抑制SARS病毒基因表达的小分子干扰核糖核酸 【技术领域】
本发明涉及反义技术领域，具体的本发明涉及具有抑制SARS病毒复制和/或SARS病毒基因表达的小分子干扰核糖核酸及其应用。
背景技术
非典型肺炎即严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory SyndromeSARS)的病原体已经确认为一种冠状病毒，该病毒是一种正链RNA病毒(GENEBANK登录号：NC_004718)，基因组为单链RNA，含有Poly(A)，总长接近30kb。病毒表面有约20nm左右棒状结构，呈皇冠状。该病原体具有很强的感染性和传染性，病毒在患者体内经过早期复制过程后，在肺部引发大规模炎症反应，最终导致肺部组织损伤。
SARS病毒感染所引起的传染性非典型肺炎严重危害了我国和世界多国人民的身体健康，也正在严重干扰我国经济的正常开展.它已成为当前我国一个严重的社会、政治、经济问题。对SARS病毒，现无有效药物抑制其生长。小分子核糖核酸(siRNA)是在RNAi(RNA干扰)技术基础上发展起来的。与它有关的技术被美国“Science”评为2001年度国际十大科技突破的第二条，2002年度国际十大科技突破的第一条，2003年被评为第四条。其作用原理主要是siRNA部分解链，与靶mRNA反向互补的片段与靶序列结合，体内的酶系将mRNA切断。由此可抑制靶基因的表达。它是一个被认为是最有前途的核酸药物技术。
RNA干扰(RNA interference)是一种由双链RNA诱发的基因沉默(gene silencing)。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA(mRNA)被降解，从而抑制了该基因地表达。RNA干扰技术在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。RNA干扰的详细机制尚不清楚。现有实验资料提示，RNA干扰过程主要有2个步骤：(1)长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶Dicer切成21～23个碱基对的短双链RNA，称为小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)；(2)小分子干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合体可识别与小分子干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。小分子干扰性RNA的发现不仅加深了人们对RNA干扰机制的认识，同时突破了一个用长双链RNA在哺乳类细胞中抑制基因表达时常常遇到的障碍，即非特异性作用。长于30个碱基对的双链RNA常常会激活蛋白激酶而诱发对蛋白质合成的非特异抑制。小分子干扰RNA一般不会在哺乳类细胞中诱发这种非特异性抑制。用人工合成的小分子干扰RNA可特异性地抑制哺乳类细胞中外源性或内源性基因的表达。实验表明，长度为21-23个碱基、3’末端有2个碱基突出的小分子干扰性RNA活性较高。小分子干扰RNA诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。RNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。那么，通过RNA干扰治疗病毒感染性疾病在理论上完全可行。目前，已有很多研究表明：通过RNA干扰可以抑制病毒在细胞内复制，如人类免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰质炎病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。但是，这些研究只是停留在实验室体外培养细胞水平及初步的动物实验水平，尚未有将小分子干扰RNA用于人体试验的结果。将RNA干扰技术用于临床治疗人类疾病还有许多研究工作要做，如何将小分子干扰性RNA安全、有效地导入靶组织或靶细胞就是一个必须解决的问题。尽管如此，大量的体外实验研究资料已经显现出该技术在基因功能研究中的应用前景和新药开发中的巨大潜力。
SARS病毒RNA编码多个蛋白质基因。其中，M蛋白、E蛋白、N蛋白均为SARS病毒所特有，人细胞中无替代其功能的其他蛋白质存在。如抑制这些蛋白质中的任何一个，SARS病毒的生长周期即不能完成，病毒生长即受到抑制。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一组SARS病毒的小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列及其应用。
本发明的另一目的就是提供一组小分子干扰核糖核酸、其载体、宿主细胞及其应用。
本发明的第一方面提供了一组SARS病毒的小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其特征在于，所述靶序列为SARS病毒M、N、E基因上的连续19-25个核酸。
较佳的，所述siRNA靶序列为与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：26中任意一条序列的连续18个核酸序列相同的序列。更佳的，所述的siRNA靶序列为SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：26所示的任意一条序列。
本发明的第二方面提供了上述siRNA靶序列在筛选抗SARS病毒药物中的应用。所述抗SARS病毒药物为治疗或预防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相关疾病的药物。
本发明的第三方面提供了一组小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其特征在于，所述核糖核酸特异性地与与上述SARS病毒位点的mRNA相结合，且能抑制SARS病毒基因的表达和/或SARS病毒的复制。
较佳的，所述核糖核酸为具有19-25对碱基的双链RNA复合体，所述双链中至少有18对碱基互补。
在一优选例中，所述的核糖核酸包括一条正义链和一条反义链，所述反义链序列与上述siRNA靶序列有至少18个碱基互补，正义链序列与所述反义链序列有至少18个碱基互补。更佳的，所述正义链与反义链结合区域含19、20或21对碱基互补。
在另一优选例中，所述反义链序列与SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：29所示的任意一条序列有至少18个碱基互补。较佳的，所述反义链序列为SEQ ID NO：30到SEQ ID NO：55所示的任意一条序列或与前述序列有连续18个碱基相同的序列。
在另一优选例中，所述核糖核酸的双链选自：
(1)反义链序列为SEQ ID NO：X，正义链序列为SEQ ID NO：(X-29)，X为30-55中任一自然数；
(2)反义链序列为SEQ ID NO：X，正义链序列为SEQ ID NO：(X-29)，但与反义链5’端配对的正义链上相应位置的碱基被替换为不配对的碱基，X为30-55中任一自然数；
(3)反义链序列为SEQ ID NO：41，正义链序列为SEQ ID NO：27；
(4)反义链序列为SEQ ID NO：54，正义链序列为SEQ ID NO：28；
(5)反义链序列为SEQ ID NO：53，正义链序列为SEQ ID NO：29。
较佳的，所述与反义链5’端配对的正义链上相应位置的碱基的替换选自：
(1)C→U；
(2)U→C；
(3)A→G或I；
(4)G→A或I。
在另一优选例中，上述核糖核酸的正义链和反义链的3’端连接有两个以上脱氧寡核苷酸的末端。较佳的，所述末端为dTdT、dAdA、dCdC、dGdG或dIdI。更佳的，所述末端为dTdT。
本发明的第四方面提供了一种载体，其特征在于，所述载体至少包含一条上述核糖核酸。较佳的，所述核糖核酸包括一个正义链区域和一个反义链区域，所述反义链区域包含与上述siRNA靶序列互补的序列，正义链区域序列与所述反义链区域序列互补。
在一优选例中，所述核糖核酸的双链选自：
(1)反义链序列为SEQ ID NO：X，正义链序列为SEQ ID NO：(X-29)，X为30-55中任一自然数；
(2)反义链序列为SEQ ID NO：X，正义链序列为SEQ ID NO：(X-29)，但与反义链5’端配对的正义链上相应位置的碱基被替换为不配对的碱基，X为30-55中任一自然数；
(3)反义链序列为SEQ ID NO：41，正义链序列为SEQ ID NO：27；
(4)反义链序列为SEQ ID NO：54，正义链序列为SEQ ID NO：28；
(5)反义链序列为SEQ ID NO：53，正义链序列为SEQ ID NO：29。
本发明的第五方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含上述载体。较佳的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。更佳的，所述哺乳动物细胞为人类细胞。
本发明的第六方面提供了上述核糖核酸的应用，其特征在于上述核糖核酸在制备治疗和/或预防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相关疾病的药物中的应用。
本发明的第七方面提供了一种组合物，其特征在于，它包括安全有效量的上述核糖核酸以及药学上可接受的载体。较佳的，所述核糖核酸包含一条正义链和一条反义链，所述反义链为选自SEQ NO：30到SEQ NO：55所示的任意一条核苷酸序列，正义链区域序列与所述反义链区域序列互补。
本发明的第八方面提供了上述载体在制备治疗和/或预防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相关疾病的药物中的应用。
本发明的第九方面提供了上述宿主细胞在制备治疗和/或预防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相关疾病的药物中的应用。较佳的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。更佳的，所述哺乳动物细胞为人类细胞。
如本发明所用，术语“小分子干扰核糖核酸”是指包含SEQ ID NO：1-SEQID NO：55所示序列的siRNA和其类似物，也指一系列化学物质，这些化学物质具有一系列核苷酸碱基序列，能通过与SARS病毒的核苷酸碱基氢键相互作用识别SARS病毒序列或其部分序列。
这些RNA类似物包括但不限于2’-O-烷基糖修饰、甲基磷酸脂、硫代磷酸酯、二磷酸酯、甲缩醛(formacetal)、3’-硫代甲缩醛(3’-thioformacetal)、砜、氨基磺酸酯和硝基骨架修饰、氨基化合物和其中碱基部分已被修饰的类似物。而且，分子的类似物可以为多聚物，其中的核糖部分已被其它合适的部分修饰或替换，产生的多聚物包括但不限于吗琳代类似物和肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)及其它类似物。这些类似物包括上述修饰的不同组合，包含连接基团和/或糖或碱基的结构修饰来改进RNaseH介导的SARS病毒RNA的破坏、结合亲和力、核酸酶抗性和/或其特异性。
在本发明中，术语“小分子核糖核酸”、“小分子干扰核糖核酸”或“siRNA”“本发明核糖核酸”可互换使用，它们都指具有抑制SARS病毒表达的核糖核酸序列，包括正义链区域(SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：29中任一条序列)和反义链区域(SEQ ID NO：30到SEQ ID NO：55中任一条序列)的核糖核酸(RNA)。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的RNA序列。然后可将该RNA序列引入本领域中已知的各种现有的RNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的核糖核酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞。所述载体可以是质粒、病毒颗粒及其他载体形式。表达载体中的核糖核酸序列可以可操作地和表达控制序列连接，还包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点，优选的包含一个或多个选择性标记。所述宿主细胞可以是细菌如大肠杆菌，真菌如酵母，昆虫细胞如Sf9，动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)如CHO、COS或人类的细胞等。通过本文的阐述，适当的载体、宿主细胞的选择都在本领域技术人员的知识范围内。
在治疗应用中，本发明的核糖核酸能够根据不同给药方式配成制剂，包括口服、局部或局部化给药。技术和配方通常在最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa中可以找到。活性组分为siRNA，其通常结合着一种载体如稀释的赋形剂，包括装填物、补充剂、接合剂、润湿剂、分解质、表面活性剂、可降解的多聚物或润滑剂、依赖于给药模式的性质和配药形式。典型的配药形式包括药片、药粉，药粒和胶囊，液体制剂包括悬浮液、乳化液和溶液。
本发明的核糖核酸特别适合于口服给药，这在常规的药物传送条件下需要在将药暴露于胃酸条件下长达4小时，当以持续释放的形式呈递时，能够长达12小时。将这些siRNA配成以持续释放形式的制剂对于治疗非典型肺炎和由SARS病毒引起的疾病非常有利。
还可以通过跨粘膜或经皮方法获得siRNA系统给药，或口服复合物。对于跨粘膜或经皮给药，适合于穿透屏障的渗透剂可以被用于制剂中。这些渗透剂在本领域中通常是已知的，包括，例如用于跨粘膜给药的胆酸盐和梭链孢酸衍生物。此外，去垢剂可以被用来协助透过。跨粘膜给药，例如可以是通过用鼻腔喷雾，以及适合于吸入或栓剂给药的制剂。鼻腔喷雾制剂可用于治疗和/或预防非典型肺炎和由SARS病毒引起的疾病。
本发明的核糖核酸也能够与适于被试者施用的可药用载体结合。合适的药物载体的例子为各种阳离子脂质体，包括但不限于N-(1-2，3-二油基氧)丙基-n，n，n-三甲基铵氯(N-(1-2，3-dioleyloxy)ProPyl)-n，n，n-trimethylammonium chloride)(DOTMA)和二油酰基磷脂酸基乙醇胺(dioleoylphophotidyl ethanolamine)(DOPE)。脂质体也是本发明的siRNA的合适载体。其它合适的载体为包含所要求的siRNA的缓释凝胶或聚合体。
本发明的核糖核酸可以通过任何有效途径施用给病人，包括肌肉注射、静脉内注射、胸内注射、鼻内注射、腹膜注射、皮下注射、和口服给药。口服给药需要肠衣以保护所要求的反义分子和其类似物在胃肠道中不被降解。siRNA可以与一定量的生理上可接受的载体和稀释剂混合，例如盐溶液或其它合适的液体。
任何所施用的特定siRNA的实际用量依赖于很多因素，如疾病或感染的类型和阶段、siRNA对体内其它细胞的毒性、其被细胞吸收的速率、施用反义分子的病人的年龄和体重。通过常规方法例如：逐渐增加siRNA的剂量使其从对抑制细胞增殖无效到有效，可以确定病人的有效量。呈递给疾病细胞的浓度范围从5nM到约5μM都能够有效抑制基因表达并表现出可检测的表型。较佳的，浓度范围从10nM到约100nM，如15号siRNA的较佳浓度为13nM。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
【附图说明】
图1.RT-PCR循环圈数的确定。
图2.RT-PCR循环数与DNA产量的关系曲线。
图3.针对E基因的siRNA的筛选。
图4.针对M基因的siRNA的筛选。
图5.针对N基因的siRNA的筛选。
图6.No.90号siRNA对SARS病毒E基因表达的抑制效果与其剂量的关系。
图7.No.15号siRNA对SARS病毒M基因表达的抑制效果与其剂量的关系。
图8.No.58号siRNA对SARS病毒N基因表达的抑制效果与其剂量的关系。
图9.No.90号siRNA对GFP-E融合蛋白表达的抑制。
图10.No.15号siRNA对GFP-M融合蛋白表达的抑制。
图11.No.58号siRNA对GFP-N融合蛋白表达的抑制。
图12.反义链5’端不配对的siRNA在Vero E6细胞中对SARS基因表达的抑制作用。
图13.针对E基因的siRNA靶位点mRNA的二级结构模拟图
图14.针对M基因的siRNA靶位点mRNA的二级结构模拟图
图15.针对N基因的siRNA靶位点mRNA的二级结构模拟图
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一siRNA靶位点的设计
对SARS病毒RNA进行二级结构计算机模拟。在M、N、E蛋白编码区内和在负链RNA中选取下列位点： 靶基因 编 号 靶位点序列 序 列 号 小信封蛋白E (small envelope pritein E) 19 26167 5’uuu cgu ggu auu cuu gcu agu 3’26187 8 51 26263 5’aac ggu uua cgu cua cuc gcg 3’26283 25 88 26211 5’uuc gau ugu gug cgu acu gcu 3’26231 9 89 26135 5’uua aua guu aau agc gua cuu 3’26155 10 90 26305 5’uga agg agu ucc uga ucu ucu 3’26325 26 M蛋白(protein M) 7 26768 5’cca gac cgc uca ugg aaa gug 3’26788 11 8 26927 5’cgu cgc agc gug uag gca cug 3’26947 12 15 26414 5’agc uua aac aac ucc ugg aac 3’26434 13 16 26985 5’aaa cua uaa auu aaa uac aga 3’27005 1 52 26580 5’ugc ugc ugu cua cag aau uaa 3’26600 2 53 26658 5’uag cua cuu cgu ugc uuc cuu 3’26678 14 54 26877 5’aga gau cac ugu ggc uac auc 3’26897 15 55 26637 5’uau ugu agg cuu gau gug gcu 3’26657 16 56 26824 5’uug cga aug gcc gga cac ucc 3’26844 3 57 26957 5’uug cug cau aca acc gcu acc 3’26977 17 N蛋白 (Nucleocapsid protein) 10 28525 5’aau aca ccc aaa gac cac auu 3’28545 18 17 28555 5’aau ccu aau aac aau gcu gcc 3’28575 19 58 28111 5’gau aau gga ccc caa uca aac 3’28131 20 59 28288 5’aag gag gaa cuu aga uuc ccu 3’28308 21 60 28483 5’aac aaa gaa ggc auc gua ugg 3’28503 4 61 28863 5’uga ggc auc uaa aaa gcc ucg 3’28883 5 62 28246 5’aau aau acu gcg ucu ugg uuc 3’28266 22 63 28371 5’aag agc uac ccg acg agu ucg 3’28391 26 64 28593 5’uca agg aac aac auu gcc aaa 3’28613 23 65 28889 5’aac gua cug cca caa aac agu 3’28909 24 91 28212 5’aag gcc aaa aca gcg ccg acc 3’28232 7
表1(二级结构模拟图见附图13、14、15)
表1所示靶位点序列与相同编号的siRNA的正义链序列相同，其序列表中的序列号见最右侧一例。本表格所示序列仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例二.siRNA的合成
1.用Bechman Oligo 1000M合成仪(Bechman)合成siRNA的正义链和反义链(序列见表2，表3)。
2.退火形成siRNA：
1)将合成的siRNA正义反义链溶于焦磷酸二乙脂(DEPC)处理过的水中。
2)制备退火缓冲液(2x)：200mM乙酸钾，4mM乙酸镁，60mM Hepes-KOH(pH7.4)。
3)制备20uM的siRNA贮存液：
2x退火缓冲液 100ul
siRNA正义链 Xul(使得终浓度为20uM)
siRNA反义链 Yul(使得终浓度为20uM)
水(DEPC处理) (100-X-Y)ul
上述成分混匀，于90℃放置1分钟，然后于37℃放置1小时。贮存于-20℃。
实施例三.siRNA在vero-E6细胞中抑制M、N、E蛋白表达的鉴定
1.方法：
(1)细胞转染
用24孔细胞培养板进行细胞转染实验。
a.转染前一天于24孔细胞培养板上每孔接种0.5×105个Vero-E6细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞库)，5％CO2培养箱37℃培养过夜。至转染时细胞铺满孔面积的30-50％。
b.M、N、E蛋白表达载体的转染用阳离子脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂，按其操作说明进行转染实验。具体用量为每孔细胞加靶基因载体50ng，siRNA用量为0.75ug，Lipofectamine 2000 2ul。
c.6小时后补加胎牛血清至终浓度为10％。于5％CO2、37℃继续培养至48小时后检测。
(2)RT-PCR检测
a.转染后48小时，除去培养基，用无菌PBS缓冲液清洗细胞三次。
b.用Trizol Reagent(GIBCO)抽提细胞总RNA溶于30ul水(RNase free)中。用无RNA酶(RNase free)的DNA酶(DNase)于37℃消化30分钟，然后于60℃处理10分钟将DNase热灭活。
c.用One step RNA PCR kit(TaKaRa)对抽提的总RNA，取5ul为模板进行RT-PCR检测，以确定siRNA的抑制效果并进行筛选。RT-PCR条件如下：
50℃，30min；
94℃，2min；
72℃，10min
反应总体积为50ul。
d.RT-PCR循环数的确定：
以M基因为样本，于24孔板中转入50ng M基因的表达载体。24小时后抽总RNA溶于30ul水(RNase free)中。取5ul为模板，如上条件做RT-PCR。分别于20、25、26、27、28、29、32、34个循环处取样20ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色。实验结果见图1、图2。由图2可得，取28个循环做RT-PCR能较真实的反应模板量。
(3)siRNA对基因表达抑制率的计算
其中：A为加药组靶mRNA RT-PCR条带的灰度；A’为加药组作为RT-PCR对照的β-actine mRNA RT-PCR条带的灰度；B为对照组靶mRNA RT-PCR条带的灰度；B’为对照组作为RT-PCR对照的β-actine mRNA RT-PCR条带的灰度。
(4)在蛋白水平检测siRNA对SARS病毒基因表达的抑制作用
由于目前尚未有针对SARS病毒结构及功能蛋白的抗体，因此，构建SARS病毒E，M及N蛋白基因与报告基因-绿色荧光蛋白(GFP)融合的哺乳动物细胞表达载体：pEGFP/E，pEGFP/M，及pEGFP/N(GFP表达载体pEGFP-N3购自Clontech)。将siRNA与此GFP融合蛋白表达载体共转染Vero E6细胞。48小时后，通过荧光显微镜(Olympus BX-50)检测荧光的强度来判定蛋白的表达水平。
(5)针对E、M、N基因的siRNA的筛选方法。
将siRNA与E、M或N基因表达载体(pCDNA3.1/E，pCDNA3.1/M或pCDNA3.1/N)共转染Vero E6细胞，48小时后抽提总RNA做RT-PCR检测，将RT-PCR产物跑2％的Agarose凝胶电泳。A，B为两次独立实验的电泳结果。C.两次结果的凝胶图象扫描测出条带密度数据，以只转pCDNA3.1/X(X即E、M或N)载体的结果做参照(抑制效果定为0％)计算出各种siRNA的抑制强度，取两次结果的平均值作图。实验结果分别见图3、4、5。具体结果见表2、表3。
2.结果
1).siRNA的筛选
I.筛选结果
抑制效率＜30％的siRNA： 靶基 因 siRNA编 号 序列 号 siRNA序列(*) 抑制 效率 蛋白 M No.16 1/30(+)5’aaa cua uaa auu aaa uac aga tt 3’(-)5’ucu gua uuu aau uua uag uuu tt 3’ ＜30 ％ No.52 2/31(+)5’ugc ugc ugu cua cag aau uaa tt 3’(-)5’uua auu cug uag aca gca gca tt 3’ No.56 3/32(+)5’uug cga aug gcc gga cac ucc tt 3’(-)5’gga gug ucc ggc cau ucg caa tt 3’ 蛋白 N No.60 4/33(+)5’aac aaa gaa ggc auc gua ugg tt 3’(-)5’cca uac gau gcc uuc uuu guu tt 3’ No.61 5/34(+)5’uga ggc auc uaa aaa gcc ucg tt 3’(-)5’cga ggc uuu uua gau gcc uca tt 3’ No.63 6/35(+)5’aag agc uac ccg acg agu ucg tt 3’(-)5’cga acu cgu cgg gua gcu cuu tt 3’ No.91 7/36(+)5’aag gcc aaa aca gcg ccg acc tt 3’(-)5’ggu cgg cgc ugu uuu ggc cuu tt 3’ 蛋白 E No.19 8/37(+)5’uuu cgu ggu auu cuu gcu agu tt 3’(-)5’acu agc aag aau acc acg aaa tt 3’ No.88 9/38(+)5’uuc gau ugu gug cgu acu gcu tt 3’(-)5’agc agu acg cac aca auc gaa tt 3’ No.89 10/39(+)5’uua aua guu aau agc gua cuu tt 3’(-)5’aag uac gcu auu aac uau uaa tt 3’
表2
抑制效率＞30％的siRNA： 靶基 因 siRNA编号 序列 号 .siRNA序列(*) 抑制 效率 蛋白 M No.7 11/40(+)5’cca gac cgc uca ugg aaa gug tt 3’(-)5’cac uuu cca uga gcg guc ugg tt 3’ 39.8 ％ No.8 12/41(+)5’cgu cgc agc gug uag gca cug tt 3’(-)5’cag ugc cua cac gcu gcg acg tt 3’ 40.9 ％ No.15 13/42(+)5’agc uua aac aac ucc ugg aac tt 3’(-)5’guu cca gga guu guu uaa gcu tt 3’ 75.8 ％ No.53 14/43(+)5’uag cua cuu cgu ugc uuc cuu tt 3’(-)5’aag gaa gca acg aag uag cua tt 3’ 54.9 ％ No.54 15/44(+)5’aga gau cac ugu ggc uac auc tt 3’(-)5’gau gua gcc aca gug auc ucu tt 3’ 47.2 ％ No.55 16/45(+)5’uau ugu agg cuu gau gug gcu tt 3’(-)5’agc cac auc aag ccu aca aua tt 3’ 46.2 ％ No.57 17/46(+)5’uug cug cau aca acc gcu acc tt 3’(-)5’ggu agc ggu ugu aug cag caa tt 3’ 62.9 ％ 蛋白 N No.10 18/47(+)5’aau aca ccc aaa gac cac auu tt 3’(-)5’aau gug guc uuu ggg ugu auu tt 3’ 35.8 ％ No.17 19/48(+)5’aau ccu aau aac aau gcu gcc tt 3’(-)5’ggc agc auu guu auu agg auu tt 3’ 56.1 ％ No.58 20/49(+)5’gau aau gga ccc caa uca aac tt 3’(-)5’guu uga uug ggg ucc auu auc tt 3’ 74.7 ％ No.59 21/50(+)5’aag gag gaa cuu aga uuc ccu tt 3’(-)5’agg gaa ucu aag uuc cuc cuu tt 3’ 48.1 ％ No.62 22/51(+)5’aau aau acu gcg ucu ugg uuc tt 3’(-)5’gaa cca aga cgc agu auu auu tt 3’ 47.5 ％ No.64 23/52(+)5’uca agg aac aac auu gcc aaa tt 3’(-)5’uuu ggc aau guu guu ccu uga tt 3’ 51.0 ％ No.65 24/53(+)5’aac gua cug cca caa aac agu tt 3’(-)5’acu guu uug ugg cag uac guu tt 3’ 37.3 ％ 蛋白 E No.51 25/54(+)5’aac ggu uua cgu cua cuc gcg tt 3’(-)5’cgc gag uag acg uaa acc guu tt 3’ 52.3 ％ No.90 26/55(+)5’uga agg agu ucc uga ucu ucu tt 3’(-)5’aga aga uca gga acu ccu uca tt 3’ 70.1 ％
表3
表2和表3中(+)表示正义链；(-)表示反义链。其中正义链序列号与表一中相应编号靶位点序列的序列号相同，正义链序列号(Y)为相应编号的反义链序列号(X，X为30-55中任一自然数)减29，即Y＝X-29。表2，表3第三列“/”左侧为正义链序列号，右侧为反义链序列号。如编号为65的siRNA的正义链为SEQ ID NO：24，反义链为SEQ ID NO：53。
实施例四 No.90号siRNA对SARS病毒E基因表达的抑制效果与其剂量的关系。
将不同浓度的No.90号siRNA与E基因表达载体(pCDNA3.1/E)共转染VeroE6细胞，48小时后抽提总RNA做RT-PCR检测。
A.将RT-PCR产物跑2％的Agarose凝胶电泳。
B.两次独立实验结果的凝胶图象扫描测出条带密度数据，以共转中文名称(control siRNA)与pCDNA3.1/E载体的结果做参照(抑制效果定为0％)，计算出各种siRNA的抑制强度，取两次结果的平均值对siRNA的浓度作量效关系曲线图。图6显示15nM的No.90号siRNA就可达到50％的抑制效率。
实施例五.No.15号siRNA对SARS病毒M基因表达的抑制效果与其剂量的关系。方法同实施例四。图7显示13nM的No.15号siRNA就可达到50％的抑制效率。
实施例六 No.58号siRNA对SARS病毒N基因表达的抑制效果与其剂量的关系。
方法同实施例四。图8显示13nM的No.58号siRNA就可达到50％的抑制效率。
实施例七 No.90号siRNA对GFP-E融合蛋白表达的抑制。
用30nM No.90号siRNA与SARS病毒E蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的表达载体(pEGFP/E)共转染Vero E6细胞，48小时后用荧光显微镜观察绿色荧光的强度。
A.只转pEGFP/E载体(none)；B.pEGFP/E与非特异的对照siRNA共转染(control)；
C，pEGFP/E与No.90号siRNA共转染。A，B，C为荧光检测结果；D，E，F分别为同一视野下用明场观察的细胞情况。G.分别计数每组实验的四个视野中发绿色荧光的细胞的数目及总细胞数，换算成每500个总细胞中带荧光的细胞的数目，取平均值。将control siRNA的抑制效率设定为0％时，可算得30nM的90号siRNA抑制效率为88.0％(见图9)。
实施例八 No.15号siRNA对GFP-M融合蛋白表达的抑制。
用30nM No.15号siRNA与SARS病毒M蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的表达载体(pEGFP/M)共转染Vero E6细胞，48小时后用荧光显微镜观察绿色荧光的强度。
A，只转pEGFP/M载体(none)；B，pEGFP/M与非特异的对照siRNA共转染(control)；C，pEGFP/M与No.15号siRNA共转染。A，B，C为荧光检测结果；D，E，F分别为同一视野下用明场观察的细胞情况。G.分别计数每组实验的四个视野中发绿色荧光的细胞的数目及总细胞数，换算成每500个总细胞中带荧光的细胞的数目，取平均值。将control siRNA的抑制效率设定为0％时，可算得30nM的15号siRNA抑制效率为89.4％(见图10)。
实施例九.No.58号siRNA对GFP-N融合蛋白表达的抑制。
用30nM No.58号siRNA与SARS病毒N蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的表达载体(pEGFP/N)共转染Vero E6细胞，48小时后用荧光显微镜观察绿色荧光的强度。
A，只转pEGFP/N载体(none)；B，pEGFP/N与非特异的对照siRNA共转染(control)；C，pEGFP/M与No.58号siRNA共转染。A，B，C为荧光检测结果；D，E，F分别为同一视野下用明场观察的细胞情况。G.分别计数每组实验的四个视野中发绿色荧光的细胞的数目及总细胞数，换算成每500个总细胞中带荧光的细胞的数目，取平均值。将control siRNA的抑制效率设定为0％时，可算得30nM的58号siRNA抑制效率为88.8％(见图11)。
实施例十 反义链5’端不配对的siRNA在Vero E6细胞中对SARS基因表达的抑制作用
1.依据：
根据Dianne S.Schwarz等人最新研究发现，siRNA双链两端配对的稳定性决定了哪一端更容易先解链，从而使该端为5’端的那条链更多的进入RISC复合体(一种siRNA与蛋白质的复合体，能特异性的降解靶基因mRNA)。(Cell，Vol 115，199-208，17 October 2003)
选出三个siRNA：No.8、No.51、及No.65，将正义链3’端最后一个核苷酸(21位)突变如下
No.8*：(正义链序列号为SEQ ID NO：27)
5’CGU CGC AGC GUG UAG GCA CUA dTdT 3’
||| ||| ||| ||| ||| ||| || о
3’dTdT GCA GCG UCG CAC AUC CGU GAC 5’
No.51*：(正义链序列号为SEQ ID NO：28)
5’AAC GGU UUA CGU CUA CUC GCA dTdT 3’
||| ||| ||| ||| ||| ||| || о
3’dTdT UUG CCA AAU GCA GAU GAG CGC 5’
No.65*：(正义链序列号为SEQ ID NO：29)
5’AAC GUA CUG CCA CAA AAC AGC dTdT 3’
||| ||| ||| ||| ||| ||| || о
3’dTdT UUG CAU GAC GGU GUU UUG UCA 5’
(注：突变位点以带下划线的粗斜体标出，*表示带突变的siRNA，下同。)
用pCDNA3.1/E与No.51 siRNA或No.51*siRNA、pCDNA3.1/M与No.8 siRNA或No.8*siRNA、pCDNA3.1/N与No.65 siRNA或No.65*siRNA分别共转染VeroE6细胞，以及单转SARS病毒基因表达载体(none)或其与非特异组siRNA(control)共转染Vero E6细胞，48小时后RT-PCR检测SARS病毒基因表达水平。2％agarose电泳，EB染色(A)。灰度扫描条带深浅，将control组抑制率设为0％，算出各组siRNA的抑制百分率(B)。
与反义链5’端第一个碱基不配对的siRNA抑制SARS病毒基因表达的效果是正常组siRNA的1.5倍，可以按照这种方法将筛选过程中得到的抑制效果不佳的siRNA重新设计，应能使之能更有效的抑制SARS病毒基因的表达(见图12)。
较佳的，与反义链5’端第一个碱基不配对的siRNA的正义链3’端碱基可按如下原则替换，嘧啶(包括C、U)与嘧啶替换，嘌呤(包括G、A)与嘌呤(包括G、A、I(次黄嘌呤))替换。如C与U互换，G替换为A或工。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>抑制SARS病毒基因表达的小分子干扰核糖核酸
<130>XQ041027N
<160>55
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
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<212>RNA
<213>SARS冠状病毒
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aaacuauaaa uuaaauacag a 21
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uuucguggua uucuugcuag u 21
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uauuguaggc uugauguggc u 21
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