级C57BL/6J小鼠，质量合格证：京动管质字(1994)第075号；三级BALB/c小鼠，质量合格证：京动管质字(1994)第074号；三级BALB/c pi-nu裸鼠，质量合格证：京动管质字(1994)第074号。小鼠体重均为18～22g，雌雄兼用，同一批试验用同一性别，由中国药品生物制品检定所实验动物繁育中心供应。
3.瘤种：Lewis肺癌、人肺腺癌LAX-83，肝癌H22瘤株均为中国药品生物制品检定所药理室传代保存。
4.仪器：血球计数仪(PC604型)，经计量认证合格，北京埃尔玛产品。60Co照射条件：军事医学科学院放别医学研究所钻源室照射。
实验例1 本组合物制剂(YDQ胶囊)抑瘤试验
根据《新药审批办法》有关规定，按照国内《抗肿瘤药物筛选规程》规定方法，即按1∶3的比例以无菌生理盐水稀释成肿瘤细胞悬液，以0.2ml给小鼠皮下接种后，24小时后开始灌胃给药。实体瘤观察14天，人肺癌裸鼠移植模型观察24火，试验到期后，解剖实体瘤并称重，按平均瘤重计算瘤重抑制率。
YDQ胶囊设三个剂量组，选用lg/kg(相当于人用剂量1.56倍)为低剂量组，2g/kg(相当于人用剂量的3.1倍)为中剂量组，4g/kg(相当于人用剂量的6.2倍)为高剂量组。CDDP，(3mg/Kg)和参莲胶(4g/Kg)为阳性药.除CDDP外，其它各组给药方法均为灌胃给药。荷瘤对照组给等体积溶剂，每天一次，连续7天，停药后观察7天后解剖。计算各给药组的瘤重抑制率。
1.1对Lewis肺癌的抑瘤作用
按上述方法分组给药，实验重复三批，三批结果均表明察瘀毒清胶囊对C57BL、6J小鼠移植Lewis肺癌有明显抑瘤作用。1g/kg组的瘤重抑制率三次结果分别为37.2％，26.1％和34.5％，2g/kg组的瘤重抑制率为41.9％，38.5％和48.7％，4g/kg组的瘤重抑制率为43.2％和52.6％。见表1-1，与参莲胶囊比较抑瘤作用相当。
表1-1 YDQ胶囊对小鼠Lewis肺癌的抑制作用
组别 鼠数 体重(克) 瘤重(克) 瘤重 P值
(始/终) (始 终) ( x±SD) 抑制率(％)
对照组 10/10 17.9±0.4 20.9±1.4 1.48±0.54 ---- ----
CDDP 10/10 18.1±0.8 17.5±1.3 0.62±0.18 58.1 ＜0.01
参莲胶囊 10/10 18.3±0.8 21.0±1.2 0.95±0.27 35.8 ＜0.05
治疗组
1g/kg 10/10 17.7±0.3 20.5±1.2 0.93±0.26 37.2 ＜0.01
2g/kg 10/10 18.6±0.9 20.1±1.0 0.86±0.29 41.9 ＜0.01
4g/kg 10/10 18.5±0.7 19.1±1.1 0.84±0.18 43.2 ＜0.01
对照组 10/10 18.4±0.7 21.6±1.7 2.18±1.00 ---- ----
CDDP 10/10 18.2±0.8 18.6±1.1 0.88±0.31 59.6 ＜0.0.1
参莲胶囊 10/10 17.9±0.4 20.1±1.1 1.35±0.42 38.1 ＜0.05
治疗组
1g/kg 10/10 18.3±0.8 20.8±1.7 1.61±0.82 26.1 ＞0.05
2g/kg 10/10 18.2±0.8 21.0±0.7 1.34±0.61 38.5 ＜0.05
4g/kg 10/10 18.4±1.1 19.9±0.9 1.28±0.56 41.3 ＜0.05
对照组 10/10 18.7±0.6 22.4±1.5 2.32±0.92 ---- ----
CDDP 10/10 19.1±0.7 19.2±0.8 0.81±0.32 65.1 ＜0.01
参莲胶囊 10/10 19.1±0.8 20.1±2.1 1.35±0.39 41.8 ＜0.01
治疗组
1g/kg 10/10 19.5±0.8 21.1±1.5 1.52±0.57 34.5 ＜0.05
2g/kg 10/10 19.6±0.9 21.6±1.0 1.19±0.65 48.7 ＜0.01
4g/kg 10/10 19.8±1.1 22.2±1.4 1.10±0.39 52.6 ＜0.01
t测验：各给药组平均瘤重与对照组平均瘤重比较
1.2对人肺腺癌LAX-83裸鼠移植模型的抑瘤作用按茁述方法稠成细胞悬液，给每只裸鼠右腋部下接种0.2ml，在移植肿瘤7天后，肉眼可见小米粒大小的瘤体，经挑选后。将长瘤裸鼠随机分组。每组8只，灌胃给药，每天一次，连续7天。停药后观察17天，解剖瘤体并称重，计算瘤重抑制率。实验重复三批。结果表明，YDQ胶囊对人肺腺癌LAX-83裸鼠移植模型有明显抑瘤作用。1g/kg组的瘤重抑制率三次结果分别为16.7％、30.8％t和24.8％；2g/kg组的瘤重抑制率为34.3％、35.5和34.1％；4g/kg组的瘤重抑制率为38.1％、37.4％和41.1％。见表1-2，与参莲胶囊比较抑瘤作用相当。
表1-2 YDQ胶囊对人肺腺癌LAX-83移植裸鼠模型的抑制作用
组别 鼠数 体重(克) 瘤重(克) 瘤重 P值
(始/终) (始 终) ( x±SD) 抑制率(％)
对照组 8/8 22.5±1.3 24.9±1.2 2.10±0.50 ---- ----
CDDP 8/8 23.4±2.2 20.1±1.8 0.72±0.15 65.7 ＜0.01
参莲胶囊 8/8 21.8±1.5 22.5±1.4 1.36±0.61 35.2 ＜0.05
治疗组
1g/kg 8/8 21.4±1.2 23.8±1.6 1.75±0.43 16.7 ＞0.05
2g/kg 8/8 20.9±0.7 22.8±2.0 1.38±0.39 34.3 ＜0.01
4g/kg 8/8 20.9±1.4 22.9±1.9 1.30±0.43 38.1 ＜0.01
对照组 8/8 21.0±1.3 22.3±2.1 2.11±0.36 ---- ----
CDDP 8/8 20.3±1.4 19.4±0.7 0.82±0.39 61.6 ＜0.01
参莲胶囊 8/8 20.2±1.3 20.9±2.6 1.34±0.51 36.5 ＜0.01
治疗组
1g/kg 8/8 19.4±0.9 20.9±0.5 1.46±0.43 30.8 ＜0.01
2g/kg 8/8 20.7±1.3 21.3±0.6 1.36±0.37 35.5 ＜0.01
4g/kg 8/8 20.8±1.5 22.2±2.4 1.32±0.49 37.4 ＜0.01
对照组 8/8 20.8±1.0 22.2±1.7 2.14±0.33 ---- ----
CDDP 8/8 20.1±1.1 18.9±0.6 0.82±0.35 61.7 ＜0.01
参莲胶囊 8/8 19.8±1.3 21.8±1.6 1.38±0.50 35.5 ＜0.01
治疗组
1g/kg 8/8 19.7±0.9 21.9±1.7 1.61±0.51 24.8 ＜0.05
2g/kg 8/8 19.5±1.4 22.6±1.0 1.41±0.35 34.1 ＜0.01
4g/kg 8/8 19.9±0.9 23.3±1.8 1.26±0.39 41.1 ＜0.01
t测验：各给药组平均瘤重与对照组平均瘤重比较
1.3对Lewis肺瘤的抗转称作用按前述方法制成癌细胞悬液。于每只C57 BL/6J鼠左后腿皮下接种0.2ml，24小时开始给药。连续7天，第八大行截肢术，切除原发灶，延长已肺转移鼠的生命，第25天解剖取肿，经固定处理计数转移灶数。按肿瘤抑制率＝(C-T)/C×100公式计算抗转移率。试验重复二批结果表明YDQ胶囊对Lewis肺癌具有抗转移作用。1g/kg组的抗转移率为24.8％和25.5％g/kg组的抗转移率为45.1％和44.0％；4g/kg组的抗转移率为48.9％和53.7％。见表1-3。
表1-3YDQ 囊对小鼠Lewis肺癌的抗转移作用
组别 鼠数 瘤重(克) 肿瘤抑制率 肺转移灶数(个) 抗转移率 P值
(始/终) (x±SD) (％) ( x±SD) (％)
对照组 10/10 2.24±0.65 ---- 13.3±6.7 ---- ----
CDDP 10/9 0.76±0.17 66.1** 3.0±1.6 77.4 ＜0.01
参莲胶囊 10/10 1.45±0.72 35.3* 8.2±3.0 38.3 ＜0.05
治疗组
1g/kg 10/10 2.07±0.43 7.8 10.0±5.1 24.8 ＜0.05
2g/kg 10/10 1.31±0.46 41.5** 7.3±3.0 45.1 ＜0.05
4g/kg 10/10 1.11±0.30 50.4** 6.8±4.5 48.9 ＜0.05
对照组 10/10 2.53±0.20 ---- 13.4±4.8 ---- ----
CDDP 10/10 0.89±0.26 64.8** 3.1±1.9 76.9 ＜0.01
参莲胶囊 10/10 1.50±0.59 40.7** 9.8±3.3 30.6 ＜0.05
治疗组
1g/kg 10/10 2.20±0.20 13.0** 710.0±4.1 25.4 ＞0.05
2g/kg 10/10 1.64±0.70 35.2** 7.5±3.5 44.0 ＜0.01
4g/kg 10/10 1.40±0.57 44.5** 6.2±2.9 53.7 ＜0.01
*P＜0.05 **：p＜0.01
t测验，各给药组平均肺转移灶数与对照组平均肺转移灶数比较
实验例2 本组合物制剂(YDQ胶囊)对增强荷瘤鼠机体免疫功能的影响
2.1 重对荷瘤鼠血清溶菌酶含量的影响
实验用小鼠Lewis肺癌。选生长良好的瘤种按1∶3制成瘤细胞悬液，给每只C5 BL/6J小鼠右腿皮下接种0.2ml作抑瘤试验。实验结束时，采血分离血清，以微球菌制成菌体的琼脂板。用前在板上打孔。孔径为3mm，孔中加入标准溶菌酶10μl，37℃保温一定时间，测量溶菌环直径。绘制半对数樯准曲线，求出血清中溶菌酶含量。试验结果表明.YDQ胶囊对Lewis肺癌荷瘤鼠具有活化单核巨噬细胞功能，增加荷瘤鼠血清溶菌酶含量。试验重复二批YDQ胶囊低、中、高三个剂量组的血清溶菌酿含量分别为34.4g/ml 36.5μg/ml 39.2μg/ml和32.7μg/ml、36.0μg/ml和38.2μg/ml。见表2-1与，参莲胶囊比较，未见明显差别。
表2-1YDQ胶囊对小鼠Lewis肺癌荷瘤鼠血清溶菌酶含量的影响
组别 鼠数 瘤重(克) 肿瘤抑制率 溶菌酶含量 P值
(始/终) ( x±SD) (％) (μg/ml)
对照组 10/10 1.48±0.54 ---- 26.2±3.7 ----
CDDP 10/10 0.62±0.18 58.7** 25.4±6.9 ＞0.05
参莲胶囊 10/10 0.95±0.27 35.8* 34.8±7.4 ＜0.01
治疗组
1g/kg 10/10 0.93±0.26 37.2** 34.4±5.2 ＜0.01
2g/kg 10/10 0.86±0.29 42.1** 36.5±8.6 ＜0.01
4g/kg 10/10 0.84±0.18 43.5** 39.2±7.5 ＜0.01
对照组 10/10 2.32±0.92 ---- 23.5±4.7 ----
CDDP 10/10 0.81±0.32 65.1** 24.7±4.6 ＞0.05
参莲胶囊 10/10 1.35±0.39 41.8** 32.8±5.8 ＜0.01
治疗组
1g/kg 10/10 1.52±0.57 34.5* 32.7±5.8 ＜0.01
2g/kg 10/10 1.19±0.65 48.7** 36.0±5.2 ＜0.01
4g/kg 10/10 1.10±0.39 52.6** 38.2±7.7 ＜0.01
*：P＜0.05 **：p＜0.01
t测验，各给药组平均溶菌酶含量与对照组平均溶菌酶含量比较
2.2对荷瘤鼠迟发型变态反应(PTH)的影响
试验用小鼠肝癌H22实体型瘤谱，选生长良好的瘤种按1∶3制成瘤细胞悬液，给每只BALB/C小鼠皮下接种0.2ml。按前述方法分组给药。另设一组正常小鼠为脾指数对照。在给药同一天。除正常鼠组以外。将各组小鼠用1％二硝基氟苯(DNFB)10μl于腹部皮下致敏。7天后再用1％二硝基氟苯(DNFB)10μl于每只小鼠左足趾部皮下攻击。右足趾用溶媒10μl作对照，24小时后取左、右足称重，以足肿胀度表示反应强弱。同时解剖荷兰鼠。取脾和瘤体称重。计算脾指数和瘤重抑制率。以足重差。脾指数。瘤重抑制率三项指标观察YDQ胶曩对致敏性T淋巴细胞的影响。试验重复2次，2次结果均表明。YDQ胶囊对T细胞介导的迟发性变态反应具有免疫增强作用。
YDQ胶囊各给药组的胖指数与正常鼠组比较明显增高、足重差加大、迟发性变态反应增强。并能抑制肿瘤生长。见表2-2，与参莲胶囊比较，未见明显差异。
表2-2 YDQ胶囊对肝癌H22荷瘤鼠迟发型变态反应(PTH)的影响
组别 鼠数 脾指数 瘤重(克) 肿瘤抑制率 足重差(mg)
(始/终) (mg/20g体重) ( x±SD) (％) ( x±SD)
正常鼠 10/10 1.00 ---- ---- ----
荷瘤鼠 10/10 2.09** 1.10±0.30 ---- ----
致敏对照 10/10 2.21** 0.83±0.12 24.5 52.5±17.5
参莲胶囊 10/10 2.13** 0.77±0.13 30.3 76.8±23.6*
1g/kg 10/10 2.55** 0.75±0.13 31.8 92.6±26.9**
2g/kg 10/10 2.58** 0.69±0.08 37.3 84.5±18.6**
4g/kg 10/10 2.49** 0.73±0.08 33.6 152.8±36.3**
正常鼠 10/10 1.00 ---- ---- ----
荷瘤鼠 10/10 2.15** 1.15±0.37 ---- ----
致敏对照 10/9 2.16** 0.95±0.21 17.4 74.0±31.7
参莲胶囊 10/10 1.92** 0.69±0.14 40.0* 102.0±36.0
1g/kg 10/10 2.21** 0.76±0.13 33.9* 106.9±43.4
2g/kg 10/10 2.19** 0.68±0.11 40.9** 122.2±47.3**
4g/kg 10/10 2.48** 0.67±0.11 41.7** 128.2±23.0**
*：p＜0.05 **：p＜0.01
t测验，各给药组平均足重量差比较
2.3对产生肿瘤坏死因子的影响
肿瘤坏死因子(RNF)是油激活巨噬细胞产生的一种细胞因子，其抗肿瘤作用表现为直接的细胞毒作用(Cytotoxicity)[2]。YDQ胶囊按前述方法分组给药，用厌氧棒状菌苗(cp)为阳性对照药，0.5g/ml ip一次给药事7天后，停药24小时后给各组每只鼠iv LPS 10mg/0.2ml小时后采血，分离血清，检测TNF活性，解剖小鼠取肺和瘤体，分别计算脾指数和肿瘤抑制率。
TNF活性检测：用微量细胞毒试验法，将传代7天生长旺盛的S180肿瘤细胞制成靶细胞，用RPNH 1640营养液调细胞数为4×102/ml，于96孔板上每孔加细胞悬液100ul.再加待检血清500l，混匀，37℃，5％CO2培养箱培养24小时。用血球计数板计数200个肿瘤细胞中死细胞数。按给药组死细胞数/对照组死细胞数计算直接细胞毒活性指数。试验重复二批，结果表明：经给药7天YDQ胶囊小鼠，单核巨噬细胞功能增强，脾指数增高，能抑制肿瘤生长。再静脉注射诱出剂LPS后，血清中TNF活性明显增强，1g/kg组的直接细胞毒指数为2.18和2.09；2g/kg组为2.36和2.05；4g/kg组为2.26和2.12。 见表2-3，与cP菌苗比较。未见明显差异。
表2-3YDQ胶囊对增强巨嗜细胞功能产生肿瘤坏死因子的影响
组别 鼠数(只) 脾重(mg) 脾指数 死细胞数 直接细胞 P值
(始/终) (mg/20体重) (％) (％) 毒指数
对照组 10/10 125.12±15.3 ---- 21.2±2.0 ---- ----
CP菌苗 10/10 245.5±21.6 1.96* 55.6±3.4 2.62 ＜0.01
YDQ胶囊
1g/kg 10/10 206.6±28.2 1.65* 46.±10.5 2.18 ＜0.01
2g/kg 10/10 196.4±25.3 1.57* 50.1±7.3 2.36
4g/kg 10/10 211.0±21.2 1.69* 48.6±5.4 2.29
对照组 10/10 137.6±19.2 ---- 22.1±2.7 ----
CP菌苗 10/10 240.6±58.1 1.75* 53.7±4.3 2.43
YDQ胶囊
1g/kg 10/10 200.6±36.5 1.46* 46.2±1.4 2.09
2g/kg 10/10 227.8±33.5 1.66* 45.2±3.5 2.05
4g/kg 10/10 202.7±27.1 1.47* 46.8±5.7
*：P＜0.01
t测验：各给药组平均死细胞数与对照组平均死细胞数比
实验例3 本发明组合物制剂(YDQ胶囊)的协同增效作用
3.1与CDDP合用时对肺癌模型的增效作用
试验用的化疗药顺氨氯铂(CDDP)3mg/kg(相当1/5 LD50)ip，隔日给药，连续4次，为治疗高剂量：0.6mg/kg(相当1/25 LD50)ip。连续4次，为治疗低剂量。低剂量(CDDP加用YDQ胶囊中或高二个剂量组。设参莲胶囊阳性对照组，荷瘤对照组。按前述方法用Lewis肿瘤和人肺腺癌LAX-83两个瘤株模型，进行组间的对比观察，结果表明：对Lewis肿癌。CDDP高剂量组瘤重抑制率为62.4％，低剂量组为20.0％。当YDQ胶囊中、高2个剂量组分别与低剂量组CDDP合用时，其瘤重抑制率平均可达40％以上，与低剂量CDDP比较可增效2倍。对人肺腺癌LAX-83模型，CDDP高剂量组的瘤重抑制率为61.4％低剂量组为15.0％。当YDQ胶囊中、高2个剂量分别与低剂量CDDP合用时，其肿瘤抑制率可达47.6～54.1％。与低剂量CDDP相比可增效三倍以上。见表3-1，照片3-1。提示YDQ胶囊与小剂量CDDP合用具有明显增效作用。但YDQ胶囊与小剂量CDDP合用。分别与单一使用YDQ胶囊及单一使用参莲胶囊比较，均来见明显差异。
表3-1YDQ胶囊与CDDP合用时对肺癌模型的增效作用
体重(克) 瘤重抑
剂量 鼠数(只) 瘤重(克)
肿瘤模型 组别 制率 P值
(mg/kg) (始/终) (始 终) ( x±SD)
(％)
对照组 同溶剂 10/10 20.4±1.4 23.2±1.5 1.65±0.26 ---- ----
Lewis CDDP 3×4 10/10 20.3±0.7 16.9±1.2 0.62±0.18 62.4 ＜0.01
肺癌 0.6×4 10/10 19.7±1.0 19.5±1.4 1.32±0.52 20.2 ＞0.05
0.6×4+4000
CDDP参莲
10/10 20.5±0.7 22.3±2.3 1.10±0.46 33.3 ＜0.01
×7
0.6×4+2000
CDDP+YDQ
10/10 19.9±0.8 22.0±2.9 0.98±0.34 40.6 ＜0.01
×7
0.6×4+4000
10/10 19.0±0.9 21.3±1.2 0.93±0.37 43.6 ＜0.01
×7
对照组 同溶剂 8/8 21.0±0.9 24.5±1.2 2.46±0.36 ---- ----
CDDP 3×4 8/7 20.4±1.6 19.8±1.9 0.95±0.42 61.4 ＜0.01
人部腺癌 0.6×4 8/8 20.9±1.4 19.8±2.3 2.09±0.50 15.0 ＞0.05
0.6×4+4000
LAX-83 CDDP+参莲
8/8 21.0±1.1 22.7±2.1 1.30±0.53. 47.2 ＜0.05
×7
0.6×4+2000
CDDP+YDQ
8/8 21.1±1.2 23.0±1.4 1.29±0.56 47.6 ＜0.01
×7
0.6×4+4000
8/8 19.9±1.5 23.3±1.9 1.13±0.44 54.1 ＜0.01
×7
T检验：各给药组平均瘤重与对照组平均瘤重比较
3.2与60Co照射合用时对肺癌模型的增效作用
试验用60Co倍量照射率为166.6倍量/分照射。治疗剂量为4 Gy，一次性全身照射，动物分组与造模方法同3.1项。结果表明，对Lewis肺癌模型，单独4 Gy，照射剂量治疗组的肿瘤抑制率为14.2％，当瘀毒清胶囊与4 Gy用时，其肿瘤重抑制率可增高至63.9～66.2％，与单独照射相比可增效4.5倍。对人肺腺癌LAX-83模型，单独照射治疗组的肿瘤抑制率为17.3％瘀毒清胶囊中、高剂理与照射合用时，其肿瘤制率可增高至49.2～49.7％。与单独照射相比增效2.8倍。见表3-2，照片3-2。提示瘀清胶囊与照射治疗合用有明显增效作用。与参莲胶囊比较，未见明显差别。
表3-2YDQ胶囊与60Co辐射合用时对肺癌模型的增效作用
剂量 鼠数 体重(克) 瘤重抑制
肿瘤模 瘤重(克)
组别 (Gy+g/kg (只) (x±SD)
率 P值
型 ) (始/终) (始 终)
(％)
对照组 同溶剂 10/10 18.9±0.9 23.2±2.6 2.19±0.27 ---- ----
60Co照射 4 GY 10/10 19.8±1.3 19.1±2.1 1.88±0.48 14.2 ＜0.01
照射+参莲 4+4×7 10/10 19.5±1.2 19.9±1.4 0.99±0.24 54.8 ＜0.01
lewis
4+2×7 10/10 18.5±1.3 20.1±1.0 0.79±0.27 63.9 ＜0.01
肺癌 照射+YDQ
4+4×7 10/10 19.1±0.9 20.4±2.1 0.74±0.36 66.2 ＜0.01
对照组 同溶剂 8/8 21.8±2.6 26.2±2.4 1.85±0.44 ---- ----
60Co照射 4 GY 8/5 20.2±1.4 19.1±1.7
人肺腺
照射+参莲 4+4×7 8/7 20.2±0.9 22.3.±3.0
癌
照射+YDQ 4+2×7 8/6 19.4±1.3 22.0±3.0
LAX-83
4+4×7 8/7 19.5±1.0 22.1±2.3
T测验：各给药组药前体重与给药后体重比较
实验例4 本组合物制剂(YDQ胶囊)的减毒作用
按照新药(中药)抗肿瘤药效研究指南中规定方法，选用环磷酰胺(cy)、CDDP ip给药和60Co照射使正常鼠，荷瘤鼠出现体重减轻、红白细胞减少、骨髓有核细胞下降等特定毒副瓜，用YDQ胶囊以观察对放、化疗引起特定毒副瓜的减毒作用。
4.1对cy CDDP引起荷瘤鼠体重下降的影响
试验用LewiS肺癌模型cy组为ip 100mg/kg×2d。YDQ胶囊为国，高2个剂量，在给予cy同时，口服YDQ胶囊，连续7天，停药后24小时称各组小鼠体重。按3.1项方法分组。给药。在观察CDDP对Lewis肺癌、人肺腺癌两个肿瘤模型增效作用的同时观察对荷瘤鼠体重下降的影响。结果表明。cy、CDDP中毒模型组第8～14天体重下降3.1和0.2克。ip cy或CDDP同时口服YDQ胶囊组。体重增长1.9和3.4克。见表4-1。提示YDQ胶囊对荷瘤鼠由cy、CDDP中毒所致体重下降有保护作用，与参莲胶囊比较，未见明显差异。
表4-1YDQ胶囊对cy，CDDP引起荷瘤鼠体重下降的影响
肿瘤模 组别 剂量 鼠数(只) 体重(克) 体重 P值
型 (mg/kg) (始/终) (始 终) 变化
(克)
对照组 同溶剂 10/10 19.7±0.9 23.4±0.7 +3.7 ＜0.01
Lewis cy 100×2 10/10 19.8±0.9 16.7±1.0 -3.1 ＜0.01
肺癌 Cy+参莲 100×2+4000×7 10/10 19.1±1.0 20.5±1.5 +1.4 ＜0.05
Cy+YDQ 100×2+2000×7 10/10 19.9±1.1 21.9±1.3 +2.0 ＜0.01
100×2+4000×7 10/10 19.2±0.9 22.4±1.5 +3.2 ＜0.01
对照组 同溶剂 10/10 20.4±1.4 23.3±1.5 +2.9 ＜0.01
Lewis CDDP 0.6×4 10/10 19.7±1.0 19.5±1.4 -0.2 ＞0.05
肺癌 CDDP+参莲 100×2+4000×7 10/10 20.5±0.7 22.3±2.3 +1.8 ＞0.05
CDDP+YDQ 100×2+2000×7 10/10 19.9±0.8 22.0±2.9 +2.1 ＜0.05
100×2+4000×7 10/10 198.0±0.9 21.3±1.2 -2.3 ＜0.01
对照组 同溶剂 8/7 21.0±0.9 24.5±1.2 +3.5 ＜0.01
人部腺 CDDP 0.6×4 8/8 20.9±1.4 19.8±2.3 -1.1 ＞0.05
癌
LAX83 CDDP+参莲 100×2+4000×7 8/8 21.0±1.1 22.7±2.1 +0.7 ＞0.05
CDDP+YDQ 100×2+2000×7 8/8 21.1±1.2 23.0±1.4 +1.9 ＜0.01
100×2+4000×7 8/8 19.9±1.5 23.3±1.9 +3.4 ＜0.01
T测验：各给药组给药前体重与给药后体重比较
4.2对cy引起荷瘤鼠外周血象变化的影响
按4.1项所述方法分组。给药。试验结果表明。荷瘤鼠组、cy中毒模型鼠，WBC，减少：当ip cy同时口服瘀毒清胶囊WBC明显升高，见表4-2。提示瘀毒清胶囊对荷瘤鼠同cy所致，骨髓血细胞脶伤有保护作用。与参莲胶囊比较未见明显差异。
表4-2YDQ胶囊对cy引起荷瘤鼠外周血毒性反应的影响
组别 剂量 鼠数(只) WBC RBC HGB HCT
(mg/kg) (始/终) (109/L) (1012/L) (g/d1) (％)
对照组 同溶剂 10/10 7.6±1.4 4.44±0.39 24.9±4.8 29.7±4.6
Cy 100×2 10/10 7.8±1.3 3.85±0.40▲▲ 21.2±4.1▲ 23.6±1.7▲▲
Cy+参莲 100×2+4000×7 10/10 12.1±1.1** 3.91±0.15 15.0±1.3** 25.9±1.8*
Cy+YDQ 100×2+2000×7 10/10 14.5±1.7** 3.64±0.31 14.5±2.4** 24.0±2.3
100×2+4000×7 10/10 15.1±1.3** 4.04±0.10 13.8±1.4** 22.6±1.5
▲：t测验与对照组比较p＜0. 05 *t测验与cy组比较p＜0.05
▲▲：t测验与对照组比较p＜0.01 **t测验与cy组比较p＜0.01
4.3对cy引起荷瘤鼠骨髓有核细胞数减少的影响
按4.1项所述方法分组。给药，在试验到期后.解剖取每只鼠股骨，冲出骨髓.计数每根股骨有核细胞数。试验结果表明.cy中毒模型组骨髓有核细胞数明显下降。当ip注射cy同时瘀毒清胶囊。骨髓有核细胞数明显升高，见表4-3。提示瘀毒清胶囊对正常鼠由cy所致有核细胞数下降有保护作用。参莲胶囊亦有保护作用。
表4-3YDQ胶囊对cy抑制小鼠骨髓有核细胞数下降的影响
组别 剂量 鼠数(只) 骨髓有核细胞数 p值
(mg/kg) (始/终) (个×104/根股骨)(x±SD)
对照组 同溶剂 10/10 1227.5±174.6 ------
Cy 100×2 10/10 842.5±130.2▲ ＜0.01
Cy+参莲 100×2+4000×7 10/10 1235.0±198.3* ＜0.01
Cy+YDQ 100×2+2000×7 10/10 1300.0±212.5* ＜0.01
100×2+4000×7 10/10 1430.0±148.2* ＜0.01
▲：t测验与对照组比较
*：t测验与cy组比较
4.4对60Co引起荷瘤鼠体重下降的影响
试验用昆明小鼠。用60CO 6Gy亚致死剂量全身照射，瘀毒清胶囊为中，高2个剂量组。
按3.2项所述方法分组给药，在照小时开始口服瘀毒清胶囊，连续7天，停药后24小时称各组小鼠重。观察毒清胶囊与60Co照射合用时对Lewis肺癌。人肺腺癌两个肿瘤模型增效作用的同时观察对荷瘤鼠体重下降的影响。结果表明。经60Co 6Gy 4Gy全身照射的正常鼠和荷瘤治疗鼠，第8～14天体重下降0.7～1.1克，在照射后2小时，口服瘀毒清胶囊的正常鼠和茶瘤治疗鼠体重增长1.3～4.2克，见表4-4。提示瘀毒清胶囊对正常鼠荷瘤同60Co照射所至体重下降有保护作用。与参莲胶囊比较，未见明显差异。
表4-4YDQ胶囊对60Co照射引起荷瘤鼠体重下降的影响
肿瘤模型 组别 剂量 鼠数(只) 体重(克) 体重变化 p值
(Gy+g/Kg) (始/终)
(始 终) (克)
昆明种 对照组 同溶剂 10/10 23.1±1.5 30.7±1.9 +7.6 ＜0.01
正常鼠 60o照射 6GY 10/10 23.0±0.8 22.2±1.4 -0.8 ＞0.05
照射+参莲 6+4×7 10/10 22.8±1.4 24.5±1.9 +1.7 ＜0.05
照射+YDQ 6+2×7 10/10 23.2±1.0 27.2±1.0 +4.0 ＜0.01
6+4×7 10/10 22.9±1.0 27.1±1.2 +4.2 ＜0.01
Lewis 对照组 同溶剂 10/10 18.9±0.9 23.2±2.6 +4.3 ＜0.01
肺癌 60Co照射 4GY 10/10 19.8±1.3 19.1±2.4 -0.7 ＞0.05
照射+参莲 4+4×7 10/10 19.5±1.2 19.9±1.4 +0.1 ＞0.05
照射+YDQ 4+2×7 10/10 18.5±13 20.1±1.0 +1.6 ＜0.05
4+4×7 10/10 19.1±0.9 20.4±2.1 +1.3 ＞0.05
人肺腺癌 对照组 同溶剂 8/8 21.8±2.6 26.2±2.4 +4.4 ＜0.01
LAX83 60Co照射 4GY 8/5 20.2±1.4 19.1±1.7 -1.1 ＞0.05
照射+参莲 4+4×7 8/7 20.0±0.9 22.3±3.0 +2.3 ＜0.05
照射+YDQ 4+2×7 8/6 19.4±1.3 22.0±3.0 +2.6 ＜0.05
4+4×7 8/7 19.5±1.0 22.1±2.3 +2.6 ＜0.01
t测验：各给药组给药前体重与给药后体重比较
4.5对60Co照射引起正常鼠外周血毒性反应的影响
按4.4所述方法分组、给药，试验结果表明，正常鼠经60Co亚致死量照射后，WBC损伤非常严重，60Co照射模型组WBC为1.2×100/L，照射后口服瘀毒清胶囊高剂量组为2.6×100/L(p＜0.01)。见表4-5。提示瘀毒清胶囊对60Co照射引起小鼠WBC损伤有一定保护作用。
表4-5YDQ胶囊对60Co亚致死量照射引起正常鼠外周血毒性反应的影响
组别 剂量 鼠数(只) WBC RBC HGB HCT
(Gy+g/Kg) (始/终) (1012/L) (1012/L) (g/dl) (％)
正常鼠对照组 同溶剂 10/10 5.2±1.5 6.89±0.90 19.4±1.3 37.6±3.0
60Co照射 6GY 10/10 1.2±0.7▲ 5.22±0.77▲ 14.4±0.7▲ 28.9±4.0▲
照射+参莲 6+4×7 10/10 1.4±1.9 5.46±1.01 14.4±2.7 29.7±4.9
照射+YDQ 6+2×7 10/10 1.4±0.4 6.18±0.68** 18.2±1.2** 33.4±3.1**
6+4×7 10/10 2.6±2.0* 5.47±1.21 18.4±0.8** 30.4±5.4
▲：t测验与正常鼠比较p＜0.01 *t测验与正常鼠比较p＜0.05
**：t测验与正常鼠比较p＜0.01
4.6对60Co照射引起正常鼠骨髓有核细胞数减少的影响
按上述及4.4项所述方法分组，给药，在试验到期后，解剖取每只鼠股骨，冲出骨髓，计数每根股骨有核细胞数，试验结果表明，60Co中毒模型组骨髓有核细胞数明显下降。当照射后口服YDQ胶囊，骨髓有核细胞数明显升高，接近正常鼠的水平，见表4-6。提示YDQ胶囊对正常鼠同60Co所致有核细胞数下降有保护作用。参莲胶囊亦有保护作用。
表4-6YDQ胶囊对60Co亚致死量照射引起正常鼠骨髓有核细胞数减少的影响
组别 剂量 鼠数(只) 骨髓有核细胞数 p值
(Gy+g/Kg) (始/终) (个×104/根股骨) (x±SD)
正常鼠对照组 同溶剂 10/10 186.3±16.8 -----
60Co照射 6GY 10/10 103.3±9.4▲ ＜0.01
照射+参莲 6+4×7 10/10 125.8±29.2* ＜0.05
照射+YDQ 6+2×7 10/10 165.3±22.5* ＜0.01
6+4×7 10/10 174.0±13.9* ＜0.01
▲：t测验与正常鼠比较
*：t测验与正常鼠比较
实验例5 本发明组合物提取工艺研究实验
1、人参和补骨脂的醇提工艺优化
影响提取效果的主要因素是乙醇浓度、溶媒量、提取时间和提取次数。以HPLC测定补骨脂素为指标，采用正交实验设计来筛选其最佳提取工艺，以下交表L9(34)安排实验[2]。称取全方1/20的相应醇提药：人参和补骨脂，按表5-1安排实验，回流提取，测定。结果见表5-2。
表5-1 醇提正交实验因素水平表
因素
水平
A(乙醇浓度)(％) B(溶媒量)(倍) C(提取时间)(h) D(提取次数)(次)
1 95 10 3 3
2 85 8 2 2
3 75 6 1 1
5-2 醇提实验具体实施方案及结果表
试验号 因子 补骨脂数含 浸膏收率
A B C D 量(mg/g) (％)
1 95 10 3 3 17.28 8.33
2 95 8 2 2 17.65 7.68
3 95 6 1 1 14.06 7.19
4 85 10 2 1 17.02 8.81
5 85 8 1 3 15.82 9.88
6 85 6 3 2 14.88 9.34
7 75 10 1 2 15.55 10.52
8 75 8 3 1 14.15 9.47
9 75 6 2 3 15.13 9.83
K1 48.99 49.85 46.31 48.23
K2 47.72 47.62 49.80 48.08
K3 44.83 44.07 45.43 45.23
R1 4.16 5.78 4.37 3.00 以补骨脂索含量分析
K1′ 23.20 27.66 27.14 28.04
K2′ 28.12 27.03 26.32 27.54
K3′ 29.82 26.36 27.59 25.47
R2 6.62 1.30 1.27 2.57 以浸膏收率分析
结果的直观分析：
按浸膏收率分析，影响浸膏收率因素的排列顺序A＞D＞B＞C。然而，由极差R1的大小顺序可知，对补骨脂素含量影响较大的是B和C，A和D则处于闪要地位。影响因素的排列顺序为B＞C＞A＞D，其最佳提取条件为A1B1C2D1(1)。结合工业化生产的安全及成本等，把乙醇浓度(A)调整为85％。另外，考虑到此二药的醇提药渣还要并入水提药材一起再提取，为了节能、省时，因此，把提取次数(D)改为提取1次。综合各种因素，调整后较佳提取条件为A2B1C2D3(H)，这样补骨脂素含量和浸膏收率都较高。分别投料5批，对最佳提取条件I和较佳提取条件II进行验证实验，结果见表5-3。
表5-3 醇提取实验验证结果表
实验号 1 2 3 4 5 X±SD
补骨脂素含量(mg/g) I 16.17 15.50 15.38 15.81 15.91 15.75±0.32
II 15.33 15.63 15.22 15.43 15.47 15.42±0.16
浸膏收率(％) I 7.28 6.72 7.33 7.51 6.88 7.14±0.33
II 8.21 7.84 8.32 7.73 7.78 7.98±0.27
表5-3结果表明，结合生产实际，采用较佳条件的验证结果与最佳条件的验证结果无显著性差别，因此，该醇提工艺条件是最佳搭配，即将人参和补骨脂用10倍量85％的乙醇浸泡1h，热回流2h，提取1次。
2、牡蛎对大黄有效成分提取的影响
称取全方1/20的大黄各5份，另称取全方1/20的大黄和牡蛎各5份。分别加20倍水，浸泡1h，煎煮1h，测定大黄素含量，计算出100g大黄素的收率，结果见表5-4。
表5-4 大黄单煎(1)及与牡蛎合煎(H)的大黄素收率(％)
实验号 1 2 3 4 5 X±SD
I 0.12 0.10 0.08 0.09 0.11 0.10±0.016
II 0.08 0.09 0.10 0.11 0.08 0.09±0.013
由表5-4的结果可知：牡蛎与大黄一起煎煮，对大黄有效成分的提取无显著性影响。
3、水煎工艺的优化
影响中药材水煎煮提取的主要因素有浸泡时间，用水量，煎煮时间、煎煮次数为了合理有效地优选这些工艺条件，采用正交实验设计，按正交表L9(34)安排实验。以HPLC测定本方中大黄的有效成分大黄素为指标，来筛选较优的条件。称取全方1/20的水提药材及醇提药渣总重为100g，按表5-6安排实验，进行水煎煮提取。结果见表5-7。
表5-5水提正交实验因素水平表
因素
水平
A(浸泡时间)(h) B(总加水量)(倍) C(总煎煮时间)(h) D(提取次数)(次)
1 1 10 1 1
2 2 15 2 2
3 3 20 3 3
表5-6水提正交实验安排表
实验号 A(h) B(倍) C(h) D(次)
1 1 10 1 1
2 1 15(8，7) 2(1，1) 2
3 1 20(8，6，6) 3(2，0.5，0.5) 3
4 2 20(8，6，6) 2(1，0.5，0.5) 3
5 2 15 3 1
6 2 20(12，8) 1(0.5，0.5) 2
7 3 10(6，4) 3(2，1) 2
8 3 15(6，5，4) 1(0.5，0.25，0.25) 3
9 3 20 2 1
表5-7水提正交实验结果及分析表
因子 大黄素含量 浸膏收率
试验号
A B C D (mg/g) (％)
1 1 1 1 1 0.56 7.23
2 1 2 2 2 0.69 9.18
3 1 3 3 3 0.80 10.89
4 2 1 2 3 0.75 10.06
5 2 2 3 1 0.49 8.94
6 2 3 1 2 0.74 9.49
7 3 1 3 2 0.66 9.01
8 3 2 1 3 0.76 10.25
9 3 3 2 1 0.64 8.92
K1 2.05 1.97 2.06 1.69
K2 1.98 1.94 2.08 2.09
K3 2.06 2.18 1.95 2.31
R1 0.08 0.24 0.13 0.62 以大黄素含量分析
K1′ 27.30 26.30 26.97 25.09
K2′ 28.49 28.37 28.16 27.68
K3′ 28.18 29.30 28.84 31.20
R2 1.19 3.00 1.87 6.11 以浸膏收率分析
结果的直观分析
按浸膏收率分析，影响收膏收率最主要的因素是煎煮次数，其次是加水量和煎煮时间，其最佳搭配为A2B3C3D3。按大黄素含量分析，由极差R1的大小可知，影响因素的排列顺序为D＞B＞C＞A，其最佳提取工艺为A1B3C2D3(因为A1的K值与A3几乎相等，所以为了省时取A1)，而且，收膏率也较高，按此最佳条件分别投料5批，进行验证实验，结果见表5-8。
表5-8水提验证实验结果
实验号 1 2 3 4 5 x±SD
大黄素含量(mg/g) 0.71 0.73 0.74 0.70 0.75 0.73±0.021
浸膏收率(％) 10.81 10.16 9.98 10.92 10.08 10.39±0.44
由此可见，此水提工艺最佳搭配。即将药材浸泡1h，提取3次。第1次加8倍量的水，煎煮1h；第2和第3次分别加6倍量水，煎煮0.5h。
实验例6 制剂工艺研究
1.赋形剂及其用量的选择
由于纯干浸膏粉吸湿性较强，若直接装胶囊，则胶囊易碎裂，不利于药品的储存，故须加入适量辅料，制粒，干燥再填装胶囊。以成粒情况及临界相对湿度为评价指标，对淀粉、糊精、乳糖及其用量进行优选，结果见表6-1。
表6-1辅料及其用量的选择试验结果表
实验号 干浸膏粉(g) 淀粉(g) 糊精(g) 乳糖(g) 成粒情况 临界相对湿度(％)
1 50 20 0 0 不能成粒 -
2 50 30 0 0 不能成粒 -
3 50 40 0 0 能成粒 64
4 50 50 0 0 能成粒 72
5 50 0 20 0 不能成粒 -
6 50 0 30 0 不能成粒 *
7 50 0 40 0 成粒好 66
8 50 0 50 0 成粒好 73
9 50 0 0 20 不能成粒 -
10 50 0 0 30 成粒好 61
11 50 0 0 40 成粒好 67
12 50 0 0 50 成粒好 76
由表6-1可知乳糖无吸湿性，成粒好，但价格太贵。而糊精易于制粒，成粒好，吸湿性低，故选择糊精为赋形剂。按干浸膏粉∶糊精为1∶0.8加糊精及金钱白花蛇细粉，混匀，制粒。
2.干燥时间与颗粒水分的关系
制粒完成后，以测定水分为考察指标来选定干燥时间，根据本方药材中含有大量的酶类，氨基酸、蛋白质、多糖等有效成分，温度太高可能破坏这些有效成分，温度太低则干燥时间太长，故确定干燥温度为60℃。
表6-2颗粒水分与干燥时间的关系
干燥时间
1 2 3 4 5 6 7 8
(h)
水分含量
9.62 7.95 6.79 5.96 5.41 5.38 5.36 5.35
(％)
由表中可看出，以干燥时间为1～5h，颗粒水分变化较大。
选定以60℃温度干燥4h。
3、胶囊成型工艺研究
将干燥颗粒整粒后，进行填装胶囊。为了选择胶囊装量大小与临床剂量相适应，进行粉粒的堆密度实验[4]，结果表6-3。
表6-3粉粒的堆密度实验
实验号 1 2 3 4 5 X±SD
堆密度(g/ml) 0.67 0.63 0.68 0.65 0.62 0.65±0.025
根据堆密度和临床一日剂量5.6g以及各号胶囊的容量[5]，选择1号胶囊，经全自动胶囊填装机试装，每粒胶囊装0.35g。这样在临床上每日服16粒，基本上能适应病人的需要。
下列实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1：
熟大黄240g 急性子240g 水蛭120g 全蝎60g
蜈蚣 60g 细 辛60g 牡蛎530g 瓜萎240g
人参 180g 补骨脂240g 金钱白花蛇30g
取金钱白花蛇31.5g打粉，过100目筛，取30g备用。将人参和补骨脂用10倍量85％的乙醇浸泡1h，热回流提取2h；提取液室温静置过夜，滤过；滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)的浓缩液。药渣并入其余8味药中，加水煎煮3次，加水量分别为8倍量、6倍量、6倍量，煎煮时间分别为1h、0.5h、0.5h；合并煎液，滤过，用三效浓缩器浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)的浓缩液。将醇提浓缩液和水煎浓缩液混匀喷雾干燥得干浸膏粉。加入金钱白花蛇和适量糊精，制粒，60℃干燥4h，整粒，装入胶囊即得成品，制成1000粒胶囊。
原料药中：
大黄：为四川产掌叶大黄，按中国药典(1995年版)大黄炮制项下熟大黄的炮制方法炮炙成熟大黄，即：取大黄块，加酒拌匀，置适宜容器内，加热蒸至内外均呈黑色，取出，干燥。
金钱白花蛇：打粉。取三批金钱白花蛇，洗净，60℃干燥，用小型万能粉碎机粉碎，计算出粉率，三次平均出粉率为95％。中国药典(1995年版)凡例规定，制剂处方中规定的药量，系指净药材或炮制品粉碎后的份量，故生产时，金钱白花蛇应比处方量多取5％。
其余药材无需另外炮制，均按中国药典(1995年版)附录“药材炮制通则”的规定进行净切，切制，炮炙，制成制剂提取所需的饮片供用。
实施例2：
熟大黄240g 急性子240g 水蛭120g 全蝎60g
蜈 蚣60g 细 辛60g 牡蛎530g 瓜萎240g
人 参180g 补骨脂240g 金钱白花蛇30g
金钱白花蛇粉碎成细粉备用；人参、补骨脂加85％乙醇，浸泡1小时后，加热回流2小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至60℃下相对密度重1.20-1.25，备用，药渣与余下的除金钱白花蛇之外的热大黄等八味，加水煎煮3次，第一次1小时，第二，三次分别为0.5小时；合并煎液，滤过，滤液浓缩至60℃下相对密度1.20-1.25，与上述浓缩液混合均匀，喷雾干燥得干浸膏粉，加入金钱白花蛇细粉和适量糊精，制成颗粒，干燥，装入胶囊1000粒即得。每粒装0.35g，相当原料药2g，口服，1日4次，每次4粒。
实施例3：
熟大黄230g 急性子230g 水蛭130g 全蝎70g
蜈 蚣70g 细 辛70g 牡蛎510g 瓜萎230g
人 参190g 补骨脂230g 金钱白花蛇40g
金钱白花蛇粉碎成细粉备用；人参、补骨脂加85％乙醇，浸泡1小时后，加热回流2小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至60℃下相对密度重1.20-1.25，备用，药渣与余下的除金钱白花蛇之外的热大黄等八味，加水煎煮3次，第一次1小时，第二，三次分别为0.5小时；合并煎液，滤过，滤液浓缩至60℃下相对密度1.20-1.25，与上述浓缩液混合均匀，喷雾干燥得干浸膏粉，加入金钱白花蛇细粉和适量糊精，制成颗粒，颗粒和0.5％的药用硬脂酸镁混匀，压制成1000片，包薄膜衣，即得；每片重0.35g，相当于原药材2g，口服，1日4次，每次4粒。
熟大黄180-350重量份 急性子180-400重量份水蛭80-280重量份
全蝎30-150重量份 蜈蚣30-150重量份 细辛30-150重量份
牡蛎450-700重量份 瓜萎150-350重量份 人参100-300重量份
补骨脂150-350重量份 金钱白花蛇10-100重量份
实施例4：
熟大黄300g 急性子300g 水蛭240g 全蝎120g
蜈 蚣 120g 细 辛100g 牡蛎600g 瓜萎320g
人 参 220g 补骨脂300g 金钱白花蛇70g
取金钱白花打粉，过100目筛备用。将人参和补骨脂用10倍量85％的乙醇浸泡1h，热回流提取2h；提取液室温静置过夜，滤过；滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)的浓缩液。药渣并入其余8味药中，加水煎煮3次，加水量分别为8倍量、6倍量、6倍量，煎煮时间分别为1h、0.5h、0.5h；合并煎液，滤过，用三效浓缩器浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)的浓缩液。将醇提浓缩液和水煎浓缩液混匀喷雾干燥得干浸膏粉。加入金钱白花蛇和适量糊精，制粒，60℃干燥4h，整粒，装入胶囊即得成品，制成1000粒胶囊。
实施例5：本组合物制剂的质量控制方法：
鉴别：
a.取本组合物制剂0.7g，研细参加甲醇20ml浸渍1小时，滤过，取滤液5ml，燕干，加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴上加热30分钟雪立即冷却，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材，同法制成对照药材溶液；再取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各4μl，分别点子同一含羧甲基纤维索钠为粘合剂的硅胶H薄层板上，在30～80℃下以15∶5∶1比例的石油醚—甲酸乙醋-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出多晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色普相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨气中熏后，日光下检视；斑点变为红色；
b.取本组合物制剂3.5g，研细、加氯仿20ml，浸渍1小时，滤过，滤液置水浴上蒸至约20ml，作为供试品溶液；另取补骨脂素，异补骨脂素对照品，加氯仿制成每1ml含2mg的混合溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～8μl，对照品溶液各4μl，分别点于同一硅胶C薄层析上，以8∶2的正己烷一醋酸乙酯为展开剂，展开，取出；晾干，喷以10％氢氧化钾甲醇溶液，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定：照高效液相色谱法，色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，比例为80∶20，磷酸凋PH为3.0，该溶液作为流动相，检测波长289nm，理论塔板数按大黄素计算应不低于4000；对照品溶液的制备：精密称取大黄素对照品适量，加甲醇定量稀释至每1ml含重10μg溶液；供试品溶液的制备，取装量差异项下的内容物，研匀、精密称取0.15g，置圆底烧瓶中，加水5ml，盐酸0.5ml，置水浴上回流30分钟，冷却，用乙醚萃取三次，每次15ml.合并乙醚液，室温挥干，残留物用甲醇溶解转至10ml量瓶中，并稀释至刻度，滤过，续滤液备用；测定法：吸取对照品溶液和供试品溶液各5～10μl注入液相色谱仪测定，记录色谱图，按峰面积值用外标法计算含量，本组合物物胶囊制剂每粒合大黄素按干燥品计不得少于0.060mg。
实施例4：
鉴别：
a.取本组合物制剂0.7g，研细参加甲醇20ml浸渍1小时，滤过，取滤液5ml，蒸干，加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材，同法制成对照药材溶液；再取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层板上，在30～80℃下以15∶5∶1比例的石油醚-甲酸乙醋-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色普相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨气中熏后，日光下检视；斑点变为红色；
b.取本组合物制剂3.5g，研细、加氯仿20ml，浸渍1小时，滤过，得滤渣，置水浴上挥干溶剂，加水30ml研磨使溶解，离心，取上清液，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇提取液，加氨试液三倍量，摇匀，放置分层，取上层液，再加水20ml，摇匀，放置分层；取上层液置水浴上蒸至近干时，加入中性氧化铝1g，拌匀、蒸干，加于中性氧化铝柱(100～220目，5g，内径9～10mm)的上部，用40％甲醉60ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂甙Re1、Re、Rb2，对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～8μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶C薄层板上，以65∶35∶10氧仿-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘数分钟，分别置日光及365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显三个相同颜色的斑点，365nm紫外光灯下，显三个相同颜色的荧光斑点。