壳寡糖在抗癌药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及抗癌药物的制备和应用，具体地说是壳寡糖在抗癌药物中的应用。
背景技术
癌症由于其病程短、危害大、流行广，是危害人民生命健康的重要疾病之一。目前尚缺乏理想的治疗药物；根据29个省市自治区8亿多人口的调查，我国每年约有大于几十万人死于九大常见癌症；对于癌症的治疗主要有外科手术、化疗、放疗、基因治疗、中医药治疗及介入治疗；但是由于癌症常合并严重并发症或者在体内播散，手术切除率仅为5％左右，近95％的患者确诊时已失去手术机会，大多依赖药物治疗；所以，开发研究治疗癌症的药物具有特别重要的意义；中国科学院大连化学研究所于2000年1月5日提出一发明专利申请，申请号为00110009.2一种酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法；该发明将膜分离技术与酶法降解壳聚糖相结合，即采用中空纤维或平板膜超滤器对降解反应液原位分离，及时分离出具有生理活性的壳寡糖，有效地控制活性壳寡糖在酶作用下的进一步降解，也可以防止降解产物对反应的抑制作用，由于实现连续操作，酶可重复使用，提高降解酶的使用效率。超滤膜地滤出液再经纳滤，除去低聚合度的无活性的寡糖和大量的水，使超滤液得到浓缩，获得生理活性高的某聚合度范围的壳寡糖产品。如今，发展具有我国自主知识产权的壳寡糖(即氨基寡糖)抗癌新药的研究开发；它将对人类健康、经济和社会发展以及环境的改善具有重要意义。
【发明内容】
本发明的目的在于提供壳寡糖在抗癌药物中的应用，其肝癌抑制率较高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：利用申请号为00110009.2的反应分离耦合技术，将纳米膜技术应用于壳寡糖的浓缩及纯化中；然后通过乙醇分级沉淀，制备聚合度为2～50医药级壳寡糖，其中聚合度为4～30含量不低于50％，不包含水分含量的壳寡糖的纯度＞98％，用于抗癌药物中；
可制成水剂、粉剂、片剂和滴丸等多种剂型。
其中所述壳寡糖制备过程如下：首先将壳聚糖溶解在1～10％的醋酸溶液中，加入底物重1～10％的壳聚糖酶，升温搅拌至20～60℃恒温，10～60小时后开始超滤，小于截留分子量(300)的部分透过膜，大于截留分子量(6000)的分子返回反应釜继续降解，超滤透过液再通过纳滤器，透过部分为水、醋酸和小分子糖，未透过部分被浓缩成为10～50％聚合度为2～50壳寡糖，然后经过70～100％的乙醇沉淀，过滤，上清经过喷雾干燥，形成2～50药级壳寡糖。
本发明具有如下优点：
1.本发明采用的壳寡糖对体外培养的多种人肿瘤细胞株(经过大量实验发现)，如壳寡糖对人肝癌、大肠癌、宫颈癌、红白血病、淋巴白血病等肿瘤细胞的抑瘤率比较性研究显示：其对肝癌的抑制作用最强，抑瘤率为79％(0.1mg/ml)。初步观察到壳寡糖抗癌作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。
2.本发明医药级壳寡糖和壳寡糖药物具有抑制癌细胞、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素的作用。
3.本发明是在国家科技部“九五”攻关项目的支持下，采用酶反应分离耦合技术和酒精沉淀方法制备聚合度为2～50用壳寡糖的新工艺。
【附图说明】
图1.药用壳寡糖制备的工艺流程图。
【具体实施方式】
下面通过实例对本发明的技术进一步说明：
实施例1药用壳寡糖制备
首先将5％的壳聚糖溶于4％醋酸溶液中，加入底物(相对于壳聚糖)重5％的壳聚糖酶，升温搅拌至30℃下反应，60小时后开始超滤，小于截留分子量(300)的部分透过膜，大于截留分子量(6000)的分子返回反应釜继续降解，超滤透过液再通过纳滤器，透过部分为水、醋酸和小分子糖，未透过部分被浓缩成为50％聚合度为2～50壳寡糖，然后经过75％的乙醇沉淀，过滤，上清经过喷雾干燥，形成2～50药级壳寡糖；其中聚合度为4～30含量65％，不包含水分含量的壳寡糖的纯度98.5％。其工艺流程如图1所示。
将所获得产品应用于以下的抗癌疗效试验
实施例2低聚几丁糖对癌细胞DNA合成的抑制作用
表1.低聚几丁糖对癌细胞DNA合成的抑制作用 样品 浓度 抑制率(％) 壳寡糖 原液(12g/100ml) 87.5 稀释10倍 81.3 稀释100倍 79.7 对照 13.3 13.5 43.7
从表1可以看出，壳寡糖对癌细胞DNA合成的抑制作用比对照(清水)高的多。
实施例3壳寡糖对多种肿瘤细胞体外抗肿瘤作用
表2.壳寡糖对多种肿瘤细胞体外抗肿瘤作用 壳寡糖组 顺铂组 正常对照组 1mg/ml 400 100 10 10(μg/ml) (未加药)肝癌 OD 0.33 0.27 0.24 0.49 0.28 1.12 ％ 73 76 79 56 75Hela OD 0.49 0.51 0.65 0.73 0.15 0.96 ％ 49 47 32 24 84K562 OD 0.48 0.51 117 1.31 0.65 1.50 ％ 68 66 22 13 57Raji OD 024 0.54 0.76 0.69 0.15 0.81 ％ 70 33 6 15 82Hepa OD 0.33 0.48—— 0.05 0.98 ％ 66 51 95
宫颈癌(Hela)、白血病(K562)、人巴白血病(Raji)、小鼠肝癌腹水(Hepa)
从表2可以看出，壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用，同时对白血病和鼠肝癌腹水细胞也有一定抑制作用。
实施例4壳寡糖体外抑制小鼠HCa-F瘤的实验
表3.壳寡糖体外抑制小鼠HCa-F瘤的实验壳寡糖 10μg/ml 50μg/ml 100μg/ml 400μg/ml 顺铂10μg/ml 1％乙酸3 5±0 32±3.53 77.5±10.6 100±0 20±0 5±06 7.5±3.53 45±7.07 100±0 100±0 32.5±3.53 5±024 12.5±6.45 65±7.07 100±0 100±0 95±0 10±0
从表3可以看出，壳寡糖对高淋巴道转移癌细胞系Hca-F具有较强的体外杀灭能力，100μg/ml壳寡糖的抑瘤能力强于10μg/ml顺铂，50μg/ml壳寡糖的抑瘤能力稍弱于10μg/ml顺铂。壳寡糖的溶剂乙酸不具有抑瘤能力。
实施例5壳寡糖对S-180的抑制及与甘露寡糖活性比较
表4.壳寡糖对S-180的抑制及与甘露寡糖活性比较 寡糖 浓度 抑制率(％) 甘露寡糖 5mg/ml 59.5 3mg/ml 60.5 2.5mg/ml 69.4 1.5mg/ml 12.9 磺化甘露寡糖 5mg/ml 18.8 2.5mg/ml 32.6 1.5mg/ml 34.8 壳寡糖 9.5mg/ml 90.5 7.14mg/ml 98.9 4.76mg/ml 99.5
小鼠腹水癌(S-180)
从表4可以看出，三种寡糖比较试验结果表明：壳寡糖抑制S-180的效果最好，其次是甘露寡糖和磺化甘露寡糖。
实施例6壳寡糖对肝癌细胞生长抑制作用
表5.壳寡糖对肝癌细胞生长抑制作用 处理 浓度(μg/m1) A595nm吸光值(X) 非氧化型壳寡糖溶液 氧化型壳寡糖溶液 壳寡糖组 30.0 0.553 0.274 18.0 1.032 0.269 10.8 1.327 0.317 6.5 1.415 0.382 顺铂组 10.0 0.083 0.080 对照组 1.621 1.468
从表5可以看出，本实验进一步证实壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用，实验所用非氧化型和氧化型壳寡糖溶液与对照组相比，均对肝癌细胞有明显抑制作用，且呈量效关系，尤其以氧化型壳寡糖作用更明显。
实施例7壳寡糖对实体瘤小鼠瘤重的影响
表6.壳寡糖对实体瘤小鼠瘤重的影响组别剂量(mL/kg.bw) 动物数(只) 实体瘤重(g)P值空白对照组0 16 1.8807±0.7513—低剂量组3.3 16 1.4212±1.17700.2500中剂量组6.7 14 1.2836±1.12000.1232高剂量组20.0 16 0.6110±0.3570***2.0*10-6阳性对照组0 15 1.2071±0.7301*0.0263
*：与对照组比较有显著性差异(p＜0.05)μ
***：与对照组比较有极显著性差异(p＜0.001)
从表6可以看出，经口给予小鼠不同剂量的低聚几丁糖30天后，与对照组比较，中剂量组(6.7mL/kg.bw)的荷腹水瘤小鼠存活时间延长34％，重复实验延长37％；荷实体瘤小鼠瘤重降低63％，重复实验降低30％。高剂量组(20.0mL/kg.bw)的荷腹水瘤小鼠存活时间延长35％，重复实验延长36％；荷实体瘤小鼠瘤重降低76％，重复实验降低67％。
实施例8对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
表7.对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 组别剂量(mL/kg.bw)动物数(只) a P值 空白对照组 0 12 6.55±0.29 — 低剂量组 3.3 12 6.51 ±0.45 0.7631 中剂量组 6.7 12 6.40±0.69 0.4805 高剂量组 20.0 12 6.56±0.47 0.9884
由表7可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后，与对照组比较，各剂量组的碳廓清指数均无显著差异(p＞0.05)。
实施例9低聚几丁糖对小鼠活性NK细胞的影响
表8.低聚几丁糖对小鼠活性NK细胞的影响 组别剂量(mL/kg.bw)动物数(只) NK活性(1∶50)(％) 空白对照组 0 12 32.8±10.6 低剂量组 3.3 12 29.6±12.7 中剂量组 6.7 12 28.0±12.0 高剂量组 20.0 12 33.4±10.9
淋巴细胞(NK细胞)
由表7可见，中剂量组和高剂量组与对照组比较碳廓清指数、NK细胞活性均无显著差异(p＞0.05)。实验结果表明口服中剂量或高剂量壳寡糖作用，在服用期间不会对机体免疫系统造成损伤。