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本发明提供了用于口服施用以治疗受感染患者的乙肝病毒感染的药物组合物，其包含2－氨基－9－[2－[双(2，2，2－三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]－6－(4－甲氧基苯基硫代)嘌呤(LY582563)。所述组合物是单位剂量形式，每单位剂量包含大约2.5至20mg的嘌呤。所述组合物适于口服施用，优选片剂或胶囊形式，可以单剂量或多剂量施用，条件是嘌呤的总日剂量为每患者每天大约2.5mg－20mg。这些组合物对降低慢性HBV感染的人类患者的血浆HBV DNA水平，或者缓解由乙肝病毒引起的症状、指标或紊乱特别有利。

1.  以剂量单位形式口服施用的药物组合物，其中包含：
每剂量单位大约2.5-20mg的2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤，以及
药用载体、稀释剂或赋形剂。

2.  根据权利要求1的组合物，其为片剂或胶囊形式。

3.  根据权利要求1或2的组合物，其中所述的2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤在每剂量单位中的含量为大约2.5mg、大约5mg、大约10mg、大约15mg或大约20mg。

4.  2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗乙肝病毒感染的人类患者，其中：
所述药物适于口服施用，以及
所述药物以剂量单位形式存在，其中每剂量单位包含约2.5-20mg所述嘌呤。

5.  根据权利要求4的用途，其中所述药物的剂型为片剂或胶囊。

6.  根据权利要求4或5的用途，其中2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤在每剂量单位中的含量为大约2.5mg、大约5mg、大约10mg、大约15mg或大约20mg。

7.  治疗人类乙肝病毒感染的方法，其中包括每天给患者施用总量为大约2.5-20mg的2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤。

8.  根据权利要求7的方法，其中所述2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤施用于患者的时间应长到足以使患者血浆中的乙肝病毒核酸水平低于施用所述嘌呤之前。

9.  根据权利要求8的方法，其中所述患者的血浆中的乙肝病毒核酸水平与施用所述嘌呤之前相比，降低到至少约10⁴拷贝/毫升。

10.  根据权利要求7的方法，其中所述2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤施用于患者的时间应长到足以改善所述患者由乙肝病毒导致的征候，症状，指标或机能紊乱。

11.  根据权利要求10所述的方法，其中所述征候、症状、指标或机能紊乱选自肝纤维化、肝硬化、炎性肝脏疾病和肝癌。

12.  根据权利要求7-11任一项的方法，其中所述的2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤以药用口服组合物形式施用于患者。

13.  根据权利要求7-12任一项的方法，其中所述药用口服组合物的剂型是片剂或胶囊。

14.  根据权利要求8-13任一项的方法，其中所述时间是几天、几周、几个月或几年。

15.  根据权利要求7-14任一项的方法，其中每天给患者施用总量为大约2.5mg、大约5mg、大约10mg、大约15mg或大约20mg的2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤。

16.  根据权利要求7-15任一项所述的方法，其中所述2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤以每日单一剂量或者按照将每天总剂量分成多次亚剂量的方式施用。

膦酸酯核苷酸类似物在治疗乙肝病毒感染方面的用途
本申请要求获得如下美国临时专利申请的优先权：60/338,242，递交日2001年12月7日；60/372,013，递交日2002年4月11日；和60/381,123，递交日2002年5月16日；所有这些文件都在此完整引用作为参考。
发明背景
发明领域
本发明是关于利用2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤(LY582563)来治疗人患者中乙肝病毒感染的一种新的剂量和给药方案。本发明对于降低感染乙肝表达的患者血浆中乙肝病毒核酸(HBV DNA)水平，改善人类中乙肝病毒感染而引起的症状、指标、或者机能紊乱有特别的疗效。
相关技术的描述
乙肝是一种潜在致命性的肝脏疾病，由乙肝病毒感染引起，该病毒是肝脱氧核糖核酸病毒科家族中的一种部分双链DNA病毒。据估计世界上有三亿五千万慢性乙肝病毒感染者，并且每年因乙肝导致肝硬化或者肝癌而死亡的人大约有一百万。
乙肝病毒是一种嗜肝病毒，它能在肝脏复制，导致急性和慢性肝疾病，包括肝纤维化、肝硬化、炎性肝脏疾病和肝癌等疾病。这些疾病都能导致某些病人的死亡(W.K.Joklil，Virology，Third Edition，Appleton & Lange，Norwalk，Connecticut，1988)。乙肝病毒是一种血液传播病原体，由接触乙肝病毒感染者的体液而得以传播，其传播方式类似于人免疫缺陷病毒(HIV)。然而，乙肝病毒比HIV的传染力更强。尽管有效的疫苗已经在临床得到使用，但它们对那些已经感染乙肝病毒的患者没有任何医疗价值。据估计15％到20％的慢性乙肝病人将发展成为肝硬化或者其它的慢性疾病。对于代偿性肝硬化的病人，在五年之内的存活率为84％，十年之内为68％。对于失代偿性肝硬化的病人，五年之内的存活率仅仅为14％(Lok等，肝脏学，2001，34：1225-1241)。
α-干扰素疗法成功应用于慢性乙肝治疗已经有一段时间了。然而，它对病人的有效率低于40％，并且伴有剂量限制副作用，例如流感样病症，体重减轻，精神抑郁和细胞减少等症状。拉米夫定(Lamivudine)和阿德福韦(adefovir)是目前发展中的用于治疗乙肝的两种新化合物。但不幸的是，已经观察到用药四年以后高达70％的病人体内出现拉米夫定耐药病毒。因此寻找一种改进的和高效的抗乙肝病毒疗法是必需的，并且是迫切的(Locarnini等，抗病毒化学和化学疗法，1996，7(2)：53-64)。
LY582563{2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰(phosphonyl)甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代(thio))嘌呤}是近来发现的一种膦酸酯(phosphonate)核苷酸类似物(见美国专利：5,840,716)，它作为一种抗乙肝病毒制剂的研究目前正在发展中。LY582563是9-[2-(膦酰甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA；即阿德福韦)的一种衍生物，其口服吸收和抗病毒活性提高了。体外试验已经证明LY582563具有比拉米夫定或阿德福韦更高的抗乙肝病毒活性。尽管利用LY582563治疗乙肝病毒患者的一些有益疗效已为人所知，但优化该药剂的治疗方案具有重要的临床应用价值。
发明简介
相应于此，本发明涉及包含LY582563的新的药物组合物，以及治疗人群中乙肝病毒感染的新方法，包括利用LY582563治疗乙肝患者的优化给药方案。
因此，第一个方面，本发明提供了一种以剂量单位形式口服给药的药用组合物，其中包括：
每剂量单位包含大约2.5-20mg的2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤，以及药用载体、稀释剂或赋形剂。
组合物的剂型可以是片剂或胶囊，其中每剂量单位中嘌呤的含量为大约2.5mg，5mg，10mg，15mg或者20mg，或者每剂量单位的含量为大约5-10mg，大约7.5-10mg。在每一方案中，范围的上限可扩大到每剂量单位大约12mg或12.5mg。
另一方面，本发明提供{2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤}在制备一种药剂中的用途，其中所述药剂可治疗乙肝病毒感染的患者，其中：
所述药剂适于口服施用，以及
所述药剂以剂量单位形式存在，其中每剂量单位包含约2.5-20mg所述嘌呤。该药剂的剂型可以是片剂或胶囊，每剂量单位中嘌呤的含量为大约2.5mg，5mg，10mg，15mg或者20mg，或者每剂量单位的含量为大约5-10mg或大约7.5-10mg。在每一方案中，范围的上限可扩大到每剂量单位大约12mg或12.5mg。
另一方面，本发明提供了一种治疗乙肝病毒感染的人类患者的新方法，其中包含每天给所述病人服用总剂量为大约2.5-20mg的所述{2-氨基-9-[2-[双(2，2，2-三氟乙氧基)膦酰甲氧基]乙基]-6-(4-甲氧基苯基硫代)嘌呤}。
在该方法中，所述嘌呤可以连续给病人服用一段时间，直到病人血浆中乙肝病毒核酸水平同未给药前相比降低时为止。优选地，上述病人血清中乙肝病毒核酸水平与给药前相比降低至至少大约10⁴拷贝/毫升。此外，该嘌呤也可给药一段时间直至治愈或改善由乙肝病毒引起的症状、指标或机能紊乱，例如肝纤维化、肝硬化、炎性肝脏疾病或者肝癌等疾病。
在前述的任何方法中，所述嘌呤可以药用口服组合物方式给药，比如片剂或者胶囊的形式。而且，所述嘌呤服用的时间可以是几天，几周，几个月或者几年；并且，该嘌呤每天用药总量可以为大约2.5mg，5mg，10mg，15mg或者20mg，或者每天用药总量为大约5-10mg或大约7.5-10mg。在每一方案中，范围的上限可扩大到每天大约12mg或12.5mg。每天所服剂量的嘌呤可以一次给药，或者分多次给药。
本发明进一步的应用范围通过下面详细的说明将变得更加明朗。然而，需要指出的是这些详述和实施例尽管阐释了本发明的优选实施方案，但其目的仅仅是解释，因为在本发明主旨和范围内的变化和修饰对于本领域的技术人员在看过此详述后将显而易见。

附图简述
以下详述结合附图，将会对本发明的上述和其它方面作出更好的解释，但所有这些仅仅是解释，不应理解为对本发明的限制。图1是用标准差线条表示的体内HBV DNA的平均对数变化情况(BID(一天两次)组)。
图2是用标准差线条(bar)表示的体内HBV DNA的平均对数变化情况(QD(一天四次)组)。
图3是用平均和标准差线条表明第29天时体内HBV DNA地对数变化情况的离散图。图中空心的图注，即正方形，三角形等图注，代表个体病人的数据点。这些显示了不同日剂量的数据柱图之间的差异，尽管这并非必要，因为柱图是有显著差异的。图中实心的图注代表平均数。线条的外围界限代表从平均数中得出的标准差。
图4用拟合E_max模式反映总日剂量(TDD)治疗下第29天时HBVDNA的对数值变化。
图5用拟合E_max模式反映总日剂量(TDD)治疗期间的最大HBVDNA对数变化。图6用拟合E_max模式反映总日剂量(TDD)治疗下首剂后HBV DNA对数变化曲线下的区域面积(AUC)。
接下来关于本发明的详述是给实施本发明的技术人员提供帮助。即便如此，以下详述不应理解为对本发明的过度限制，因为本领域的技术人员可以对此处所述的实施方案进行修饰和变化而不背离本发明的主旨和范围。在这里引用的每篇文献的内容都完整引用作为参考。
目前对慢性乙肝病毒感染治疗方案的选择在数量上和临床应用方面都非常有限，其原因是耐受性问题和耐药变异株的出现。LY582563，其结构如下所示，是一种新的嘌呤核苷酸类似物的前药，该前药在临床前的研究中显示出抗乙肝病毒的有效活性[Ono-Nita等，2002，Antimicrob.Agents Chemother.46(8)：2602-5；Wise等，2002，J.Gastroenterol.Hepatol.17(suppl)：A46]。

对LY582563的口服给药方案，美国专利5,840,716讲述了对成人的临床剂量通常是每天0.1-500mg/kg，优选每天1-50mg/kg。对一位体重为68kg(大约150磅)的成年人来说，其每天的用药剂量范围大约为6.8mg至34g，优选每天大约68mg至3.4g。‘716号专利指出用药剂量可随年龄，健康状况或症状，或者协同药物的存在与否进行酌情增减。除此以外，美国专利5,840,716指出上述给出的日用药剂量可以是在一天中进行一次给药，也可是间隔适当的时间分两次或几次分次给药。最后，该药的连续服用的实施可有几天的间隔时间。
对任何一种新药制剂，确定一安全，有效的剂量，并且找出一合适的治疗方案是一个经验过程。该过程通常需要给患者不同的用药剂量，每天一次或多次，持续不同的时间，并且利用公认的诊断方法监测其疗效。对乙肝病毒来说，这些方法包括测定血浆或组织中的乙肝病毒核酸水平，或测定包含部分病毒的各种抗原，或测定病人应答，比如抗体的形成(例如乙肝病毒e抗体)，或测定生化指标的改善情况，比如降低的丙氨酸转氨酶(ALT)值。除此以外，还可通过监测由病毒导致的症状、指标或机能紊乱在用药后的改善情况测定治疗效果。在乙肝病毒病例中，这些症状包括疲劳、食欲不振、黄疸、肝纤维化、炎性肝脏疾病、肝硬化和肝癌(肝细胞癌)。然而，除了证明其有效性外，还必须证明该药对人体足够的安全，包括人体可接受的毒力。毒力在其他HBV抗病毒剂中已被观察到，包括对线粒体的毒性，肾脏的毒性和对骨髓的毒性。对一种新药本身来说，服药剂量和治疗方法的关系以及有效性和安全性只能在人类的临床实验中才能够被测定出来。因此，确定服药剂量和治疗方法参数决不能预测或者推断，并且测定的结果必定是新颖的和并不是一目了然的。在选择治疗参数时，除了保证治疗疾病的疗效外，还必须注意不能对病人产生其它的伤害。考虑到这些因素，我们对利用LY582563治疗乙肝病毒感染者的发现结果是令人惊讶的，并且该发现结果在本研究开展之前不可能被预见。这些研究结果为利用LY582563以安全的，有效的剂量和治疗方法来治疗乙肝病毒患者提供了一种合理的科学依据。
本研究开展的目的是测定利用LY582563治疗乙肝病毒感染患者的最佳服药剂量和服用方法，从而使这种抗病毒药剂的安全性和疗效最大化。简单的说，慢性乙肝感染的患者以随机的，以安慰剂作为对照，按比例上升的用药剂量连续服用LY582563 28天以上。LY582563的用药剂量包括2.5mg，5mg和10mg QD或BID，和20mgQD。还服用了一种安慰剂。服药期间患者中的乙肝病毒核酸值连续测定达12周。安全数据，例如临床反应(比如血压，脉搏，呼吸频率和一般的体征)，副反应(例如上腹部疼痛、腹泻、恶心、头痛、疲劳和脱发)、心电图、血液学、血中生化物质的测定(例如天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸、血尿素氮(BUN)、肌酸酐和胆红素)，以及肾小管毒性的高灵敏性的尿液标志物(乳酸脱氢酶(LDH)，尿肌酸酐和尿β-N-乙酰葡糖氨酶(β-NAG)等也进行了测定。所得数据证明LY582563对慢性乙肝病毒感染患者具有有利的安全特性和有效的抗乙肝病毒活性，并且表明这种新的抗乙肝病毒药剂的最佳服药剂量和服法具有长期安全性和有效性。基于上述结果，权衡安全性和有效性后，LY582563的合适剂量是每人每天介于大约2.5-20mg之间。这些剂量的药可以在几天，几周，或者几个月，或几年当中给病人服用，其目的是改善或控制不希望的HBV感染所引起的结果。
利用LY582563治疗乙肝的服用方法
利用LY582563来治疗乙肝患者的口服给药方案通常根据许多因素来选择，这些因素包括年龄，体重，性别，饮食和病人的医疗状况，所感染病毒的基因型，感染的严重性和药理学上的考虑，比如LY582563的活性，有效性，药动力学和毒性。LY582563通常需连续给药几小时，几天，或几周直至几个月或几年直到病人体内的病毒滴度达到可接受的水平，或者直到由乙肝病毒感染所引起的一种或几种征候(indicium)、症状、指标(condition)或机能紊乱得到改善或完全消除，表明感染已被控制或彻底根除。
关于血浆中乙肝病毒核酸的降低，长期目标是目前正在争论的一个问题，在这个领域中的一些工作者提议合适的DNA值应低于10⁴拷贝/毫升。乙肝病毒核酸的这一水平的持续时间目前还没有明确的定义。
乙肝病毒感染的代表性临床症状除了血浆中含乙肝病毒核酸外，还有肝纤维化，肝硬化，肝炎和肝癌，但并不仅限于这些。见(Hollinger等，2001，病毒领域(Fields Virology)，第四版，Vol.2，David M.Knipe等，编著，“乙型肝炎病毒”，87章，2971-3036页，Lippincott，Williams，& Wilkins，Philadelphia，PA.)。在世界上大多数地方，肝纤维化等疾病通常通过肝活组织检查来诊断，在大多数的亚洲国家，医师们通常并不依靠肝活组织检查进行诊断，而是依靠临床检测来预测进行诊断。
通常可利用某些技术，如狭缝-印迹，点-印迹或者聚合酶链反应(PCR)技术对利用LY582563进行治疗的乙肝患者的血清中乙肝病毒核酸值进行监测，或者通过测定血清或组织中的乙肝抗原值，例如乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)来测定治疗效果。这些方法在Hoofnagle等人于1997年发表在“新英格兰医学杂志”上的文章中讨论过，还有Hollinger，1996，发表在“病毒领域”，第三版，Vol.2，Bernard N.Fields等人，Eds.，“乙型肝炎病毒”，86章，2738-2807页，Lippincott-Raven，Philadelphia，PA和Hollinger等，2001，“病毒领域”，第四版.，Vol.2，David M.Knipe等，Eds.，“乙型肝炎病毒”，87章，2971-3036页，特别是2989-2991页，Lippincott，Williams，&Wilkins，Philadelphia，PA.和在这里引用的文献。对慢性乙肝病患者，病情缓解的表征是乙肝病毒核酸的消失，即乙肝病毒核酸值减少到被杂交实验等无法检测到的水平，杂交实验的检测水平为≥10⁵基因组拷贝/毫升血清，或者尽管持续存在乙肝表面抗原(HBsAg)，但是从血清中已不能检测到乙肝e抗原(HBeAg)。这些血清学现象是和乙肝的生化和组织学特征的改善相关的。在大多数抗病毒治疗的实验中成功治疗的最终关键是乙肝病毒e抗原(HBeAg)和病毒DNA从血清中消失。在e型抗原消失的患者中缓解通常得以维持，并导致产生失活的表面抗原携带者状态。许多白种病人在成年时得了该病并且接受过干扰素治疗，最终成为乙肝表面抗原阴性(见Hoofnagle等人发表在“新英格兰医学杂志”上的一篇评论336(5)：347-356)。然而，这并不代表世界上大约90％的乙肝病毒患者。对上述方法测定的数据进行连续分析允许在治疗期间调整服药方法，这样做的目的是可找到一种关于LY582563的最佳给药量，并且治疗的持续时间也能被同时确定。因此，在治疗过程中治疗方案/剂量方案可进行合理的调整，以便给出达到满意的抗病毒疗效的LY582563的最低用药剂量，并且连续服药只持续到能成功的治愈乙肝病毒感染。
在本发明所叙述的内容中，术语“改善”，“治愈”，“治疗”，“治疗应用”或“治疗方案”在这里的含义为LY582563给药的预防，缓解和治疗方式，包括所述嘌呤的任何一种或所有的用途：改善因乙肝病毒感染所致的征候，疾病状态，指标，症状，或失调；防止，阻碍，延迟或逆转与乙肝病毒感染有关的征候，疾病状态，指标，症状或失调。因此，任何预防，改进，缓解，逆转或完全消除与乙肝病毒感染有关的、不希望的征候，疾病状态，指标，症状或失调均是本发明所包括的范畴。术语“剂量单位”在这里指个体递送载体(vehicle)，比如，活性LY582563嘌呤给药的片剂或胶囊，但不限于此。
下述实例用来对发明的各个方面进行解释，不以任何形式对本发明进行限制。
实施例1
健康受试者和慢性乙肝感染患者中的多剂量逐步升高研究
关于LY582563的一种随机的，单周期，多剂量逐步上升(escalation)，单盲的给药方案的研究分两部分开展。第一部分在健康的受试者中进行，第二部分在代偿性的慢性乙肝患者中进行(以后称之为“患者”)。设计本项研究旨在评估LY582563的多剂量的安全性和药效。在人类中进行此多剂量研究尚属首次。
健康受试者以BID(一天两次)方式给药两周，保守性地逐步增加剂量。每一次剂量升高之前都要对安全性数据进行检查。
第一部分(健康受试者)
在第一部分中，共包括4组，每组8位受试者(其中6位使用研究药物，另2位使用安慰剂)。表1显示参与本项研究的受试者情况。LY582563的剂量如下：2.5mg BID，5mg BID，10mg BID和15mgBID。单一剂量的LY582563给药大约24小时后，多次BID(一天两次)给药LY582563大约14天，最后一天为QD(一天四次)。每组受试者所使用的剂量均逐步升高。在每一次剂量升高之前，安全性及其他的一些数据都应做适当的检查。单一剂量LY582563后和最后一次剂量后，用已确认的LC/MS/MS方法(Advion生物科学有限公司，Ithaca，纽约)24小时监测血浆中LY582563及其代谢产物(602074，602075和602076)的浓度。受试者使用LY582563的最后一个剂量后，按常规间隔期，对其进行追踪大约4周时间。
                                 表1.健康受试者情况