一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法.pdf

本发明公开了一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，包括以下步骤：(1)以节瓜种子灭菌后接种于基本培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖，转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大繁殖，建立节瓜无性繁殖系；(2)用镰刀菌酸作为离体胁迫剂与所述节瓜不定芽分化培养基配制筛选培养基，对已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，获得具有对镰刀菌酸抗性的无性繁殖系；(3)将具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。本发明不仅筛选出的变异体抗性强，而且选择效率高，选择效果好。

1、  一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以节瓜种子灭菌后接种于1/2MS基本培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖，转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大繁殖，建立节瓜无性繁殖系；
(2)用镰刀菌酸作为离体胁迫剂与所述节瓜不定芽分化培养基配制筛选培养基，对已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，获得具有对镰刀菌酸抗性的无性繁殖系：
(3)将具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。

2、  根据权利要求1所述的节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，其特征在于步骤(1)中的不定芽分化培养基由MS基本培养基中加入6-苄基腺嘌呤至4～6mg/L，吲哚乙酸至0.1～0.2mg/L配制而成，无菌苗茎尖在不定芽分化培养基中培养18～22天，培养条件为室温23℃～27℃，每日光照10～14小时。

3、  根据权利要求1所述的节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，其特征在于步骤(2)中的筛选培养基是在所述不定芽分化培养基中加入经过滤灭菌的镰刀菌酸溶液，使之最终镰刀菌酸浓度为75～100mg/L。

4、  根据权利要求1所述的节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，其特征在于步骤(2)中的具体筛选过程为将继代1～2次的节瓜不定芽接种至筛选培养基中，在25±2℃，每日光照10～14小时的条件下进行培养，15～18天后将尚存活的不定芽转入不定芽分化培养基上进行恢复培养，由此不定芽分化增殖所获得的无性繁殖系具有对镰刀菌酸的抗性。

5、  根据权利要求1所述的节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，其特征在于步骤(3)中的生根培养基由MS基本培养基加入吲哚乙酸至0.3～0.8mg/L而成。

一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法
技术领域
本发明涉及一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法。
背景技术
节瓜是华南地区有优势的特色蔬菜，节瓜枯萎病是节瓜的主要病害之一，给节瓜生产造成严重损失。由于枯萎病菌在土壤中存活时间可达3年以上，通过轮作等栽培措施难以从根本上消除病害的影响。选育节瓜抗枯萎病品种是解决节瓜枯萎病危害问题的根本途径。由于节瓜遗传资源比较狭窄，目前节瓜种质资源中抗枯萎病材料较为缺乏，已成为节瓜抗枯萎病育种的瓶颈。
节瓜枯萎病是由镰刀菌属病菌引起的真菌性病害。镰刀菌侵入植物体内，可以分泌毒素镰刀菌酸，对寄主植物产生毒害，使后者枯萎，直至死亡。常规的抗枯萎病材料筛选的方法是田间自然筛选或苗期人工接种筛选。田间自然筛选在病害自然发生时，在田间感病群体中选择发病轻或未发病的个体进行繁殖，以获得抗病材料；这种方法的缺点是依赖于病害的自然发生，病害轻的年份无法开展工作；苗期人工接种筛选是在苗期将人工培养的病菌接种到植株上，待群体发病时，从中选取未发病或发病轻的个体进行培育，繁殖，进而获得抗病植株；这种方法可以克服对病害自然发生的依赖，但仍会受季节限制，必须在适宜发病的季节进行接种鉴定，选择效率相对较低，同时如果群体较小，或群体中变异较少，也难以达到预期的选择效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种选择效率高，选择效果好的节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法。
本发明的目的可通过以下的技术步骤来实现：
(1)以节瓜种子灭菌后接种于1/2MS基本培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖，转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大繁殖，建立节瓜无性繁殖系；
(2)用镰刀菌酸作为离体胁迫剂与所述节瓜不定芽分化培养基配制筛选培养基，对已建立地节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，获得具有对镰刀菌酸抗性的无性繁殖系；
(3)将具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。
本发明步骤(1)中的不定芽分化培养基由MS基本培养基中加入6-苄基腺嘌呤至4～6mg/L，吲哚乙酸至0.1～0.2mg/L配制而成，无菌苗茎尖在不定芽分化培养基中培养18～22天，培养条件为室温23℃～27℃，每日光照10～14小时。
本发明步骤(2)中的筛选培养基是在所述不定芽分化培养基中加入经过滤灭菌的镰刀菌酸溶液，使之最终镰刀菌酸浓度为75～100mg/L。
本发明步骤(2)中的具体筛选过程为将继代1～2次的节瓜不定芽接种至筛选培养基中，在25±2℃，每日光照10～14小时的条件下进行培养，15～18天后将尚存活的不定芽转入不定芽分化培养基上进行恢复培养，由此不定芽分化增殖所获得的无性繁殖系具有对镰刀菌酸的抗性。
本发明步骤(3)中的生根培养基由MS基本培养基加入吲哚乙酸至0.3～0.8mg/L而成。
选用广东地方品种“黑毛节瓜”无菌苗增殖的不定芽，以镰刀菌酸浓度为75mg/L～100mg/L筛选培养基筛选的变异体经3代恢复和增殖，回接到含镰刀菌酸浓度为50～100mg/L的筛选培养基上再次筛选，以同源的未经筛选的细胞系为对照。表1结果表明，变异体对镰刀菌酸(FA)的抗性明显增强。
        表1经筛选的细胞系对FA抗性的提高