高山冰缘植物组织培养与冷诱导分泌蛋白生产的方法 【技术领域】
本发明属于蛋白质工程技术，尤其属于一种高山冰缘植物组织培养与冷诱导分泌蛋白生产的方法。
背景技术
植物分泌蛋白是指植物细胞分泌到质外体的蛋白，可以在液体摇培时分泌到培养液。一般植物的分泌蛋白包括信号多肽或抗冻蛋白。例如钙调素是一种信号多肽，经国内外10多年的研究已证实钙调素不仅普遍存在于植物细胞外，而且在胞外位点具有促进悬浮培养细胞及其原生质体的增殖和促进二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因的光不依赖性表达等多种重要生物学功能；关于抗冻蛋白及其基因的研究也已有40多年的历史，但实验材料大多集中于鱼类和昆虫，自从1992年Griffith等从冬黑麦质外体中发现可经冷诱导表达的抗冻蛋白以来，黑麦草、胡萝卜的抗冻蛋白相继被发现，并且都是冷诱导表达，都存在与质外体中，属于分泌性蛋白，并且其抗冻活性优于鱼类或昆虫。所以植物冷诱导产生分泌蛋白很有可能具有抗冻功能。由于抗冻蛋白分布的不普遍性，很难从特定的几种植物中找到，并且传统地质外体提取技术难掌握，大大限制了冷诱导分泌的抗冻蛋白的分离。高山冰缘植物是很好的植物抗冻种质库，通过组织培养获得其扩繁的组织材料进而分离内源的抗冻蛋白及其编码基因，这在细胞生物学、遗传学、植物生理学、分子生物学等基础研究方面具有重要的意义，而且具有广泛的应用价值。
【发明内容】
本发明的目的着眼于高山冰缘植物，并通过高质量的采样、运输系统，将高山冰缘植物活体移植回实验室，排除形态解剖学上有明显抗寒特性的物种，将通过筛选的物种进行组织培养，并在组织培养过程中评价变异情况，并利用可控低温、光周期悬浮愈伤组织摇动培养，通过分光光度计定时检测培养液蛋白吸收波段吸收峰，确定诱导出冷诱导蛋白，利用套管离心愈伤组织，得到冷诱导蛋白。
本发明的目的可通过以下步骤来实现：
(1)选择合适的采样地点。在冰川附近，植物生长期大约在6-10月份，白天气温10℃以上，晚上气温0℃左右，昼夜有反复冻融的温差。利用采集杖将植物的植株连根带土挖下，迅速放置到聚乙烯采集袋中，采集到的植株当天取出放入运输箱中。运输箱夹层支撑隔板上放置加缓释冰袋，每隔6小时从透气孔中向箱内喷雾补水，如果储存或运输超过2天则换一次冰袋。同时在采样地用FAA固定液固定每种植物的几篇叶片，留作形态解剖观察之用。
(2)筛选植物。根据所设计的产冷诱导分泌蛋白高山冰缘植物候选标准，即无分泌蜡质的腺体、无表皮绒毛、无角质层加厚。具体将运输回实验室的固定叶片用梯度乙醇脱水(90％，95％，100％)各30-40分钟，并用二甲苯浸泡1小时，浸腊包埋后进行切片，1％伊红染色。
(3)组织培养。在筛选后的植株中，选择饱满挺拔的叶子剪下置于自来水管下流水洗涤1小时，然后在超净台上将叶片移入高压灭菌过的烧杯中，70％乙醇浸泡30秒，放于另一无菌烧杯用无菌水淋洗一次，加0.1％的氯化汞灭菌15分钟，移入无菌培养皿中用无菌水淋洗3次，然后用无菌滤纸吸干表面水分。切去叶片边缘，将叶片切成5mm左右的片断，转到含2.0-6.0mg/L的GA3的MS固体培养基中，25℃、每天10小时光照培养。一周后保持鲜活的叶片移入含1.0-2.0mg/LGA3+0.1-2mg/LBA+0.1-2mg/L的NAA或0.1-2mg/L2，4-D的MS固体培养基中诱导愈伤组织。愈伤组织出现后，经过4-6周的相同培养基的继代扩繁，转移到不含激素的MS液体培养基，利用可控低温与光周期摇动培养装置进行低温诱导。摇培后的愈伤组织接入无激素MS培养基发芽生根，再生为植株。
(4)组织培养的变异评价，其分两部分。第一部分是幼胚染色体变异评价，操作步骤包括：选取液体摇动培养后的1毫米左右直径的小颗粒在显微镜下挑出发育的幼胚，利用6％纤维素酶+6％果胶酶25摄氏度6小时消化细胞壁，过6微米的尼龙膜，滤液每分钟600转离心5分钟，去上清，加入2M的氯化钙打散细胞，底部加入60％的蔗糖，形成双相溶液，每分钟600转离心5分钟，然后用注射器针头抽出界面处的原生质体条带。2M的氯化钙稀释原生质体，于载玻片上空1米处滴片，加一滴卡诺固定液展片，将制片65摄氏度温浴4小时，然后乙醇梯度脱水(70％，80％，95％，100％乙醇各10分钟)，室温晾干制片上的乙醇，1％醋酸洋红染色10分钟，显微镜观察染色体数目。第二部分是再生苗根尖染色体变异评价，操作步骤包括，选取液体摇动培养中的幼胚，转到MS固体培养基再生并生根，根长至1厘米时取根尖，6％纤维素酶+6％果胶酶25摄氏度6小时消化细胞壁，压片，染色步骤同上，显微镜下观察染色体数目。
(5)冷诱导。利用冷柜接-30℃-+30℃温控器，内置40瓦日光灯4个接微电脑控时开关，内置水平摇床。在无菌操作台上，取1克愈伤组织接入盛有50毫升MS液体培养基的150毫升三角瓶中，盖橡胶塞，插入17号注射针头，尖端进入液体培养基，温度-4-4摄氏度，光周期每天光照12小时，摇动速率每分钟60转，摇动培养4-6周。
(6)冷诱导分泌蛋白的检测。每天用注射器连接橡胶塞中的针头，抽取液体培养液200微升，放到150微升石英比色皿，选取200-300纳米激发波长做分光光度扫描，以新鲜配制的液体MS培养基为对照扫描基线，观察吸收峰的变化，有明显吸收峰时即为诱导蛋白出现。
(7)冷诱导分泌蛋白的分离。将出现诱导蛋白的愈伤组织橡胶塞打开，抽真空渗透30分钟，然后将愈伤组织过滤收集。移入底部用钢针扎0.1毫米孔的0.5毫升离心管，外套2毫升离心管，每分钟500转离心10分钟，收集2毫升离心管中的渗出液，即为得到的冷诱导蛋白混合液，可采用聚丙烯酰胺变性胶电泳印证。
本发明的优点及产生的效果是：
1、高山冰缘植物采样与运输系统首次提出采用聚乙烯袋保湿，运输过程中运输箱采取夹层冰袋制冷。减少了采后鲜样的蒸腾失水，降低高山冰缘植物的代谢速率，并采取透气孔通气和喷雾补充水分的方法，大大提高了高山冰缘植物的成活率，为下一步组织培养创造良好的条件；
2、本发明首次提出高山冰缘植物候选标准，排除形态解剖学抗寒特性的思想和方法，缩小了产冷诱导蛋白高山冰缘植物的候选范围；
3、高山冰缘植物组织培养首次采用GA3预处理的方法，抑制了高山冰缘植物组织培养初期出现的叶片易褐变、易水渍化和易白化的现象；
4、高山冰缘植物组织培养的变异评价首次提出用摇动培养的幼胚制作原生质体进行染色体变异评价，并结合再生苗根尖染色体变异评价，形成完善的评价系统；
5、可控低温、光周期的悬浮组织摇动培养的冷诱导系统首次采用冰柜内置摇床，利用微电脑控时结合精密温控器进行控光、控温，满足了摇动培养中对温度和光照的要求，填补现阶段无满足冷诱导条件的仪器的空白；
6、冷诱导分泌蛋白的检测系统首次提出针头定时吸取培养液进行分光光度扫描的方法，大大优于分阶段提取蛋白进行电泳的繁杂方法；
7、冷诱导分泌蛋白的分离系统首次提出利用原培养液取代提取缓冲液进行真空渗透，保持了冷诱导蛋白的环境稳定性，并首次利用离心管套叠取代注射器或微管的离心的方法分离分泌蛋白，是一种有效而简化的方法。
【附图说明】
图1为本发明运输箱剖面示意图。
图2为可控低温、光周期的悬浮组织摇动培养冷诱导与冷诱导蛋白检测示意图。
图3为冷诱导分泌蛋白的分离示意图：
图4为高山离子芥组织培养结果。
图5为扫描检测结果第四周出峰。
图6为三个蛋白条带
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明的技术方案再作进一步详述：(1)高山冰源植物样品采集。8月份在天山一号冰川附近的空冰斗采样，此处此时的昼夜有反复冻融的温差，白天平均气温10℃左右，夜晚平均气温0℃以下。利用采集杖将植物的植株连根带土挖下，迅速放置到聚乙烯采集袋中，采集到的植株当天取出放入运输箱1，夹层支撑隔板3上放置加缓释冰袋2，每隔6小时从透气孔中向箱内喷雾补水，同时在采样地用FAA固定液固定每种植物的几篇叶片，留作形态解剖观察之用(参见图1)。(2)产冷诱导分泌蛋白高山冰缘植物候选。将固定样用梯度乙醇脱水(90％，95％，100％)各30分钟，并用二甲苯浸泡1小时，浸腊包埋后进行切片，1％伊红染色，发现高山离子芥无分泌蜡质的腺体、无表皮绒毛、无角质层加厚，随即将高山离子芥做为组织培养对象。(3)进行高山冰缘植物组织培养及其变异评价。选择高山离子芥植株，并将饱满挺拔的叶子剪下，置于自来水管下流水洗涤1小时，然后在超净台上将叶片移入高压灭菌过的烧杯中，70％乙醇浸泡30秒，放于另一无菌烧杯用无菌水淋洗一次，加0.1％的氯化汞灭菌15分钟，移入无菌培养皿中用无菌水淋洗3次，然后用无菌滤纸吸干表面水分。切去叶片边缘，将叶片切成5毫米左右的片断，转到含4mg/L的GA3的MS固体培养基中，25摄氏度、每天10小时光照培养。一周后保持鲜活的叶片移入含2mg/LGA3+0.2mg/L2，4-D+0.2mg/LNAA的MS固体培养基中诱导愈伤组织。4周后高山离子芥愈伤组织出现，再经过4周的相同培养基的继代扩繁，转移到不含激素的MS液体培养基，冷诱导过程利用冷柜5接-30～+30℃温控器6内置40W的该灯管10接微电脑开关7、内置水平摇床铺11进行低温诱导4-6周，温度-4-4摄氏度，光周期每天光照12小时，摇动速率每分钟60转(参见图2)。选取液体摇动培养后的1毫米左右直径的小颗粒在显微镜下挑出发育的幼胚，利用6％纤维素酶+6％果胶酶25摄氏度6小时消化细胞壁，过6微米的尼龙膜，滤液每分钟600转离心5分钟，去上清，加入2M的氯化钙打散细胞，底部加入60％的蔗糖，形成双相溶液，每分钟600转离心5分钟，然后用注射器针头抽出界面处的原生质体条带。2M的氯化钙稀释原生质体，于载玻片上空1米处滴片，加一滴卡诺固定液展片，将制片65摄氏度温浴4小时，然后乙醇梯度脱水(70％，80％，95％，100％乙醇各10分钟)，室温晾干制片上的乙醇，1％醋酸洋红染色10分钟，显微镜观察染色体数目。选取液体摇动培养中的幼胚，转到MS固体培养基再生并生根，根长至1厘米时取根尖，6％纤维素酶+6％果胶酶25摄氏度6小时消化细胞壁，压片，染色步骤同上，显微镜下观察染色体数目。发现观察到的染色体数目皆为14条，没有发现变异。(4)摇动培养进行低温诱导。无菌操作，取1克高山离子芥愈伤组织接入盛有50毫升MS液体培养基的150毫升三角摇瓶8中，盖橡胶塞，插入17号注射针头9，尖端进入液体培养基，温度-4-4摄氏度，光周期每天光照12小时，摇动速率每分钟60转，摇动培养4周。(5)冷诱导分泌蛋白的检测。每天用注射器连接橡胶塞中的针头，抽取液体培养液200微升，放到150微升石英比色皿，选取200-300纳米激发波长做分光光度扫描，以新鲜配制的液体MS培养基为对照扫描基线，观察吸收峰的变化，在第4周开始出现明显吸收峰，即为诱导蛋白出现(参见图5)。(6)冷诱导分泌蛋白的分离。将盛有高山离子芥愈伤组织的三角瓶的橡胶塞打开，抽真空渗透30分钟，然后将愈伤组织过滤收集。移入底部用钢针扎0.1毫米孔13的0.5毫升离心管12，外套2毫升离心管14，每分钟500转离心10分钟，收集2毫升离心管14中的渗出液，即为得到的冷诱导蛋白混合液，(参见图3)采用聚丙烯酰胺变性胶电泳印证，发现有三条明显条带(参见图6)。