一种优良番木瓜种苗的组织培养方法.pdf

本发明涉及番木瓜种苗的组织培养方法，从大面积番木瓜种植区筛选出抗病优质母株，并对其作进一步的抗病性鉴定，再以抗病优质母株之成龄侧芽为外植体，对扩繁增殖条件、繁殖率、正常化成苗、诱导生根等关键技术环节作较为系统的研究，从而建立一套较为完整且适应性好的繁殖体系，解决了以大田成龄番木瓜侧芽为外植体进行组织培养存在的污染率高、增殖率低、诱导生根难和移栽成活率低的关键问题，为番木瓜的生产提供培育优质种苗的技术途径，同时亦为番木瓜的大规模生产开发起到积极的推动作用，这具有十分重要社会和经济效益。

1.  一种适合于建立番木瓜无性系的外植体，其特征在于该外植体为大田较抗病、产量高、品质好及果型好的优良番木瓜两性株成龄侧芽。

2.  一种优良番木瓜种苗的组织培养方法，包括外植体采集、预处理、消毒和培养等步骤，其特征在于：
外植体采集：取大田成龄番木瓜侧芽为外植体；
预处理和消毒：采用含Vc+AgNO₃+PVP的溶液、含羧苄青霉素(Carb.)的水先后预处理和用70％酒精、0.15％升汞消毒；
培养：培养阶段包括初始接种、继代增殖培养、壮苗培养、催根培养、试管苗移栽等步骤。

3.  根据权利要求2所述的优良番木瓜种苗的组织培养方法，其特征在于在预处理时处理液含有100mg/L Vc+1mg/L AgNO₃+20mg/L PVP，含100mg/L羧苄青霉素(Carb.)的水，在速度为100-120转/分的振荡摇床上处理时间达2小时以上。

4.  根据权利要求2或3所述的优良番木瓜种苗的组织培养方法，其特征在于，外植体经预处理后在70％酒精中浸泡50秒、0.15％升汞，在速度为100-120转/分的振荡摇床上处理5分钟。

5.  根据权利要求2或3所述的优良番木瓜种苗的组织培养方法，其特征在于所述的初始接种步骤为：接种于MS+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L+GA₃1.0mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.7，26-28℃，每日光照培养12小时，强度为1500lx。

6.  根据权利要求2或3所述的优良番木瓜种苗的组织培养方法，其特征在于所述的继代增殖培养步骤为：外植体经初始培养后，作适当分割后继代接种于MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.7，26-28℃，每日光照培养16小时，强度为2000lx。

7.  根据权利要求2或3所述的优良番木瓜种苗的组织培养方法，其特征在于所述的壮苗培养步骤为：外植体经继代培养后，接种于MS+BA0.2mg/L+KT0.3mg/L+NAA0.1mg/L+GA₃1.0mg/L+ADS40mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.7，26-28℃，每日光照培养16小时，强度为2000lx。

8.  根据权利要求2或3所述的优良番木瓜种苗的组织培养方法，其特征在于所述的催根培养步骤为：繁殖芽经壮苗培养后，接种于MS+KT0.1-0.2mg/L+NAA0.05-0.1mg/L+IBA0.2-0.3mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6.5g/L，pH＝5.6，26-28℃，每日光照培养12小时，强度为1500lx。

9.  根据权利要求2或3所述的优良番木瓜种苗的组织培养方法，其特征在于所述的试管苗移栽步骤为：生根苗经2-3天的自然光炼苗后，移栽于砂土+椰糠+菜园土或发酵的农家肥混和(2∶2∶1)的基质中，移苗后1周内，每天喷施浓度为200-400ppm的IBA。

10.  按权利要求1-9培育的2个无性系，其特征在于，以苏鲁I号、苏鲁II号的成龄两性耐病母株的大田侧芽为外植体培育2个无性系。

11.  如权利要求10获得苏鲁I号、苏鲁II号2个无性系，其特征在于，外植体为较为抗(耐)病的两性株侧芽，繁殖形成2个同质的无性系。

一种优良番木瓜种苗的组织培养方法
【技术领域】
本发明涉及大田成龄番木瓜两性株侧芽细胞组织培养优良种苗的方法。
【背景技术】
番木瓜(Carica Papaya L.)是一种广泛分布于世界热带、亚热带地区的多年生常绿果树作物，其因生长快速、结果早、产量高，成为我国南部及世界热带地区最普遍栽培的果树种之一。它具有重要的食用和工业价值，是当前发展热带高效农业的重要推广项目和热带农业产业结构调整项目之一。番木瓜的营养价值高，含可溶性固形物12％，每100g果肉含有维生素A、B1、B2、C和G60-122mg。未熟青果的乳汁中，含有大量的“木瓜酵素(papain)”，作为肉类软嫩剂可助消化。用途广，除成熟的果实作为果品供鲜食，青果作为蔬菜食用外，还可加工腌渍或制成蜜饯、果脯、果酱和果汁等。成熟的果实还可制造胃药，未熟的果实含有丰富的木瓜蛋白酶，可用来软化肉类、帮助消化；在医药上可用作制造蛋白胨；在饮料工业上可作澄清剂；在化妆工业上可用来制造面膏、洗发水等。未成熟的果实和肉质根也可作为饲料，可见本发明不仅能促进番木瓜的生产，而且将极大刺激食品加工、医药卫生、美容保健和养殖业等相关产业的发展，具有重要的经济意义。目前，番木瓜在生产上存在番木瓜花叶病(病毒病)严重和品种不纯、种子混杂两个问题，严重地威胁番木瓜的栽培事业和发展前途。
番木瓜快繁中存在的问题：1)商业化生产中的不利因素至今为止，番木瓜的生产种植仍以传统的种子繁殖方式，番木瓜的株性复杂，有两性株、雌株及雄株之分，通常两性株占65-70％、雌株占30％、雄株占3-5％，用常规种子繁殖不能保证植株株性一致，而实际生产中只有两性株才具有生产价值，其它植株必需去除，可见用种子进行生产会造成很大的浪费；杂交制种成本很高，种子不耐贮藏，且易受病虫的侵害，特别是番木瓜环斑病毒病使番木瓜由多年生变为一年生，这些因素大大限制了番木瓜的生产和利用。采用无性繁殖技术可以解决这些问题，但常规的无性繁殖(即扦插和嫁接)成活率极低，不适合番木瓜的快速繁殖，因此，需要通过组织培养进行无性系的快速繁殖。Chen等、Mehdi等、Yie等提出通过愈伤组织进行快繁，但培养出的植株基因型易发生变化，效果不理想。大量研究结果表明，用茎尖和侧芽进行番木瓜快繁是较理想的途径，但尚存在一些问题有待解决。番木瓜快速无性繁殖技术已小规模应用于商业生产中，虽具有不少优点，但有些因素限制了这种技术的应用：(1)优良基因型的番木瓜组培需要用田间成龄优良植株的芽特别侧芽来培养，组培成龄木瓜的芽比实生苗的要困难；(2)不能无限地继代培养，在培养8-13代后，增殖率有所下降，12-13代后，不再产生顶端优势；(3)田间抗病毒或耐病毒的番木瓜植株较难找到。2)污染问题直接从田间采回的番木瓜的顶芽或侧芽，经消毒后污染率高达80％以上，因此大多数的番木瓜快繁均以失败告终。污染问题成了番木瓜快繁中的一大障碍。在番木瓜生产中，环斑病毒病(Papaya Ringspot Virus，PRSV)是其致命的病害，其病原是马铃薯Y病毒组的重要成员之一，分为P型和W型，其中P型普遍发生于热带、亚热带番木瓜产区，是世界番木瓜生产重要的制约因素，多年来由于这一病害的流行，严重阻碍了国内外的番木瓜生产，一些重病地区甚至濒临灭绝，例如2000-2001年期间许多果农在海南种植几千亩番木瓜，由于PRSV得不到有效地控制而使整个生产造成不可估量的损失。生产实践证明若不解决番木瓜生上的PRSV病害问题就无从谈起番木瓜能生产。迄今，还没有十分有效的化学药剂来控制这一病毒病害，轮作等农业措施只能起到一定的减轻病害的作用，常规的新品种选育效率较低，且抗病品种由于病原菌株的快速更换，其抗病性在较短的时间内就会丧失。利用病毒核酸序列培育抗病的转基因植物是一种重要的抗病毒基因工程策略，夏威夷大学、中国热带农业科学院(与中国科学院微生物研究所合作)均利用木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(Papaya Ringspots Virus Coat Protein Gene，PRSV-CP)进行番木瓜抗病毒崭新品系的培育，几乎同时获得了具有一定抗病性的转基因株系，并进行大田中试，可望进行扩广种植，美国夏威夷大学亦在积极探索进行大规模商业化生产番木瓜的途径；泰国等国在利用PRSV-CP转基因技术探索获得抗病毒番木瓜新的栽培品种，以期发展番木瓜的生产。不过转基因番木瓜涉及生物安全性问题，使转基因抗病番木瓜品种的推广和应用暂时受到一定的限制，同时考虑消费者权益，对转基因食品实行标签销售，因此利用转基因品种生产出来的果品短期内不能被普遍接受，考虑到番木瓜种植产业的延续性，近期内利用大田抗病植株作为材料生产优质种苗显然是一种重要补救措施；番木瓜在性别方面比较复杂，在两性、雌性株中，两性番木瓜植株能生产出高品质、高产量的果品，目前普遍采用的种子实生种苗进行种植生产的方法显然无法达到这一目的；以组织培养技术建立起来的快繁技术能为番木瓜的生产提供同质的优质种苗，而利用快繁技术对已知性状的优良单株进行扩繁显然是达到这一目标的最佳途径，大田成龄侧芽为外植体进行的种苗扩繁尽管在国内外做了许多工作，但都不系统，还存在许多技术难题亟待解决，如利用某一品种获得地扩繁技术对另一种番木瓜品种的重复性差，还有许多诸如诱导生根的频率低等环节的问题还没有完全突破，这些都大大限制了该技术体系在番木瓜种苗生产上的应用。综上所述，番木瓜组培快繁既可保持优良品种(抗病、优质、高产)的遗传稳定性，为其种质的保存提供了一条有效途径，同时也方便了国际间种质交流；又结合其他方法如番木瓜转基因来筛选抗病品种，为从根本上解决番木瓜病毒病的危害打下基础。使番木瓜由如今的一年利用变为二至三年利用，这对番木瓜的商业化生产具有重要的意义。
【发明内容】
为了解决现有技术中存在的实际且迫切需要解决的问题，本发明的目的是提供一种消毒后污染率低、增殖率高的优良番木瓜同质两性种苗的组织培养方法。
本发明技术方案：一种优良番木瓜种苗的组织培养方法，包括外植体采集、预处理、消毒和培养等步骤：
外植体采集：取大田成龄番木瓜侧芽为外植体；
预处理和消毒：一、用自来水洗净，用饱和香皂水(比普通洗衣皂碱性弱)浸泡20-30分钟；用含有100mg/L Vc+1mg/L AgNO₃+20mg/L PVP处理液，在速度为100-120转/分摇床上处理时间达2小时以上；然后在含羧苄青霉素(Carb.)的水继续预处理半小时，处理方法同前；二、外植体经预处理后在70％酒精中浸泡50秒，采用0.15％升汞在速度为100-120转/分摇床上消毒5分钟；
培养：培养阶段包括以下步骤：初始接种、继代增殖培养、壮苗培养、催根培养、试管苗移栽；
初始接种：经消毒的外植体初始接种于MS+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L+GA₃1.0mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.7，26-28℃，每日光照培养12小时，光照强度为1500lx，连续培养时间29-31天；
继代增殖培养：外植体经初始接种后，作适当分割后接种于MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.7，26-28℃，每日光照培养16小时，光照强度为2000lx，连续培养时间39-41天，产生丛生芽。
壮苗培养：经继代培养后，丛生芽接种于MS+BA0.2mg/L+KT0.3mg/L+NAA0.1mg/L+GA₃1.0mg/L+ADS40mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.7，26-28℃，每日光照培养16小时，光照强度为2000lx，连续培养20-30天形成繁殖芽。
催根培养：经壮苗培养后，繁殖芽接种于MS+KT0.1-0.2mg/L+NAA0.05-0.1mg/L+IBA0.2-0.3mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6.5g/L，pH＝5.6，26-28℃，每日光照培养12小时，光照强度为1500lx，连续培养19-21天则诱导出较高质量的根系，成为生根苗。
试管苗移栽：生根苗经2-3天的自然光炼苗后，移栽于砂土+椰糠+菜园(2∶2∶1)土混和的基质中，移苗后1周内，每天喷施浓度为200-400ppm的IBA。
结果分析：外植体消毒的成功率：经过预处理的外植体，再用升汞消毒，其成功率达50％以上，这说明预处理对番木瓜外植体有较明显的正效应，即对外植体表面乳汁、细菌及其孢子、酚类化合物的去除均有一定的作用；采用这一消毒技术获得的良好效果是已见报道的技术方法所不能达到的。
2、叶丛芽的获得：侧芽接种于第一培养基1个月内，每周对外植体侧芽更换新鲜培养基能较有效地避免外植体的褐变现象，1个月后芽纵切继代于第二培养基上，约5周形成叶丛芽(茎较短、叶片变形且大)。
3、叶丛芽继代培养及正常诱导化培养：叶丛芽若继续培养于第二培养基上，芽的生长状态始终保持叶丛状。若转入第三培养基上，能较明显地改善苗的生长状态—茎伸长、叶片生长趋于正常化，繁殖系数达3-5倍。
4、催根及移栽成活率：正常化生长的小苗进行催根前壮苗处理有利于提高根的质量及成根率；这不仅解决了种苗在继代过程中出现的退化问题而且对保证种苗的质量是有益的。采用本研究催根培养基不仅根的质量大为改观，而且催根率由原先的30％左右上升至目前85％以上，主根不明显，根系较发达；这有利于提高试管苗的移栽成活率。采用砂土+椰糠+菜园土或发酵的农家肥混和(1∶1∶1)的基质(袋装)进行试管苗的移栽，移栽成活率达80％以上。移栽后1周内保持一定的湿度对试管苗的初始适应生长是必要的。成龄番木瓜快繁植株获得较高的移栽成活率，为番木瓜种苗的商业化生产奠定了良好的基础。
本研究已对成龄番木瓜苏鲁I号、苏鲁II号两性株侧芽的取材、消毒、芽的继代增殖、催根及移栽等环节作了系统的研究，找到了一条适合成龄番木瓜侧芽快繁的可行途径，若投入一定的人力、物力，以此技术体系为依托进行番木瓜种苗的商业化生产是可行的，此项技术的突破填补了国内在成龄番木瓜快繁技术上的空白；通过本技术体系目前已获得了苏鲁I号、苏鲁II号两性株的无性性各1个，并已移栽至大田进行示范种植，示范面积为100亩。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明进行详细说明：
1、材料来源：成龄番木瓜侧芽取自大田较抗病、产量高、品质好及果型好的优良两性株苏鲁I号、苏鲁II号。春秋季节晴天午后切取两性母株地上部分约占整株高度1/3以下区段的侧芽，以此作为外植体。
2、方法：
(1)材料预处理及消毒处理①用自来水洗净，用饱和香皂水(比普通洗衣皂碱性弱)浸泡20-30分钟；用含有100mg/L Vc+1mg/L AgNO₃+20mg/L PVP处理液，在速度为100-120转/分摇床上处理时间达2小时以上；在含羧苄青霉素(Carb.)的水继续预处理半小时，处理方法同一；②外植体经预处理后在70％酒精中浸泡50秒、0.15％升汞，在速度为100-120转/分摇床上处理5分钟；                                  经消毒的外植体的初始接种于MS+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L+GA₃1.0mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.7，26-28℃，每日光照培养12小时，强度为15001x，每周换一次培养基，连续培养时间30天。
(2)丛芽的形成和继代增殖培养：外植体经初始培养后，作适当分割后继代接种于MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.7，26-28℃，每日光照培养16小时，强度为2000lx，连续培养时间40天，产生丛生芽。
(3)壮苗培养：外植体经继代培养后，接种于MS+BA0.2mg/L+KT0.3mg/L+NAA0.1mg/L+GA₃1.0mg/L+ADS40mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.7，26-28℃，光照培养16小时，强度为2000lx，连续培养时间25天，形成繁殖芽。
(4)催根培养：繁殖芽经壮苗培养后，接种于MS+KT0.1-0.2mg/L+NAA0.05-0.1mg/L+IBA0.2-0.3mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6.5g/L，pH＝5.6，26-28℃，光照培养12小时，强度为1500lx，连续培养时间20天。
(5)试管苗移栽：生根苗经2-3天的自然光炼苗后，移栽于沙土+椰糠+菜园土(1∶1∶1)混和的基质中，移苗后1周内，每天喷施浓度为200-400ppm的IBA。