一种法氏囊素的提取方法及其在疾病治疗和免疫中的应用 一、技术领域：
本发明涉及一种用于畜禽的免疫制剂，尤其是涉及一种法氏囊素的提取方法及其在疾病治疗和免疫中的应用。
二、背景技术：
传染病尤其是病毒性传染病的发生是影响畜牧业发展的一个重要因素，大多数病原微生物侵入机体后，能造成免疫器官的损伤，使机体免疫功能低下，抗病力减弱，使疫病进一步发展，同时，引起继发感染及免疫失败，给养殖业造成巨大损失。单纯依靠疫苗免疫一方面由于多种原因引起的免疫失败，另一方面由于疫苗本身免疫保护率的限制，很难完全防止传染病的发生，因而，探求免疫增强剂，保护、提高机体免疫力和积极有效的病毒性疾病防制方法，已成为世界各国兽医工作者努力的热点。
目前研究较多的免疫增强剂主要有微生物类、化学剂、生物制剂和中药制剂4类。其中生物制剂主要包括胸腺素、转移因子、γ-球蛋白和干扰素(表1)。
表1 常用的免疫增强剂
分类 名称 来源 作用机制
微生物类 卡介苗菌 减毒牛型结核 激活巨噬细胞，免疫佐剂
短小棒状杆菌苗 短棒菌灭活菌苗 激活巨噬细胞，免疫佐剂
化学剂 左旋咪唑 化学合成 提高巨噬细胞和T细胞功能
异丙肌苷 化学合成 激活巨噬细胞和T细胞
生物制剂 胸腺素 动物胸腺 诱导T细胞分化和增殖
(生物因 转移因子 淋巴细胞 转移T细胞免疫信息
子) 干扰素-α Mo/巨噬细胞 抗病毒、抗肿瘤、调节免疫
干扰素-γ T细胞 调节免疫、MHC表达、增强NK细胞活性
IL-2 T细胞 扩增T细胞克隆
中药类 云芝多糖* 云芝(多孔菌科) 促进巨噬细胞和T细胞功能
*类似地还有茯苓多糖、灵芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖等制肿瘤生长。
上述免疫增强效果好，但由于成本高和不易保存而极大的限制了其在兽医临床中的应用。因此，降低成本或探求成本低廉、效果良好的免疫增强剂已成为兽医工作者的一项重要任务。
法氏囊素(Bursin，BS)是讫今为止法氏囊组织提取物中唯一一种化学组成已被确定的生物活性分子，由T.Audhya等于1986年首次从鸡法氏囊组织抽提液中纯化并定名，其化学组成为三肽，即Lys-Hls-Gly-NH2。研究证明BS在体外具有诱导B淋巴细胞系分化的功能，并对B淋巴细胞抑制剂有拮抗作用，能提高人B细胞系-Duadi细胞系内cAMP和cGMP水平。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种法氏囊素的提取方法及其在疾病治疗和免疫中的应用，其在提高机体免疫力及作为免疫增强剂，在提高疫苗效果等方面具有重要的应用价值，同时可提高哺乳动物的体液和细胞免疫功能，并且成本低，易保存。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种法氏囊素的提取方法，其特殊之处在于包括以下操作步骤：取健康法氏囊80g，加入适量1N冰醋酸应用液，20 000r/min匀浆3min，使其成糊状。在水平振荡仪上振荡1.5h～2h，于4500r/min 4℃离心60min，取上清，沸水浴中作用20min，再离心一次，取上清过滤。过滤液用旋转蒸发仪在60℃～70℃之间减压浓缩至40ml左右，浓缩液经20 000g，于4℃条件下高速离心30min，得上清液约20ml，即为粗提物，取粗提物过G-50葡聚糖凝胶柱，1N醋酸洗脱，收集CuSO4反应阳性部分，用7.5％的NaHCO3调pH值至中性，即为组织提取物—法氏囊素。
一种法氏囊素在疾病治疗中的应用，其特殊之处在于：法氏囊素单独应用于传染性疾病和幼龄动物疾病的预防与治疗。
上述法氏囊素与抗病毒药物配合用于传染性疾病和幼龄动物疾病的预防与治疗。
上述法氏囊素与抗菌药物配合用于传染性疾病和幼龄动物疾病的预防与治疗。
一种法氏囊素在免疫中的应用，其特特殊之处在于：所述法氏囊素与动物疫苗配合使用，用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。
上述法氏囊素作为动物疫苗佐剂应用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。
上述法氏囊素作为动物疫苗免疫增强剂应用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。
上述法氏囊素直接用作疫苗稀释液。
一种法氏囊素在免疫中的应用，其特殊之处在于：所述法氏囊素用作畜禽饲料添加剂。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、本发明在提高机体免疫力及作为免疫增强剂，在提高疫苗效果等方面具有重要的应用价值，同时法氏囊素(BS)可提高哺乳动物的体液和细胞免疫功能。
2、本发明化学结构简单，性质稳定，肌肉注射或口服均易于吸收，可与常温条件下保存而不降低活性。
3、本发明无药物残留，可同时促进机体体液免疫和细胞免疫应答水平，对禽类可促进损伤法氏囊的修复，提高疫苗的免疫效果。
4、本发明经动物试验研究，直接作为疫苗稀释液或与疫苗同时注射可是疫苗的免疫抗体水平提高1-2个滴度。
5、本发明用于雏鸡或幼龄动物注射，可使母源抗体水平延长维持时间。
6、本发明与特异抗体配合应用，可显著提高治疗效果，鸡新城疫和法氏囊炎的治愈率提高1倍。
7、本发明单独注射或作为饲料添加剂应用可显著提高羔羊和仔猪断奶成活率。
8、本发明与抗菌素、抗病毒药物配合应用(口服或肌肉注射)可显著提高治愈率。
四、附图说明：
图1为法氏囊素对小鼠脾细胞PFC数目的影响。
图2为法氏囊素和LCGF对小鼠PFC数目的影响。
图3为溶血分光光度法测定结果。
图4为注射法氏囊素后鸡群母源抗体效价的变化。
五、具体实施方式：
本发明的提取过程为：
取健康法氏囊80g，加入适量1N冰醋酸应用液，20 000r/min匀浆3min，使其成糊状。在水平振荡仪上振荡1.5h～2h，于4500r/min 4℃离心60min，取上清，沸水浴中作用20min，再离心一次，取上清过滤。过滤液用旋转蒸发仪在60℃～70℃之间减压浓缩至40ml左右。浓缩液经20 000g，于4℃条件下高速离心30min，得上清液约20ml，即为粗提物。取粗提物过G-50葡聚糖凝胶柱，1N醋酸洗脱，收集CuSO4反应阳性部分，用7.5％的NaHCO3调pH值至中性，即为组织提取物—法氏囊素。
本发明主要应用于：
1.单独应用或与其他药物如抗病毒、抗菌药物或免疫制剂配合用于传染性疾病和幼龄动物疾病的预防与治疗。
2.作为佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗，以提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力。
3.直接用作疫苗稀释液。
4.可用作畜禽饲料添加剂。
本发明的作用主要表现在：
1.BS在提高机体免疫力及作为免疫增强剂，在提高疫苗效果等方面具有重要的应用价值，同时BS可提高哺乳动物的体液和细胞免疫功能。
2.BS与抗病毒以及抗菌药物配合制备成粉剂、针剂或口服剂均可显著提高药物的疗效。
3.将BS作为饲料添加剂应用，可显著提高动物(畜禽)的免疫力。
4.人工合成的BS与提取的组织中的BS具有相同的生物学活性，且可与常温条件下保存而不降低活性。
典型配方：
抗病毒制剂：法氏囊素 利巴韦林
抗菌制剂： 法氏囊素 抗菌素
1.本发明主要研究内容及研究方法：
1.1法氏囊素的研究
1.1.1法氏囊素的制备：
分别应用醋酸提取法自健康鸡法氏囊和鸡法氏囊细胞培养上清液中提取、纯化法氏囊素，同时应用化学合成法合成了法氏囊素及其类似物，并进行进一步纯化，应用高压液相和色谱分析其纯度和含量。
1.1.2法氏囊素活性鉴定：
分别应用溶血空斑试验和细胞转化试验测定提取和合成的法氏囊素及其类似物的活性，确定活性单位。
1.1.3法氏囊素的免疫学活性测定：
法氏囊素对鸡母源抗体的影响：以鸡新城疫(ND)母源抗体为指标，应用β-微量法，测定雏鸡注射法氏囊素后抗体消长规律。
法氏囊素对鸡新城疫疫苗免疫的影响：应用β-微量法，测定法氏囊素对雏鸡初免后抗体消长规律和效价的影响，进一步测定鸡群在患传染性法氏囊炎，经用法氏囊素治疗康复后，对新城疫疫苗二次免疫的影响。
1.1.4法氏囊素对鸡新城疫和法氏囊炎的治疗作用：
首先应用法氏囊素对人工感染鸡群进行治疗试验，确定法氏囊素的治疗作用及其用量，之后，将其与高免卵黄抗体或血清抗体配合制成制剂，进行应用试验，观察记录治愈率，分析治疗效果。
2.主要研究成果：
2.1研究确定了自健康鸡法氏囊提取法氏囊素的方法，简单易行，可用于大量制备；在法氏囊细胞培养上清液中也发现有法氏囊素的存在，并证明其与提取的法氏囊素具有相同的免疫活性。
分别应用多肽合成仪和人工合成方法合成了法氏囊素及其两种类似物(同分异构体)，纯度均达到75％以上。
2.2应用溶血空斑试验证明所制备的法氏囊素均可促进小鼠抗绵羊红细胞溶血空斑(PFC)的形成，其活性在合成和提取以及法氏囊培养上清中法氏囊素之间无显著差异，但三者的活性显著高于合成的两种类似物。各制剂对PFC形成的促进作用与剂量在一定剂量范围内呈正相关。
通过淋巴细胞转化试验也取得了与上述一致的结果。
2.3给1日龄雏鸡肌肉注射法氏囊素能显著延长母源抗体存在的时期，使其保持高水平母源抗体的时间延长，其机制尚不清楚。
2.4在ND、IBD疫苗免疫的前1d、同时、或免疫后1d，肌肉注射一定剂量的BS或其类似物，均对该两种疫苗的免疫具有促进作用。试验结果证明，可使鸡群新城疫抗体效价升高1.5-2个滴度，使鸡群抗IBDV抗体的琼扩效价和ELISA检测效价分别升高2-4倍。使两者的有效抗体滴度持续期延长。
2.5治疗试验表明，法氏囊素对ND和IBD均有一定的治疗和预防作用，与相应的卵黄抗体或抗血清配合，在发病的早期具有良好的治疗作用，治愈率可分别达到85％和90％以上。能够促进鸡法氏囊炎发病后法氏囊损伤的修复，提高发病后ND疫苗二次免疫的抗体水平，从而有效地预防因法氏囊损伤造成的ND疫苗免疫失败。
在宁夏中卫、天津和陕西等地的临床应用试验表明，法氏囊素作为免疫佐剂，可显著提高ND和IBD疫苗的免疫效果，对鸡群ND和IBD的混合感染具有良好的治疗作用，在发病早期，应用法氏囊素与特异抗体配合治疗，可于注射后9小时左右，使发病鸡群精神状况明显好转，3d后鸡群达到基本稳定，临床治愈率达到85％以上。
研究的科学意义与应用前景：
本项目系统研究了法氏囊素活性鉴定、免疫学活性及其对鸡主要病毒性疾病的治疗作用，所获结论为进一步研究法氏囊素的免疫学及其在机体免疫调节中的作用提供了实验依据，在免疫增强剂及新型疫苗研究等方面具有重要的科学意义。在应用方面，建立了法氏囊素的制备方法和人工合成方法，使其大量生产成为可能。由此可见，该研究在应用法氏囊素作为免疫增强剂及其与特异抗体配合应用治疗病毒性疾病等方面具有广阔的应用前景。
三、法氏囊素的制备
I法氏囊素的组织提取
1.材料和方法：
健康鸡法氏囊：采自当地肉鸡屠宰场，部分由青岛动检所提供，-20℃保存。
主要试剂：
冰醋酸(分析纯，西安化学试剂厂)；牛血清白蛋白(电泳纯，上海奶牛公司综合厂，批号：890642)；葡聚糖凝胶G-50(西安华美公司)；
法氏囊素的提取：
参照Audhya等的方法，并进行改进。主要过程是：取健康法氏囊80g，加入适量1N冰醋酸应用液，20 000r/min匀浆3min，使其成糊状。在水平振荡仪上振荡1.5h～2h，于4500r/min 4℃离心60min，取上清，沸水浴中作用20min，再离心一次，取上清过滤。过滤液用旋转蒸发仪在60℃～70℃之间减压浓缩至40ml左右。浓缩液经20 000g，于4℃条件下高速离心30min，得上清液约20ml，即为粗提物。取粗提物过G-50葡聚糖凝胶柱，1N醋酸洗脱，收集CuSO4反应阳性部分，用7.5％的NaHCO3调pH值至中性，即为组织提取物—法氏囊素。
提取物的定性检测：
分别应用考马斯亮兰和1％硫酸铜对提取物进行定型检测，并用ELISA法检测法氏囊素的存在。
提取物中多肽含量的测定：
利用双缩脲法，在721分光光度计上540nm处测吸光度(OD)值，以牛血清白蛋白作标准曲线，计算提取物中多肽的含量。
2.结果
2.1提取物的定型检测结果：
用160g法氏囊共获得100mL提取物，该提取物不能使考马斯亮兰变色，而使硫酸铜溶液出现变色反应，表明提取物中的成分主要是多肽。
将提取物作连续梯度稀释，用ELISA检测，显示在提取物中法氏囊素的ELISA检测效价为1∶104，证明提取物中含有高浓度的法氏囊素。
2.2提取物中多肽的含量：
测定结果表明提取物中多肽含量为2g/L。
3.讨论
自从Audhya于1986年在Science杂志公布了其法氏囊素的提取方法后，其他研究者基本沿用其方法进行提取。其主要过程是：①将法氏囊和1N醋酸按1∶10的比例混合匀浆，4℃过夜；②于4℃条件下，以14000g离心60min，取上清，重复离心，取上清在冷冻干燥仪内冻干；③将冻干品重新溶解于1N醋酸溶液(室温下充分溶解1h)，于12000g，4℃条件下离心20min；④上清液过G-50葡聚糖凝胶柱，将收集液冷冻干燥；⑤干燥粉以50mM碳酸氢氨溶解，7000g离心离德5min，取上清，即法氏囊素提取物。该方法操作步骤多，对温度要求高，耗费时间长，另外需要冷冻干燥仪等贵重仪器，不适于推广应用。
考虑到三肽法氏囊素在100℃左右较为稳定，因而在法氏囊进行初步提取后，应用沸水浴法迅速去除其中的高分子蛋白，使提取过程简化，应用旋转蒸发仪代替冷冻干燥仪，进一步使该过程简化，用时减少。Audhya等认为，法氏囊中法氏囊素的总含量为0.06％，其提取的回收率为45％，而应用本试验中的方法，其回收率明显提高(64％)。表明改进后的方法优于原方法。由于其简单，部需要特殊仪器，可用于大量制备。
定性测定结果证明，本试验所提取的物质主要为多肽，而ELISA法检测表明其中主要含法氏囊素。同时证明其保持了与抗法氏囊素抗体结合的特性。本研究的后续试验也证明，改进后的提取过程不影响法氏囊素的生物活性。
II法氏囊细胞培养上清的制备
本实验进行了雏鸡和鸡胚的法氏囊原代细胞的培养，应用酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immuno-adsorption Assay，ELISA)证明培养上清中含有三肽囊素。
材料与方法
鸡胚17～18日龄鸡胚或1～3日龄雏鸡，由西北农林科技大学试验农场孵化室提供；
主要试剂与材料
胰蛋白酶(GIBCO，1∶250)，胶原酶IV型(SIGMA)，MEM培养基(GIBCO)，M199培养基(日本)，RPMI1640(Hyclone)，新生犊牛血清(NCS，自制)，100mL细胞培养瓶(FALCON)，24孔细胞培养板(NUNC)
法氏囊细胞培养
取17～18日龄鸡胚或1～3日龄雏鸡(西北农业大学试验农场孵化室提供)，无菌摘取法氏囊，置于盛有15mL Hank’s液或PBS的平皿中充分涮洗，剔除血污及法氏囊周围的结缔组织，移于青霉素瓶中剪至1mm3大小，加Hank’s液洗涤2～3次，用巴氏吸管吸出沉淀组织，置一加有玻珠的三角瓶中，加入约10倍量0.25％胰酶，混匀后于37℃水浴消化20～30min，静置沉淀，吸弃胰酶液，加入适量含10％NCS的Hank’s液，用力振摇，打散组织块，静置，待未消化的组织块沉淀后，吸出细胞悬液，用400目尼龙网过滤，得细胞悬液，加入足量Hank’s液或培养液，离心洗涤3次(1000r/min，10min)，最后一次离心后，加入适量培养液，将沉淀细胞吹散，使成均匀的混悬液。取少量加入台盼兰染色计数，加入含10％NCS，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，10mM HEPES的细胞培养液，调整细胞浓度，分装于100mL细胞培养瓶或24孔培养板，置37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养，24h后，逐日观察记录细胞生长情况，待长成90％以上单层细胞后，分段收集培养上清液，减压浓缩，20 000r/min离心1h，取上清液，调pH值至中性，-20℃保存备用。
培养上清中三肽囊素的检测
用ELISA法，按使用操作说明进行。
2.结果
2.1培养液对法氏囊细胞培养的影响：
试验分别应用了3种培养液，在同一条件下培养，结果表明，除RPMI1640外，MEM和M199两种培养液间无明显差异。同时，缨培养瓶和培养板之间也无明显差异。本试验后期均使用MEM培养液。
2.2细胞生长状况：
培养24h，细胞逐渐变大，仍保持圆形，至48h细胞开始贴壁生长，84h基本铺成单层。细胞形态主要呈长梭形、多边形或星芒状，混杂分布。在24孔培养板中，可见某些孔中，以某一种细胞明显增多。培养至84h或更长时间，细胞开始脱落，脱落的细胞变圆，内呈空泡状，细胞核碎裂。
2.3鸡胚和雏鸡对细胞培养的影响：
从细胞贴壁情况看，依次为18日龄鸡胚＞19日龄鸡胚≌1日龄雏鸡。但从细胞获取量看，则正相反，而且，1日龄雏鸡法氏囊较大，易于分离。另外，可选用孵化室淘汰的1日龄公雏，可极大的降低成本。
2.4消化液的影响：
应用胶原酶IV消化所获取的活细胞数量高于胰蛋白酶，尤其是对18和19日龄的鸡胚源法氏囊，但应用胶原酶消化时间为胰蛋白酶的3倍。
应用胰蛋白酶消化时，时间以12～15min为宜，时间过长，则火细胞数量减少，过短则收获的细胞数量少。本试验中应用胰蛋白酶消化所获的细胞活率均大于90％。
2.5法氏囊素的检测：
经ELISA法检测，无论是48h的培养上清液，或换液后24h、48h或更长时间的培养上清液中，均可检测到法氏囊素，表明体外培养的法氏囊细胞分泌法氏囊素是持续的。
3.讨论
由于应用法氏囊原代细胞培养IBDV较其它细胞的病毒收获量大，因而，目前所用的主要是鸡胚法氏囊细胞，因其法氏囊体积小，收获细胞量少，使病毒繁殖的成本提高。本试验证明，应用1日龄的公雏进行法氏囊细胞培养，与应用鸡胚法氏囊的结果基本相近，因其获得的细胞量大，且易得、经济，为今后进一步降低疫苗制造成本提供了实验依据。
到目前为止，天然法氏囊素主要是从健康鸡的法氏囊组织中提取，由于法氏囊来源的限制，制约了法氏囊素的研究与推广应用。本试验证明，在法氏囊细胞培养上清中含有法氏囊素，这一方面，对于研究法氏囊素的分泌规律和影响因素具有实际意义，另一方面，扩大了法氏囊素的获取途径，对于在利用法氏囊原代细胞培养繁殖病毒过程中，有效利用培养上清具有参考价值。
对细胞消化和培养条件的研究表明，应用胰蛋白酶进行消化，可完全满足细胞分离的要求，其关键是要掌握好消化液的浓度和消化时间。培养中可应用MEM或M199培养液。
四、法氏囊素的免疫活性检测
材料与方法
试验动物
60只LACA小鼠(18g～20g，雌雄不限)，3只成年豚鼠，以上均购自西安医科大学实验动物中心。健康绵羊有西北农林科技大学试验动物中心提供。
主要试剂
RPMI1640培养基(日本制药株式会社)，犊牛血清(自制)，琼酯糖(电泳纯，上海东海制药厂，批号：890624)
琼脂平板溶血空斑试验按常规方法进行。主要过程是：
SRBC的制备 无菌操作，从绵羊颈静脉采血，玻璃珠脱纤抗凝，用pH7.2的PBS液洗涤3次，每次2000r/min离心5min，取压积红细胞，用适量PBS稀释，计数，用PBS调细胞浓度为30×108/mL，供当日使用。
小鼠免疫取30只小白鼠(LACA)随机分成5组，每组6只，其中一组为空白对照组，只注射0.4mL细胞培养液，其余4组进行绵羊红细胞(SRBC)免疫，剂量均为3×107个/0.2mL·只，其中一组作为SRBC免疫对照组，剩余3组，再同时注射不同剂量的法氏囊素，3组的剂量分别为0.5mg/只，1.0mg/只和2.0mg/只。另取30只小鼠，分组同上，试验组分别注射法氏囊素和其类似物。
小鼠脾细胞悬液制备 于免疫后第4d，脱颈处死小鼠，取脾脏，用玻片刮取脾细胞，依次过200目和400目滤网，用含5％NCS的Hank’s液洗涤2次，含5％NCS的RPMI1640培养液洗涤1次，并用该培养液稀释细胞，用台盼兰染色计数，调整活细胞浓度至1×106个/mL，要求活细胞率大于95％。
溶血空斑试验
制备底层琼酯平板 用Hank’s液配制1.4％的琼酯糖，加热，使其充分溶化，待温度降至50℃左右时，倾注于75mm的平皿内，每皿2～3mL，在水平台上使其均匀分布。
制备表层琼酯平板 取制备的脾细胞悬液0.1mL与0.1mL SRBC悬液(3×108个/mL)，同时加入预温48℃～50℃的2mL 0.7％琼脂糖内，混匀，倾入铺有底层琼脂糖的平皿内，均匀铺开，每只鼠做3个重复，于37℃，5％CO2，饱和温度条件下孵育1.5h。
加补体 将孵育的平板取出，每平皿加入2mL经SRBC吸收的1∶5稀释的新鲜豚鼠混合血清，置培养箱中继续孵育30min。
结果观察 孵育结束后，取出，用体视显微镜观察，计数每一平皿中的空斑数，计算每100万脾细胞中含空斑生成细胞的平均数。
溶血分光光度测定法
取制备的小鼠脾细胞悬液，配成2×107个/mL，取其0.5mL加入小试管中，再加入1％的SRBC 0.5mL，1∶10豚鼠血清0.5mL，充分混匀，置37℃温育1h，取出，3000r/min，离心5min，用酶标仪(DG5030)在410nm测其上清液中红细胞裂解释放的血红蛋白量(以OD值表示)。
2.结果
2.1不同剂量的法氏囊素对小鼠空斑形成细胞数(PFCs)的影响：结果见图1，由图1可见，法氏囊素可明显促进小鼠空斑形成细胞数，即PFCs，显著性检验表明，各试验组与免疫对照组之间均差异极显著(P＜0.01)。不同剂量的法氏囊素对PFC的影响均具有显著性差异(P＜0.01)。剂量在1.0mg/mL时，促进作用最强。表明其对机体免疫的促进作用具有剂量依赖性。
2.2法氏囊素及其类似物对PFC的影响：
法氏囊素及其不同类似物对PFC的影响见图2，由图2可见，法氏囊素和肝细胞生长因子均能显著提高小鼠的空斑形成细胞数(P＜0.01)，两者之间差异不显著(P＞0.05)，显示，法氏囊素与肝细胞生长因子具有类似的免疫促进作用。法氏囊素组与其同分异构类似物相比差异极显著(P＜0.01)，说明其作用与分子结构密切相关。
溶血分光光度法测定结果(见图3)，图3显示，应用分光光度法测得的结果与应用溶血空斑试验所得结果一致。进一步说明法氏囊素及其类似物对B细胞免疫的促进作用。
3.讨论
BS是到目前为止自鸡法氏囊组织纯化的唯一一种能促进法氏囊发育和机体体液免疫的活性多肽。Audhya等认为，BS能够加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进细胞内蛋白质的合成，从而使B细胞分泌和产生抗体的能力加强。本试验中，溶血空斑实验和溶血分光光度测定均证明，合成的BS能促进小鼠体内抗体形成细胞的数量(P＜0.01或P＜0.05)。与Baba等所得到的结果—它能提高淋巴细胞的转化率，促进B细胞的分化—相一致。
LCGF是自小鼠肝脏组织分离纯化的一种活性三肽，其组成与BS相同，但氨基酸次序不一致。Audhya曾证明，高剂量的LCGF具有与BS类似的促进B细胞产生和分泌抗体的作用。本试验证明当LCGF的剂量大约为BS的1000倍左右时，二者在提高小鼠抗体产生细胞的数量方面无显著差异。这是否表明哺乳动物的肝脏具有类似禽类法氏囊的作用，有待今后进一步研究。另外，肝脏较之法氏囊组织容易得到，LCGF免疫作用的进一步证实将为其在兽医临床的应用提供试验基础。
五、法氏囊素对鸡免疫的影响
通过雏鸡新城疫(Hewcastle disease，ND)免疫实验初步探讨了三肽囊素对雏鸡免疫的作用。
材料与方法
1.1实验动物
1日龄雏公鸡200只，购自西北农业大学畜牧场种鸡场孵化室。
ND IV系弱毒苗：
Lasota株，南京生物药械厂生产。法氏囊强毒由我校畜牧微生物实验提供。IBD-ELISA快速诊断试剂盒，广西兽医研究所生产，批号9811。抗法氏囊病毒高免血清，由我校家畜生殖内分泌实验室提供，琼扩效价26。
主要试剂
合成法氏囊素结构式为Lys-His-Gly-NH2，分子量(MW)：339，纯度70％，用0.05M pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)配成相应浓度，4℃保存备用。0.05M pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)。
1％鸡红细胞(PBC)悬液制备；
无菌采集大公鸡翅静脉血，柠檬酸钠抗凝，用0.05M pH7.2的PBS液反复洗涤三次，每次1500r/min离心15min，末次洗涤后，加入适量PBS液，配成1％浓度，4℃保存，供当日使用。
NDV 4单位毒；
将NDIV弱毒疫苗用PBS稀释后。自尿囊腔接种9～11日龄鸡胚(西北农大畜牧场种鸡孵化室提供)，取48h～96h内死亡鸡胚，收取尿囊液，于96孔血凝板测血凝价(HA)，冻存备用，以后每次据HA，将所收毒液(HA在1∶128以上者)稀释成4单位毒，供当日使用。
法氏囊素对母源抗体水平的影响
将鸡随机分成4组，每组50只，3日龄时，实验组A、B、C组分别注射不同剂量的法氏囊素，对照组D组肌肉注射等体积生理盐水(表2)；
表2试验分组表 单位：μg
第一组(A) 第二组(B) 第三组(C) 第四组(D)
法氏囊素 0.3 0.6 1.2 -
生理盐水 - - - 0.5
于3、6、9、12、15日龄采血，测定新城疫母源抗体水平(HI)。
1.7法氏囊素对NDIV系疫苗免疫的影响；
于22日龄(母源抗体降至21左右)时，所有鸡滴鼻点眼NDIV系疫苗各50μL(1羽份)，于免疫后第3d、5d、10d、15d、18d采血，测定抗体水平(HI)。
1.8应用法氏囊素治疗鸡群IBD后对ND疫苗二次免疫的影响：
当鸡34日龄时，在鸡群中放入患IBD病鸡，使鸡群自然感染发病，鸡群内出现IBD发病症状后，应用法氏囊素配合特异抗血清进行治疗，同时设不治疗组作对照。在鸡群全部稳定后，从A、B、C组各挑出15只健康鸡。从未治疗组中挑耐过鸡15只，于42日龄时，进行二次ND免疫，方案方法等同1.7。于免疫后第3d、5d、10d、15d、18d，心脏采血，室温析出血清，用β-微量法测定血清中ND血凝抑制(HI)抗体水平。
结果
2.1法氏裹素对母源抗体的影响(见表3、图4)：
表3 注射法氏囊素后鸡群母源HI抗体效价变化 X±Sd
注射法氏囊素后天数(日龄)
组别
3(6) 6(9) 9(12) 12(15) 15(18)
A 4.5±0.71 4.25±0.50 4.25±0.5 4.0±0.82 2.0±0.82
B 5.0±0.41 5.0±0.1 4.5±1.29 4.25±0.5 2.25±0.96
C 5.0±0 5.25±0.96. 4.75±0.5 4.5±0.71 2.5±0.58
D 3.5±0.96 4.0±0.82 3.25±1.5 3.0±0 1.5±0.58
从表3可以看出，从6日龄到18日龄(注射BS后3～15d)，实验组抗体水平比对照组高0.25～1.5个滴度，尤其是大剂量组C组与对照组相比在9、12日龄差异显著(P＜0.05＝，在15日龄差异极显著(P＜0.01＝。B、C两组相比较在6日龄到9日龄这段时间，B组抗体水平高于C组，9日龄以后C组抗体水平高于B组，但两组差异不显著。C组抗体水平在9日龄达到最高点，以后逐渐降至最低。
从图4可以看出，从6日龄到18日龄，三组注射BS组，抗体水平均高于对照组，且C组高于B组，B组高于A组，但实验组每两组间差异不显著(P＞0.05)，从此整个过程内所有抗体水平的平均值可以看出，注射BS的A、B、C三组分别比对照组高0.75、1.15和1.35个滴度。
2.2 BS对ND IV系疫苗首免效果的影响(表4)
从表4可以看出，实验组抗体水平在此过程中均较对照组(正常免疫组)高，在免疫后的第3、第6天均较对照组高1个滴度，尤其是免疫后第6天，A、B两组与对照组相比差异显著(P＜0.05)，C组与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。在免疫后的第6天，抗体水平均升至最高，以后逐渐下降，且A、B、C组的抗体变化动态趋势与D组一致。
从免疫后第3d到第14d(即从22日龄到33日龄)的12d，三组BS注射组的平均抗体水平均高于正常免疫组，但每两组间差异不显著(P＞0.05)，注射BS的A、B、C组分别比正常免疫组高0.75，1，1.2个滴度。
表4 首次免疫后鸡群HI抗体变化
首次免疫后天数(d)
组别
3 6 9 14
A 5.5±1 6.5±0.58 5.5±1 5.0±0.82
B 5.75±0.82 7.0±0.82 5.75±0.96 5.0±0.82
C 6.0±0.82 7.0±0.82 6.0±0.82 5.0±0.82
D 4.5±0.82 5.25±0.5 5.0±0 4.75±0.96
3 BS对感染IBD后NDIV免疫(二免)效果的影响(表5)
从表5可以看出，实验组抗体水平在此过程中均较对照组高，尤其是大剂量组C组在免疫后第3、5、15、18天与对照组相比差异极显著(P＜0.01)，在免疫后第10d差异显著(P＜0.05＝，A、B、C三组抗体变化动态趋势基本一
表5 二次免疫后鸡群HI抗体变化 X±Sd
二次免疫后天数(d)
组别
3 5 10 15 18
A 1.5±0.58 3.0±0.82 4.25±1.25 4.75±0.5 4.25±0.5
B 2.0±0.82 3.25±0.5 5.0±0 5.0±0 4.5±0.58
C 2.75±0.5 3.5±0.58 6.0±1.4 5.5±0.58 5.0±0
D 1.0±0 1.75±0.5 3.75±0.5 3.75±0.96 4.0±0
在二免后17d内(45日龄到61日龄)。各BS注射组的平均抗体水平均高于对照组，且C组＞B组＞A组，在免疫后第3d，10d，18d，A、C两组差异显著(P＜0.05)，免疫后第5d、15d差异不显著(P＞0.05)，A组与B组，B组与C组在整个过程中差异不显著(P＞0.05)。
3.讨论
从上述图表综合来看，BS能使母源抗体水平维持较高水平，对NDIV系疫苗免疫有免疫促进作用，且与剂量有关，适当剂量可以提高整个免疫过程中的HI水平，而大剂量可以使HI水平在短期内迅速升高到一个较高水平，但本实验在首免过程中BS对免疫的促进作用不是很明显，这可能与雏鸡的生理状况有关，有待进一步试验。
六、法氏囊素及其类似物对鸡IBD的治疗作用
传染性法氏囊病病毒(IBDV)能严重损害被感染鸡的中枢免疫器官—法氏囊及其它组织，引起病禽免疫功能低下，给养鸡业造成巨大损失。因而对IBD的有效治疗，尤其是促进发病鸡病后免疫功能的恢复，为兽医工作者所广泛关注。存在于法氏囊组织中的法氏囊素(bursin，BS)能选择性地诱导B细胞的分化，促进法氏囊组织的正常发育。而有关合成BS及其类似物—肝细胞生长因子(liver cell growth factor，LCGF)在IBD治疗等方面的报道较少，本试验对此进行了研究，以期寻求对IBD的有效治疗方法。
1.材料和方法
1.1试验用鸡：1日龄雏鸡，购自西北农林科技大学畜牧场，隔离饲养至21日龄，待法氏囊母源抗体检测阴性后，用于试验；
合成BS分子式为LYS-HIS-GLY-NH2，分子量339.41，纯度70％，用无Ca++、Mg++Hank’s液(CMFS)配制成A液和B液两种浓度的应用液，滤过除菌，4℃保存待用；合成LCGF分子式为GLY-HIS-LYS-NH2，分子量为340.39，纯度80％，用CMFS配制成溶液，滤过除菌，4℃保存待用。上述两种试剂均为美联生物科技有限公司(西安)产品。法氏囊高免卵黄抗体(琼扩效价26)和强毒均由西北农林科技大学畜牧微生物实验室提供。
2.3合成BS及LCGF对IBD的治疗试验
将人工感染发病鸡与待试鸡混群，使其自然感染发病，病鸡表现典型的IBD临床症状，剖捡可见典型的IBD病变，取法氏囊、脾脏和肾脏等组织分别匀浆，离心，取上清液，用ELISA法检测(试剂盒购自广西兽医研究所)，表现IBDV强阳性反应，证明其确为IBD，发病率达80％以上。随后将发病鸡随机分为7组，每组25只，进行治疗试验，其间逐日观察记录各组鸡群发病状况和死亡数，并对病死鸡进行剖检，记录病理变化。待群症状消退后，随机抽样解剖，观察病变组织的恢复情况。试验方案见表6。
BS和LCGF对ND的治疗试验
鸡群分组及处理均同上。
表6 病鸡分组及处理 单位：mL
治疗组 对照组
1 2 3 4 5 6 7
BS(B) 0.3 - - - - - -
BS(A) - 0.3 - 0.3 - - -
LCGF - - 0.3 - 0.3 - -
高免卵黄抗体 0.3 0.3 0.3 - - 0.3. -
生理盐水 - - - 0.3 0.3 0.3 0.6
注：以上药物均于胸肌注射。
结果和分析
IBD治疗结果
临床状况：
鸡群于27日龄发病，发病率80％，病鸡精神萎顿，采食量减少，羽毛蓬松，畏寒打盹，垂头昏睡。排白色粘稠和水样稀粪。剖检病鸡，可见腿肌、胸肌严重出血肝脏土黄色，有条纹状出血点，法氏囊肿大，内部粘膜有不同程度的出血和干酪样渗出物；脾、肾有不同程度的肿大和出血；腺胃和肌胃交界处有条状出血点。采集病鸡法氏囊、脾、肾加适量生理盐水研磨，离心，上清液用IBD-ELISA快速诊断试剂盒检测呈强阳性，该反应可为法氏囊阳性血清所抑制。
治疗结果：
治疗后第2d，治疗组鸡群大部分精神开始好转，高免卵黄抗体组部分开始好转；3d后，所有治疗组存活鸡精神基本恢复，饮水、进食恢复正常。第6d，各组存活鸡临床症状均消失。
对病死鸡剖检发现，各项病理变化在各组之间无明显差异，与治疗前病死剖检变化一致。治疗第6d后对存活鸡剖检表明，各组鸡肌肉和肝脏可见陈旧性病变，各组之间无明显差异；但法氏囊恢复情况各不相同，其中第2、4组法氏囊眼观基本正常，大如蚕豆，明显大于其他各组0.5～1.0倍；对照组法氏囊明显萎缩，发干，个别法氏囊内仍有干酪样物。
各组鸡群存活率
各治疗组鸡的存活率均显著高于对照组(P＜0.01)；卵黄抗体治疗组显著高于不治疗组(P＜0.05)；各治疗组(1~5组)之间比较，差异均不显著(P＞0.05，表7)。表明合成BS和LCGF分别配合高免卵黄或单独应用均对IBD具有明显的治疗作用；单独应用高免卵黄也可显著提高病鸡的成活率。
表7 各组鸡群的存活率 (％)
治疗组 对照组
BS(A) BS(B) LCGF 生理
BS(A) LCGF Yab
+Yab +Yab +Yab 盐水
存活率 84 80 80 76 72 40 12
与组6相比存
44 40 40 36 32 - -
活率提高
与组7相比存
72 68 68 64 60 28 -
活率提高
ND治疗结果
1临床症状：
感染2～3d后，鸡群出现开始发病，表现喘气、咳嗽、出现锣音、病鸡流涕，鼻孔周围形成干痂。嗉囊变软，倒提时，自口鼻流出水样酸臭液体。剖检可见腺胃粘膜水肿、乳头出血，肌胃角质层下有出血点，盲肠扁桃体肿大、出血，肠粘膜有大小不等的出血点和坏死灶。
2.3.2治疗结果：
治疗后临床转归表现与IBD治疗后一致。
2.3.3鸡群存活情况(见表8)：
表8 ND发病鸡群治疗后存活情况
治疗组 对照组
A B C D
存活数 27/50 38/50 42/50 4/50
存活率 54 76 84 8
由表8可见，BS+Ab或BS单独应用均对鸡ND具有明显的治疗效果，与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。
3.讨论
BS是到目前为止自鸡法氏囊组织纯化的唯一一种能促进法氏囊发育和机体体液免疫的活性多肽。Audhya等[2]认为，BS能够加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进细胞内蛋白质的合成，从而使B细胞分泌和产生抗体的能力加强。
LCGF是自小鼠肝脏组织分离纯化的一种活性三肽，其组成与BS相同，但氨基酸次序不一致[2]。Audhya[2]曾证明，高剂量的LCGF具有与BS类似的促进B细胞产生和分泌抗体的作用。
对于IBD，目前多采用特异抗体和中药制剂进行治疗，取得了一定的效果。本试验结果表明，虽然卵黄抗体能显著提高IBD鸡的成活率，但却显著低于BS或LCGF及二者与卵黄抗体结合应用的效果(P＜0.01)。尤其是卵黄抗体对法氏囊的损伤无明显的作用，因而不能从根本上解决继发感染和对其他疫苗免疫效果产生影响等问题。BS对机体免疫和法氏囊发育的促进作用已得到较多的试验结果支持。本试验证明，合成的BS和LCGF均对IBD具有治疗作用两者与高免卵黄抗体结合应用，治愈率高于单独应用，但统计分析结果无显著差异，这可能与抗体剂量小有关。应用不同剂量BS的治疗组之间的治愈率虽无显著差异，但高剂量组(A组)鸡的法氏囊恢复状况明显优于低剂量组，法氏囊素对鸡ND的治疗效果与IBD类似，提示其作用的机制主要是促进法氏囊组织的恢复和机体抗病毒抗体的生成，其作用与剂量相关。
上述试验表明：
人工合成的法氏囊素与自健康鸡法氏囊组织提取的法氏囊素具有相同的免疫学活性，法氏囊组织细胞培养上清中也存在法氏囊素。
上述各种法氏囊素制剂均可显著延长雏鸡母源抗体存在的时期。
上述各种法氏囊素制剂对ND和IBD弱毒疫苗免疫均具有显著的促进作用。
上述各种法氏囊素制剂单独应用或与特异抗体配合对ND和IBD具有明显的治疗作用，尤其是能促进损伤法氏囊的修复。