新的钠通道阻滞剂 相关申请
根据35 USC§199(e)的规定，本申请要求美国临时申请序列号60/373,440，2002年4月18日申请，和60/373,784，2002年4月19日申请的优先权，其内容在此引入作为参考。
【发明领域】
本发明涉及新的化合物以及这些化合物作为钠通道阻滞剂的用途。这些组合物在治疗与不合适的钠通道活性有关的疾病中具有实用性，以及包括这些化合物作为抗癌药的用途。
【发明背景】
一个细胞改变它的形态和迁移的能力是癌细胞转移所固有的。尽管在转移期间的细胞形态成形的准确生物机理还没有阐述清楚，但是众所周知，这些改变包括细胞-基质相互作用和细胞骨架成分。在细胞形态成形过程中涉及的Na+通道已经用于神经元的描述(Mattei etal.，Journal of Neuroscience Research，55(6)：666-73，1999)。但是到目前为止，Na+通道活性调节癌细胞形态的胞内机理还不清楚，虽然离子通道已经与几种类型的细胞行为有牵连，这些行为可能与转移的不同阶段有关。这些包括增殖、迁移和粘连/与细胞基质的相互作用。
在各种上皮细胞类型中还发现电压门控离子通道，其在传统上被认为与兴奋性组织中的冲动传导有关，其中它们的功能目前还不为人所知。已经确定了九种哺乳动物的钠通道基因，并且发现它们是被表达的和功能性的。在横跨膜和胞外域中，这些基因超过50％的氨基酸序列是相同的。最近，在老鼠和人前列腺癌细胞中发现了几种类型的电压门控离子通道。若干独立研究还将前列腺电压门控钠离子(Na+)通道α-子单元与人前列腺细胞系包括LNCaP和PC-3的入侵连接在一起(参见Diss，et al.，The Prostate，48：165-178，2001和Smith et al.，FEBS Letters，423：19-24，1998.)。另外，使用一个整个细胞的膜片箝的电生理学研究表明：在600nM处，识别地前列腺细胞钠通道对河豚毒素(TTX)敏感，表明该通道为电压依赖性TTX敏感的Na+通道蛋白质。
在啮齿动物和人前列腺癌细胞线之间进行比较后得出结论：Na+通道表达水平与体外前列腺癌细胞的入侵呈正相关关系。令人振奋地，蛋白质和功能研究都强烈支持钠通道阻断剂作为PCa细胞抑制的可行机理。最近，使用每种蛋白不同的酶联免疫吸附测定法(ELISA)，通过人前列腺癌细胞线(LNCaP、DU-145和PC-3)对四个抗惊厥药在前列腺特异性抗原(PSA)的分泌和白细胞介素-6(IL-6)上的作用，进行了测定。结果表明：苯妥英和卡马西平，它们使电压门控钠通道(NVSC)失活，都通过LNCaP和IL-6、DU-145和PC-3细胞系抑制PSA的分泌(Abdul，M.和Hoosein，N.，Anticancer Research，21(3B)：2045-8，2001 May-Jun)。此外，上述作者还表明：在Matrigel中，用苯妥英治疗减少了形成菌落的能力。这些数据还表明：对于有效的治疗PCa，钠通道阻断剂是一种强有力的候选药。
使用氚化的蛙毒(BTX)实验显示：在BTX和脑组织中的苯妥英结合位点之间存在一种变构的关系。这种关系引导申请人去研究脑中的神经元的乙内酰脲受体的构象和亲脂性质。由于很少有关于在NVSC上苯妥英-结合位点的结构数据，因此设计、合成和评价了确定数目的化合物，以识别新的Na+通道阻滞剂。这些化合物在治疗与超钠通道活性有关的疾病中具有实用性，包括治疗癫痫症、疼痛、双极疾病、抑郁症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和肿瘤病例如雄激素-敏感的和雄激素-独立型的前列腺癌。
前列腺肿瘤形成是男人当中癌症的最常见的原因，并且在男人当中癌症死亡的第二大主要原因，在美国，约189,000个男人被诊断具有前列腺癌，并且在2002年，由于这种疾病导致约30,000人死亡。人前列腺癌细胞表示一种电压门控钠通道，一种260Kd跨膜蛋白质，其与神经元亚型类似，整个细胞的膜片箝实验表明：前列腺电压钠通道(PVSC)还起与神经元亚型类似的功能。值得注意地是，前列腺癌细胞中的Na+通道表达与在高度转移性细胞系MAT-LyLu(老鼠)中的入侵之间呈正相关。已经发现，PVSC对河豚毒素(TTX)敏感，据报道，TTX抑制PC-3细胞(人)的入侵达31％(P＝0.02)Laniado，et al.AmericanJournal of Pathology，150(4)：1213-21，1997。此外，TTX(6mM)在前列腺癌细胞形态中产生改变，包括细胞突起长度、场直径的减少；胞体直径和突起厚度的增加。S.P.Fraser，Y.Ding，A.Liu，C.S.Foster M.B.A.Djamgoz.Cell Tissue Research.295：505-512，1999和Grimes JA.Djamgoz MB.Journal of Cellular Physiology.175(1)：50-8，1998。因此，PVSC作为一种潜在的前列腺癌症治疗的有效靶，因此需要开发一种这种钠通道的新的抑制剂。
发明概述
本发明涉及新的电压门控钠通道(VGSC)和前列腺电压钠通道(PVSC)抑制剂的设计和合成。含有这些抑制剂的组合物在治疗过多或超活性VGSC/PVSC的疾病中具有实用性。在一种实施方案中，一种钠通道结合剂/阻滞剂，其在前列腺中选择地将过多或超活性的VGSC作为靶向，用来限制或预防PCa生长和/或转移。
附图的简要说明
图1：苯妥英(DHP)和类似物1、5和44对rNav1.2的作用。通过逐级去极化引发电流，以15秒的间隔，将电势从-100mV到+10mV保持50毫秒。在每个实施例中，控制追踪叠加在最大药物作用处记录的一种上。所有化合物在100μM浓度处进行测试。
发明的详细说明
定义
在本发明的说明书和权利要求书中，将根据下面所述的定义，使用以下术语。
在此使用的术语“提纯”及类似术语与分子或化合物的分离有关，是指分子或化合物处于这样一种形式，其基本上与通常在自然环境中的分子或化合物有关的其它组分游离(至少60％游离，优选75％游离，最优选90％游离)。
在此使用的术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲液、水、乳液例如油/水或水/油乳液，以及各种型式的润湿剂。
该术语还包括任何由美国联邦政府的管理机构审批的或列在美国药典上供动物包括人使用的药剂。
在此使用的“有效量”是指足以产生选定效果的数量。例如，钠通道阻滞剂的有效量是指阻滞剂的数量，这种数量对钠通道活性足以产生可检测的抑制。
在本发明化合物的描述所使用的一般化学术语具有它们通常的含义，例如，术语“烷基”单独或作为另一种取代基的一部分是指直链或分枝的具有规定碳原子数目的脂肪族链。
术语“卤素”包括溴、氯、氟和碘。
在此使用的术语“卤代烷基”是指带有至少一个卤素取代基的烷基，例如氯甲基、氟乙基或三氟甲基等等。
在此使用的术语“C1-Cn烷基”其中n是一个整数，是指具有一个至指定数目个碳原子的分枝的或线性的烷基。典型地C1-C6烷基包括，但是不局限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等等。
在此使用的术语“C2-Cn链烯基”其中n是一个整数，表示具有2至指定数目个碳原子的并且至少具有一个双键的烯键式不饱和的分枝的或线性的基团。这些基团的例子包括，但是不局限于，1-丙烯基、2-丙烯基、1，3-丁二烯基、1-丁烯基、己烯基、戊烯基等等。
在此使用的术语“C2-Cn炔基”其中n是一个整数，表示具有2至指定数目个碳原子的并且至少具有一个三键的不饱和的分枝或线性的基团。这些基团的例子包括，但是不局限于，1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等等。
在此使用的术语“任选取代的”是指零至四个取代基，其中该取代基是每个独立选择的。更优选地，该术语是指零至三个独立选择的取代基。
在此使用的术语“芳基”是指具有一个或两个芳香环的单-或双环的碳环体系，包括但不限于，苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等等。芳基基团(包括二环芳基基团)可以是未取代的或被一个、两个或三个取代基所取代，这些取代基独立地选自低级烷基、卤代烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、卤素和硝基。术语(烷基)芳基是指通过烷基与母体部分相连的任何芳基基团。
术语“C3-Cn环烷基”其中n＝4-8，表示环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
术语“杂环基”是指含一个至三个选自氧、硫和氮的杂原子的C3-C8的环烷基基团。
术语“双环”表示不饱和的或饱和的稳定的7-至12-元桥连的或稠合的双环碳环。双环可以在任何提供一种稳定结构的碳原子处连接。该术语包括，但是不局限于，萘基、双环己基、双环己烯基等等。
在此使用的术语“低级烷基”是指分枝或支链的具有1-8个碳原子的烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基等等。
术语“肠胃外的”是指没有通过消化道，但是通过某种其它的途径例如皮下注射、肌肉注射、脊柱内的或静脉注射。
在此使用的术语“治疗”包括特定疾病或病症的预防，或与特定疾病或病症有关的症状的减轻和/或预防或消除所述的症状。
在此使用的术语“抗肿瘤药”是指本领域已知的药物，其已经表明对治疗肿瘤病具有实用性。例如，抗肿瘤药包括，但是不局限于，抗体、毒素、化学治疗、酶、细胞因子、放射性核素、光动力学药和血管生成抑制剂。毒素包括蓖麻毒A链、变异体假单胞菌属外毒素、白喉类毒素、链黑菌素、博安霉素、皂草素、白树毒素和商陆抗病毒蛋白。化学治疗包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、柔红霉素、顺-铂、博来霉素、梅尔法兰、紫杉酚、三苯氧胺、丝裂霉素-C和氨甲喋呤。放射性核素包括射电金属。光动力学药剂包括卟啉和它们的衍生物。本领域中已知的血管生成抑制剂包括天然的和合成的原生质例如紫杉醇、邻-(氯乙酰基-carbomyl)烟曲霉醇(“TNP-470”或“AGM 1470”)、凝血栓蛋白-1、凝血栓蛋白-2、制管张素(angiostatin)、血小板因子-4、gro-beta、人干扰素-诱导蛋白10(“IP10”)、白细胞介素12、Ro 318220、三环硅烷-9-基黄原酸酯(“D609”)、伊索格拉定、8，9-二羟基-7-甲基-苯并[b]喹嗪溴化鎓(“GPA 1734”)、6α-甲-17-羟孕酮、肝素和可的松的联合、葡糖苷酶抑制剂、染料木素、反应停、二氨基-antraquinone、杀草霉素、熊果酸和齐墩果酸。
本发明的新的VGSC阻滞剂在分子中含有一个或多个不对称中心。根据本发明，没有标明立体化学的结构将被理解为包括所有各种光学异构体和其外消旋混合物。
本发明
本发明涉及新的钠通道阻滞剂的发现和那些化合物的用途，用于治疗与过量电压门控钠通道活性有关的疾病。根据本发明，提供一种电压门控钠通道调节剂，其中该调节剂具有通式：
其中R选自C1-C12烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、-(CH2)mCOOH、-(CH2)mNH2、-(CH2)mCONH2、-(CH2)nC3-C6环烷基、-(CH2)p(CHOH)CONH2、-(CH2)n取代的芳基、-(CH2)pNCH3(CH2)p取代的芳基-和-(CH2)n取代的杂环，其中m是3-8的整数，n是0-4的整数，p是1-4的整数。R2选自H、C1-C8烷基、-(CH2)nCOOH、-(CH2)nNH2、-(CH2)nNHCH3和-(CH2)nCONHR10，R3选自H、羟基、氨基、(C1-C4)烷氧基、-CH2OH和-CONH2，或者R2和R3与它们相连的原子一起形成任选取代的芳基或任选取代的杂环，R4和R5独立地选自H、卤素、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4炔基、-COR11和(C1-C4)烷氧基，以及R6选自H、卤素、C1-C8烷基、氨基、羟基、C1-C8烷氧基、
和
其中R7和R8独立地选自H、C1-C4烷基、C2-C4链烯基和C2-C4炔基，以及R9是H，或者R8和R9与它们相连的原子一起形成任选取代的杂环，R10选自H和C1-C4烷基，以及R11选自H、C1-C4烷基、NH2和OH，条件是当R4、R5和R6每个是H，以及R2和R3连接在一起形成杂环时，R不是-(CH2)n芳基。
在一种实施方案中，该化合物具有式I的通式，其中R2和R3与它们相连的原子一起形成具有下面结构的杂环：
其中X选自-CHR12-、-O-和-NR12-，其中R11和R12独立地选自H、苄基和C1-C4烷基，条件是当X是-NH2-以及R11是H时，R不是苯基。在一种优选实施方案中，X是-NR12-。
在一种实施方案中，化合物具有式I的通式，其中R选自C1-C12烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基，R2和R3与它们相连的原子一起形成一个具有下面结构的环：
和
其中q是从1-2的整数。在一种优选实施方案中，R是C1-C12烷基，q是1，R4、R5和R6独立地选自H和卤素。
根据一种实施方案，本发明提供一种钠通道阻滞剂，其中该阻滞剂具有通式：
或
其中R选自C1-C12烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、-(CH2)nC3-C6环烷基、
和
其中n是从0-4的整数。R2是H或C1-C4烷基，R4和R5独立地选自H、卤素、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4炔基、-COR10和(C1-C4)烷氧基，以及R6选自H、卤素、C1-C8烷基、氨基、羟基、C1-C8烷氧基和
和
其中R7和R8独立地选自H、C1-C4烷基、C2-C4链烯基和C2-C4炔基，以及R9是H，或者R8和R9与它们相连的原子一起形成一个任选取代的杂环，以及R10选自H、C1-C4烷基、NH2和OH。
在一种实施方案中，本发明提供一种调节钠通道活性的化合物，其中该化合物用下面通式表示
或
其中R选自C3-C10烷基，
和
R4和R5独立地选自H、卤素、C1-C4烷基和-OCH3，以及R6选自H，
和
其中n是从0-4的整数。根据一种实施方案，该化合物具有式III或IV的通式，其中R是C3-C9烷基，以及R4和R5独立地是H或甲基，以及R6选自
和
根据本发明的一种实施方案，本发明提供一种下面通式表示的化合物
或
其中R选自C3-C9烷基、C2-C9链烯基和C2-C9炔基，
R4和R5独立地选自H、卤素、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4炔基和-OCH3，以及R6选自H、卤素、C1-C8烷基、氨基、羟基、和
和
其中n是从0-4的整数。根据一种实施方案，该化合物具有式III或IV的通式，其中R是C3-C12烷基，以及R4、R5和R6独立地是H和卤素。在另一种实施方案中，该化合物具有式III或IV的通式，其中R是C3-C12烷基，R4和R5独立地是H或C1-C4烷基，以及R6选自
和
在本发明的另一种实施方案中，本发明提供一种通式III或IV的化合物，其中R是
R4和R5独立地选自H、卤素、C1-C4烷基和-OCH3，以及R6是H。在另一种实施方案中，本发明的钠通道阻滞剂具有通式：
其中R选自C1-C12烷基、C2-C9链烯基和C2-C9炔基，R3是羟基、氨基、(C1-C4)烷氧基、-CH2OH或-CONH2，R4和R5独立地选自H和卤素，以及R6选自H、卤素和
和
其中n是从0-4的整数，以及在一种实施方案中，n是1或2。在一种优选实施方案中，本发明提供一种式II表示的钠通道阻滞剂，其中R是C1-C12烷基，R3是羟基，R4是卤素，以及R5和R6是卤素或H，以及在一种优选实施方案中，卤素取代基是F或Cl。在另一种实施方案中，本发明提供一种式II表示的化合物，其中R是C5-C9，R3是羟基，R4和R5两个都是H和R6是卤素，更优选是F或Cl。在另一种优选实施方案中，本发明提供一种式II表示的化合物，其中R是-(CH2)6CH3，R3是羟基，R4和R5两个都是H，R6是对-F或间-Cl。
本发明的一方面涉及电压门控钠通道的抑制作为靶向赘生性细胞和抑制转移的新方法。若干研究已经表明：前列腺癌细胞中存在钠通道同种型。来自两个高度转移性的前列腺上皮细胞肿瘤细胞系MAT-Ly-Lu(老鼠)和PC-3(人)的钠通道mRNA被确定为全长骨骼肌型1(SkM1)。原位杂交数据表明：rSkM1 mRNA表达的水平和模式不同于Dunning细胞的显著不同的转移潜在性。有趣地是，在AT-2(老鼠)和LNCaP(人)PCa细胞的微弱转移复本中，还检测到相同类型的mRNA。Diss等人(The Prostate，48：165-178，2001)使用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定钠通道mRNAs在若干前列腺癌(PCa)细胞系中的表达分布。这些结果表明：四个不同的具有9个剪接变体的VGSC基因在LNCaP细胞中表达，而PC-3具有11个相同mRNAs的剪接变体。这些剪接变体中的许多编码VGSC的胎儿形成。根据最新报道，前列腺癌细胞表示电压门控钠通道(VGSC)，这种通道蛋白质的活性与细胞的入侵有关。
通过蛋白质印迹法和流式细胞光度术对LNCaP和PC-3人前列腺癌细胞系中的VGSCs进行研究，该研究显示：这种通道是表示一个α亚单位的260-kd蛋白质(Komuro，etal。，Science，257：806-809，1992)。使用整个细胞膜片箝技术的电生理学研究表明：由这种通道引起的电流被河豚毒素(TTX)在600nmol/L处抑制，由此识别作为Na+通道的亚单位。此外，已经报道：高度转移的(老鼠)MAT-LyLu PCa细胞系，来源于老鼠前列腺癌的Dunning模型，表达一种VGSC，而较少转移的(老鼠)AT-2 PCa细胞系却没有。带有TTX的Na+流的阻滞显著地减少了体外MAT-LyLu细胞的入侵，表明：表达的通道在转移中具有一种功能作用。此外，体外MAT-LyLu细胞的入侵被高达50％的6μM的TTX，一种特定的VGSC抑制剂，所抑制。TTX暴露(MAT-LyLu与6μM TTX一起培养24h)还改变了若干与一种攻击性的或高度能动的表型有关的形态特征，更具体地说，暴露于TTX中减少了细胞突起的长度、场直径，以及增加了胞体的直径和突起厚度。
使用TTX获得的结果表明：Na+通道可以在测定MAT-Ly-Lu细胞的形态发育中发挥重要的作用，以这样的一种方式增强它们的转移潜在性。使用整个细胞膜片箝，对这些通道流的其它特征进行标准，并且测得的流与在各种其它组织中发现的Na+流进行比较。可以表明：Mat-Ly-Lu细胞的向内的流被彻底取消，但是这种情况在无Na+的溶液中却相反。这证实Na+的确是渗透性离子。类似数据从人PCa细胞系中获得。使用Boyden chamber测定法，用TTX处理的PC-3细胞体的外入侵减少31％(P＝0.02)。TTX调节的PC-3细胞入侵的减少强烈表明：离子通道调节剂在人肿瘤侵入中起到一个很重要的功能作用。但是，TTX(其来自河豚)对活的生物体具有非常大的毒性，因此并不是药物制剂的合适候选者。
最近，Abdul等人表明：与正常前列腺相比，PCa标本具有较高水平的钠通道表达(参见Anticancer Research，21(3B)：2045-8，2001)。此外，他们还表明：VGSC-开启剂(藜芦碱)增加了增殖，而VGSC-阻滞剂(氟桂嗪和利鲁唑)在微摩尔范围内引起PCa细胞生长的剂量依赖性抑制。将这些研究联系在一起表明：老鼠和人PCa细胞系表达VGSCs，其是这些细胞系的致瘤行为的一部分。
根据本发明的一种实施方案，本发明提供一种治疗被肿瘤病例如前列腺癌折磨的温血脊椎动物患者包括人的方法。该方法包括给予这样的一个患者一种有效量的组合物的步骤，其中该组合物包含一种由下面通式表示的钠通道阻滞剂：
或
其中R选自C1-C12烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、-(CH2)nC3-C6环烷基、
和
其中n是从0-4的整数；
R2选自H、C1-C8烷基、-(CH2)nCOOH、-(CH2)nNH2、-(CH2)nNHCH3和-(CH2)nCONH2；
R4和R5独立地选自H、卤素、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4炔基、-COR11和(C1-C4)烷氧基；以及
R6选自H、卤素、
和
其中R11选自H、C1-C4烷基、NH2和OH。在一种优选实施方案中，患者用一种通式III或IV表述的化合物进行治疗，其中R选自C1-C12烷基，R2是H，R4和R5独立地选自H、卤素和C1-C4烷基，以及R6选自H、卤素，
和
n是1或2。这些钠通道阻滞化合物可以联合使用，或者与其它已知的抗癌药或疗法例如化学治疗或辐射治疗一起使用，以有效地对癌症患者进行治疗。
根据本发明的一种实施方案，本发明提供一种在患者中抑制电压门控钠通道活性的方法，作为一种治疗与不合适的钠通道活性有关的疾病的方法。不合适的活性通常表现为活性过度或它可以表现为在一种细胞/组织中电压通道变体的表达，其通常不表达那种通道。现有的钠通道阻滞剂已经用于治疗许多疾病，包括癲痫症、双极疾病、抑郁症、疼痛、ALS和心律不齐。可以预料，本发明的钠通道阻滞剂作为神经保护剂具有实用性(包括预防初始损伤后的继发性神经元死亡)以及治疗任何以前用钠通道阻滞剂进行治疗的病害状态。
根据一种实施方案，治疗一种特征在于不合适的钠通道活性的疾病状态的方法，包括给予一种包含一种由下面通式表示的化合物的组合物：
或
其中R选自C1-C12烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基、-(CH2)nC3-C6环烷基、
和
R2选自H、C1-C8烷基、-(CH2)nCOOH、-(CH2)nNH2、-(CH2)nNHCH3和-(CH2)nCONH2；
R4和R5独立地选自H、卤素、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4炔基、-COR11和(C1-C4)烷氧基；以及
R6选自H、卤素、
和
其中n是0-4的整数，以及R11选自H、C1-C4烷基、NH2和OH。
现已表明：在此公开的两种类型的钠通道阻滞剂可以作为前列腺癌细胞增殖的有效抑制剂。通式III的羟基酰胺和通式IV的乙内酰脲都可以抑制雄激素依赖性和雄激素不依赖性的体外细胞系。在PC-3细胞中使用乙内酰脲类似物44的氚化胸腺嘧啶吸收测定表明：55％的DNA合成在40uM处被抑制(参见表3，在实施例4中)。此外，这些类似物表明：治疗24小时后，对细胞成活力仅仅存在有限的影响(表4，在实施例4中)。在若干细胞系内，在长期生长测定中，本发明的钠通道阻滞剂还表现出生长的细胞选择性抑制。在前列腺肿瘤形成的过程中，从肿瘤引发以及进展到侵入性癌症的时间通常在四十和五十岁的男人之间并且跨越多个十年。由于这种疾病的延长过程，在治疗前列腺癌症过程中，化学预防策略或抑制细胞生长策略可能是理想的。
根据本发明的一种实施方案，本发明提供一种抑制赘生性细胞增殖的方法，更具体地说，在一种实施方案中，本发明提供一种抑制前列腺癌细胞增殖的方法。该方法包括将细胞与一种通式表示的化合物进行接触：
或
其中R选自C1-C12烷基、C2-C8链烯基和C2-C8炔基；
R4和R5独立地选自H、卤素、C1-C4烷基、-COR11和(C1-C4)烷氧基；以及
R6选自H、卤素、
和
其中R11选自H、C1-C4烷基、NH2和OH．在一种实施方案中，R选自C1-C12烷基，R4和R5独立地选自H、卤素和C1-C4烷基，以及R6选自H、
和
在另一种实施方案中，R选自C1-C12烷基、C2-C8链烯基、C2-C8炔基，R4和R5独立地选自H和卤素，以及R6是H。这些化合物另外可以与药学上可接受的载体以及其它治疗化合物(例如抗癌药)结合，以提供治疗药物组合物用于治疗赘生性疾病，包括乳房癌、胶质瘤和前列腺癌。
本发明的钠通道阻滞剂组合物可以口服或胃肠外给药。在一种实施方案中，组合物通过注射或者通过一种可植入延时释放装置局部给药。当口服给药时，化合物可以以液体溶液、粉剂、片剂、胶囊或锭剂的形式给药。化合物可以与一种或多种常规的用于制备片剂、胶囊、锭剂以及其它可口服给予形式的药物添加剂或赋形剂一起使用。当胃肠外给药时，更优选通过静脉注射给药，本发明的钠通道阻滞剂可以与盐溶液和/或常规的IV溶液混合在一起。
在本发明的一种实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的化合物以及一种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以选自赋形剂、崩解剂、结合剂和润滑剂。适合给予的药物量将根据标准临床实践确定。此外，药物组合物还可以与已知的抗癌药相结合以及与已知的抗癌疗法相结合。
实施例1
被提及的化合物的有机合成
化合物 R31 3-Cl2 4-Cl3 2-Cl4 4-OCH35 H9 4-F1
根据文献方法和如流程式1中所列的，合成羟基酰胺化合物1-5。通常，通过格利雅加成将相应的腈转化为酮，接着使用TMSCN将该酮转化为TMS醚。用1％的HCl将TMS醚分裂为羟腈，接着使用浓HCl/HCl气体，将相应的羟腈水解为最终产物。乙内酰脲类似物44和66通过Bucherer-Berg反应由市场上可买到的酮制备得到。
流程式I
使用Sharpless二羟基化策略，对羟基酰胺进行对映选择性合成。
由于大部分现有化合物是手性的，因此可以预料，希望制备数克活性类似物的每个对映体。为此，制定了一种一般合成流程式(流程式II)并且成功地合成了S(-)-2。使用一种对映选择性Sharpless二羟基化策略，在AD混合α或β存在下，将烯烃109转化为二醇110。将手性的二醇110氧化成手性的羟酸111，接着转化为保留立体化学的手性对映体。可以预料，这种方法可以用于合成外消旋羟基酰胺的任何其它对映体，这些外消旋羟基酰胺是在本研究中提出的并且证明具有抗前列腺癌细胞增殖效果和钠通道活性。
流程式II
使用Jacobsen催化剂策略对乙内酰脲类似物进行对映选择性合成。
由于大部分乙内酰脲化合物也是手性的，因此可以预料，希望制备数克活性类似物的每个对映体。为此，制定了一种一般合成流程式(流程式III)用来合成R(+)-44。使用亚胺136作为初始物质，Jacobsen催化剂97将被用于合成手性乙内酰脲。一种制备Jacobsen催化剂的合成路线以及该催化剂制备手性乙内酰脲类似物的用途表示在流程式III中。可以预料，这种方法可以用于合成外消旋乙内酰脲的任何其它对映体，这些外消旋乙内酰脲是在本研究中提出的并且证明具有抗前列腺癌细胞增殖效果和钠通道活性。
流程式III
然后，Jacobsen催化剂97被用于合成手性乙内酰脲(例如化合物44)。初始物质是亚胺136：
在Jacobsen催化剂(97)存在下，将HCN对映选择性地加入到亚胺136中，接着进行水解和137的脱保护，得到手性氨基酸138。手性氨基酸138的保护将生成Fmoc保护的氨基酸139。将化合物139装载到王氏树脂上得到140。用在DMF中的哌啶进行脱保护，加成KCNO，生成酰脲141。通过与Et3N反应促成从树脂中的释放和环的闭合，以形成(+)或(-)-44。
其它的化合物将根据下列流程式进行制备：
流程式IV
流程式V
化合物 R345 C3H746 C5H1147 C7H1548 C9H1149 C6H11
流程式VI
流程式VII
n n
153 1 81 1
152 2 82 2
适合在本发明中使用的其它的化合物包括以下：
其中R3是H或卤素，以及R是C1-C9烷基。
实施例2
合成的化合物对3H-BTX-B粘合的影响
用于筛选钠通道活性调节剂的化合物的一种试验法是基于放射性配体3[H]-BTX-B试验法的用途。BTX与通道蛋白质上的2位结合，由此那些可以与结合钠通道的BTX竞争或抑制BTX的化合物是潜在的钠通道抑制剂。在更严格的功能试验例如通过电生理学评价化合物之前，此试验表示一种灵活工具用以预筛选钠通道粘合。与苯妥英相比，化合物2和44对3H-BTX-B粘合表现出有效的抑制(参见表1)。
表1 3H-BTX-B抑制数据
化合物 3H-BTX-B(μM)
5 9±2
44 5±1
苯妥英 40
α羟基酰胺 名称 R％BTX抑制 (40μM) JDA-II-105 H tbd JDA-xx-xxx 2-Cl tbd JDA-III-145 3-Cl 46.14±2.65 JDA-III-177 4-Cl 48.36±1.18 JDA-IV-191 3，4-CI tbd JDA-IV-069 2-F 37.88±1.06 JDA-IV-111 3-F 47.96±2.70 JDA-xx-xxx 4-F tbd SS-xx-xxx 2-OMe tbd JDA-IV-067 3-OMe 56.36±4.33 JDA-III-271 4-OMe 52.55±1.15 JDA-xx-xxx 2-Me tbd JDA-IV-093 3-Me 43.69±0.51 JDA-IV-095 4-Me 25.37±0.06
乙内酰脲 名称 R％BTX抑制 (40μM) JDA-I-073 H tbd JDA-III-105 2-Cl 41.61±5.36 JDA-III-135 3-Cl 69.57±3.34 SS-xx-xxx 4-Cl tbd JDA-III-113 3，4-Cl 9.25±3.25 JDA-xx-xxx 2-F tbd JDA-xx-xxx 3-F tbd JDA-III-179 4-F 11.71±4.51 JDA-II-053 2-OMe 35.29±0.46 JDA-II-047 3-OMe 37.80±0.64 JDA-IV-273 4-OMe tbd JDA-xx-xxx 2-Me tbd JDA-xx-xxx 3-Me tbd JDA-xx-xxx 4-Me tbd
实施例3
电生理学：合成的化合物对钠电流的影响
使用电生理学测定若干合成化合物的功能性钠通道阻滞性能。使用稳定表达钠通道同工型的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，Nav1.5，从-120mv的保持电势到一系列从-80mv到+60mv的电压范围(以5mv为一级，每级的时间为25ms)引出钠电流。在药物存在或不存在的情况下记录这些电流-电压，接着清除掉。在清除上，所有影响是完全可逆的，因此表明这些化合物对细胞没有毒性。表2列出了由所有测试化合物得到的IC50。这些研究的结果直接表明：本发明的化合物阻滞了Na通道电流。
表2 化合物EC50(μM)n＝5-7 1 14.7±0.4 2 12.7±2.7 5 166.4±44.1 9 34.2±7.4 44 29.8±4.2 苯妥英 ＞200
实施例4
钠通道阻滞剂对雄性激素依赖型和雄性激素独立型细胞系的影响。
新的钠通道阻滞剂进行抗双套细胞系活性试验，增加转移潜在性，PC-3和PC-3M(已经雄性激素独立型，AI)，或者随雄性激素独立型增加，转移潜在性增加，LNCaP和C4-2。还包括DU145以提供另一种AI细胞系，其在LNCaP系列和PC-3衍生物之间具有中等的致肿瘤性。为了比较药效，此策略至少需要检验三种不同的基因型。在初始筛选这些钠通道类似物中，已经使用若干生物测定。用于筛选这些化合物的第一个试验是在PC-3细胞中的3H-胸苷吸收。将细胞胰蛋白酶化，将相同的细胞数目放入每个孔中，隔夜进行回收。第二天改变培养基，以表3中所示的浓度加入类似物。在所有测试的剂量中，类似物2和乙内酰脲类似物44要比苯妥英更好地抑制DNA的合成。的确，在更高浓度下，在所有测试的剂量中，苯妥英与类似物4一样是刺激性的。这些数据证实了预期的设计策略取得了成功，其由上面所列出的受体靶向流程式调用。
表3
PC3细胞的抑制 浓度(μM) 化合物 10040 20 10 1 0 ％/抑制 30.75-12.54-21.78 -13.93 -23.77 0 苯妥英 81.99 55.09 32.70 26.64 12.75 0 44 -13.36-42.58-71.62 -53.19 -41.03 0 4 96.20 48.90 44.58 25.25 -3.61 0 2
为了测定新的钠通道阻滞剂是抑制细胞生长的或细胞毒素的抑制剂，用该类似物对PC-3细胞进行治疗后，使用MTT进行研究。在这些试验中，MTT化合物被培养基中的活细胞所摄取，并由功能性呼吸线粒体转化为不溶性的formazan晶体。然后，可以将这些晶体溶解在DMSO或酸-EtOH中，在570nM处测量吸光度，以确定培养基中活细胞的相对数目。这些研究的结果表明：治疗24小时后，该化合物对细胞成活力仅仅具有很小的影响。成活力减少仅仅在所测试的最高剂量100μM处发现。对于抑制性化合物30μM的表观IC50来说，此剂量是大大过量的。
还进行长期生长试验(用药7天)以确定所观察到的影响是否是稳定的或者是暂时的。以预先确定的细胞密度，将C4-2细胞传到板上，在第7天达到饱和。在培养基用类似物(所有在40μM处)交换之前，将细胞隔夜进行回收。试验在第1、3、5和7终止。培养基改变在第0、2、4和6天进行，每次加入新鲜的类似物。然后，将细胞用戊二醛固定，接着用结晶紫染色。然后，结晶紫在Sorenson溶液中洗脱，在540nM处读取吸光度。C4-2细胞的代表性的生长试验结果列于图10中。这些结果表明：羟基酰胺化合物1对生长具有显著抑制作用。乙内酰脲类似物5，具有中等功效，而一种相似的类似物66，相对于对照组来说没有可识别的作用并且与利多卡因对照组中观察到的一样具有适度地刺激性。用AI，人前列腺癌细胞系，C4-2获得的这些结果并不仅仅限于C4-2、DU145、PC-3和成对转移细胞系PC-3M重复这些试验。每种细胞系的数据相对第7天DMSO对照组进行归一化，以进行直接细胞：细胞的比较。这些数据表明两个要点。首先，到目前为止，羟基酰胺类似物1非常有效地抑制了所有被测试PCa细胞系的生长，抑制细胞生长达到最大的20-25％的对照组。其次，乙内酰脲类型的类似物，44和66显示出生长的细胞选择性抑制。在第5天，测定化合物1、2、5和44的IC50，若干我们的通道阻滞剂对抗PCa细胞系的匹配板(表4)。显著地，该数据表明：表现出最大活性的钠通道阻滞剂化合物(化合物1和2对5和44)是前列腺癌细胞增殖的最好抑制剂。
表4钠通道阻滞剂对前列腺癌细胞增殖的影响(第5天) 第5天对细胞系的作用 IC50(μM)±S.E.M.Na+通道阻滞剂 化合物 C4-2 PC3 DU-145 PC-3M LNCaP EC50 (μM) 1 51.3±0.2 66.0±0.7 56.0±0.7 61.9±0.1 72.2±0.1 14.7±0.4 5 61.8±0.0 ＞100 84.3±2.2 69.9±1.3 81.3±0.5 166.4±44.1 2 61.1±0.1 66.8±1.2 67.2±0.1 50.0±0.0 64.1±4.3 12.7±2.7 44 67.4±1.3 66.0±0.1 35.6±2.6 58.4±0.0 71.8±1.8 29.8±4.2
实施例5
钠通道阻断剂对PSA分泌和细胞迁移的影响。
PSA水平在接下来的肿瘤进行和负担中是临床重要的。通过PCaC4-2细胞，研究钠通道阻滞剂1、2和44(在40μM处)和苯妥英在(100μM处)它们抑制PSA分泌的能力。在每种细胞基础上，化合物1和2分别显著降低了PSA分泌达到42.5％和41.8％。苯妥英在抑制PSA分泌方面效果较差(17.8％在100μM时)，化合物44在40μM时抑制14.9％的分泌。显著地，这种趋势反映了阻滞钠通道的能力和对细胞增殖的作用。此外，化合物1用于减少PSA的剂量反应曲线显示约10μM的IC50，其与14.7μM的钠通道EC50相当。关于离子通道对PSA分泌途径的作用引起了非常新的和令人感兴趣的问题。
软琼脂糖菌落形成(SACF)是一种悬浮在一种3-维(3-D)半固体培养基中的细胞生长工艺。以这种方式使用琼脂糖的单一细胞生长使得它们免于与其粘附的附着层。癌细胞的一种标志是它们具有以支抗独立的(anchorage-independent)方式生长的能力。在软琼脂糖上的菌落形成模拟一种肿瘤的3-D、对抗-独立的生长。当正常细胞在相似条件下生长时，它们快速地死亡。为了确定这种化合物抑制肿瘤形成的可能功效，使用SACF筛选了若干化合物。当使用与苯妥英IC50等摩尔当量进行测试时，相对于在2-D生长试验中观察的那些，在3-D生长中的钠通道阻滞剂具有增加的抑制活性。与苯妥英比较，化合物1和2，其在2-D生长试验中是最好的化合物(66.3％和42.3％的抑制)，在3-D生长中在相同的浓度下增加到约87.2％和62％。还应该强调的是：与苯妥英比较，在测试化合物板中形成的菌落要小许多。因此，菌落形成的减少要比仅仅通过剪切数目所示的更显著。其次，那些在2-D中对细胞生长具有微不足道作用的化合物，即化合物2，使用SACF显示出显著增加的抑制(苯妥英的41.5％)。这些数据表明：若干化合物具有抑制体内肿瘤生长的潜在性。令人感兴趣的是，苯妥英本身在这些3-D试验中是有些抑制性的.与DMSO/EtOH对照板相比，苯妥英抑制了25.7％的SACF。
化合物1在小鼠中毒性的评价
与NIH National Institute of Neurological Disorders andStroke合作，对化合物1在小鼠中的急性毒性进行了评价(表5)。数据显示：化合物1可以忍受高达300mg/kg，在这样高的剂量下，3/4的动物表现出短期(0.5小时)的平衡损害。腹膜内给予化合物1时，没有死亡、痉挛或呼吸困难的报告。
概括地说，到目前为止，已经使用了胸苷结合、MTT、结晶紫试验、PSA、软琼脂菌落形成和膜片箝方法，并且对所要求的化合物的活性提供了有见识的信息。此外，在小鼠中获得的初步毒性数据显示：在半小时的平衡损害下，对化合物1可以忍受高达300mg/kg。没有观察到急性有毒作用(死亡、癫痫发作、共济失调、心跳停止或呼吸驱动损失)。综上所述，这些初步研究预示两种类型的化合物，羟基酰胺和乙内酰脲，其有效地抑制PCa细胞生长。
表5
化合物1在小鼠中在Rotorod上对平衡损伤的NIH评价 剂量(mg/kg)b 时间(小时) 30 100 300 0.25 0.5 1.0 4.0 - 0/4a - 0/4 1/8 3/4 - 1/8 - 0/2 10/4 0/2 a在旋转竿损伤平衡的小鼠的数目/所测试动物的总数#。 没有关于死亡、痉挛或呼吸困难的报道。b腹膜内给药