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独一味的活性提取物和它的制备方法及用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体地说涉及以单一植物独一味为原料提取的含有总黄酮的活性提取物。本发明还涉及该活性提取物的制备方法及用途。
背景技术
独一味片和独一味胶囊是一种传统的中成药，它是由单一植物独一味的全草或根加工制得的，收载于中国药典，它具有活血止痛，化瘀止血的功能，用于多种外科手术后的刀口疼痛。出血、外科骨折、筋骨扭伤，风湿痹痛以及崩漏、痛经、牙龈肿痛、出血等。中国专利申请号0213469.9公开了一种独一味的分散片，但这三种制剂都是用采用独一味的水提物制得的，它存在服用量大的缺点，一般需要口服一次3粒，每粒300mg，一日三次，相当于9g生药。
发明内容
本发明的目的是克服现有独一味制剂的剂型少，服用量大的缺点，开发利用独一味的有效的药用部位制成对治疗确有疗效的，服用剂量少的新药物。
为达到本发明目的所采用的技术方案是：采用唇形科植物独一味(Phlomis rotata Benth)，包括根或全草经提取得到的活性提取物，于是采用独一味药材的根和/或全草经醇提及其水提后的提取液，进一步分离纯化得到活性提取物，其活性提取物的干品含有总黄酮以芦丁计达百分重量为50-80％，含木犀草素达百分重量为1.0-5.0％。
活性提取物中总黄酮的测定方法参照中国药典二部附录分光光度法测定，以芦丁为对照品，在500nm波长处测定吸收度，计算总黄酮的含量。木犀草素的测定方法参照中国药典二部附录高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为350nm；理论板数按木犀草素峰计算应不低于1500。以木犀草素为对照品。
该独一味的活性提取物的制备方法，是采用独一味药材的根和/或全草通过制药工艺通用的水提醇沉法或醇提水沉法或醇渗漉提取法得到的提取液经过a、大孔树脂吸附分离或 b.聚酰胺吸附分离或 c.硅胶吸附分离得到的溶液，回收溶剂后得到活性提取物。
所采用独一味药材可以是单独用其根或单独用全草，也可以是根和全草按任意比例混合物使用，以根与全草的混合比例为1∶0.1～5为佳，经药效试验以根与全草的混合比例为1∶0.5～2更佳。
上述的活性提取物的制备方法中所说的分离纯化方法，为了适合考虑生产成本优选大孔树脂吸附分离方法，是将独一味的提取液通过大孔树脂吸附，待提取液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以20～80％乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液。大孔树脂的类型很多，可以采用有极性树脂、非极性或弱极性树脂，优选非极性或弱极性的大孔树脂为佳，如HPD-100、HPD-450、WLD、AB-8、ZTC-5等。
下面叙述本发明的制备方法：
一、提取：a.所说的水提醇沉法是称取药材粗粉，混合均匀，加水煎煮1～3次，合并各次水煎液，浓缩，加乙醇调节醇浓度到30～70％，静置，待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相当药材量的1∶0.5～2的浓度，备用；
b.所说的醇提水沉法是称取药材粗粉，加40％～90％乙醇回流提取，回收乙醇，药液浓缩，加适量水混合搅拌均匀，静置，待沉淀完全后，倾出上清液，药液浓缩至相当药材量的1∶0.5～2的浓度，备用；
c.所说的醇渗漉提取法是称取独一味药材粗粉，加乙醇浸泡后，进行渗滤，收集渗漉液，回收乙醇，药液浓缩，加适量水混合搅拌均匀，静置，待沉淀完全后，倾出上清液，药液浓缩至相当药材量的1∶0.5～2的浓度，备用；
二、上述的提取液进一步分离纯化：
a.将上述药液通过大孔树脂吸附，待滤液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以20～80％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂后即得到中药独一味的活性提取物；大孔树脂可以采用非极性或弱极性树脂，以HPD-100、HPD-450、WLD、AB-8、ZTC-5为佳。(将过量的一定浓度的独一味提取液分别通过不同型号的已预处理好的树脂柱，进行动态吸附。过柱后，先用水洗洗脱至洗脱液近无色，再用70％的乙醇洗脱树脂柱，将乙醇洗脱液蒸干。分别计算出比上柱量、比吸附量、洗脱率及纯度)
b.聚酰胺吸附分离聚酰胺吸附分离：将上述药液浓缩，通过聚酰胺吸附，以甲醇或乙醇由10％梯度变化到95％洗脱，收集中等极性部位(30％～80％甲醇或30％～95％乙醇)，减压回收溶剂后即得到中药独一味的活性提取物。
c.硅胶吸附分离：将上述药液浓缩，通过硅胶吸附，洗脱剂由氯仿-甲醇4∶1梯度变化到100％甲醇，再梯度变化到10％甲醇；或由氯仿-乙醇3∶1梯度变化到95％乙醇，再梯度变化到10％乙醇。收集中等和较高极性的部位(其洗脱剂范围为：氯仿-甲醇2∶1梯度变化到100％甲醇，再梯度变化到30％甲醇；或由氯仿-乙醇2∶1梯度变化到95％乙醇，再梯度变化到30％乙醇)，减压回收溶剂后的浓缩物即得到中药独一味的活性提取物。
用醇提水沉工艺方法提取的药液200ml，分别通过HPD-100树脂、60～200目硅胶和60～200目聚酰胺。按各自的分离方法进行分离纯化。收集洗脱液，测总黄酮含量。并将洗脱液蒸干后，测定干固物中的总黄酮含量。
                  三种分离与纯化方法实验结果

    吸附填料    洗脱液总黄酮含量(mg)    干固物总黄酮含量(％)    HPD-100树脂    1386.1    72.38    60～200目硅胶    1126.2    77.62    60～200目聚酰胺    1287.4    79.13
回收溶剂后得到的活性提取物，为了延长保质期和制备药物的方便及运输方便，其活性提取物以制成干品为佳，故回收溶剂后得到的浓缩物，进一步优选采用喷雾干燥制得活性提取物的干粉。
三、喷雾干燥
将上述经分离得到的乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.05-1.1时，喷雾干燥，收集干燥粉，为独一味的活性提取物的干粉。
本发明地另一个目的是该独一味的活性提取物用于制备治疗外科手术后的刀口疼痛、出血，外伤骨折等各种疼痛与出血等病的药物。
所说的药物可以用常规的中药制剂方法，添加药学上允许的辅料制成任何一种口服制剂的药物如片剂、分散片、颗粒剂、胶囊剂、合剂、口服液、糖浆剂、丸剂、等。其中优选滴丸剂，其滴丸剂中各组分的重量为：独一味活性提取物干粉1份、聚乙二醇0.5～4份。
下面用独一味提取物进行药效试验说明本发明的活性提取物及用途。
一.镇痛实验：
1、小鼠醋酸扭体法：
动物：昆明种小白鼠，体重18-22g，雌雄各半。
试验方法：动物随机分为空白对照、4个样品组及阳性药物对照组，称重、标记，连续给药3天，末次给药后30分钟，腹腔注射0.6％醋酸0.1ml/只，观察10分钟内引起的扭体次数。
结果：见下表
             表1  扭体实验测定不同提取物对小鼠的止痛作用(X±SD)组别剂量(g/kg)动物数  扭体次数  P正常对照12  42.33±9.3杜冷丁0.0512  10.5±3.8  ＜0.01药典独一味胶囊剂样品(广州某厂产品)1.212  29.8±8.8  ＞0.05独一味根提取物干粉0.0612  18.16±6.3  ＜0.01独一味全草提取物干粉0.0612  23.08±7.3  ＜0.01独一味根：全草1∶0.1混合物的提取物干粉0.0612  18.56±5.3  ＜0.01独一味根：全草1∶1混合物的提取物干粉0.0612  10.58±3.8  ＜0.01独一味根：全草1∶2混合物的提取物干粉0.0612  17.24±6.8  ＜0.01独一味根：全草1∶5混合物的提取物干粉0.0612  19.34±4.9  ＜0.01
显示本发明独一味各提取物均可减少小鼠的扭体反应次数，有镇痛作用，而独一味根和全草混合物的活性提取物的镇痛效果较好，与正常组相比有明显差异。
2、热板法：
动物：昆明种小白鼠，体重18-22g，全部为雄性。
试验方法：动物随机分为空白对照、4个样品组及阳性药物对照组，称重、标记，各组按剂量连续给药7天，参考文献使用热板法，分别测定末次给药的小鼠痛阈值。
结果：见表2
表2  热板法测定不同提取物对小鼠的止痛作用(X±SD)组别剂量(g/kg)动物数  舔足时间(S)P正常对照12  15.4±8.6杜冷丁0.0512  35.9±15.2＜0.01药典独一味胶囊剂样品(广州某厂产品)1.212  21.8±12.9＞0.05独一味根提取物干粉0.0612  25.8±6.30＜0.05独一味全草提取物干粉0.0612  26.6±19.8＜0.05独一味根：全草1∶0.1混合提取物干粉0.0612  26.82±11.3＜0.05独一味根：全草1∶1混合提取物干粉0.0612  33.2±18.6＜0.01独一味根：全草1∶2混合物提取物干粉0.0612  27.2±7.2＜0.05独一味根：全草1∶5混合物提取物干粉0.0612  25.2±18.6＜0.05
结果表明，本发明提供的活性提取物与原药典的独一味提取物相比镇痛效果明显，根与全草的混合物的活性提取物镇痛效果明显。
二、止血实验
剪尾法：结果见下表：
      表3  不同提取物对正常小鼠出血时间的影响(X±SD)组别剂量(g/kg)动物数  止血时间  (S)  P正常对照12  100.1±20.1药典独一味胶囊剂样品(广州某厂产品)1.212  85.6±20.8  ＞0.05独一味根提取物干粉0.0612  73.3±23.0  ＜0.05独一味全草提取物干粉0.0612  80.4±18.4  ＜0.05独一味根：全草1∶0.1混合物提取物干粉0.0612  75.2±16.2  ＜0.05独一味根：全草1∶1混合物提取物干粉0.0612  62.6.2±18.6  ＜0.01独一味根：全草1∶2混合物提取物干粉0.0612  74.61±12.3  ＜0.05独一味根：全草1∶5混合物提取物干粉0.0612  79.25±8.9  ＜0.05
动物：取健康昆明种小白鼠，体重18-22g，雌雄各半。
试验方法：动物随机分为空白对照、4个样品组及生理盐水对照组，称重、标记，连续给药7天，末次给药后固定，测定鼠尾长度并标记，30-40分钟后分别将小鼠尾尖3mm处横断，待血液自行溢出开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴，直至血液自然停止，计算出血时间。
结果表明独一味的活性提取物的止血效果较好，与空白组对照组差异明显。
其根和全草混合物以1∶1组的提取物与其它组相比，止血效果最好。
2、玻片法
动物：取健康昆明种小白鼠130只，体重18-22g，雌雄各半。
试验方法：动物随机分为空白对照、6个样品组及生理盐水对照组，称重、标记，每个样品小鼠设3个口服剂量，末次给药后30分钟，于载玻片两端各滴一滴小鼠眼球血液，立即用秒表计时，每隔30秒观察是否有血丝产生，记录凝血时间，取其平均值。
结果：见表4
                表4  不同提取物对正常小鼠凝血时间的影响(X±sD)组别剂量(g/kg)动物数  凝血时间(S)    P正常对照12  135.83±19.77药典独一味胶囊剂样品(广州某厂产品)1.212  102.50±8.29    ＜0.01独一味根提取物干粉0.0612  95.8±6.30    ＜0.01独一味全草提取物干粉总黄酮0.0612  111.67±9.86    ＞0.01独一味根：全草1∶0.1混合物提取物干粉0.0612  97.3±8.58    ＜0.01独一味根：全草1∶1混合物提取物干粉0.0612  75.42±24.19    ＜0.01独一味根：全草1∶2混合物提取物干粉0.0612  89.42±14.13    ＜0.01独一味根：全草1∶5混合物提取物干粉0.0612  105.42±24.19    ＞0.01
结果表明，本发明提供的活性提取物与对照组相比可明显缩短小鼠的凝血时间。
本发明的有益效果是：
1、将药材的粗提物进一步分离提纯到有效部位，提高了药物疗效，减少了病人的每次服用量。
2、本药物的特点是：用于外科手术后的刀口疼痛、出血，外伤骨折等各种疼痛与出血等病，既可止痛又可止血。
3、本发明提供的制备方法适合于工业化批量生产。
下面结合实施例阐述本发明的技术方案
具体实施方式
一、提取独一味药材的三种工艺方法：
实施例1、水提醇沉法：称取独一味的全草和根(1∶1)的粗粉，混合均匀，加水煎煮2次，合并各次水煎液，浓缩，加乙醇调节醇浓度到60％，静置。待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相当药材量的1∶2的浓度，备用；
实施例2、醇提水沉法：称取独一味的全草和根(1∶1)的粗粉，混合均匀，加60％乙醇回流提取3次，合并醇提液，回收乙醇，药液浓缩至相对密度1.0-1.2，加适量水混合搅拌均匀，静置。待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相当药材量的1∶2的浓度，备用；
实施例3、醇渗漉提取法：称取独一味的全草和根(1∶1)的粗粉，混合均匀，加70％乙醇浸泡后，以5ml/分钟的速度进行渗滤，收集渗漉液，回收乙醇，药液浓缩至相对密度1.2，加适量水混合搅拌均匀，静置。待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相当药材量的1∶2的浓度，备用；
将实施例1、2、3、三种提取工艺方法的药液分别用同样的方法过大孔树脂分离洗脱，回收乙醇后浓缩成浸膏，喷雾干燥得到干粉，测定结果见下表；
                表5  三种提取方法测定结果    工艺方法    投料量  浓缩液    干粉    总黄酮含量    实施例1    20Kg  40L    1015g    70.3％    实施例2    20Kg  40L    982g    74.1％    实施例3    20Kg  40L    935g    67.9％
二、进一步分离纯化方法
实施例4、取上述实施例2的提取浓缩液进一步分离纯化：
将上述药液200ml通过AB-8大孔树脂15g进行动态吸附，流速约为1ml/min，待滤液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为1ml/min，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂后即得到独一味的活性提取物，并进一步干燥，得到干粉。
实施例5、取上述实施例2的提取浓缩液进一步分离纯化：
将上述药液200ml通过HPD-100大孔树脂15g进行动态吸附，待滤液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以20％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，其它操作同实施例4。
实施例6、取上述实施例2的提取浓缩液进一步分离纯化：将上述药液200ml通过WLD、大孔树脂15g进行动态吸附，待滤液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以80％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，其它操作同实施例4。
实施例7、取上述实施例2的提取浓缩液进一步分离纯化：将上述药液200ml通过HPD-450大孔树脂15g进行动态吸附，待滤液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，其它操作同实施例4。
实施例8、取上述实施例2的提取浓缩液进一步分离纯化：
将上述药液200ml通过ZTC-5大孔树脂进行动态吸附，待滤液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，其它操作同实施例4。
实施例9、取上述实施例2的提取浓缩液进一步分离纯化：
将上述药液200ml通过AB-8大孔树脂15g进行动态吸附，待滤液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，其它操作同实施例4。
结果见下表    实施例    干粉(g)    总黄酮含量(％)    木犀草素含量(％)    4    5.54    79.36    4.10    5    5.38    67.21    1.83    6    4.25    70.87    3.12    7    5.67    53.11    0.62    8    3.71    50.12    2.39    9    5.68    76.26    2.86
三、喷雾干燥
实施例10、将上述实施例2得到的提取浓缩液过大孔树脂后的乙醇洗脱液，方法如同实施例4，回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.05-1.1时，喷雾干燥，收集干燥粉，即得到独一味活性提取物的干粉982g，总黄酮的含量为74.1％，木犀草素含量2.12％
喷雾干燥条件：进风温度：85℃；出风温度135℃。
总黄酮的含量测定和木犀草素含量测定方法见中国药典。
下面用实施例阐述本发明的用途。
实施例A、片剂：
称取实施例10制得的独一味活性提取物的干粉150克，与15％的羧甲基淀粉钠、PVP等适量混合粉碎，过100目筛，用95％的乙醇湿法制粒，干燥整粒后加入适量硬脂酸镁混合压片。制成1000片，每片重约0.3g，口服，每次一片，每日3次。
实施例B、胶囊剂：
称取实施例10制得的独一味活性提取物的干粉150g，加适量的辅料，过100目筛，干压法或湿法制粒，烘干，灌入1号胶囊，制成1000粒，每粒重约0.25g，每次1粒，每日3次。
实施例C、分散片
称取实施例10制得的独一味活性提取物的干粉150克，与10％的羧甲基淀粉钠混合粉碎，过100目筛，加适量低取代羟丙基甲基纤维素，用聚乙烯吡咯烷酮乙醇液制软材，湿法制粒，干燥整粒后加入适量硬脂酸镁混合压片。制成1000片，每片重约0.3g，口服，每次一片，每日3次。按中国药典崩解时限方法检查，样品应在3分钟内崩解。
实施例D、口服液
称取实施例3提取后的浓缩液后用实施例4的方法分离纯化得到的浸膏约15g，加入少量热水溶解，搅匀，加入适量单糖浆，加水至1000ml，调节PH值至6～7，滤过，灌封，灭菌，即得。规格：10ml/支，口服，每次一支，每日3次。
实施例E、滴丸剂
取实施例10的独一味活性提取物的干粉250g，粉碎，过120目筛，加入到约350g熔融的聚乙二醇6000与4000的混合液中，充分混合，于滴丸机上以70～90℃的药液温度滴制成10000粒滴丸，每粒重约60mg。口服，每次6粒，每日3次。
实施例F、糖浆剂：
称取实施例3提取后的浓缩液后用实施例4的方法分离纯化得到的浸膏约15g，加入少量热水溶解，搅匀，加入适量单糖浆，加水至1000ml，调节PH值至6～7，滤过，灌封，灭菌，即得。规格：100ml/瓶，口服，每次口服10ml，每日3次。
实施例G、颗粒剂
称取实施例3提取后的浓缩液后用实施例4的方法分离纯化得到的浸膏约75g，加入适量乳糖与糊精混合均匀，湿法制粒，干燥整粒，分包装。制成1000g，每包2g。口服，每次一包，每日3次。