应用肽-药物的结合减少受试者间药物血清水平的变异 相互有关的申请
本申请要求于2002/2/22提交的美国临时申请第60/358,382号和2002/3/7提交的美国临时申请第60/362,083号的优先权。这里将它们完整包括供作参考。
所述发明的领域
所述发明旨在合成和药物分子结合的氨基酸聚合物，并应用这些结合物将药物输入至血清中，这时个体之间的变异要比单独给药所见到的小。
口服药物的吸收程度对于决定体循环中的药物浓度或血清水平来说是关键的。在血流中，药物分子将经历各种命运，包括与血清蛋白质结合，分布到其作用的部位(理想的命运)，还有组织蓄积，生物转化或代谢以及最终的排泄。这些命运之前有初始的吸收过程。虽然口服途径通常被认为是最安全和最方便的途径，但是它会带来相对较高程度地变异。口服途径安全的原因之一是因为胃肠道(GI)中的药物在到达体循环之前可能被酶来自(从肠内菌丛，粘膜和肝脏)代谢。发生在吸收和体循环之间的药物代谢指的是“首关效应(first pass effect)”。
在一些实例中，有可能在一组剂量之后测定血清水平并计算相关参数，但这不是常规做的。剂量方案的最优化更通常的是通过测定药物治疗作用和调整剂量直至获得理想的作用的较实际的方法来决定。在治疗作用更带主观性的一些情况中，例如通常用来治疗精神疾病的许多药物，可通过调整它们的剂量而消除不良作用，例如恶心或眩晕。在一些情况中，可证明药物剂量的最优化要比它在每天的临床医疗中接受的关注更少。无论如何，由于治疗性药物的监测通常在医院外是很困难的，因此任何减少病人间变异的方法对于剂量指导的决定是有实际意义的。这对于那些刚刚开始用于特定病人的新药物来说尤其如此。
所述发明的简述
所述发明包括一种共价结合于生物聚合物，例如肽，的药物分子。在口服给药之后，消化酶例如胰蛋白酶，催化肽的水解，从而导致药物的吸收。这种吸收的发生使得病人间血清药物水平的变异比单独应用药物时小。
所述发明的另外一种实施方案是所述活性药物可与各种氨基酸组成的肽结合，赋予结合物特殊的物理化学特性，包括分子量、大小、功能团、pH敏感性、溶解性、三维结构和消化性，从而提供了理想的性能特点。相似的，多种活性药物可与特别优选的肽一起应用产生特殊的性能特点。关于通过应用20种天然存在的氨基酸中的一种或多种赋予活性药物稳定性、释放和/或吸收特性的显著优点在肽的下列物理化学特性中是显而易见的，这种肽的物理化学特性赋予活性药物形成的结合物特殊的稳定性、消化性和释放特性。
在所述发明的其他实施方案中，有一个概念，就是组成载体肽的氨基酸是一组工具，以便使载体肽符合药理要求和活性药物的化学结构，从而达到组合物有最大的稳定性和最佳性能。
在其他优选的实施方案中，所述氨基酸链的长度可根据不同的传输标准变化。为了增加传输的生物利用度，所述活性药物可连接至单个氨基酸到八个氨基酸，2-5个氨基酸的范围是优选的。为了调节传输或增加活性药物的生物利用度，所述寡肽的优选长度是在2-50个氨基酸长度之间。为了保护构象、延长消化时间并且持续释放，优选的氨基酸长度在8-400个氨基酸之间。在其他的实施方案中，所述发明的结合物也适合于大和小分子的活性药物。在所述发明其他的实施方案中，载体肽控制了活性药物-肽结合物的溶解性，并不依赖于活性药物的溶解性。因此，由结合物-药物组合物提供的持续或0级动力学机制避免了不规则的释放以及典型的由溶出控制的持续释放方法造成的难处理的制剂。
在其他优选的实施方案中，所述活性药物结合物可包含选出的佐剂，使组合物和特异性受体相互作用，从而实现靶向传输。这些组合物在肠道所有部位和沿着肠壁在特异性部位提供靶向传输。在其他优选的实施方案中，所述活性药物在进入靶细胞之前的释放和来自肽结合物的参考活性药物一样。在其他优选的实施方案中，所应用的特异性氨基酸序列不是针对特异性细胞受体，也不设计成被特异性基因序列所识别。在一种更优选的实施方案中，所述肽载体设计成被肿瘤细胞识别和/或不被识别。在其他优选的实施方案中，所述活性药物传输系统不要求活性药物在特殊的细胞中或细胞内释放。在一种优选的实施方案中，所述载体和/或结合物在体内是通过特异性识别而起作用的。(例如通过癌细胞，引物(改善趋化活性)，通过血清蛋白质特异的结合位点的序列)(例如激肽或类花生四烯酸类)。
在其他实施方案中，所述活性药物可与佐剂结合，这种佐剂被一种活性转运蛋白识别和摄取。在一种更优选的实施例中，所述主动转运蛋白不是胆汁酸主动转运蛋白。在其他实施方案中，所述发明不要求活性药物连接在传输时被主动转运蛋白识别和摄取的佐剂。在其他实施方案中，所述佐剂提供了一种可供选择的转运机制，它克服了被动扩散的局限性。并且肽载体、佐剂或它们的组合可促进主动转运。
在优选的实施方案中，所述活性药物结合物不与固定化的载体结合，而它的设计更是为了通过消化系统转运和转化。
所述发明其他的实施方案是，通过利用肽对活性药物的保护性作用增加药物结合物的稳定性，从而减少变异。这种保护性作用可赋予那些对于酸不稳定的活性药物，不然它们就会在胃中降解。此外，所述载体肽可保护活性药物不受由胃或胰腺分泌的酶的作用，在那里活性药物受到保护直至被吸收，接着在肠上皮细胞中由肽酶释放。
虽然微球体/胶囊可与所述发明的组合物联合应用，所述组合物优选的不包含在微球体/胶囊中，并不需要另外的添加剂来改善持续释放或调节吸收。
在一种优选的实施方案中，所述活性药物不是激素、谷氨酰胺、甲氨喋呤、柔红霉素、胰蛋白酶-激肽释放酶抑制剂，胰岛素、钙调蛋白、降钙素、L-多巴、白细胞介素、促性腺素释放素、炔诺酮、托美汀、伐昔洛韦、紫杉醇或磺胺嘧啶银。在一种优选的实施方案中，所述活性药物是肽类活性药物，优选的是所述活性药物是未修饰的(例如氨基酸结构没有被取代)。
在一种优选的实施方案中，所述发明提供了一种相互结合的载体和活性药物，但在其他方面结构上没有被修饰。在一种更优选的实施方案中，所述载体，不管是单氨基酸、二肽、三肽、寡肽或多肽，仅仅包括天然存在的氨基酸。
在一种优选的实施方案中，所述载体不是蛋白质转运蛋白(例如组蛋白、胰岛素、运铁蛋白、IGF、白蛋白或催乳素)，Ala、Gly、Phe-Gly或Phe-Phe。在一种优选的实施方案中，所述载体也不是一种和非氨基酸取代物例如PVP共聚的氨基酸，聚(亚烷基氧化物)氨基酸共聚物，或烷氧羰基(聚天冬氨酸盐/聚谷氨酸盐)或一种芳氧基羰基甲基(聚天冬氨酸盐/聚谷氨酸盐)。
在一种优选的实施方案中，所述载体或结合物都不用来分析提纯、结合研究或酶分析。
在其他实施方案中，所述载体肽可与多种活性药物结合。所述结合物提供了不仅仅是活性药物，也可以是活性药物与其他活性药物的联合，或其他被修饰过的分子多重结合的附加的好处，，它们能进一步改进传输，增加释放，靶向传输入，和/或增加吸收。在其他实施方案中，所述结合物也可与佐剂结合或被装入微囊。
在一种优选的实施方案中，所述发明提供了一种相互结合的载体和活性药物，但其他方面在结构上没有被修饰。这种实施方案可进一步描述为含有游离羧基和/或胺末端和/或侧链基团的载体，它们不是活性药物的结合位点。在一种更优选的实施方案中，所述载体，不管是单个氨基酸、二肽、三肽、寡肽或多肽，仅仅包括天然存在的氨基酸。
附图简述
图1图示了参考药物与所述发明的肽轭合药物的一种典型释放曲线。
图2阐明了影响生物利用度的因素的图，来自Amindon等；
图3图示了与单独T4以及对照相比较的基底侧T4-结合物的浓度；
图4图示了顶侧和基底侧的T4-结合物浓度；
图5图示了聚T4(T4-结合物)和T4钠平均总T4(TT4)血清浓度和δ(TT4)；
图6图示了聚T3和T3钠平均总T3(TT3)血清浓度和δ(TT3)；
图7图示了polythroid、T4钠加T3钠和T3钠的总T3血清浓度曲线；
图8图示了磷酸化AZT和胸苷的化学结构；
图9图示了AZT和LeuGlu/AZT结合物血清浓度曲线；
图10图示了聚T3和T3单体的人体临床试验。
优选实施方案的详述
应用生物利用度可有效的量化药物吸收。这定义为到达体循环的剂量分数(F)。因此，在极端的场合，在GI道中完全不吸收的药物F＝0，而完全吸收的药物(且不经首过效应代谢)F＝1。所述生物利用度可根据血清水平对时间标给的曲线下面积(AUC)计算。它依赖于许多因素，这些因素在正常的个体间是不同的。所述变异系数(CV)典型的用来表达生物利用度的变异。这个值通过将标准差表达为占算术平均数的百分比而获得。
例如，在抗癫痫药物加巴喷丁的研究中，Gidal及其同事发现在口服给药后受试者间AUC的CV是22.5％。相似的，对于降低胆固醇的药物西立伐他汀来说，个体间AUC的变异在30％和40％之间。在癌症病人的研究中发现吗啡的CV是50％。和首过效应相关的高度变异是导致吗啡高CV值的原因。大体上，许多药物生物利用度的CV大约是20％。这在药物动力学上不是罕见的，因为其他参数会变化更大。例如，稳态分布容积(Vss)的CV大约是30％，清除率(CL)的CV大约是50％。然而，药物传输的改变会使得生物利用度的变异最小，这对于治疗是有价值的。理想的，对于要开给药物的个体来说所有这些药物动力学参数的值，医生是了解的，但情况很少如此。
在1998年，Stavchansky和Pade报导许多被研究的药物在人体吸收的百分比和渗透性之间是线性相关的，但呋塞米是例外。有趣的是，和呋塞米在结构上密切有关的氯噻嗪，在人体中的渗透性和吸收率都很低，这和其他药物很相关。(见，Linkbetween Drug Absorption Solubility and Permeability Measurements in Caco-2Cells；J.of Pharm.Sci.卷87，No.12：160407(1998))。呋塞米的吸收要比标绘预计的高，实际上它的渗透性比氯噻嗪低。可以推断呋塞米与氯噻嗪相比通过一种不同的机制转运，虽然它们在化学上是十分相似的。此外，所述研究也显示呋塞米、氯噻嗪和西咪替丁可能有与被动吸收相反的主动流出机制。因此，为克服其低渗透性和溶解性而改善氯噻嗪吸收的研究，对于它的总效能是一个重大的进步，也可减少利尿剂的吸收变异。
变异可被定义为较低的标准偏差或离群值数目的减少。它直接转化为应用特定药物所伴随发生的不良事件次数的降低。本发明的一种实施方案是，受试者间变异的减少可通过减少吸收的离群值的数目而实现。
个体病人对于特定剂量的药物生物反应的变异有多种原因。病人的一个正态总体对于以特定浓度存在于血中的药物有不同程度的反应。本发明不涉及病人间差异的来源。这里的焦点是在口服施用特定剂量后，病人间血药水平的差异。具体说，它是从胃肠道吸收药物。这个过程的关键是扩散和转运的概念。转运是指药物在体内从一个地方转移至另外一个地方。这个过程典型的包括移动通过生物膜，它通过任何一种或以下类型扩散的联合而发生。
简单非离子扩散和被动转运—这种类型的移动用来描述无电荷分子通过无电梯度区域的随机运动。一段时间内转运通过膜的药物净数量(Q)的变化可通过Fick’s扩散定律计算：dQ/dT＝DA(C1-C2)/x；其中：
D＝扩散系数，A＝面积；C1和C2是膜两侧的浓度，x是膜的厚度。所述膜的因子被合并成一个常数P，即渗透性常数或系数。因此，被动扩散可通过以下方程描述，dQ/dt＝P(C1-C2)。药物通过浓度梯度的移动以一级过程继续直至膜的两边浓度相等。
离子或电化学的扩散—离子药物分子除了从高浓度移动至低浓度外，还根据电化学梯度分布。因此，带负电荷的药物和带正电荷的药物的扩散是不相同的。
易化扩散—这描述了和简单扩散相比加速了的通过生物膜的移动。膜中一种特殊的载体分子被认为在膜一侧和药物结合，并沿着电化学梯度将它移动至另外一侧。在那里，药物从载体解离，接着游离的载体重复那个过程。
主动转运—和易化扩散相比，这个过程包括药物逆着电化学梯度通过生物膜的能量依赖性的移动。转运系统典型地显示出要求被转运的分子有一种特殊的化学结构，并且和化学结构主要部分密切相关的分子进行竞争。根据被转运底物的物理特性，可将存在已知的肠转运系统分为七类。它们包括氨基酸、寡肽、葡萄糖、一元羧酸、磷酸酯、胆汁酸，以及P-糖蛋白转运系统，它们各自都有自己相关的转运机制。所述机制依赖于氢离子、钠离子、结合位点或其他辅因子。
胞饮作用和胞吐作用—这些过程分别描述了物质通过一种类型的吞噬作用移动进出细胞。细胞膜内陷将药物包含在收紧的小泡中，并将其转运通过膜。这种类型的转运被认为在肠道中是重要的，在那里这种转运可能与大分子和较大微粒例如某些蛋白质的吸收有关。
改善的吸收—影响药物由胃肠道(GI)吸收程度的物理化学和生物学因素包括溶剂化、氢键、构象的改变、pH、pKa、logP、代谢和外在以及内在的因素。将这些支配吸收的特殊机制的因素组合是每种药物与生俱来的。绝大部分药物是通过被动转运、离子扩散、易化扩散、主动转运或胞饮作用被吸收的。此外，如果药物的渗透性很低，通常就观察到生物利用度的变异较大。不管是改善通透性还是促进主动转运机制，都将提高这类药物的生物利用度。对于那些主要依赖主动转运的药物(例如DOPA、左甲状腺素、碘塞罗宁)来说，改善药物的溶解性或为药物提供其他可供选择的转运途径也会提高吸收。
较低的峰值—药物治疗中一个基本的考虑因素包括血药水平和治疗活性之间的关系。对于大多数药物来说，最重要的就是血清水平保持在最小有效浓度和潜在毒性水平之间。在药物动力学关系上，药物血液水平的峰和谷值理想的完全与血清浓度治疗窗符合。
低峰值某些治疗药物的。这个窗如此狭窄以致制剂变得很关键。用来治疗心衰的药物地高辛就是这样的情况。治疗血浓度包括的范围是0.8ng/mL(低于它就观察不到理想的作用)-2ng/mL(高于它就会产生毒性)之间。在观察到临床毒性的成人中，2/3的血清地高辛浓度大于2ng/mL。并且，只要在这个最大水平之上稍有上升，不良反应就明显增加。例如，在血清药物浓度为1.7、2.5、3.3ng/mL时，地高辛引起的心律失常的发生率分别是10％、50％和90％。
在口服施用地高辛后，通常在1-2小时内作用会显现，而在4-6小时之间观察到最大作用。在足够长一段时间后，血浆中的浓度以及总的体内储备依赖于每天一次的维持剂量。关键的是这种剂量对于每个病人来说应该是个体化的。因此拥有一种能在几次给药期间提供更稳定的血清水平的地高辛剂型是十分有益的。
另外一个例子由β-阻滞剂阿替洛尔提供。这种经常应用的药物作用持续时间据推测通常是24小时。然而，如果以每天25-100mg一次的正常剂量范围给药，所述作用就会在下次剂量起效之前数小时消失。对于治疗心绞痛、高血压或预防心脏病发作的病人来说，这是尤为危险的。另外一种选择是为了在血清水平最低时获得理想的作用水平，给予比所需更大的剂量。这就有和给药间期初始阶段过高浓度相关的副作用危险。在这些较高的水平，阿替洛尔失去了其潜在的有利的β-1选择性，和β-2受体阻滞相关的不良反应变得更显著。这可以通过在施用聚阿替洛尔之后获得更恒定的阿替洛尔水平而避免。
降低变异性—已经有几种模型设计用来预测通过胃肠道的药物的生物利用度。由Amidon等提出的模型提供了一种产生直观算法的方便途径。(见Amidon，GL，Lennernas，H；Shah，VP，Crison，JR(1995)。“A Theoretical Basis for aBiopharmaceutic Drug Classification：The Correlation of in Vitro and in VivoBioavailability.”Pharm.Res.，12(3)，413-20；Amidon，GL，Oh，D-M，Curl，RL(1993)。“Estimating the Fraction Dose Absorbed from Suspensions of Poorly SolubleCompounds in Humans：A Mathematical Model.”Pharm.Res.，10(2)，264-70.)。所述Amidon模型应用三个关键的无量纲变量预测药物的吸收或药物吸收的分数(F)。第一个变量，吸收值(An)，它与药物的有效渗透性(Peff)以及肠道的容积流速(tres/R)是成比例的，通过以下方程决定：An＝(Peff tres)/R。第二个变量，剂量值(Do)，是剂量(M0)，药物溶解度(Cs)和药物利用水的体积(V0)的函数，通过以下方程决定：Do＝M0/(Cs V0)。第三个变量，溶出值(Dn)，包括扩散系数(D)、溶解度(Cs)、肠道转运时间(tres)、微粒大小(r)和密度(ρ)，通过以下方程决定：Dn＝(3DCstres)/(r2ρ)。
通过同时解这些和其他方程估计F，对它们的描述。这里不打算讨论只要说在给定An时能产生F估计值对Dn和Do的等高线图就足够了。图2显示了An＝10的高渗透性药物的典型图(图2来自Pharm.Res.，12(3)，416)。可以看到曲线的斜率在Do(10-100)和Dn(0.2-2)的临界区域是最大的。这个临界区域和变异最大的药物的吸收程度是相符的。如果An值低于10，临界区域的斜率就更陡，Fmax的面积就更小。因此，药物的生物利用度可通过增加An而提高，这可以通过促进主动转运机制而实现。
为了阐明这一点，表1显示了为获得90％吸收或F＝90％导出的An、Do和Dn值。表中的数据表明在Do值的一定范围内，增加An就会减少Dn的变化。例如，当An＝2.0时，Dn的变化是2.06-1.87＝0.19，这时Do的范围为0.1-0.5。相比较而言，当An＝7.0时，Dn的变化是1.32-1.28＝0.04，这时Do的范围相同。这意味着有一定Dn值的药物，当An值上升时，它的Fmax可保持在更宽的Do值范围内。换言之，药物的An值越高，药物的给药剂量更灵活，吸收分数的变异更低。
表1.90％剂量吸收分数的吸收值(An)、剂量值(Dn)和溶出值(Dn) An Do Dn 1.15 -------a ------b 2.0 0.1 1.87 2.0 0.5 2.06 2.0 1.0 2.38 2.0 4.4 ------b 3.0 0.1 1.49 3.0 0.5 1.59 3.0 1.0 1.73 3.0 5.0 6.29 3.0 6.7 ------b 5.0 0.1 1.33 5.0 0.5 1.39 5.0 1.0 1.46 5.0 5.0 2.44 5.0 10.0 13.94 5.0 11.1 ------b 7.0 0.1 1.28 7.0 0.5 1.32 7.0 1.0 1.36 7.0 5.0 1.89 7.0 10.0 3.64 7.0 15.6 ------b
a未假设Do限度
b未假设bNo Dn限度
甲状腺激素T4就是一个例子，说明如何通过增加药物的Dn减少药物吸收的变异。(对于那些有临界Do值的药物来说，降低Do相似的也可以减少变异)。估计T4的Cs是6.9μg/ml，假定V0是250ml，应用典型剂量100μg，可估计T4的Do值是0.057。由于口服施用的甲状腺激素极可能是主动转运通过肠上皮的，可以推测T4的An近似为10。这是葡萄糖实验测定的An，据所知它是主动转运的。从图2中的等高线图以及报导的T4生物利用度推测，T4的Dn在0.2-2之间。如果Dn＝1，Cs＝6.9μg/ml，tres＝240min，r＝25μm，ρ＝1000mg/ml，T4的D估计为1.21×10-3cm2/min，这是一个相对较高的数值，因此对于T4来说Dn值大于1不太可能，除非Cs增加。保持所有其他变量相同，将T4的Cs增加至69μg/ml会使得Dn上升至10，Do下降至0.0057。这使T4的F值接近等高线图的上面的平台(即Fmax)，在这里吸收是最大的，而变异是最小的。
假设T4的An等于7。为了使T4 90％被吸收，它的Dn需近似为1.3，这是很难实现的。因此，如果An＝7，Dn＝1，Do＝0.057，那么T4的F将大大低于报导的48％。无论如何，增加药物的生物利用度，不管是通过增加Dn或An还是通过降低Do，都会减少它吸收的变异。
注意这些类型的转运以及以上的标准，就能清楚的知道以下因素为什么能影响药物的吸收：浓度、制剂的物理状态，溶出度、吸收表面积、血管分布和血流，胃的活动和排空，以及溶解度。一种增加吸收入细胞的方法是通过将药物结合于肽。根据先前的讨论，肽药物结合物可能参与易化和主动转运过程以及胞饮作用，否则在药物吸收中不会观察到它们。
有证据表明某些化合物通过特异性的转运蛋白通过肠上皮细胞被有效的吸收。根据转运底物的物理特性分类，存在七种已知的肠转运系统。它们包括氨基酸、寡肽、葡萄糖、一元羧酸、磷酸酯、胆汁酸，以及P-糖蛋白转运系统，它们各自都有自己相关的转运机制。所述机制依赖于氢离子、钠离子、结合位点或其他辅因子。所述发明也使肠上皮转运系统的机制针对促进活性药物的吸收。
整个膜转运系统是内在不对称的，不对称的对手性化合物起作用，例如氨基酸。因此，人们预期膜转运系统的激活将包括一些类型的特殊佐剂，这增加了活性药物通过生物膜的转运。合适的佐剂，例如包括：木瓜蛋白酶，它是一种将氨基肽酶-N的催化域释放入腔内的有效酶；糖识别物，它会激活刷状缘膜中的酶；胆汁酸，它与肽结合，从而增加了肽的吸收。
Caco-2或其他肠上皮模型系统(例如培养的HT29-H杯状细胞)可用来预测肠道对药物的吸收。早期应用这些模型系统的研究表明通过被动跨细胞吸收途径吸收的药物更容易在这些模型系统中研究，因为它们需要相对较小的吸收表面积(出现于培养物模型，和广泛折叠的肠内衬相比)。此外，Caco-2细胞模型对于肿瘤细胞的再分化，因此对于关键的上皮标记物的再表达已经过最优化(这是通过将细胞平面培养在胶原原纤维支架上并将该细胞补充入规定的细胞活素的混合物中而实现)。然而，HT29细胞可产生粘液，但不能表达上皮细胞的其他分化标记物，并通常被认为是生物吸收较为不可靠的模型。
通过被动的细胞旁途径(通常限制分子的大小)吸收的药物不能有效的在Caco-2模型中吸收，可能是由于这种模型紧密连接中的孔相对较少。然而，这些分子的体外吸收之间的相关性在性质上和体内的吸收是相同的。
采用主动转运过程吸收的药物似乎需要阐明该转运过程的特点以完全了解任何体外/体内的相关性。例如，Caco-2细胞不转运L-dopa，这和它在体内通过大的中性氨基酸载体迅速有效的吸收不太相似。这是因为这种载体在培养基中表达较低。其他采用主动转运机制的化合物，似乎和体内吸收更相关，这表明所述转运机制必须在关联之前被限定。
因此，优选的是所述活性药物结合物通过细胞旁或主动转运机制吸收。已经使得所述Caco-2模型能最优化地再表达细胞相关的蛋白酶，这样前体药物(结合物)的释放潜力就更大。所述结合物也会促进通过细胞受体结合于细胞表面，例如二-和三-肽转运蛋白或一些未知的，但特异的受体，它们提供了一种连续释放剂量的机制。进而，所述再分化Caco-2细胞能够再表达细胞表面分子所有适当的组成成分。下面是三种释放/吸收产生可重现的摄取的可能机制：
(1)通过前体药物片段促进结合至细胞表面，通过细胞表面相关的蛋白酶释放。
(2)通过前体药物片段促进结合至细胞表面，胞吞后在胞吞小泡的溶酶体环境中释放。
(3)主动转运小的以二聚物/三聚物为基础的前体药物，并在溶酶体腔或通过血清蛋白酶释放。
所述发明的一种实施方案提供的方法，用来测定药物结合至单个氨基酸、二肽、三肽、寡肽和/或一种肽如何改变吸收。在一种优选的实施方案中，所述活性药物是呋塞米，它是通过将呋塞米结合至在蛋白质合成中应用的20种普通氨基酸中的每种氨基酸而合成的。在一种优选的实施方案中，所述呋塞米二肽丝氨酸结合物选自Ile-Ser(呋塞米)-Ome；Glu-Ser(呋塞米)-Ome以及Phe-Ser(呋塞米)-OH。接着测试每个氨基酸加入结合物后对于呋塞米通过Caco-2细胞吸收的任何影响。当观察到易化转运时，接着进行附加的实验评价易化产生的过程。为了进一步改变氨基酸结合物的作用，可另外结合氨基酸改变药物动力学参数。
所述发明还提供了一种控制活性药物从组合物中释放的方法，其中所述组合物包含一种肽，所述方法包括将受肽控制释放的活性药物共价结合至肽。在所述发明的其他实施方案中，通过延长治疗窗内的持续血药水平的时间实现提高来自多种化学和治疗类别的活性药物的性能的效果。对于标准制剂产生良好的生物利用度的药物来说，所述血清水平到达峰值对于如图1所示的最佳临床效果来说是太快了，。设计和合成一种特殊的能通过肠道酶消化释放活性药物的肽结合物，就可以调节释放和吸收特点，从而使活性药物随时间的吸收变得平缓，而仍在曲线下保持相当的面积。
所述发明的结合物前体药物使得母体化合物持续或延长释放。持续释放典型的指接近缓慢的一级动力学吸收。延迟释放典型的指为所述化合物的吸收提供0级动力学。生物利用度还可以被吸收速率以外的因素影响，例如通过肠上皮细胞和肝脏的首过代谢，肾脏的清除率。涉及这些因素的机制要求所述药物-结合物在吸收之后是完整的。定时释放的机制可能是由于许多因素中的任何一种或所有因素。这些因素包括：1)通过腔内消化酶逐渐酶促释放母体药物，2)通过表面联结的肠粘膜酶逐渐释放，3)通过肠粘膜细胞的细胞内酶逐渐释放，4)通过血清酶逐渐释放，5)被动吸收机制转化为主动摄取机制，使得药物吸收依赖于受体结合的Km，以及受体密度，6)降低母体药物的溶解性导致更缓慢的溶出，7)溶解度的增加会导致更大量药物的溶出，因此由于可利用数量的增加吸收需要更长的时间。
酶介导释放技术的潜在好处超越了以上描述的例子。对于那些可从吸收增加受益的活性药物来说，所述发明一种实施方案的实施就是通过将那些活性药物共价结合于肽的一个或多个氨基酸并如先前所述对病人给药。所述发明也针对肠上皮转运系统，促进活性药物的吸收。反过来，更好的生物利用度有助于所需剂量更低。因此，所述发明的另外一种实施方案是以这里所述的方式通过调节释放和改善活性药物的生物利用度实现降低活性药物的毒性。
所述发明另外一种实施方案是连接一个氨基酸、寡肽或多肽，它可通过许多机制增加母体药物的吸收/生物利用度，包括母体药物转化为聚合物-药物结合物，使氨基酸前体药物可被氨基酸受体和/或二肽、三肽受体摄取(PEPT转运蛋白)。这对于聚合物药物结合物也是正确的，因为肠道中酶活性的产物可产生连接1-3个氨基酸的前体药物。而且，其他受体可能在前体药物的结合和摄取中也是有活性的。为药物吸收增加一种或多种其他机制会改善它的生物利用度，尤其在是附加的机制要比母体药物吸收机制更有效时。许多药物通过被动扩散吸收。因此，将氨基酸连接到化合物上可使吸收机制从被动转化为主动，或在一些实例中变为主动和被动摄取的组合，这是由于前体药物可通过肠腔中的酶活性逐渐转化为母体药物。
所述发明另外一种实施方案是活性药物的效果通过较低的活性药物血清浓度而增强。所述发明另外一种实施方案是将多种活性药物结合至载体肽上，从而持续释放和吸收所述活性药物，这将会帮助实现精确的每天一次的药物代谢动力学。在所述发明的其他实施方案中，峰和谷可被改善，例如在施用肽-阿替洛尔结合物后获得更稳定的阿替洛尔水平。
在所述发明的其他实施方案中，所应用的氨基酸会使结合物在某些pH或温度更不稳定或更稳定，这依赖于所要求的传输。进而，在其他实施方案中，所述氨基酸的选择将依赖于理想的物理特性。例如，如果体积或亲脂性的增加是理想的，那么载体多肽将包括氨基乙酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。另一方面，极性氨基酸可被选来增加肽的亲水性。在另外一种实施方案中，带有反应性侧链的氨基酸(例如谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸)可被包含进来作为多个活性药物或佐剂与同一个载体肽的结合位点。这种实施方案对于提供两种或多种活性药物之间的协同作用尤为有用。
在另外一种的实施方案中，所述肽通过任何一种在肠腔中发现的或与刷状缘膜相连的氨基肽酶水解，这样活性药物的释放和接下来的吸收将发生在空肠或回肠。在另外一种实施方案中，所述载体分子的分子量可被控制，从而提供可靠的、可重复的和/或增加的活性药物负荷。
调整意味着至少包括变化的影响，或改变总的吸收、吸收率和/或靶向传输，这是和参考药物单用相比较的。持续释放至少指的是和参考药物单用相比，在输入载体肽活性药物组合物长达36小时之内，血流中参考药物量的增加。持续释放进一步被定义为和通过相似传输途径释放的传统制剂中的活性药物相比，所述活性药物释放进入全身血循环的时间更长。
所述活性药物通过pH依赖性的载体肽解折叠从组合物释放，或通过酶催化从组合物释放。在一种优选的实施方案中，所述活性药物以时间依赖性的方式，通过pH依赖性的载体肽解折叠和酶催化联合作用从组合物中释放出来。所述活性药物以持续释放的方式从组合物中释放出来。在另外一种实施方案中，所述活性药物从组合物中的持续释放是0级或接近0级的药物代谢动力学。
所述发明为活性药物的传输提供了多种好处。第一，所述发明可稳定所述活性药物，并保护其不在胃中被消化。此外，可通过活性药物的延迟或持续释放延长药理作用。所述持续释放的发生可通过利用将活性药物共价结合到肽和/或通过另外的共价结合佐剂，后者能生物粘附于肠粘膜。而且，活性药物可联合产生协同作用。同样，所述活性药物在肠道中的吸收可通过共价结合于肽或通过加入的佐剂的协同作用而增加。所述发明同样使活性药物靶向传输至特殊的作用位点。
贯穿这个申请，“肽”的应用意味着包括单个氨基酸、二肽、三肽、寡肽、多肽或载体肽。短肽指的是包含2-70个氨基酸。进而，有时所述发明被描述为连接于氨基酸、二肽、三肽、寡肽、多肽的活性药物，从而阐明活性药物结合物的特殊实施方案。这里还描述了所述结合物的优选长度和其他优选的实施方案。在其他的实施方案中，氨基酸的数目选自1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。在所述发明其他的实施方案中，所述结合物的载体部分分子量大约低于2,500，更优选的大约低于1,000，最优选的大约低于500。
所述发明其他的实施方案进一步通过例子和插图阐述，但它们不是为了限制所述发明的范围。
实施例
实施例1：Polythroid增加通过Caco-2单层的T4吸收
在Caco-2跨孔(transwell)系统(n＝4)中监测T4的吸收。将Polythroid(10μg)加入到跨孔的顶面。将T4以Polythroid中T4含量相同的浓度加入到顶面。一种商业上应用的ELISA测定法被用来测定在37℃保温4小时后基底侧室中T4的水平(图3)。和用包含于聚合物中相当量的T4保温的Caco-2细胞相比，从Polythroid吸收的T4的量明显更高。
为了测定Polythroid本身是否穿过Caco-2单层，在与高浓度(100微克)Polythroid保温后，我们应用Polythroid特异性ELISA测定基底侧室中聚合物的量。保温4小时后，来自基底侧的样本(n＝4)在ELISA中显示没有反应性(图4)。能探测到Polythroid的极限是10ng，因此少于1/10,000的Polythroid被吸收。结论是，在ELISA检测之内，Polythroid不穿过Caco-2单层。
我们的研究通过一种体外实验证明了病人中减少变异的可能。有三种方法通过这种体外的实验模型减少病人中的变异，这就提供了三种选择：(1)变化Caco-2跨膜孔的环境，(2)变化Caco-2的细胞纱，和/或(3)变化连接于活性药物的肽。由于Caco-2细胞的脆弱性，选择一没有提供一种似乎合理的证明，这是由于试验应用的实验条件的限制。选择二，很难表明病人与病人之间的变异，这是因为选择一种新细胞系可能不会表达吸收所需要的所有细胞转运机制。作为结果，仅有选择三，肽载体的变化提供了必要条件。接下来就可能测试在Caco-2细胞中表达的不同转运蛋白和转运机制的有效性和变异。选择三也识别在Caco-2细胞中表达的肽转运蛋白，并通过将活性药物连接于被识别出的肽上，倘若所述Caco-2细胞表现出统计上可靠的变异，可以证明受试者的变异可以通过穿越Caco-2细胞的吸收而减少。
实施例2：聚T4TM(左甲状腺素)和聚T3TM(碘塞罗宁)
在甲状腺机能正常的状态，甲状腺是两种碘化甲状腺原氨酸激素即，四碘甲状腺原氨酸(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)的来源。在大脑的发育过程以及其他器官系统的生长和发育过程中，T3和T4都起到了关键的作用。所述碘-代激素也刺激心脏、肝脏、肾脏和骨骼肌消耗更多的氧，直接和间接的影响心脏功能，促进胆固醇代谢为胆汁酸，并增加脂肪细胞的解脂反应。甲状腺机能减退是甲状腺最常见的疾病，并表现为甲状腺不能产生足够的甲状腺激素。
现在，对于甲状腺机能减退最普通的治疗是施用左甲状腺素钠(或T4钠)。现在，市场上存在数种包含T4钠的产品，包括Levothroid(Forest)、Unithroid(Watson)，Levoxyl(Jones)和Synthroid(Abbott)。研究已经表明来自T4钠盐的T4的生物利用度在48％-80％之间变化，因此这使得以正确的剂量给药变得困难，并时常需要延长调整时间。增加口服T4钠的吸收应该不仅仅降低剂量过大的可能，还同样需要缩短病人的调整时间。
甲状腺素是一种氨基酸，可连接到载体肽的C-末端、N-末端或两者(散置)。根据概念，通过将特殊的氨基酸共价的连接于T4，T4的吸收会得到改善，正如大鼠喂饲和放血研究中所阐明的，它们给予等效剂量的T4钠盐和聚T4作比较。将八个独立的研究求平均值，大鼠T4血清浓度对时间绘图揭示了两种化合物之间相似的药物动力学(图5)。然而，聚T4的Cmax大于T4钠盐的Cmax。并且，两种化合物相对AUC的分析显示聚T4要比T4钠盐多吸收37％(表2)。
表2：T4特性指数(PI) T4钠盐百分数* 结合物 研究项数* AUC Cmax Deltamax 聚T4 8 137 122 141*所述百分比是平均值。
可通过应用附加的一种转运机制来解释增加的吸收，例如一种肽转运蛋白。作为选择，增加的吸收可能是由于聚T4的溶解度(pH7.4时70.5μg/ml)要比T4钠(pH7.4时6.9μg/ml)的高。
将聚T3应用于同类的大鼠喂饲和放血研究，和T4一样，也获得相似的结果。图6显示了大鼠模型中聚T3和T3钠之间的相对药物代谢动力学。如表3中所见，从聚T3所吸收的T3相对于T3钠为150％。 表3-T3特性指数(PI) T3钠盐百分数* 结合物 研究项数* AUC Cmax Deltamax 聚T3 5 160 148 162*所述百分比是平均值。
一种T4/T3复方产品设计用来模拟甲状腺机能正常个体中的天然甲状腺功能。一种标准的大鼠喂养和放血研究，证明来自Polythroid的T3的Cmax稍微低于来自T4/T3钠盐的cmax，虽然AUC较高。而且，通过将Polythroid的T3的剂量调整至参考混合物中T3剂量的2/3，就观察到Cmax大大下降，但AUC相等(图7)。多巴和卡比多巴是具有与T4和T3相似化学特性的氨基酸。合成了一种多巴-谷氨酸共聚物和卡比多巴-谷氨酸共聚物。
例1和2中讨论的T3和T4结合物表明：
(i)T3和T4的吸收都增加会减少变异；
(ii)T3的Cmax的降低降低了T3尖峰形成的可能性；
(iii)T3的延迟释放导致T3的血清水平更持久；
实施例3：聚AZT
通过在包含谷氨酸残基的肽中加入AZT合成聚AZT，该肽预先被一溴三吡咯烷-1-基鏻六氟磷酸盐(PyBrop)活化。可应用相似的步骤连接其他含醇基的药物。例如，通过这种步骤连接的其他药物包括，但不局限于喹硫平、托特罗定、对乙酰氨基酚和曲马多。
所述AZT肽结合物和母体药物相比有明显的临床优势。例如，已经知道核苷类似物肠道吸收增加，它们作氨基酸酯前体药物施用，母体本核苷类似物肠通渗透性可增加至3到10倍(见，Han H，de Vrueh RL，Rhie JK，Covitz KM，Smith PL，LeeCP，Oh DM，Sadee W.，Amidon GL(1998).“5’-Amino Acid esters of antiviralnucleosides，acyclovir，and AZT are absorbed by the intestinal PEPT1 peptidetransporter.”Pharm Res 15(8)：1154-9.)。另外一个潜在的优势和药物一旦进入细胞后的激活有关。和核苷母体相似，AZT之类类似物依赖于细胞内5’-OH的磷酸化(图8)。在它们能抑制逆转录酶之前，核苷类似物必须经受由特殊激酶催化的连续磷酸化。磷酸化发生的速率依赖于底物的浓度，在这个实例中是AZT。所述AZT结合物使得靶细胞中药物浓度随时间而变化，这部分是因为结合物在它被吸收之前必须被消化。输入细胞的药物数量被分散在更长的一段时间。因此，所述肽结合物能够以一定浓度将药物输入细胞，这种浓度更接近激酶磷酸化核苷所需要的最佳水平，并导致所给剂量药物在给药间期内效果增强。
其他的核苷类似物也可以作为缓慢消化的肽结合物施用，这种结合物保留了较低的血清浓度峰值(因此避免了激酶的饱和)，和更长时间的维持中等浓度(更接近磷酸化速率最佳时的水平)。这对于核苷类逆转录酶抑制剂来说是尤为有价值的，因为相同的酶会催化不同核苷类似物的磷酸化。当同时施用两种或三种核苷类似物时，就像它们现在经常是“以鸡尾酒(混合)”施用的那样，最佳底物水平的维持变的更为重要。因此所述发明的结合物也可使多种核苷类似物作为肽结合物给药而改善治疗效果。
AZT的一种肽结合物在大鼠中有所述药物动力学特点(图9)，它表明了与给予等摩尔的母体药物相比，AZT保持较高血浆水平的时间超过两倍，而同时Cmax时降低超过35％。因此，聚AZT的PK应该增加药物的磷酸化效率，并减少副作用。
实施例4：聚-T3(一种甲状腺激素)
碘塞罗宁(T3)是一种天然存在的甲状腺激素，它被作为一种药物施用来治疗各种内分泌疾病。
所述合成的聚合物，聚-T3，包括结合于T3分子的聚-L-谷氨酸。它通过标准的肽化学方法制造，通过总％I含量测定它的T3效价。上面显示了一种可能类型的聚T3分子的化学结构。
图10显示了人体聚T3和T3单体临床试验的数据。在这个研究中，在整夜禁食10小时后，对20个健康的男性受试者施用一种药物。尽可能的将年龄、身高和体重相近的受试者配对。测试每组中10个受试者的17个时间点总T3血清水平，应用他们的原始数据。计算每个时间点10个值的平均值以及标准差。为了比较相同时间点两组数据的变异，用平均值除标准差。条线图代表所获得的值，这样更高的条线代表更大的变异。
从数据中可以看出，对于吸收最大的时间点(0.5-4小时)，T3单体受试者间的变异要比聚T3的大。差异在剂量给药1、1.5和2小时后最大，在这期间吸收最多。然而，应该注意的是，聚T3以溶液给药，而T3以片剂给药。
例5：各种结合物实例
应用所述发明的方法合成了以下呋塞米的二肽结合物，包括Boc-Ala-Ser(Furo)-Ome；Boc-Gly-Ser(Furo)-OmecBoc-Leu-Ser(Furo)-Ome；Boc-Val-Ser(Furo)-Ome；Boc-Trp-Ser(Furo)-Ome；Boc-Cys-Ser(Furo)-Ome；Boc-Ile-Ser(Furo)-Ome；Boc-Met-Ser(Furo)-Ome；Boc-Phe-Ser(Furo)-Ome；Boc-Pro-Ser(Furo)-Ome；Boc-Arg-Ser(Furo)-Ome；Boc-Asp-Ser(Furo)-Ome；Boc-Glu-Ser(Furo)-Ome；Boc-His-Ser(Furo)-Ome；Boc-Lys-Ser(Furo)-Ome；Boc-Asn-Ser(Furo)-Ome；Boc-Gln-Ser(Furo)-Ome；Boc-Ser-Ser(Furo)-Ome；Boc-Thr-Ser(Furo)-Ome；Boc-Tyr-Ser(Furo)-Ome。