确定细胞对VEGF反应的方法及其用途 【技术领域】
本发明涉及内皮细胞在对VEGF反应时的基因表达谱(profile)，以及该谱在诊断和治疗中的用途。
背景技术
血管发生是从预先存在的血管生成新的毛细血管的过程，它在生理和病理状态下起重要作用。新的毛细血管网络的生成是一个复杂过程，它包括基膜降解和细胞外基质水解，伴随着内皮细胞的增殖和迁移，原基血管结构(rudimentary vascular structures)的形成和细胞外基质的改造(remoulding)。一般认为，通过血管发生诱导物和抑制剂之间地平衡来调控血管发生，其中的许多诱导物和抑制剂与目标细胞上的特异受体相互作用。已经证明一些肽类和非肽类的因子在体内诱导血管发生：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)和转化生长因子β(TGFβ)、肿瘤坏死因子α(TNFα，体内)、血管生成因子、酸性和碱性纤维细胞生长因子(aFGF/bFGF)、血管水平生长因子(VEGF)、PGE2和甘油一丁酸酯。血管生成的抑制剂已经被确定，从复杂的类固醇到多肽，包括钙结合糖蛋白(thromospondin)、血小板因子IV、TNF-α(体外)、TGF-β、干扰素、制管张素(angiostatin)、整联蛋白抑制剂、16-kD促乳素。
内皮在健康成年生物体中通常是静止的。特别例外的是雌性生殖道，其中由于暂时结构的周期性演变和受损组织的循环修复持续地需要额外的血管系统。最近表明在用血管生成抑制剂AGM-1470处理的小鼠中，雌性生殖道被大范围和严重地破坏(Klauber N，等，1997，Nature Medicine，4：443-446)。这还说明可以完全消除卵巢和子宫内膜的周期性以实现动物不育，而全面阻断血管生成也可以破坏蜕膜化和胎盘形成。雌性生殖系统中的循环血管生成事件极有可能与激素协调，该血管生成作用可能由直接或间接被激素诱导的血管生成因子调节。已经证明卵巢组织、子宫组织和胎盘组织中含有和产生血管生成因子和抗血管生成因子。在各种这些血管生成因子中，VEGF具有一些独特的特征，表明它在这些组织中起重要作用。特别地，它促进血管内皮细胞的有丝分裂、提高血管通透性，并且还调节大量参与新血管形成过程的蛋白水解酶的生成。因此，它还能够调节新血管形成的所有步骤，并可能在雌性生殖道和其他组织的生理性和病理性血管发生中起重要作用。在许多成年组织中检测到VEGF结合位点，表明VEGF可能不仅在血管发生中，而且在已有血管的维持中都起重要作用。
VEGF在血管系统发育中的重要作用还被最新的数据进一步证实(Risau 1997，Nature 386：671-674最新综述)。缺乏单个VEGF等位基因导致胚胎死亡，这表明既便是VEGF水平相对适度的下降也具有深远的影响。基因敲除试验也已经证明Flt-1和KDR(VEGF受体)对于胚胎血管系统的发育和分化是关键的。缺乏Flk-1基因的小鼠不发生血管生成并且不形成血岛，导致在第8.5-9.5天死亡在子宫中。靶向(targetted)突变Flt-1等位基因的小鼠胚胎纯合子在体节中期死亡在子宫中。
血管内皮生长因子(VEGF)是结合肝素、30-46kDa的分泌型同源二聚体糖蛋白，又被称作为血管渗透性因子。它是血管内皮的有效促有丝分裂原，具有有效提高血管通透性的活性，并且调节一些参与血管发生的蛋白水解酶的表达，还起到维持新形成的毛细血管的作用。
对VEGF基因的分析已经说明蛋白质编码区排列在8个外显子中。通过可选剪接所述外显子，产生VEGF的5种不同mRNA，分别具有121、145、165、189和206个氨基酸(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206)。在大多数组织中，主要是121和165个氨基酸的形式，而145个氨基酸的形式一般很少。这种形式最早被描述存在于人的子宫内膜和胎盘组织中(Charnock-Jones DS等，1993 Biology of Reproduction 48：1120-1128)，最近被证实具有其他VEGF形式不具有的独特性质(Poltorak Z等，1997，Journal of Biological Chemistry USA，7151-7158)。预计啮齿类和牛的VEGF少一个氨基酸，但是通常高度保守。近来还确定了一些其他的蛋白质，它们与VEGF同源性可观。它们被称作为胎盘生长因子(PLGF)(Maglione D等，1993 Oncogene 8 925-931)、VEGFB(Olofsson B等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：2576-2581)、VEGFC(Joukov V等，1996 EMBO Journal 15：290-298)和VEGFD(Yamada Y等1997 Genomics 42 483-488)。已经证明胎盘生长因子能够与VEGF形成异二聚体，这些异二聚体能够与VEGF受体之一结合。但是，它们促有丝分裂能力比VEGF165同源二聚体低20-50倍。
VEGF通过两个酪氨酸激酶家族受体起作用，这些受体是c-fms-样酪氨酸激酶(flt-1)和含有激酶结构域插入片段的受体(KDR)。不同于先前描述具有5个环的III类受体酪氨酸激酶，flt-1和KDR在其胞外结构域中都具有7个免疫球蛋白(IG)样环。它们还有单个跨膜区和中间被激酶插入片段隔断的共有酪氨酸激酶序列。Flt-1的第二个IG-样细胞外结构域对于配体结合和特异性是关键的。这两种受体都被证明高亲合性地结合VEGF。Flt-1对VEGF的亲合性最高，其Kd为10-20pM，KDR具有较小的100-125pM的Kd。鼠类KDR同系物，胎儿肝脏激酶-1(Flk-1)也被鉴定，与人KDR具有85％序列同一性。在胎儿和成年组织中，Flt-1和KDR/Flk-1的mRNAs主要在血管内皮细胞中表达。它们也存在于非内皮细胞中，包括外周血液单核细胞、恶性黑素瘤细胞系、滋养层样绒毛膜癌细胞系BeWo和腹水(peritoneal fluid)巨噬细胞。Flt-4酪氨酸激酶受体与VEGF受体flt-1和KDR相关，但是不与VEGF结合，在发育过程中其表达主要被限制在淋巴内皮中。flt-1、KDR/Flk-1和flt-4的mRNA具有独特的表达谱，一些内皮缺乏这三个受体的mRNA中的一种或两种，表明由该基因家族编码的受体酪氨酸激酶在调控血管的生长/分化中具有不同功能。
供应大部分成年组织的血管是稳定的，其内皮细胞是静止的，不发生凋亡。但是在组织改变(remodel)的过程中血管变得有弹性，并且自我改变来满足其所供应的组织的不同需要。这在肿瘤退化和在雌性生殖器官中发生每月一次的萎缩的过程是最明显的。这种血管改变中最重要的部分是内皮细胞的凋亡。
在血管改变中，去除存活信号可能增进内皮细胞的凋亡。在体外，去除成纤维生长因子(FGF)-I、FGF-II、血管内皮生长因子(VEGF)-A或血管生成素(Angiopoietin，Ang)-1，会诱发内皮细胞凋亡。在体内，用雄激素消融疗法治疗人前列腺瘤导致由前列腺上皮细胞生成的VEGF-A下降，接着引起新形成的肿瘤血管中的内皮细胞选择性凋亡。重要的是，在这些肿瘤中，由存活因子去除来介导的内皮细胞凋亡发生在赘生性细胞自身凋亡之前，而肿瘤血管减少发生在肿瘤变小之前。其他在血管修复过程中由去除存活信号可能引起内皮细胞凋亡的方法，包括乳腺萎缩、胎盘形成和卵巢黄体周期性退化。
调节转录丰度可能使已经十分清楚的翻译后路径与内皮细胞中在去除存活因子后的凋亡程序一致。例如，转录因子p53的活性受一些促凋亡刺激物(stimuli)诱导，许多最重要的凋亡调节剂是p53靶向基因，如p21/WAF-1、14-3-3、Bax、Fas、DR5、PIG3和Tspl。差异显示(differentialdisplay)和基因阵列试验已经鉴定编码凋亡调节剂的转录本和由p53诱导的机制。另一个在凋亡过程中调节内皮基因表达的已知转录因子是NFκB。在健康的内皮细胞中，NFκB-激活的抗凋亡基因如TRAF-1、TRAF-2、IAP-1和IAP-2的转录对于细胞存活是关键的。当脂多糖、肿瘤坏死因子(TNF)-α和表鬼臼毒素亚乙基吡糖苷(etoposide)诱导凋亡时，内皮NFκB的活性上升。但是，由于在凋亡过程中半胱天冬酶(caspase)介导的xIAP裂解可能降低NFκB活性，而且NFκB能够促进保护性基因和促炎基因在内皮细胞中表达，因此NFκB在内皮细胞凋亡中所起的作用是复杂的。其他转录因子如E2F和Myc家族也在去除存活因子诱导的内皮细胞的凋亡中起作用。
【发明内容】
内皮细胞的特化(specialized)性质及其受VEGF-A调控对于生存是重要的。其特化部分取决于上述的翻译后信号化级联的内皮特异性组合。但是，这最终取决于独特的RNA转录本群体，即内皮细胞转录组(transcriptome)及其调控。
为了对此进行研究，我们分析了大量不同序列(context)的基因表达。首先，结合Affymetrix基因阵列表达数据和SAGE数据来鉴定在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中丰度最大的转录本。其次，比较HUVEC和其他细胞/组织类型中的相对转录本丰度来鉴定内皮细胞特异的转录本。
在两组附加试验中，我们采用Affymetrix阵列杂交来鉴定转录本丰度的变化，该变化发生在去除血清后由VEGF-A诱导HUVEC存活和扩增时或者加入VEGF刺激一般培养基中的HUVEC时。在本试验中，发现来自不同个体的原代内皮细胞培养物具有真正的转录组异质性。基于这种发现，我们认为采用单一的、特应性(idiosyncratic)的原代细胞培养物的基因组试验可能是误导的。
总之，在本发明中，我们采用新的方法学来鉴定其转录本水平应VEGF-A反应被改进的内皮细胞中的基因。
虽然在现有技术中，其他研究人员已经鉴定出了其活性相应于该因子来改进的各种基因，但是本发明人采用的方法学在一些显著方面是不同的。它包括使用原代细胞培养物；采用五个独立的样本，以及在加入VEGF-A前进行血清饥饿。后一步骤特别地用于在一部分细胞中启动凋亡，模拟期望的情形，例如治疗肿瘤引起肿瘤退化。加入VEGF-A引起细胞转录本水平的调整。采用严格的统计标准，我们鉴定了转录本水平在加入VEGF-A后4小时和24小时被显著调整的基因。令人惊奇的是，在这两个时间点，在4小时时鉴定的转录本和在24小时时鉴定的转录本仅有两个相同。
我们也去除血清48h来使HUVEC细胞应激(stress。确定明显和可重复的变化，是内皮细胞命运受到威胁时发生的全面和特异变化的最好指示。
因此，本发明提供一种方法来分析内皮细胞的命运，该法以有用的新方式来监控大量疾病状态。大量如这些已知基因的和来自ESTs的转录本的信息，提供新的分析(assay)靶点，并可开发疾病的新疗法。
虽然不希望被任何理论约束，一般认为在处理后4小时时被显著调节的转录本是对VEGF直接反应的基因，而在24小时时，转录本谱除了包括反映VEGF-A直接作用的基因外，还包括反映存活或稳态功能的基因。
除了不同的暂时转录本谱，我们发现个体的异质性是非常显著的。因此，发现一个个体中应VEGF可能被上调和下调的数个基因，在其他个体不被持续调节。通过排除这种变化，可能提供一组基因，它们一般被认为特别是相互结合时，用于在人类患者中检测对VEGF的真正反应。
而且，在血清饥饿细胞和非血清饥饿细胞中VEGF诱导表达谱不同，表明人体中细胞对VEGF反应的不同取决于其位置和性质。例如，雌性生殖道中的细胞或进行放射治疗或其他治疗的实体瘤细胞具有对VEGF的反应谱与血清饥饿细胞类似，而机体其他部位的细胞的反应方式可能与非血清饥饿细胞更类似。
在许多临床条件下，血管发生是临床结果的显著标记，无论是理想的与否。把凋亡作为发病的显著特征或者甚至是关键特征的状况，包括实体瘤如神经胶质瘤、风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病、SLE、脑卒中、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s)、痴呆、高血压、子宫内膜异位、子宫异常出血、卵巢超刺激综合症、肺炎、视网膜病、斑点恶化、不育、排卵、外周血管病、外周神经病、动脉粥样硬化、血管炎、肾小球肾炎、败血病、败血性休克、惊厥前期(pre-eclampsia)和子宫内生长阻滞。
因此，持续需要开发可靠和有效的方法来诊断和预后人的医疗状况，包括VEGF-A相关状况、特别是血管发生和血管生成，包括上面和本文他处描述的状况。
在本领域仍然还持续需要鉴定治疗性干扰此类疾病的新靶点。此外，需要鉴定具有抗这些靶点活性的治疗剂。而且，采用抗这些靶点的这些试剂在治疗和诊断这些疾病中是有价值的。
在第一个方面，本发明提供一种监控人类患者中与血管发生或血管生成相关的疾病状态发展的方法，所述方法包括：
定量测定在从所述疾病的部位中得到的细胞样本中至少一种表1所示基因的转录本水平；和
比较所述测定的转录本水平与至少一个得自对照细胞样本的基因的转录本水平。
优选地，所述细胞样本是内皮细胞。
在另一个方面，本发明提供一种适合用于上述发明方法的基因芯片阵列，包含至少一种适合检测至少一种表1所示基因的核酸；可选一个特异于所述至少一种基因的对照；并可选所述基因芯片的至少一个对照。
在另一方面，本发明提供血管发生或血管形成的调节剂的分析方法，其中所述方法包括：
(a)提供一种由选自表1的基因编码的蛋白质；
(b)将所述蛋白质与其活性的候选调节剂接触；和
(c)确定所述候选调节剂是否能够调节所述蛋白质的活性；
或者其中所述方法包括：
(a)提供一种培养的内皮细胞；
(b)将所述细胞与血管发生的候选调节剂接触；和
(c)确定所述候选调节剂是否能够调节至少一个选自表1的基因的转录本水平。
通过这种方法获得的调节剂可被用于调节人类患者中血管发生或血管生成的方法。
在另一个方面，确定ESTs可以开发用于治疗性干涉的新的潜在靶点。因此，本发明提供一种包含来自表1的EST序列的载体，所述EST序列可操作地连接到转录所述序列的启动子上。在血管发生或血管生成的基因分析中，这种载体可用于表达由ESTs编码的蛋白质，其本身具有直接的治疗用途，如作为重组蛋白或在基因治疗应用中。
在另一个方面，本发明提供一种监控患者对治疗与血管发生或血管生成相关状态的反应的方法，该方法包括提供一种来自所述患者的组织样本，在体外将所述样本与VEGF接触，和测定表1中的一个或多个转录本的表达。优选地，该表达与用VEGF处理前的样本中的转录本的表达比较。在一个方面，检测表1a、1b或1f的一个或多个转录本的表达。在本发明的这个方面，其中表达变化最大的转录本是表1a或1b的，这表明这些细胞处于类似于血清饥饿的状态。这预示着一种疾病状态，或者例如在治疗肿瘤的情况下，指示对抗血管发生的治疗性处理的反应。我们发现表1f的转录本的表达变化最大，这指示细胞不被应激，从而表示肿瘤组织或健康组织对治疗不反应，这视情况而定。
附图简述
图1a-d表示在去除血清后用VEGF-A处理的细胞中的凋亡和细胞数量。
图2a和b表示在4和24小时时，细胞中的基因转录本水平。
图3表示3个基因的转录本水平的变化。
图4表示由SAGE确定的大量转录本也在基因芯片上被确定。
附表简述
表1a列举其水平在用VEGF-A处理后4小时的内皮细胞中被调节的转录本。
表1b列举其水平在用VEGF-A处理后24小时的内皮细胞中被调节的转录本。
表1c列举其水平在去除血清处理后48h的内皮细胞中被调节的EST转录本。
表1d列举已经被特性描述的转录本，其水平在去除血清处理后48h的内皮细胞中被调节。
表1e列举其他转录本，其水平在去除血清处理后48h的内皮细胞中被调节。
表1f列举其水平在添加血清的培养基中培养的细胞中受VEGF调节的转录本。
表2列举大在内皮细胞中丰度大的转录本。
表3列举在HUVEC内皮细胞中的表达水平高于子宫内膜组织或B淋巴细胞系Raji的转录本。
【具体实施方式】
表1
本文提及的表1应当被理解为指表1a、1b、1c、1d、1e和1f的任何之一，除非上下文明确仅指表1的这些组成部分之一(或两个或三个，视情况而定)。
监控疾病发展的方法
在本发明中，应当理解，确定“得自患者的疾病部位”的细胞是指在从机体取出的样本中实施的体外方法。取出机体的样本，如活体解剖，不是本发明的一部分。
如上所述，用于鉴定表1的基因的特定方法是一种监控与血管发生或血管生成相关的疾病状态发展的有效手段。本发明得到的数据表明一些基因对VEGF-A反应时被上调，而其他在导致内皮细胞凋亡的条件下被上调。因此，在治疗与不期望的血管发生相关的疾病中，临床医生将寻求一种反应，其中前一类基因表现出转录本水平下降，而后者表现出转录本水平升高。
在治疗患者过程中，可以上调或下调所确定的基因，以调整治疗效力。例如，许多癌症治疗依赖于不同抗癌剂的混合物(cocktail)。任何一种特定混合物的效力在不同患者或者在患者细胞对一种或多种药物产生抗性的治疗过程中是不同的。
在本发明的这个方面，对得自较早时间点，如在治疗之前或治疗过程之间，的患者疾病部位的转录本水平进行比较。可选地，可对所述患者的未患病组织中的细胞转录本水平进行比较。另一种选择是提供对照基线样本或来自另一个患者的病历记录(historical record)，或更加优选地，来自患者群体的病历记录。优选地，所述对照细胞是内皮细胞。
在一个优选方面，本发明通过参照大量基因的转录本谱来实施。这是由于本发明人发现在个体患者中，个体基因的转录本水平是变化的。例如，在表1a可见，患者2-5中细胞周期蛋白D1的转录本水平上升了约1.5-2倍，而在患者1中转录本水平几乎没有升高。因此，期望对几个基因的转录本水平进行评估。例如，被评估的基因包括至少一个转录调节剂；至少一个凋亡调节剂，至少一个生长因子或生长因子受体，和至少一个粘着/基质蛋白。
一般地，测定至少5个、优选至少10个和更优选至少20个基因的转录本水平。
优选地，表1a或者表1的其他部分的一种或多种的转录本水平被确定。
可以通过任何合适的方法测定一个或多个基因的转录本水平。当检测许多不同的基因转录本，一种方便的方法是将所述样本(直接地或在生成cRNA或cDNA后)杂交到基因芯片阵列上。
当采用基因芯片技术时，所述基因(在此所用的该术语包括表1的ESTs)都存在于可从Affymetrix购买得到的芯片上，这些芯片按照生产商提供的操作使用。一般地，提供微阵列的方法及其用途还可见，如WO84/01031、WO88/1058、WO89/01157、WO93/8472、WO95/18376、WO95/18377、WO95/24649和EP-A-0373203，还可以参考这些以及本领域的其他文献。
表1提供了基因的名称，可以用此从数据库如Genbank中获得其DNA序列。此外，我们所用的Affymetrix芯片上使用的特定序列可以通过表格中提供的Affymetrix参考号来确定，它们是公众可以获得的并可能与Genbank参考号直接相关。所述EST基因序列也由Genbank参考号给出。本领域技术人员在实施本发明时可以查阅Genbank参考号的任一Affymetrix参考号。
可选地，或另外可以采用定量PCR方法，例如基于本领域被广泛地使用的ABI TaqManTM技术。其描述见大量现有技术出版物，例如，可以参考WO00/05409。PCR方法需要靶向目标基因的相对双链的引物对，它之间相隔适宜的长度(通常50-300个碱基)。所述引物的适宜靶向序列如上述可以参照Genbank序列来确定。
本发明的特别应用涉及与不期望的细胞增殖相关的疾病的治疗和预后，所述疾病特别是实体瘤，包括神经胶质瘤和肉瘤。这些状况的发展依赖于血管发生，因此阻断血管发生或阻止血管维持的治疗是理想的。
此外，一些与血管系统缺乏相关的疾病状态，如心血管疾病或其他状态参照本文上述的状态。本发明可以监控这些状态并评价治疗方案的效率。
基因芯片
虽然现有技术提供一种基因芯片，它包括表1a、1b、1c、1d、1e和1f中的一个或多个的基因作为庞大的阵列的部分。鉴定在本发明中用于诊断和预后的相对小的一组基因，可以产生特别被设计适合用于本发明的小芯片。
因此，本发明提供基因芯片阵列，它包括适合于检测表1所示的至少一种基因的至少一种核酸；并可选，对所述至少一种基因特异的对照；并可选所述基因芯片的至少一个对照。理想地，阵列中的序列数量如下：其中适合检测表1转录本的核酸数量为n，对个体转录本特异的对照核酸数量为n’，其中n’为从0到2n，和所述基因芯片上的对照核酸的数量(如用于确定“看家”转录本，大量内皮细胞转录本(如表2中的那些)，在内皮细胞中表达水平较高的转录本(如表3中的那些)等)为m，其中m是从0到100，优选从1到30，因此n+n’+m代表了所述芯片上核酸的至少50％，优选70％和更优选至少90％。
分析方法
本发明的分析方法可以以许多不同形式进行，如在蛋白质或核酸成分或在全部培养细胞中进行。
一种分析包括：
(a)提供由表1的转录本编码的一种蛋白质；
(b)将所述蛋白质与其活性的候选调节剂接触；和
(c)确定所述候选调节剂是否能够调节所述蛋白质的活性。
在这种分析方法中，确定活性的调节将依赖于被分析蛋白质的性质。例如，在所述酶的底物存在的情况下分析具有酶促功能的蛋白质，因此存在能够调节活性的调节剂导致底物的周转更快或更慢。所述底物可以是该酶的天然底物或合成类似物。在任何一种情况下，所述底物可用可检测的标志标记来监控其转化为最终产物。
对于具有配体结合功能的蛋白质，如受体，以能够拮抗或激动所述配体结合性质的方式来检测所述候选调节剂的配体结合功能。
对于具有DNA结合活性的蛋白质，可测定这种转录调节剂的DNA结合或转录激活活性，其中调节剂能够或增强或降低这种活性。例如，可以在迁移率变动分析中测定DNA结合。可选地，将所述蛋白质结合的DNA区域可以可操作地连接到一个报道基因上(此外，如果需要，在所述DNA区域和报道基因之间有启动子区和/或转录起始区)，从而确定所述基因的转录，并在该转录的调节发生时，可以看到此调节。适宜的报道基因包括例如氯霉素乙酰转移酶，或更优选，荧光报道基因如绿色荧光蛋白。
候选的调节剂化合物可以是用于药物筛选程序的天然的或合成的化学物质。也可以使用植物、微生物或其他生物体的提取物，其含有确定的或未确定的成分。组合文库技术(包括固相合成和平行合成方法)提供有效途经来检测大量潜在的不同物质的调节相互作用的能力。这种文库及其用途在本领域是已知的，为天然产物、小分子和肽等的所有形式。许多这种文库是可以购买得到的，被出售用于由本发明现在所针对的类型的药物筛选程序。
还有一类候选调节剂是与蛋白质靶点结合的抗体或其结合片段。
能够结合抗原或其他结合部分(partner)的示例抗体片段，是由VL、VH、Cl和CH1结构域组成的Fab片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由一个抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH组成的dAb片段；分离的CDR区域和F(ab′)片段，一个包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段。还包括单链的Fv片段。对蛋白质特异的抗体可以从表达免疫球蛋白可变区的重组制备文库中获得，如用在其表面具有功能性免疫球蛋白结合结构域的λ噬菌体或丝状噬菌体；例如参见WO92/01047。这种技术快速制备抗一种抗原的抗体，然后这些抗体可以按照本发明进行筛选。
另一类候选调节剂是基于被抑制的蛋白质序列的片段的肽。特别地，和与其他蛋白质或DNA作用的所述蛋白质的部分相对应的蛋白质片段是小分子肽的靶点，该小分子肽作为蛋白质功能的竞争性抑制剂。例如，这种肽长度在5-20个氨基酸。
这种肽还提供进行模拟设计的基础。这种模拟将基于对所述肽的分析来确定对于生物学活性来说是必需和重要的氨基酸残基或其侧链部分，之后建立药效团的模型来设计在恰当的三维关系中保留必需的残基或其部分的模拟物。本领域存在各种计算机辅助技术便于这种模拟物的设计。
可以形成(configure)基于细胞的分析方法来在转录水平或在翻译水平上确定所述基因的表达。测定转录本时，可以采用本发明上述的第一方面的方法，如基因芯片、多重PCR等来确定。
基于细胞的分析方法可以如上述用于筛选候选调节剂。还可以用于筛选其他类型的候选调节剂，包括反义寡核苷酸。这种寡核苷酸通常长12-25，如约15-20个核苷酸，它可以包括被修饰的主链结构或由其组成来稳定所述寡核苷酸，所述主链结构如甲基膦酸酯主链和硫代磷酸酯主链。所述反义寡核苷酸可来自目标基因的编码区或来自其5’或3’非翻译区。候选的分子还包括RNAi，即短的双链RNA分子，它是对基因转录特异的序列。
按照本发明获得的调节剂可用于在人类患者中调节血管发生或血管形成。一般地，所述调节剂将用一种或多种药学上可接受的载体配制，以适合所选择的给患者给药的路径。对于固体组合物，可以采用常规的无毒固体载体，包括，例如，制药级的甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬酯酸镁、糖精钠盐(sodium saccharin)、滑石粉、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。制备可药用的液体组合物的可以例如通过在载体如水、生理盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等中溶解、分散调节剂和可选择的药学佐剂，从而形成一种溶液或悬浮液。如果需要，给药的药学组合物还含有较小量的无毒辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如，醋酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。制备这种剂型的实际方法是已知的，或者对于本领域技术人员来说是显而易见的；例如，参见Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，15th Edition，1975。给药的组合物或制剂在任何情况下含有一定量的活性化合物，其量可有效减轻被治疗的患者的症状。
尽管由于内皮细胞形成所述血管的内层，将其施用到血流中(如通过静脉注射)是一种可能路径，给药路径可取决于治疗的确切状况。
载体
鉴定数个与通过VEGF调控的内皮细胞相关的ESTs提供了新的载体系统的基础，其可用于本发明上述的方面以及下文描述的其他方面。因此，用于表达由所述ESTs编码的蛋白质的表达载体构成了本发明的另一个方面。
优选地，本发明载体中的一种EST被可操作地连接到控制序列上，它能使宿主细胞表达所述编码序列，即该载体是表达载体。
术语“可操作地连接”是指一种临近，其中所述成分处于使它们以确定的方式起作用的关系中。“可操作地连接”到一条编码序列上的控制序列是以在与所述控制序列相容的条件下表达所述编码序列的方式来连接的。
适当的宿主细胞包括细菌、真核生物细胞如哺乳动物和酵母，和杆状病毒系统。在本领域可得的用于表达异质多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠(baby hamster)肾细胞、COS细胞及许多其它。
所述载体可包括其他序列如启动子或增强子来表达所插入的核酸、核酸序列，使得所述多肽作为融合蛋白和/或核酸编码分泌信号来生产，使得在宿主细胞中产生的多肽从该细胞中分泌。
所述载体可含有一个或多个选择性标记基因，例如，用于细菌质粒的氨卡青霉素抗性基因或用于哺乳动物载体的新霉素抗性基因。
所述载体还包括增强子序列，终止子片段、多聚腺苷酸化序列和其他适当的序列。
所述载体可在体外用于，例如制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。该载体还适合体内使用，如在基因疗法中使用。在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是已知的。所述载体包括基因治疗载体，如基于腺病毒、腺伴随病毒(如HIV或MLV)的载体或α病毒载体。
可选择启动子和其他表达调控信号来与设计表达载体所针对的宿主细胞相容。例如，酵母启动子包括啤酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae，S.Cerevisiae)GAL4和ADH启动子、稷酒酵母(S.pombe)nmt1和adh启动子。哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子，其被包括在对重金属如镉的反应中。还可以采用病毒启动子如SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子。所有这些启动子在本领域很容易得到。
用于基因治疗、制备由本发明的ESTs编码的多肽的载体包括含有小基因(mini-gene)序列的载体。
如上述可以转化到适宜的宿主细胞中的载体可表达本发明的多肽。因此，在另一个方面，本发明提供由本发明的ESTs所编码的多肽的制备方法，该方法包括在一定条件下培养用上述表达载体转化或转染的宿主细胞来通过此载体表达编码所述多肽的编码序列，并回收所表达的多肽。也可以采用体外系统如网状细胞溶解产物来表达多肽。
由本发明的ESTs编码的基本上为分离形式的多肽或其片段构成了本发明的另一个方面。所述多肽片段优选大小至少为20个氨基酸，优选从25个氨基酸到所述多肽的全长。
本发明的另一个方面是编码所述多肽及其片段的核酸序列。这种核酸序列可能被包括在如上述的那些载体中。
更多细节参见例如分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：aLaboratory Manual)：第二版，Sambrook等，1989，冷泉巷实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)。用于核酸处理的许多已知技术和操作，例如核酸构建体的制备，突变，测序，将DNA导入细胞和基因表达，和蛋白质分析，已经在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，JohnWiley & Sons，1992中被详细描述。
当本发明的EST序列存在于载体中时，将它按阅读框(in-frame)连接到翻译起始区域来翻译所述序列，或者可选地使它以反义方向转录反义RNA。
本发明通过如下实施例来阐明。
丰度大的内皮非线性的(biased)转录本
为了鉴定丰度最大的内皮的转录本，从5个不同个体中分离的HUVEC在其最佳培养基中被培养到第5代。从这些培养物中提取的RNA用于制备复合cRNA探针，其杂交到12,600个元件的Affymetrix基因阵列芯片上(U95-A)。归一标准化(normalize)来自五个被杂交的芯片的转录特异性信号数据(参见方法部分)来进行芯片间的直接比较，并计算五个培养物中每个转录本的中等丰度。将前0.5％的HUVEC转录本按照功能分类，列于表2中。该试验表明所述五个原代内皮培养物(来自不同个体)具有真正的转录组异质性。当五个HUVEC培养物的转录组相互比较时，所述12,600个转录本的6％-8％在丰度上差别＞1.5倍。
为了定义内皮细胞的转录组并确定其如何区别于其他细胞类型的转录组，我们比较HUVEC的转录组和B淋巴细胞系(Raji)和人子宫内膜的转录组。为了最小化上述相互分离的异质性的作用，测定每种细胞/组织类型的数个样本的中间归一标准化的转录本丰度-HUVEC，五个芯片的中间值：Raji，两种芯片的中间值；子宫内膜，两种芯片的中间值(每种代表从五名患者中收集的组织)。表现为信号在HUVEC中比子宫内膜或B淋巴细胞高10倍的转录本通过功能分类，列于表3中。在某些情况下，内皮细胞中包括PAI-1、PECAM-1、胶原酶和TSG-14的信号比B淋巴细胞或子宫内膜中高50倍以上。
VEGF-A调控内皮细胞的寿命和转录本丰度
将VEGF-A对内皮细胞生物学的作用与转录本丰度相关。VEGF-A在体内具有促存活和促有丝分裂的功能。为了在体外研究这两种功能，在低于最佳生长所需的生长因子和血清浓度下培养五个独立的HUVEC的原代分离物24小时。这降低了增殖比例，并诱导约10-16％的低凋亡发生率。为了检测VEGF-A恢复增殖和防止进一步凋亡的能力，将所述HUVEC在含有或不含10ng/mL VEGF-A165的相同培养基中再培养4小时或24小时。在这些试验结束时，计算凋亡发生率和总细胞数量，并制备总RNA。用VEGF-A培养4小时对于凋亡发生率或细胞数量没有显著影响(图1a和1b)。但是，用VEGF-A培养24小时，显著降低所有五种HUVEC培养物中的凋亡发生率(配对T-检验P＜0.05)，并提高五个HUVEC培养物中的三个的总粘着细胞数(配对T-检验P＜0.05；图1c和d)。
从这些培养物中提取的RNA被用于制备复合cRNA探针，其杂交到上述Affymetrix基因阵列上。为了确定VEGF-A处理是否会改变HUVEC中转录本丰度的整个模式，采用随机的效果-模型方差分析(ANOVA)。这表明用VEGF-A培养24小时显著地改变转录本丰度的整个模式(F＝4.8；F＞3.9表明P＜0.05)，但是用VEGF-A培养4小时不改变该模式(F＝1.3)。先前指出的原代培养物之间的异质性在本发明中也是明显的。转录本丰度的模式在用VEGF-A处理4小时试验的5个对照培养物之间(F＝7.1；F＞2.4表明P＜0.05)，以及在用VEGF-A处理24小时试验中的5个对照培养物之间(F＝9.2；F＞2.4表明P＜0.05)差别显著。由ANOVA方差组成计算表明，转录本丰度模式变化是由于用VEGF-A处理24小时，有意思的是，虽然该变化显著，但仅为五个原代培养物之间的转录组差异所导致的作用的五分之一。
对VEGF-A的异质反应
ANOVA表明五个原代培养物对VEGF-A的精确反应模式是相互区别的，这是由于用VEGF-A处理和培养物来源之间的统计学作用是显著的(在24小时试验中，F＝4.4；F＞2.4表明P＜0.05)。
除了试验“误差”外(如各个培养物的确切状态间的细微变化)，对VEGF-A的异质反应是由于HUVEC供体之间的遗传学和病史的差别。在任何两组培养物之间测定对于VEGF-A反应差别＞1.5倍的转录本的百分比。在同一个重复试验中，来自一个个体(个体3)的两小管HUVEC被解冻并培养。发现两个姐妹培养物对VEGF-A的反应模式变化比不相关的培养物对VEGF-A的反应模式变化小。
由VEGF-A调控的转录本
为了确定由VEGF-A培养4小时或24小时调控的特异性转录本，选择满足三个标准的转录本：(i)在五个对照和被处理培养物中比较转录本丰度的Baysian T-检验(CyberT算法；参见方法部分)的结果表明P＜0.05。(ii)在所述五个培养物中的至少四个的丰度全都一致地受VEGF-A调控。(iii)由于存在于至少被比较之一的培养物的转录组中，转录本被Affymetrix软件标记。采用这些标准，我们鉴定了可能受VEGF-A培养4小时调节的20个已知转录本和5个ESTs(图2a和表1a)。我们鉴定了可能受VEGF-A培养24小时调节的55个已知转录本和9个ESTs(图2b和表1b)。这些转录本的完全归一标准化丰度数据见表1a和lb。可能被VEGF-A调节的转录本编码已知调节内皮细胞寿命的不同蛋白家族的成员，以及未被特性描述的蛋白质。溶基质素-2及所述转录因子“tubby”似乎在4小时和24小时的时间点都被VEGF-A调节。一些其他转录本在4小时或24小时的时间点满足上面列出的标准，但是在另一个时间点不满足该标准。
为了确定所述Affymetrix阵列，已经正确地鉴定受VEGF-A调节的转录本，采用Affymetrix杂交分析的RNAs作为模板进行定量实时PCR(TaqMan)。同时得到所分析的三个基因(tubby、蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B和G-蛋白信号-3调节剂)的Affymetrix和实时PCR的结果。在大多数情况下，通过TaqMan测定的由VEGF诱导的转录本丰度的变化大于用Affymetrix阵列分析所测定的变化(图3)。
SAGE分析
为了确定丰度最大的内皮细胞的转录本以及它们是否受VEGF-A调节，在Affymetrix基因阵列试验的基础上增加SAGE。如上所述，用或不用VEGF-A精确地培养另一个HUVEC分离物4小时。分离信使RNA然后进行SAGE。从VEGF处理的细胞中总共测序到5380个双标记，而未处理的对照细胞中6698个双标记。由SAGE和Affymetrix分析检测的丰度最大的转录本的目录大体上是一致的。但是，由SAGE确定的0.5％丰度最大的转录本中只有5个在由相应的Affymetrix试验确定的1％丰度最大的转录本中(图4)。在相对小的SAGE试验中计数的双标记数量仅足以可靠地评价所述丰度最大HUVEC的转录本的表达。但是，与所述Affymetrix的分析一致，所述丰度最大的HUVEC转录本中只有很少通过VEGF-A培养4小时来调节。在所述SAGE试验中计数的双标记数量不足以在丰度适中的转录本的表达中检测VEGF介导的变化，如通过更加灵敏的Affymetrix分析来测定的变化。
总结
内皮细胞具有一个特化的转录组
丰度最大的HUVEC转录本包括细胞骨架元件及其调节剂、核糖体蛋白、参与糖代谢的酶、泛素系统的成员、涉及各种形式信号的蛋白质(表2)。这些丰度大的蛋白质在不同的细胞系中具有重要功能，在各处均被表达。令人感兴趣的是，该目录中还包括非整联蛋白的层粘连蛋白受体和淋巴因子(巨噬细胞移动抑制，MIF)。
在内皮细胞中比在其他细胞系中表达丰度更大的转录本可能是内皮特化性质的基础。这种转录本在培养的内皮细胞中高水平地表达，在子宫内膜中中等水平地表达(由于该组织的血管成分)和在培养的B淋巴细胞中低水平地表达。这种分析表明已知形成内皮细胞的特化结构和功能的数个转录本按照这种谱来表达(表2)。它们包括丝氨酸蛋白酶抑制剂PAI-1(调节血管愈合和动脉新内膜形成；[15])、基质金属蛋白酶-1(在血管发生中降解间质胶原蛋白；[16])、和Von Willebrand因子(作为凝血因子VIIIC的载体和调节血小板和血管壁的相互作用)。其他因子包括ERG(ETS家族的成员)和HHEX(同源框家族的成员)，作为转录因子，它们本身形成了内皮转录组的特定性质。其他按照内皮非线性模式表达的转录本编码细胞粘着分子，如整联蛋白α5和α6B，VE-钙粘着蛋白[7]和CD31。这些可能是伴随着毛细血管形态发生和跨内皮白细胞迁移的特化粘着的基础。内皮细胞特异性反应的丰度相对大的生长因子，如VEGF-C、血管生成素-2和PlGF阐明了其自分泌信号和协同作用对内皮细胞存活的重要性[17]。由这种分析鉴定的ESTs所编码的蛋白质可能具有类似的重要性，但是对于内皮细胞生物学的作用还没有被确定。
对VEGF-A的反应
由于VEGF-A促进内皮细胞的存活、增殖、迁移、形态发生成为血管并提高血管通透性，它是内皮细胞的关键生长因子。虽然已知内皮细胞对VEGF-A的反应依赖于翻译后的信号级联，但是目前特性描述极少的下游转录组的变化可能起到关键的作用。为了定义这些变化，HUVEC细胞与VEGF-A一起培养4小时和24小时。在用VEGF-A培养4小时后，极少发生任何增殖和凋亡的变化，这表明此时明显的转录本丰度变化直接对VEGF-A本身反应。在用VEGF-A培养24小时后，细胞存活和增殖已经上升。因此，此时的转录组变化反映除了VEGF-A直接作用之外的这些过程。ANOVA表明用VEGF-A培养4小时对于转录本丰度的整个模式没有显著影响。然而，鉴定出可能通过VEGF-A培养4小时来调节的少数个体转录本。暴露于VEGF-A中24小时确实显著影响了转录本丰度的整体模式。但是，由VEGF-A处理24小时所调节的整个转录组变化仍然相当小，不如来自不同个体的内皮细胞转录组之间的差别显著。由于这些试验是设计用来研究单个因子对单一细胞类型的急性作用，发现仅一小组选择的转录本的丰度特异地被VEGF-A调节可能并不令人惊奇。这些转录本中的一些在下文被讨论。
VEGF介导调控编码细胞周期调节剂的转录本可能启动HUVEC的增殖，见图1所示。例如，细胞周期蛋白D1(启动G1/S阶段转换)被上调。E2F-4(结合到RB、p107和p130来抑制增殖相关基因的表达)被下调。
见图1所示的VEGF-介导的HUVEC的存活可能通过降低编码促凋亡蛋白的转录本的丰度来启动。示踪信息素(trial)(TNF样死亡配体[18])的丰度在用VEGF-A培养4小时后下降。在本试验所分析的HUVEC中，DR-5示踪信息素受体丰度很大(第97个百分位)，而无论是否用VEGF-A处理，示踪信息素的两个抑制性诱捕受体(inhibitory decoy receptors)Dcr-1和Dcr-2仅被低水平表达。因此，示踪信息素可能以自分泌的方式提高内皮细胞凋亡的可能性，而VEGF-介导的示踪信息素转录本的丰度下降除了促进其他局部细胞如血管平滑肌细胞和白细胞存活外，可能促进内皮细胞存活。VEGF-介导的编码两种其他促凋亡蛋白质的转录本的下调也可能具有生物学意义；p75(增强TNF-RI-介导的凋亡；[19])，和DAXX(与Fas相关并激活JNK路径的促凋亡衔接蛋白；[20])。
在此描述的转录本丰度的变化可能对体内VEGF-A促进血管形态发生起作用。例如，可通过降解蛋白多糖和纤连蛋白而辅助血管发生的溶基质素-2被VEGF-A上调。可作为血管平滑肌细胞促有丝分裂原促进动脉发生的PDGF II也被上调。上调编码整联蛋白β1和α2的转录本也可能促进这一过程。VEGF-A下调VEGF受体Flt-1起先是令人惊讶的。但是，这可能通过负反馈限制VEGF刺激的新血管发生的过程和范围。受VEGF-A调节的大量转录因子可能将VEGF介导的变化特化(specify)于转录组，从而最终调节内皮特异性蛋白质组。具有特殊意义的是VEGF介导的雌激素核受体家族hERR1[21]的一个成员的下调。VEGF-A是由子宫内膜的基质细胞循环生成的。因此，由VEGF-A下调雌激素受体转录因子可以进行VEGF-A和生殖性类固醇之间的“串话(crosstalk)”，在生殖组织中精确地控制血管发生。
三组在此鉴定的转录本的调控与先前的研究不一致，但是对此似乎有理由。(i)抗凋亡分子Bcl-2和A1之前已经被确定是受VEGF调控的[22]。但是，由于它们的丰度不足以作为Affymetrix比较的可靠内含物，所以不适用于(feature in)本分析。(ii)在先前的试验中，用50ng/mL VEGF-A持续培养对人微血管内皮细胞(HMEC)的588个转录本丰度的影响甚微[23]。但是，该试验设计(研究VEGF-A刺激的长效作用)和所用的细胞类型(HMEC)可解释这种不一致。(iii)VEGF-A先前被证明在HUMEC细胞中上调Flt-1的表达[13]。在本试验中，Flt-1的表达不能通过用VEGF-A处理4小时和24小时改变，但是编码可溶性flt-1的剪接变体在24小时后被下调。在本试验系统中，VEGF-A刺激和Flt-1表达可能是互不关联的。促进VEGF介导的Flt-1表达[16]的Ets-1转录因子，通过HUMEC培养物在用VEGF-A培养之前去除血清的步骤来下调(数据未显示)。
虽然，可能本发明所鉴定的内皮特异性和VEGF调节的转录本中的某些对培养体系是特异的，同样可能的是许多通过本试验所确定的转录本丰度模式在体内发生，并且在所有内皮细胞中有重要功能。这可以通过各种试验证明，如通过在血管化胚状体中由本试验所鉴定的大量内皮特异性和VEGF调节的ESTs的表达和“敲除”，来评价它们在复合组织的内皮细胞中的作用。
对去除血清的反应
令人惊奇的是，极少SFD调节的转录本与应激所诱导的保护性反应相关。被调节的包括编码热激蛋白27(↑2.3x)、谷胱甘肽S转移酶M4(↑9.5x)和A20(↑1.8x)的转录本。大部分通常与内皮细胞应激反应相关的转录本，包括那些被转录因子NFκB、p53和HIF-1α和热激因子上调的，在本试验中不被上调-事实上，数个被下调。这可能是由于在本试验中采取延长SFD时间来最大化凋亡相关的转录积累变化。这或许已经排除了瞬时应激反应的检测。
令人惊讶的是，绝大部分SFD依赖的转录组变化似乎是直接促凋亡的，或者间接为之后的细胞凋亡作准备的。本发明人认为，这些变化构成凋亡程序的关键部分。下文将描述这些变化可能促使凋亡的一些机理。
由去除存活因子诱导的转录组变化可能促进细胞死亡
由于死亡受体LARD(DR3)被上调↑2x，而肿瘤坏死因子同源示踪信息素被上调↑2.8x，死亡受体信号可能在SFD细胞中被升高。凋亡“机制”的组分在SFD细胞中被上调，包括Caspase 10(↑1.8x)和Caspase 4(↑1.7x)。在SFD细胞中，一些编码抗凋亡蛋白的转录本被下调，包括caspase抑制剂cIAP1(MIHB；↓1.9x)和DISC相关蛋白TRAF-2(↓6.1)。
存活信号下调
数个转录组的变化似乎协同降低SFD EC对细胞外存活信号的反应能力，从而促使细胞死亡；(i)编码数个自分泌/旁分泌EC生长因子和存活因子的转录本在SFD细胞中被下调，包括VEGF-A(↓4.5x)、VEGF-C(↓4.2x)、结缔组织生长因子(↓1.8)和表皮生长因子(EGF；↓5.1x)。(ii)存活因子受体也被下调。例子包括流动诱导的内皮G蛋白偶联受体(↓4.9x)、GP130(↓5.8x)和IL1受体组分-L1(↓6.6x)。(iii)通常给EC提供依赖于粘着的存活信号的编码ECM成分的转录本也被下调。例子包括VI型胶原蛋白α2(↓3.4x)和VII型胶原蛋白α1(↓4.3x)。(iv)转导生长/存活信号的粘着分子受体被下调，包括Nr-CAM(↓5.3)。有意思的是，Nr-CAM是少数在体外血管发生过程中被上调的转录本之一。整联蛋白α2也被显著下调(↓4.1x)。但是，由于其他整联蛋白被上调(如整联蛋白α3↑2.9x)，在SFD细胞中调节整联蛋白表达的意义是不清楚的。(v)一些编码在EC中转导存活信号的细胞内信号分子的转录本被下调。例子包括：STAT2(↓3.6x)和整联蛋白相关激酶ICAP-1a(↓3.3x)。大量与G蛋白信号相关的转录本也被调节；由于Rho/Ras和G-蛋白在决定EC寿命时起关键作用，这可能特别有意义。
在凋亡培养物中调节转录因子
转录因子在控制凋亡程序中起至关重要的作用。例如NF-κB家族成员通过上调抗凋亡的内皮细胞转录本的表达来抑制凋亡。SFD后，NF-κB亚基p65在一定程度上(marginally)被上调(↑1.5x)，毫无疑问，其在EC对应激的反应中起先前所描述的作用。但是，NF-κB核定位I-kBα和I-kBε(MAD3)的抑制剂被显著上调(分别为2.8x和2.7x)-这可能在SFD细胞中拮抗NF-κB的促存活作用。编码Rel-B的转录本也被上调(↑3.5x)。Rel B，也称作为I-Rel，是NF-κB介导的转录激活的直接抑制剂。此外，NF-κB p100亚基被上调(↑4.8x)。所述p100具有I-kB样活性，含有一个致死结构域。最近它被确定为使细胞对死亡受体介导的凋亡敏感和激活Caspase 8的复合物的一个成分。NF-κB依赖的转录本如cIAP1和TRAF-2在SFD后被下调，证实了NF-κB活性在SFD细胞中被抑制的观点。转录因子JunD也被SFD上调(↑2.1x)。根据其促凋亡的同源c-Jun推导，JunD上调可能促进SFD EC的凋亡。编码转录和剪接因子的另外26个RNAs的丰度在SFD细胞中被上调≥2倍，这可能是由于本文报道的一些转录组的变化。
转录变化可能促进凋亡小体(apoptotic body)的吞噬作用
凋亡程序的最后阶段是凋亡小体被吞噬细胞吞噬。在健康的EC中检测不到趋化因子单核细胞化学引诱物蛋白(MCP-1)的RNA和蛋白质，但是它们在SFD后被显著上调。重新表达MCP-1可能增加巨噬细胞聚集(recruitment)到EC死亡区域。SFD介导的Clusterin上调(↑3.7x)也可能促进凋亡细胞的吞噬。Clusterin(载脂蛋白J)在活细胞中被凋亡碎片诱导，在邻近细胞死亡时产生含有磷脂酰丝氨酸(phospatitidylserine)的脂囊泡，一般认为是通过非专一(professional)的吞噬细胞促进凋亡小体的吸收。
有丝分裂所需信号通过去除存活因子被下调
编码细胞周期和有丝分裂调节剂的转录本的表达变化可造成去除血清的细胞的有丝分裂停滞，这是由于24个细胞周期相关的转录本在SFD后被下调≥2倍。细胞周期相关的转录本都不被上调。被下调的转录本包括：对于G1/S和G2/M阶段转换关键的(↓3.8x)的CDC2、细胞周期蛋白A(↓2.9x)、H(↓2.4x)和E2(↓3.4x)、增殖细胞核抗原(PCNA；↓3.4x)、DNA聚合酶持续合成因子(↓3.4x)和在将DNA聚合酶-α加载到染色质上时起作用的CDC45(↓3.5x)。
细胞死亡的数项其他变化与SFD过程诱导的转录本丰度的相关性更加准以评价。它们包括：血管生成素-2(血管改变的启动子；↓5.3x)、连接蛋白43(一种间隙连接成分；↓6.0x)、溶基质素II(一种金属蛋白酶；↓9.1x)和双糖链蛋白聚糖(一种胶原蛋白和TGF-结合糖蛋白；↑3.4x)。
基于本文提供的数据，本发明人认为转录组和糖组(glycome)的变化可能最后使应激细胞对存活因子耐受(refractory)，直接提高死亡信号和caspase的表达，促使细胞周期停滞，将吞噬细胞集聚在内皮损伤区域并促进吞噬过程。
ESTs
大量被确定的与本发明相关的ESTs特别可作为本发明的监控方法的标记，作为分析的靶点和作为治疗所用的可能的疗法。扩增有意义的ESTs并列于在附随的序列表中。可确定所述ESTs的开放阅读框，这些开放阅读框和ESTs或其片段可用于本发明。其他有意义的ESTs包括：
AI223047是1.1kb的转录本，与NADH脱氢酶(泛醌)1α亚复合物具有同源性，与其383bp的序列的同源性高。
AI813532是3.7kb的转录本，与TNF-R2的A链和R链具有同源性(与其长度为1.3kb具有极其高的同源性)，与TNF-R超家族同源。
AL050021是3.1kb的转录本，与sco-spondin-粘液素样蛋白同源，与潜在的(M.musculus的)TGF-结合蛋白具有一定同源性。
AB020649是3.9kb的转录本，其序列的305bp与一PH结构域同源，其序列的365bp与RUN结构域的同源性极高。
AL049701是648bp的转录本，编码假设蛋白质(hypothetical protein)，还与克隆MGC：20057相关。
AI885381(710bp)是另一个与克隆MGC2650相关的假设蛋白质。
AI214965(4.4kb)与A链、C-末端Wd40的晶体结构具有蛋白质同源性，与KIAA1006的mRNA同源。
AA492299(5.6kb)与RAP1、GTPase激活蛋白1相似，与其638bp长度具有极高同源性。
AA631972(896bp)与天然杀伤转录本4、A链同源，与其558bp长度具有极高同源性。
D13633(2.6kb)与KIAA0008基因产物相关。
AI720438(925bp)类似于小的可诱导的细胞因子亚家族A，与人趋化因子Hcc-2的溶液结构和链A、人Mip-1α的Nmr结构具有蛋白质结构域同源性。
M20812(770bp)与Ig kappa链具有同源性，与链L、与亲合成熟抗体复合的VEGF和链J、与中和抗体复合的VEGF具有蛋白质结构域同源性，与人kappa-免疫球蛋白种系假基因具有单基因同源性(unigene homology)。
AI985964(487bp)与(肠道的)三叶草因子3同源，与A链具有蛋白质结构域同源性。
S73591(2.7kb)与被1，25-二羟基维生素D-3上调的蛋白质同源。
AI912041(723bp)与10KD热激蛋白1类似，与热激蛋白1的A链具有蛋白质结构域特异性。
U41635(2.7kb)是从骨肉瘤中扩增的蛋白质，与人鸟苷酸结合蛋白-1的A链具有蛋白质结构域同源性。它还与人OS-9前mRNA具有单基因同源性。
U79259(1.7kb)类似于调理素(trophin)-1-人蛋白质。
AI760932(805bp)与前列腺素D2合成酶类似，与人嗜中性粒细胞的晶体结构、B链具有蛋白质结构域同源性。
X66436(1.9kb)与未知功能的人GTP-结合蛋白样GTPase同源。
AB014538(5.1kb)与重酶解肌球蛋白(heavy meromysin)的cryo-Em结构、S链同源。
AF052106(4.2kb)与假设蛋白MGC 4614同源。
Y09022(1.4kb)类似非样蛋白质(not-like protein)和与黑色素蛋白的A链具有蛋白质结构域同源性。
D80008(3.3kb)与KIAA0186同源。
AI743606(1.9KB)与ras-相关蛋白同源，与sec4-鸟苷-5′的晶体结构/A链具有蛋白质结构域同源性。
AA663800(1.4kb)是一种假设蛋白质。
原代培养物之间的异质性
本试验中一个有意义的发现是来自不同个体的原代内皮培养物具有真正的转录组异质性。所述异质性部分由于所述培养物所源自的个体之间的遗传的和病史的差异。事实上，相同个体细胞的重复(duplicate)培养物对VEGF-A的反应差异小于来自不同个体的培养物的反应差异支持了这种观点。根据对冠状动脉[26]和对外周血管疾病[27]的治疗，对VEGF-A反应的相似差异也可能发生在用VEGF-A处理的个别患者中。由于相同个体细胞的重复培养物仍然具有一些转录组的差异，转录组异质性的其他部分必须存在的，如培养条件的细微变化。因此，从采用单一的、可能是特殊的原代细胞培养物的基因组试验中获得结论是极其轻率的。
转录本丰度数据的解析
目前，Affymetrix表达数据有时被接受，而不通过另一种技术进一步验证[28]。但是，为了确保本发明的数据是可靠的，采用SAGE来证实一大组高表达的转录本的相对丰度，采用定量实时PCR来证实三个转录本被VEGF调节。本发明人认为Affymetrix表达数据的可靠性极大地依赖于严格的质量控制和对原始数据的仔细的全面和局部的归一标准化，如在方法部分中所描述。由于大量转录本通过Affymetrix阵列验证(interrogate)，可以预料到一些“假阳性”的转录本丰度的变化意外地共同存在于所有5个VEGF处理的培养物中。这是所有大规模基因组试验中的共同问题。可以根据被观察的基因数量采用如Bonferroni修正的技术来提高显著性所需的P-值，采用如“微阵列的显著性分析”(Significance Analysis of Microarrays)[29]的方法来评估假发现率。但是，减少“假阳性”转录本丰度变化的最有效方法是采用多个独立样本，如本发明所用。
总结
本发明已经确定受VEGF-A调节的转录本丰度(转录组)的特化的内皮细胞特异性模式。该独特的转录组可能造成(underlie)这些细胞的特化结构，及其在健康和疾病状态在体内起的独特作用。本试验所鉴定的内皮特化的和VEGF调节的转录本可分析引起受VEGF调节的复杂过程(包括内皮细胞存活、组织侵入及与其他类型细胞互相作用)的翻译前事件(pre-translational events)。还给治疗血管发生依赖性疾病如癌症、子宫内膜异位和动脉硬化提供新的靶点。本试验还提出一个警示。本发明人证明令人惊讶的是从不同患者中分离的原代内皮细胞的转录组是异质的。可能其他细胞类型的情况也一样。因此，本发明人认为在单一的(可能是特应的)原代细胞培养物上进行的试验可能是误导的。
材料与方法
用于基因阵列试验的细胞培养和RNA分离
如所述用胶原酶消化从脐带中分离HUVEC[30]。在培养到第2代后，数瓶各种HUVEC分离物被冷冻备用。解冻后，在具有5％CO2的湿润空气中将HUVEC培养到第5代，采用添加了含有肝素、氢化可的松、EGF、FGF、2％胎牛血清、庆大霉素和两性霉素的特定混合物的专门培养基(大容器(large vessel)内皮细胞培养基；TCS，Botolph，UK)。一旦到了第5代，在含或不含10ng/mL人VEGF165(R&D systems，Abingdon，UK)的情况下，在仅添加了2％木炭剥离(stripped)的FCS(Gibco/BRL UK)的基础培养基中培养HUVEC以部分地去除生长因子。每份HUVEC培养物采用相同的汇合和相同批次的培养基、血清和VEGF-A。采用Trizol(Gibco/BRL UK)，接着通过RNeasy柱(Qiagen，UK)和乙醇沉淀来制备总RNA。用Agilent 2100生物分析仪来评估RNA的完整性和浓度。
评估凋亡和细胞数
用于基因阵列分析的HUVEC分离物同时在48孔平板上采用上述条件进行培养。使用落射荧光体视反相显微镜(epifluorescent relief-phase contrastmicroscope)(Olympus，UK)计数8个重复孔中的总细胞和凋亡粘着细胞。凋亡细胞定义为排除(exclude)了台盼蓝(0.2％；Sigma UK)和碘化丙锭(20μg/mL；Sigma)的细胞，但用被膜连蛋白V标记的细胞(膜连蛋白V-荧光染色试剂盒，按照生产商的说明书使用；Roche UK)和表现凋亡的形态特征的细胞。
Affymetrix寡核苷酸基因阵列
制备生物素标记的cRNA复合探针，按照Affymetrix方案(Affymetrix，High Wycombe，UK)杂交到Affymetrix人“U95A”基因芯片上。用AffymetrixMicroarray Suite(4.0版本)和dChip[31]软件评价来自所有芯片的表达数据的质量。去除不能通过这些质量控制测试的芯片的数据。转录本丰度数据(“平均差”)全部用来使各个芯片(除了对照基因)的基因表达中值以1为尺度。然后需要更小级的局部尺度(scaling)来使所有芯片上的每个表达水平的转录本表达都可比。为了达到这个目的，基于‘NOMAD’方案使用的一种方法(http：//pevsnerlab.kennedykrieger.org/)，采用‘R’统计软件系统的‘loess’功能(http：//www.r-project.org/)。归一标准化的来自VEGF处理的和未处理的培养物的转录本丰度数据用CyberT算法(7.03版本；sliding window＝301，Bayes置信估计＝15)来比较。这种算法是不配对T-检验，通过基于数据组的其他转录本的方差的Bayesian先验的内容(prior)进行改进[32]。被选择的基因的详细Affymetrix探针组杂交数据用Filemaker Pro数据库系统检测。该系统可以根据来自Affymetrix芯片的数据(所报道的转录本丰度、各个探针组(probe set)的量度等)和已知功能形成分类。然后该系统可以在多种比较情况下(和/或/非)组合这些分类，以获得更小的数据库，接着被链接到网络数据库(如Swiss Prot，BLAST等)来收集序列和功能信息。用于进一步统计分析，在Macintosh G4计算机中使用‘R’统计软件系统和Microsoft Excel2001。
SAGF程序及计算
另一个HUVEC分离物购自TCS(Botolph Claydon，UK)，如上用或不用10ng/mL VEGF-A165培养4小时。采用稍加改进的先前描述的SAGE操作从5□g polyA+RNA制备SAGE文库[33]。捕获的cDNAs被连接到含有标记酶BsmF1(New England Biolabs)的识别位点的接头上。然后用BsmF1释放SAGE标记，使其末端钝化，并头对头连接形成双标记。通过Nla III消化从接头释放，连接(concatenate)并克隆到去磷酸化的由Sph I切开的pGEM-3Zf+上(Promega Life Sciences)，采用Applied Biosystems Prism DyeTerminator反应试剂盒，在ABI 373自动测序仪上(Applied BiosystemsWarrington UK)测序。
实时PCR
采用ABI PRISM 7700序列检测系统(TaqMan)，按照生产商的方案进行实时聚合酶链式反应。对于用于Affymetrix试验的所有RNAs，比较三个转录本与亲环蛋白(cyclophilin)。所用的引物和探针为：
(i)Tubby；
正向 5’-CCCCCCAGGGTATCACCA-3’(SEQ ID NO：4)
反向 5’-CCCCGGTCCATCCCTTT-3’(SEQ ID NO：5)
探针 FAM-5’-AAATGCCGCATCACTCGGGACAAT-3’-TAMRA(SEQID NO：6)
(ii)PTP-1B；
正向 5’-TGATCCAGACAGCCGACCA-3’(SEQ ID NO：7)
反向 5’-CCCATGATGAATTTGGCACC-3’(SEQ ID NO：8)
探针 FAM-5’-AAATGCCGCATCACTCGGGACAAT-3’-TAMRA.(SEQID NO：9)
(iii)RGS-3
正向 5’-GGCTGCTTCGACCTGGC-3’(SEQ ID NO：10)
反向 5’-AAGCGAGGGTACGAGTCCTTT-3’(SEQ ID NO：11)
探针 FAM-5’-AGAAGCGCATCTTCGGGCTCATGGT-3’-TAMRA(SEQID NO：12)
附图和附表详述
表1a和表1b通过本文描述的统计检验的候选VEGF-调节转录本以功能分类被列举。某些情况下指明了丰度的变化方向。“By-P”表示来自Bayesian T-检验的P值，用于比较5对对照和VEGF处理的培养物的转录本丰度。“探针组”表示对应于每个转录本的Affymetrix密码。完全不被VEGF-A显著调节的亲环蛋白为对照。
表1a列举了丰度最大的0.5％HUVEC转录本。丰度指来自不同个体的5个HUVEC培养物的归一标准化转录本丰度的中值(其中指定丰度位于中值的转录本的值为1)。探针组表示对应于各个转录本的Affymetrix探针组。
表1b显示受VEGF调节的候选HUVEC转录本的归一标准化的转录本丰度数据，该转录本满足本文所述的统计标准(对于每个芯片，指定丰度位于中值的转录本的值为1)。1-5表示来自用(VEGF)或不用(con)VEGF-A培养的5个个体的HUVEC。By-P表示来自Bayesian T-检验的P值，用于比较5对对照和VEGF处理培养物中的转录本丰度。探针组表示对应于各个转录本的Affymetrix探针组。
表1c和表1d表1c提供本发明的ESTs，其转录本水平在去除血清48h后被调节。因此，这些ESTs指示凋亡状态。表1d显示具有已知功能的基因也具有显著被调节的转录本水平。
表1e表1e提供在去除血清48h后被调整的其他转录本。它们如本文表1c所述来测定。
表1f表1f提供了发现用原代HUVEC的VEGF处理可调节的转录本，该HUVEC通过胶原酶消化从三个个体的脐带中分离，在5％CO2的完全湿润的空气中，在添加了含有肝素、氢化可的松、EGF、FGF、2％胎牛血清(FCS)、庆大霉素和两性霉素的特定混合物(大容器内皮细胞培养基；TCS，Botolph，UK)的基础培养基中培养到第5代。用10ng/ml VEGF 165处理细胞24小时。分析来自三个样本的数据，在所述表格的最后一列中显示平均倍数变化表达。
表2上述丰度大的转录本
表3列举了在HUVEC中的丰度至少比B淋巴细胞和子宫内膜中大10倍的转录本。Et/BL表示HUVEC中归一标准化的转录本丰度(5个芯片的中值)与人B-淋巴细胞系Raji的归一标准化丰度(2个芯片的中值)的比例。Et/Em表示HUVEC中归一标准化的转录本丰度与人子宫内膜样本中归一标准化的丰度的比例(2个芯片的中值，每个代表采集自5个个体的组织)。
图1 VEGF-A抑制凋亡并诱导原代内皮细胞的增殖。(a和b)用(黑色柱)或不用(空心柱)VEGF-A培养HUVEC 4小时。(c和d)用或不用VEGF-A培养HUVEC 24小时。(a和c)平均凋亡发生率。(b和d)平均细胞数。显示5个分别的表皮细胞分离物的结果，误差条(error bars)表示两个SD。
图2 VEGF调节的转录本。用点图来比较用(Y轴)或不用(X轴)10ng/mL VEGF-A培养的HUVEC的(归一标准化的转录本丰度)loge值。(a)VEGF-A培养4小时。(b)VEGF-A培养24小时。下标字母(Lower case letters)表示表3所列的转录本。为延及所述尺度的较低部分，可见未显示表明丰度最大的转录本。
图3定量PCR确定一组来自Affymetrix基因阵列分析的结果。显示对照与VEGF处理的HUVEC的转录本丰度之间的倍数差异。所述图代表5个培养物中的丰度中值，并与亲环蛋白的丰度相关(探针组33667_at；基本不被VEGF-A调节)。相同的RNAs用于PCR和Affymetrix分析。误差条表示平均数的标准误差。被分析的转录本是tubby(34600_s_at；在用VEGF-A处理4小时和24小时后评价丰度)，蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B(40137_at；VEGF-A处理4小时)和G-蛋白信号-3调节剂(36737_at；VEGF-A处理4小时)。
图4 SAGE确定与Affymetrix分析丰度相同的内皮细胞转录本。所述点图显示用(Y轴)或不用(X轴)10ng/mL VEGF-A处理4小时的HUVEC(归一标准化的转录本丰度)的loge值。被覆盖的白圈表示SAGE所检测的丰度最大的0.5％转录本在Affymetrix数据组(dataset)中的位置。线条标记Affymetrix数据的第99个百分位。
缩略语
基因表达的系列分析；SAGE
血管内皮生长因子；VEGF
促有丝分裂原激活蛋白激酶；MAPK
应激激活蛋白激酶；SAPK
c-jun-NH2-激酶；JNK
粘着斑(focal adhesion)激酶；FAK
人脐静脉内皮细胞；HUVEC
方差分析；ANOVA
人微血管内皮细胞；HMEC
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表1a.受VEGF-A处理4小时调节的转录本
转录本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe set
CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG
F F F F F
转录调节剂
NPW38 3.35 1.88 3.97 3.13 3.13 1.99 8.10 3.43 4.18 0.47 0.0078 34325_at
CDC25 B 3.39 1.75 4.64 3.11 5.37 3.31 3.92 3.71 2.74 0.56 0.0488 1347_at
细胞周期蛋白D1 25.74 26.59 68.59 93.88 40.58 65.21 39.56 67.10 32.86 79.94 0.0134 38418_at
HEM45 1.70 4.01 2.50 3.85 1.32 3.81 2.94 3.66 2.06 3.08 0.0195 33304_at
tubby转录因子 5.48 4.93 5.17 0.52 5.33 2.68 4.93 4.53 4.36 1.34 0.0112 34600_s_at
凋亡调节剂
示踪信息素 2.92 1.07 2.54 1.04 1.47 1.11 0.75 0.57 3.24 1.25 0.0153 1715_at
TNF受体II(p75) 6.57 2.07 3.81 2.56 4.13 2.52 5.26 3.29 5.65 4.57 0.0153 33813_at
生长因子/受体
PDGF 2(c-sis) 9.40 20.32 12.79 12.52 13.73 26.01 13.24 17.75 11.77 21.79 0.0087 1573_at
IGF-BP10 21.87 29.54 25.70 40.11 25.08 40.09 21.38 31.94 25.29 40.13 0.0198 38772_at
neuropilin-2 4.15 1.52 4.44 0.61 2.49 3.09 1.47 1.08 3.39 2.50 0.0307 33853_s_at
粘着/基质
溶基质素-2 1.16 1.39 0.52 2.80 0.87 2.25 1.51 2.94 1.13 1.81 0.0132 1006_at
杂项(Miscellaneous)
细胞角蛋白17 0.44 4.68 1.36 4.59 6.45 6.83 1.08 8.63 0.53 9.26 0.0002 34301_r_at
Pex14 2.16 0.55 1.05 0.70 2.59 0.51 3.38 1.15 1.90 0.94 0.0012 33760_at
Na，K-ATP酶β-1 5.10 8.00 7.47 17.01 10.04 12.90 8.21 16.33 12.16 15.81 0.0121 37669_s_at
Hsp70-5 32.95 46.72 26.81 35.84 38.04 44.61 30.12 58.40 35.75 62.17 0.0207 36614_at
calponin 3 9.89 9.17 8.54 12.13 9.33 13.33 10.29 17.53 8.51 16.49 0.0308 40953_at
PTP 1B 0.45 2.47 1.63 1.74 0.51 1.28 1.90 2.30 1.26 3.47 0.0344 40137_at
G-蛋白信号3调节剂 14.12 23.80 13.23 16.45 18.94 24.25 19.61 22.89 19.70 37.30 0.0366 37637_at
亲环蛋白(对照) 182.23 169.6 178.6 184.9 182.3 172.0 170.8 186.1 172.1 143.6 0.5526 33667_at
8 0 8 9 8 1 0 3 9
ESTs
EST AA883101 3.65 0.52 0.52 0.86 3.90 0.52 5.52 2.79 4.21 0.77 0.0009 39815_at
EST D80007 0.52 2.68 0.52 2.72 0.52 1.51 0.52 0.55 0.60 1.37 0.0020 34731_at
EST AF000959 38.29 39.37 73.24 40.65 37.82 26.30 48.65 34.26 53.96 22.59 0.0121 38995_at
EST AL050021 4.85 7.30 6.70 10.18 7.70 7.81 8.08 11.75 4.72 14.57 0.0174 39748_at
EST AF052172 2.43 2.95 1.32 2.39 1.02 3.00 1.41 2.43 1.13 2.40 0.0273 36747_at
表1b受VEGF-A处理24小时调节的转录本
转录本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe set
CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG
F F F F F
转录调节剂
hERR1 6.15 3.20 6.36 3.90 5.05 0.79 6.07 3.57 8.53 5.10 0.006 1487_at
原癌基因C-Myc 13.50 12.03 9.84 8.37 11.33 8.17 8.81 4.93 20.34 7.02 0.0333 1936_s_at
PBX1 3.46 2.67 2.01 1.29 2.14 1.60 2.68 0.54 9.47 2.58 0.0264 32063_at
LMO2 4.30 7.52 5.89 7.67 5.38 6.23 5.78 9.00 5.07 7.24 0.0375 32184_at
fra-1 3.29 1.96 2.97 2.43 3.23 2.15 3.90 2.90 6.77 2.75 0.0476 32271_at
Tubby 6.75 4.32 3.54 2.26 4.00 1.56 3.63 1.79 4.77 3.84 0.0442 34600_s_at
神经元PAS1 2.59 0.88 2.33 0.52 1.17 0.52 2.05 2.13 5.02 0.52 0.0055 34652_at
TFHF 15.34 10.38 9.85 9.51 11.91 9.25 10.74 8.41 24.03 9.61 0.0378 36826_at
SCML2 1.39 2.39 1.06 2.86 1.50 2.38 2.64 3.35 0.39 1.84 0.0136 38518_at
E2F-4 19.37 13.50 11.50 11.89 14.61 10.04 10.49 8.01 30.41 11.01 0.0284 38707_r_at
DRAP1 7.69 12.88 11.35 14.18 10.93 17.10 4.59 4.70 9.31 15.55 0.0454 39077_at
R kappa B 8.23 6.06 8.03 4.56 7.88 4.59 7.05 4.84 9.93 4.90 0.0174 39137_at
HOX3D 4.33 3.44 6.35 1.57 4.46 0.73 5.57 3.93 7.17 3.84 0.004 416_s_at
DNA修复
OGG1 5.85 2.88 4.62 2.22 5.57 1.45 2.68 1.98 12.01 3.92 0.0043 34146_at
凋亡调节剂
DAXX 8.46 5.76 6.38 4.15 7.30 4.65 8.56 5.87 12.71 4.93 0.0155 1754_at
生长因子
活化素β-C 2.74 2.75 3.64 1.89 3.52 0.54 2.69 1.50 8.97 2.39 0.0103 35915_at
生长/分化因子1 5.85 3.40 2.74 2.61 3.44 1.26 3.31 2.51 20.00 3.63 0.0266 887_at
粘着/基质
溶基质素-2 1.35 3.42 0.98 1.96 4.42 5.21 3.17 4.24 1.62 5.13 0.0231 1006_at
胶原蛋白C-蛋白酶- 3.39 1.11 2.57 2.32 1.72 0.52 2.77 1.25 14.18 1.73 0.0132 31609_s_at
转录本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe set
CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG
F F F F F
增强子(enh.)
整联蛋白β1 60.23 73.00 75.84 91.95 67.92 80.28 62.31 85.33 57.31 91.49 0.0027 32808_at
原胶原蛋白C-蛋白酶 5.61 2.63 5.11 4.06 7.31 3.76 8.40 6.44 17.91 3.77 0.0097 39406_at
整联蛋白α-2 1.13 3.00 4.02 5.35 4.78 7.98 1.68 2.69 0.39 2.64 0.0329 41481_at
细胞表面受体
B型白细胞介素-8受体 3.79 2.14 2.38 1.61 3.04 1.63 2.43 1.56 6.29 2.95 0.0242 1032_at
Flt-1 2.31 1.42 3.25 1.86 2.24 0.53 2.71 0.89 4.73 2.49 0.0091 1567_at
IGF-结合蛋白-3 6.05 2.39 1.51 2.20 3.74 0.79 2.43 0.66 20.70 2.19 0.0116 1586_at
LDL受体相关蛋白3 8.82 6.08 5.80 5.64 13.48 3.19 6.16 4.45 34.61 4.36 0.0061 31815_r_at
前列腺素E受体EP3 7.39 4.58 5.54 4.10 3.55 2.86 5.08 3.76 20.75 5.06 0.0314 32691_s_at
多巴胺D4受体 1.25 0.81 2.57 0.52 3.37 0.52 3.68 0.52 10.04 2.95 0.0039 35042_at
4型谷氨酸盐受体 21.16 16.08 15.46 13.10 19.03 14.34 13.94 11.84 44.46 13.91 0.0199 35485_at
白细胞唾液酸蛋白 2.67 2.09 2.29 1.98 2.51 0.53 2.67 1.73 3.87 0.55 0.0137 36798_g_at
红细胞生成素受体 18.68 14.69 11.17 8.82 12.85 6.08 11.47 9.17 68.03 10.15 0.0158 396_f_at
白三烯b4受体 2.58 5.09 2.51 4.60 2.34 2.51 2.69 3.44 0.45 4.74 0.0036 39624_at
DMBT1 6.29 4.31 2.61 2.89 4.67 1.06 4.01 2.41 9.83 3.04 0.0135 41382_at
杂项
c-Ral 16.26 23.51 20.62 22.34 27.48 34.40 22.52 30.25 18.86 32.63 0.0344 1877_g_at
RAP1 6.06 4.67 7.40 6.10 5.20 4.84 6.03 3.84 41.79 5.97 0.0365 33080_s_at
胞嘧啶脱氨酶 7.71 5.31 5.71 2.03 7.48 0.48 4.94 3.93 10.12 4.61 0.0037 1117_at
细胞色素P450 IIA 3.00 2.08 1.72 0.52 1.88 0.79 2.00 1.06 2.49 1.53 0.0345 1553_r_at
钙网蛋白 65.41 41.33 39.49 37.99 45.98 18.25 50.46 40.82 62.61 40.92 0.0061 32543_at
核糖体S6激酶 4.62 7.03 2.68 3.84 5.28 5.33 0.97 2.43 2.58 7.35 0.0334 32892_at
HGF激活剂抑制剂 6.30 0.69 2.49 0.51 1.65 2.83 3.12 1.38 16.66 2.82 0.009 33448_at
类4(like-4)-ADP-核 2.00 4.24 2.21 2.58 1.88 3.79 2.12 3.01 0.42 2.70 0.0063 33796_at
转录本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe set
CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG
F F F F F
糖基化因子
BAF170 4.32 1.08 1.48 1.18 1.79 0.52 3.43 1.97 3.60 0.68 0.0031 34690_at
细胞色素c氧化酶 5.13 7.58 5.41 7.08 5.62 9.59 5.28 7.22 4.54 7.22 0.0179 36687_at
VIIb
GlcNAcα-唾液酸转 3.35 5.25 0.64 2.55 2.14 4.23 1.53 2.86 0.39 1.99 0.006 36916_at
移酶
FEZ1-T 7.80 4.34 6.20 4.01 7.05 4.42 5.32 2.68 56.47 5.73 0.021 37744_r_at
膜协同因子蛋白 8.83 12.09 9.43 10.43 10.64 15.54 8.02 13.90 11.80 15.93 0.037 38441_s_at
溶酶体酸脂肪酶 2.56 3.35 1.01 1.80 3.11 4.80 1.90 2.88 0.40 2.12 0.0483 38745_at
胸腺特异性肽酶 3.51 1.79 2.08 1.10 2.70 2.33 2.36 1.99 13.60 1.67 0.0243 39306_at
cullin-1 2.80 3.69 2.10 4.20 3.52 4.79 3.42 3.99 1.24 3.17 0.0451 39724_s_at
Fzr1 9.15 6.04 4.11 3.20 4.34 2.29 5.29 3.02 13.43 4.60 0.0226 39855_at
MAP激酶磷酸酶4 3.85 0.61 4.02 1.43 3.19 0.71 3.95 2.35 6.80 0.55 0.0002 40186_at
磷酸二酯酶Iα 6.33 2.87 0.47 0.72 2.11 1.17 3.01 0.57 14.30 4.71 0.0331 41125_r_at
5-核苷酸酶 2.40 2.77 1.90 3.02 1.78 3.75 2.40 3.23 1.90 3.25 0.0343 738_at
亲环蛋白(对照) 86.10 73.36 83.25 90.25 76.10 73.76 93.12 80.47 77.19 61.09 0.2545 35823_at
ESTs
EST AB014574 15.22 14.04 18.63 11.71 14.77 9.60 17.09 14.29 22.85 13.53 0.039 31826_at
EST AL050065 2.91 1.44 2.58 2.03 3.13 1.12 2.25 1.17 2.85 1.48 0.0177 34112_r_at
EST AA527880 3.96 6.17 4.86 5.76 3.34 4.27 3.94 4.01 1.49 5.53 0.0438 35773_i_at
EST AB020649 0.99 2.95 1.27 3.94 1.82 4.28 2.99 4.05 0.39 4.29 0.0001 36150_at
EST AI140857 4.48 3.01 2.38 2.31 2.87 110 3.06 1.46 31.98 2.69 0.0291 37429_g_at
EST W28610 9.72 3.25 7.77 6.28 9.90 5.51 7.20 5.11 11.09 4.71 0.0054 38942_r_at
EST AB028951 1.47 2.71 2.11 3.18 2.78 4.45 2.68 3.38 0.48 2.00 0.0348 39417_at
EST AB011148 1.97 2.64 2.96 3.44 2.89 4.16 1.44 3.36 1.30 2.82 0.0406 40811_at
转录本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe set
CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG CON VEG
F F F F F
EST W26628 14.77 9.77 10.09 6.33 14.71 6.54 14.14 8.81 14.81 9.33 0.006 41514_s_at
表1c潜在受去除血清48h的处理来调节的转录本登录号Bays P探针组S/W的调节方向AI2149651.2767E-0934130_at下AA4922992.0876E-0933081_at下AI9859641.5923E-0837897_s_at下N420071.7283E-0840564_at下AA2555022.203E-0839969_at下AI9120412.2559E-0739353_at下AI2673732.7539E-0734273_at下AI6806756.2944E-0741569_at下AA7041371.6396E-0639395_at上W730462.2218E-0635467_g_at下AA1282492.2615E-0638430_at下AA5225372.8653E-0639367_at下W070337.0103E-0635261_at下H683409.3845E-0641446_f_at下AI1309101.1059E-0537050_r_at下AI1260041.2425E-0533150_at下AI7405221.812E-0538085_at下W520241.9632E-0534317_g_at上W637932.1867E-0536685_at下AI6880982.5998E-0533458_r_at下
登录号Bays P探针组S/W的调节方向AA4184372.8084E-0534246_at上AA8453493.9339E-0537348_s_at下AI2011088.4431E-0538338_at上AI7011649.31E-0537662_at下AI9283659.6083E-0538267_at下AA1953010.000109834805_at下AI8853810.0001424936529_at上R935270.0001827339594_f_at下AI4000110.0001858840257_at上AL0792830.0001936434813_at下AA1517160.0001972132720_at下AI7655330.000216834335_at下AI5394390.0002274335726_at下N505200.0002560636687_at下AI6742080.0002654940239_g_at上AI8063790.0002956639844_at下AA1941590.0003427841282_s_at上AA8835020.0003544940505_at上AA9324430.0003939741624_r_at上W520240.0004305234316_at上H169170.0004622439879_s_at上AA7463550.0004850237244_at下AA8732660.0005025836720_at下W680460.0006172935154_at上AI2003730.0007103134157_f_at下H124580.000722622090_i_at上AI2467260.0007968437046_at下AI6776890.0008730540223_r_at上
登录号Bays P探针组S/W的调节方向AA4877550.0008928238761_s_at上AL0792920.0008929239140_at下AA7689120.0010137139086_g_at下AI2225940.0010776541229_at上AA0588520.0012980540986_s_at上R923310.0014003636130_f_at下AI9717260.0015490834508_r_at上AA9055430.0015963538620_at下AI0398800.0017701537358_at下AI8034470.0019031337337_at下AI9617430.0019983838823_s_at下T752920.0020361733173_g_at下AI2012430.002065835963_at下AA9179450.0022319435991_at下AI0751810.0022745135882_at下AL1096890.0023639134673_r_at下AI8004990.0024341732112_s_at上AA8277950.0027383541340_at上AA4263640.0027990238751_i_at上AI3470880.0029243235738_at下AI8277930.0029831239516_at下AI9355510.0031712535734_at下AI3778660.0033251639870_at下AA6638000.0033267639910_at上AA0594080.0033721238676_at下AA1276240.0034558333865_at下W024900.0035682840038_at上AI0522240.0036355533016_at上
登录号Bays P探针组S/W的调节方向AA1522020.0038607432222_at下AW0077310.0038998939092_at下AI9259460.0039320635067_at下AA2032130.0040067538432_at上R878760.0041728239798_at上H974700.0052523139518_at下AA1569870.0055923139162_at下AA1494280.0057402532789_at下AL1097010.005812136948_at下AL1096820.0059576934538_at上AI8278950.006279736224_g_at上AA9269570.0069137140982_at下AI0571150.0074156140601_at下AI7204380.0074511733790_at下AA4789040.0077147534216_at下AI0955080.0079310433207_at下AA1524060.0081722839031_at上AI1274240.0085609938251_at上AA2034760.0088689540412_at下AA8777950.0092338233854_at下AA4263640.009398838752_r_at上R939810.0099644141331_at下
表1d登录号探针组同一性S/W的调节方向X078201006_at金属蛋白酶溶基质素-2下M128861105_s_atT-细胞受体激活β链mRNA下U439161321_s_at肿瘤相关膜蛋白同系物(TMP)下M311661491_at诱导型肿瘤坏死因子(TSG-14)下M127831573_atc-sis/血小板来源的生长因子2(SIS/PDGF2)上X566811612_s_at人junD上U654101721_g_atMad2(hsMAD2)下U080231786_at细胞原癌基因(c-mer)mRNA上J056141824_s_at增殖细胞核抗原(PCNA)下U011341964_g_at可溶性的血管内皮细胞生长因子受体下X170331978_at整联蛋白α-2亚基下M147522041_i_at人c-abl基因下U1225531432_g_at人IgG Fc受体hFcRn mRNA上S7359131508_at大脑表达的HHCPA78同系物上K0138331623_f_at人金属硫蛋白-I-A基因下U8155431670_s_at智人(homo sapiens)CaM激酶II同种型(isoform)mRNA下Z9874431751_f_at组蛋白H4下U3480231778_at人内在膜蛋白MP70(Cx50)基因下Y1349231830_s_at智人smoothelin mRNA下D8773531907_at智人核糖体蛋白L14的mRNA上U5642131921_at人嗅感受器(OLF3)基因下L0287032123_at人-α1VII型胶原蛋白(COL7A1)下X1704232227_at造血蛋白聚糖核心蛋白下X5684132321_at智人HLA-E上D8701232362_r_at人免疫球蛋白轻链(λ)DNA下
登录号探针组同一性S/W的调节方向X5595432395_r_at人HL23核糖体蛋白同系物的mRNA上X5294732531_at人心脏间隙连接蛋白(cardiac gap junctionprotein)的mRNA下AJ13118633230_at核基质蛋白NMP200下U8678233247_at26S蛋白酶体相关pad1同系物(POH1)下S6621333410_at整联蛋白α6B下AF05892133707_at智人细胞胞质磷脂酶A2-γ上AF05608533764_at智人GABA-B受体mRNA下M3620033780_at人突触小泡蛋白1(SYB1)下X1379433820_g_at智人乳酸脱氢酶B基因外显子1和2下J0524333833_at人非红色(nonerythroid)α-血影蛋白(SPTAN1)上AB00810933890_at智人RGS5的mRNA下AJ00101934075_at智人RNF3A的mRNA(DONG1)下Z2687634085_at智人核糖体蛋白L38的基因上U2776834272_at人RGP4下M2822534375_at编码单核细胞分泌蛋白的人JE基因上V0051134552_at编码胃泌素前体(pregastrin)的人mRNA下M1296334638_r_atI类乙醇脱氢酶(ADH1)α下X8353534747_at膜型基质金属蛋白酶下U4176634761_r_atMDC9下AB01998734878_at染色体相关多肽-C下AB01213034936_at碳酸氢钠协同运输蛋白2的SBC2 mRNA下U9433335036_at人Clq/MBL/SPA受体ClqR(p)下D6339135800_at血小板激活因子乙酰脱氢酶IBγ上D0026535818_at细胞色素c的智人mRNA下D4212335828_atESP1/CRP2的智人mRNA上L1916135934_at翻译启动因子eIF-2γ亚基下
登录号探针组同一性S/W的调节方向M7239335938_at钙依赖性磷脂结合蛋白下AF06765635995_at智人ZW10 interactor Zwint下M7270936098_at人可变剪接因子mRNA下X1627736203_at人鸟氨酸脱羧酶ODC基因下Z1217336262_at编码氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶的GNS mRNA下U7264936634_at人BTG2(BTG2)上X7894736638_at智人结缔组织生长因子mRNA下M2906536654_s_at人hnRNP A2蛋白下AF07209936753_at免疫球蛋白样转录本3蛋白质变体1下M2591536780_at人补体细胞溶解抑制剂(CLI)上Z2309036785_at智人28kDa热激蛋白的mRNA上M1926736791_g_at人原肌球蛋白mRNA上Z2472736792_at智人原肌球蛋白同种型mRNA上AF01605036836_atVEGF165下U7567936913_at人组蛋白茎-环(stem-loop)结合蛋白(SLBP)下X5961836922_at小亚基核糖核苷酸还原酶下U1695436941_at人(AF1q)mRNA下U4163536996_at人OS-9 mRNA前体上X8220937283_at智人MN1上X0482837307_at人G(i)蛋白α亚基mRNA上X0106037324_at人转铁蛋白受体mRNA下X6369237333_atDNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶下X5853637383_f_at人I型HLA的C基因座重链mRNA上U9718837558_at智人假定RNA结合蛋白KOC(koc)下U2765537637_at人RGP3 mRNA上M6903937668_at人前mRNA剪接因子SF2p32下U1679937669_s_at人Na，K-ATP酶β-1亚基mRNA上
登录号探针组同一性S/W的调节方向M2238237720_at(核编码的)线粒体基质蛋白P1下Y0790937762_at智人级数相关蛋白mRNA下X1265437927_at细胞周期基因RCC1的人mRNA下X5511038124_at人促轴突的突起(outgrowth)蛋白的mRNA上J0459938126_at双糖链蛋白聚糖上AL04965038455_at(小核核蛋白颗粒)蛋白B下AF05418338708_at智人GTP结合蛋白mRNA下X6422938992_at智人dek下AB02470439109_at智人fls353的mRNA下M3758339337_at人组蛋白(H2A.Z)下M3151639695_at人衰变加速因子mRNA下AF00036439792_at异质核核糖核蛋白R mRNA下M9485639799_at脂肪酸结合蛋白同系物(PA-FABP)下M9834339861_at智人amplaxin(EMS1)mRNA上AB00044939980_at智人VRK1的mRNA下D8455740117_at智人HsMcm6的mRNA下X1485040195_at编码组蛋白H2A.X的人H2A.X mRNA下D1276340322_at智人ST2的mRNA下X6149840362_at智人NF-κB的mRNA上U4138740490_at人Gu蛋白mRNA下AB00837540681_at成骨细胞特异性富含半胱氨酸的蛋白质下X5494240690_atCks1蛋白同系物的智人ckshs2 mRNA下L4149840886_at智人长效因子1-α1(PTI-1)mRNA下U4675140898_at人磷酸酪氨酸自由配体p62上D2980540960_at人β-1，4-半乳糖基转移酶mRNA上AF04310141072_at智人小窝蛋白-3下U3251941133_at人GAP SH3结合蛋白mRNA下
登录号探针组同一性S/W的调节方向AF02975041168_at智人tapasin (NGS-17)上X7403941169_at尿激酶血浆酶原激活剂受体下AB01338241193_at智人mRNA for DUSP6下D3212941237_at人I型HLA(HLA-A26)重链mRNA上X1703341481_at人整联蛋白α-2mRNA下X5668141483_s_at人junD上L1518941510_s_at智人线粒体HSP75 mRNA下U9573541517_g_at人SNARE蛋白Ykt6(YKT6)mRNA下M6242441700_at人凝血酶受体mRNA下AF06103441742_s_at智人FIP2上AF06103441743_i_at智人FIP2上U63717467_at破骨细胞刺激因子mRNA下U57452481_atSNF1-样蛋白激酶mRNA下M94250577_at视黄酸诱导因子(MK)上L78833605_atBRCA1，Rho7和vatI基因，完整的cds上M10321607_s_at人von Willebrand因子上U90313824_at谷胱甘肽-S-转移酶同系物mRNA下U12471867_s_at人钙结合糖蛋白-1基因下M26683875_g_at干扰素γ处理诱导的mRNA上X74794981_at智人P1-Cdc21下
表1e登录号探针组同一性S/W调节的方向AF0043271951_at血管生成素2下AF01202340843_atICAP-1a下AF01525737447_at流动诱导的内皮G-蛋白-偶联受体下AF05014539451_i_at艾杜糖-2-硫酸酯酶上AF09143335249_at细胞周期蛋白E2下AJ22372837458_atCDC45下D87673720_at热激转录因子-4上HG2855-HT21179_at热激蛋白70下L0806939118_atDNAJ下M3719732194_atCCAAT转录结合因子亚基g下M382581587_at视黄酸受体-γ上M5723037621_atGP130下M59911884_at整联蛋白α3上M651882018_at连接蛋白43下M690431461_atIkBα上M778101071_atGATA-2上M83221570_atRel-B(I-Rel)上M96233556_s_at谷胱甘肽-S转移酶M4上U117911924_at细胞周期蛋白H下U1259733784_atTRAF2下U15590528_at热激蛋白17/3下U1867136770_atSTAT2下U1893234182_at乙酰肝素硫酸盐N-脱乙酰酶N硫代转移酶下U28014195_s_atCaspase 4上
U375181715_at示踪信息素上U3754736578_atcIAP1(MIHB)下U5525837288_g_atNr-CAM下U605191326_atCaspase 10上U668381914_at细胞周期蛋白A下U835981331_s_atLARD(DR3)上U9161638276_atIkBδ上X045711542_at表皮生长因子下X1588234802_atVI型胶原蛋白α2下X5256038354_atNF-IL6下X942161934_s_atVEGF-C下Y0027240915_r_atCDC2下
表1f组(Set)登录基因信息 CP CyT 倍数变化39473_r_atW29065Cluster Incl.W29065：56g2智人cDNA/gb＝W29065/gi＝1309094/ug＝Hs.110820/len＝916 -5.0272334410_atU49260Cluster Incl.U49260：人甲羟戊酸焦磷酸盐脱羧酶(MPD)mRNA，完整cds/cds＝(7，1209)/gb＝U49260/gi＝1235681/ug＝Hs.3828/len＝1795 -4.4254881089_i_atM64936M64936/FEATURE＝/DEFINITION＝HUMRIRT智人视黄酸诱导的内源性逆转录病毒DNA -3.82429839339_atAB018335Cluster Incl.AB018335：智人KIAA0792蛋白的mRNA，完整cds/cds＝(250，2673)/gb＝AB018335/gi＝3882304/ug＝Hs.119387/len＝4074 -2.86529932794_g_atX00437Cluster Incl.X00437：人T细胞特异性蛋白mRNA/cds＝(37，975)/gb＝X00437/gi＝36748/ug＝Hs.2003/len＝1151 -2.85386340635_atAF089750Cluster Incl.AF089750：智人flotillin-1 mRNA，完整cds/cds＝(164，1447)/gb＝AF089750/gi＝3599572/ug＝Hs.179986/len＝1796 -2.84335734293_atAF004426Cluster Incl.AF004426：智人微管为基的马达(HsKIFC3)mRNA，完整cds/cds＝(0，2063)/gb＝AF004426/gi＝3249734/ug＝Hs.23131/len＝2064 -2.82103736485_atU85647Cluster Incl.U85647：智人小视神经叶同系物(SOLH)mRNA，完整cds/cds＝(363，3623)/gb＝U85647/gi＝3462350/ug＝Hs.55836/len＝4163 -2.793421
组(Set)登录基因信息 CP CyT 倍数变化41270_atAA019936Cluster Incl.AA019936：ze63h04.s1智人cDNA，3 end/clone＝IMAGE-363703/clone_end＝3 /gb＝AA019936/gi＝1483743/ug＝Hs.228131/len＝538 -2.60101635473_atZ74615Cluster Incl.Z74615：智人前-α(I)胶原蛋白mRNA/cds＝(119，4513)/gb＝Z74615/gi＝1418927/ug＝Hs.172928/len＝6728 -2.4513740274_atU48213Cluster Incl.U48213：人D-位点结合蛋白基因，启动子区和/cds＝(375，1352)/gb＝U48213/gi＝1245166/ug＝Hs.155402/len＝1626 -2.370751369_s_atM28130M28130/FEATURE＝mRNA/DEFINITION＝HUMIL8A人白细胞介素8(IL8)基因，完整cds -2.36645932625_atX15357Cluster Incl.X15357：人钠尿肽受体(ANP-A受体)mRNA/cds＝(43，3228)/gb＝X15357/gi＝28229/ug＝Hs.167382/len＝3803 -2.33908836193_atU52522Cluster Incl.U52522：人arfaptin 2，ADP-核糖基化因子的假定靶点蛋白，mRNA，完整cds/cds＝(67，1092)/gb＝U52522/gi＝1279762/ug＝Hs.75139/len＝1654 -2.334116349_g_atD14678D14678/FEATURE＝/DEFINITION＝HUMMHCB人驱动蛋白相关蛋白的mRNA，部分cds -2.32726338845_atR89044Cluster Incl.R89044：ym99b08.s1智人cDNA，3 end/clone＝IMAGE-167031/clone_end＝3 /gb＝R89044/gi＝953871/ug＝Hs.92261/len＝477 -2.32026741074_atAF062006Cluster Incl.AF062006：智人孤儿G蛋白-偶联受体HG38 mRNA，完整cds -2.306947
组(Set)登录基因信息 CP CyT 倍数变化/cds＝(48，2771)/gb＝AF062006/gi＝3366801/ug＝Hs.98384/len＝2880408_atX54489X54489/FEATURE＝mRNA/DEFINITION＝HSMGSAG人黑素瘤生长刺激活性(MGSA)基因 -2.23003736530_g_atAI885381Cluster Incl.AI885381：wl93b01.x1智人cDNA，3 end/clone＝IMAGE-2432425/clone_end＝3 /gb＝AI885381 /gi＝5590545/ug＝Hs.61273/len＝668 -2.2027736727_atM64936Cluster Incl.M64936：智人视黄酸诱导的内源性逆转录病毒DNA/cds＝未知/gb＝M64936/gi＝337422/ug＝Hs.55322/len＝3307 -2.1119438524_atU49184Cluster Incl.U49184：人occludin mRNA，完整cds/cds＝(167，1735)/gb＝U49184/gi＝1276978/ug＝Hs.171952/len＝2369 -2.09740841711_atAB019694Cluster Incl.AB019694：智人硫氧还蛋白还原酶IIαmRNA，部分cds/cds＝(0，1574)/gb＝AB019694 /gi＝4827176/ug＝Hs.12971/len＝1931 -2.08615432964_atX81479Cluster Incl.X81479：智人EMR1激素受体mRNA/cds＝(38，2698)/gb＝X81479/gi＝784993/ug＝Hs.2375/len＝3118 -2.000737898_r_atAI985964ClusterIncl.AI985964：wr79d08.x1智人cDNA，3 end/clone＝IMAGE-2493903/clone_end＝3 /gb＝AI985964/gi＝5813241/ug＝Hs.82961/len＝487 2.05124139544_atAB002351ClusterIncl.AB002351：人KIAA0353基因的mRNA，部分cds/cds＝(0，4125)/gb＝AB002351/gi＝2224646/ug＝Hs.10587/len＝6651 2.066011
组(Set)登录基因信息 CP CyT 倍数变化538_atS53911S53911/FEATURE＝/DEFINITION＝S53911 CD34＝在淋巴造血祖细胞中表达的糖蛋白{可选剪接，平端形式}[人，UT7，mRNA，2657 nt] 2.09939538747_atM81945Cluster Incl.M81945：人CD34基因，启动子和/cds＝(258，1415)/gb＝M81945/gi＝409018/ug＝Hs.85289/len＝2616 2.13363431834_r_atAB020644Cluster Incl.AB020644：智人KIAA083 7蛋白的mRNA，部分cds/cds＝(0，2237)/gb＝AB020644/gi＝4240162/ug＝Hs.14945/len＝4868 2.16882634235_atAB018301Cluster Incl.AB018301：智人KIAA0758蛋白的mRNA，部分cds/cds＝(0，2961)/gb＝AB018301/gi＝3882236/ug＝Hs.22039/len＝4353 2.18564437187_atM36820ClusterIncl.M36820：人细胞因子(GRO-beta)mRNA，完整cds/cds＝(74，397)/gb＝M36820/gi＝183628/ug＝Hs.75765/len＝1110 2.250091753_atD86425D86425/FEATURE＝/DEFINITION＝D86425智人骨巢蛋白(osteonidogen)的mRNA，完整cds 2.255818599_atM60721M60721 /FEATURE＝mRNA/DEFINITION＝HUMHB24人同源异型框基因，完整cds 2.28338533358_atW29087Cluster Incl.W29087：56b8智人的cDNA/gb＝W29087/gi＝1309053/ug＝Hs.21894/len＝877 2.30630539039_s_atAI557497ClusterIncl.AI557497：Pt2.1_16_A04.r智人的cDNA，3 end/clone_end＝3/gb＝AI557497/gi＝4489860/ug＝Hs.11498/len＝862 2.314698
组(Set)登录基因信息 CP CyT 倍数变化34262_atY15909Cluster Incl.Y15909：智人dia-156蛋白的mRNA/cds＝(350，3655)/gb＝Y15909/gi＝3171905/ug＝Hs.226483/len＝9347 2.38765537539_atAB023176Cluster Incl.AB023176：智人KIAA0959蛋白的mRNA，部分cds/cds＝(0，2463)/gb＝AB023176/gi＝4589561/ug＝Hs.79219/len＝4703 2.38829137872_atAF072468Cluster Incl.AF072468：智人(JH8)mRNA，部分cds/cds＝(0，1251)/gb＝AF072468/gi＝3435202/ug＝Hs.142296/len＝1700 2.41162334495_r_atAJ011733Cluster Incl.AJ011733：智人synaqtogyrin 4蛋白的mRNA/cds＝(109，813)/gb＝AJ011733/gi＝4128018/ug＝Hs.120857/len＝872 2.66596737013_atX16295Cluster Incl.X16295：人血管紧缩素I转化酶(ACE)mRNA/cds＝(28，2226)/gb＝X16295/gi＝28264/ug＝Hs.76368/len＝2477 2.66661834832_s_atAB018306Cluster Incl.AB018306：智人KIAA0763蛋白的mRNA，完整cds/cds＝(106，2631)/gb＝AB018306/gi＝3882246/ug＝Hs.4764/len＝4148 2.76050340352_atAF060862Cluster Incl.AF060862：智人未知mRNA/cds＝(84，443)/gb＝AF060862/gi＝3094013/ug＝Hs.71791/len＝711 2.85227932168_s_atU85267Cluster Incl.U85267：智人唐氏先天愚症候选区1(DSCR1)基因，可选的外显子1，完整cds/cds＝(84，677)/gb＝U85267/gi＝2612867/ug＝Hs.184222/len＝2272 2.86983933534_atX89426Cluster Incl.X89426：智人ESM-1蛋白的mRNA/cds＝(55，609)/gb＝X89426/gi＝1150418 3.296108
组(Set)登录基因信息 CP CyT 倍数变化/ug＝Hs.41716/len＝200634598_atX98085Cluster Incl.X98085：智人肌腱蛋白-R的mRNA/cds＝(117，4193)/gb＝X98085/gi＝1617315/ug＝Hs.54433/len＝4738 3.64782933803_atJ02973Cluster Incl.J02973：人凝血调节蛋白基因，完整cds/cds＝(541，2268)/gb＝J02973/gi＝339658/ug＝Hs.2030/len＝4050 3.75715637710_atL08895Cluster Incl.L08895：智人MADS/MEF2-家族转录因子(MEF2C)mRNA，完整cds/cds＝(401，1822)/gb＝L08895/gi＝292289/ug＝Hs.78995/len＝4077 3.96591331740_s_atAB008913Cluster Incl.AB008913：智人Pax-4的mRNA，完整cds/cds＝(0，1052)/gb＝AB008913/gi＝2809074/ug＝Hs.129706/len＝1088 4.28278240223_r_atAI677689Cluster Incl.AI677689：wd33c06.x1智人的cDNA，3 end/clone＝IMAGE-2329930/clone_end＝3 /gb＝AI677689/gi＝488787 1/ug＝Hs.153121/len＝478 6.492528
表2丰度大的内皮细胞转录本
转录本 丰度 探针组
G-蛋白信号
G-蛋白α亚基S 85.8 37449 i at
RACK1 122.6 34608_at
糖代谢
醛缩酶A 91.8 32336_at
磷酸甘油酸变位酶1 87.2 41221_at
GAPDH 138.3 M33197_3_at
细胞骨架
β-微管蛋白 107.4 151_s_at
胸腺素β-4 119.7 31557_at
肌球蛋白轻链 87.8 33994_g_at
波形蛋白 132.4 34091_s_at
γ肌动蛋白1 117.5 34160_at
β-肌动蛋白 164.6 X00351_M_at
核糖体蛋白
核糖体蛋白S3A 83.8 1653_at
核糖体蛋白L10 118.8 2016_s_at
核糖体蛋白S19 93.5 31330_at
核糖体蛋白L28 100.9 31385_at
核糖体蛋白L8 99.9 31505_at
核糖体蛋白S2 125.2 31527_at
核糖体蛋白S18 97.3 31545_at
核糖体蛋白S10 83.6 31568_at
核糖体蛋白L3 93.6 31722_at
核糖体磷蛋白P1 90.3 31956_f_at
核糖体磷蛋白P1 111.1 31957_r_at
核糖体蛋白L37a 125.8 31962_at
核糖体蛋白L32 81.7 32276_at
核糖体蛋白S11 87.7 32330_at
核糖体蛋白S14 93.4 32412_at
核糖体蛋白S5 87.2 32437_at
核糖体蛋白S20 121.4 32438_at
核糖体蛋白L41 121.9 32466_at
核糖体蛋白S21 84.6 32744_at
核糖体蛋白S12 99.6 33116_f_at
核糖体蛋白L38 98.3 34085_at
核糖体蛋白S17 109.0 34592_at
核糖体蛋白S17 104.0 34593_g_at
核糖体蛋白S4 90.2 34643_at
核糖体蛋白S3 108.0 34645_at
核糖体蛋白S28 99.0 347_s_at
核糖体蛋白L13a 84.9 35119_at
杂项
层粘连蛋白受体(非整联蛋白) 128.6 256_s_at
膜连蛋白A2(脂皮质蛋白II) 171.8 769_s_at
MIF 90.2 895_at
血浆酶原激活剂抑制剂I 111.4 38125_at
延伸因子1-α 148.6 1288_s_at
泛素C 91.5 1367_f_at
烯醇酶1 93.6 2035_s_at
多泛素UbC 97.9 32334_f_at
苯丙二氮受体 88.2 32806_at
亲环蛋白A 97.0 33667_at
延伸因子1-α 144.0 40887_g_at
ESTs
EST AI535946 114.5 33412_at
EST AI541542 113.8 35278_at
EST U34995 172.4 35905_s_at
表3内皮非线性转录本
转录本 Et/BL Et/Em 探针组
转录
HHEX(同源异型框) 14 14 37497_at
erg 265 22 914_g_at
粘着/基质
整联蛋白α6B 24 11 33410_at
VE-钙粘蛋白 110 44 37196_at
PECAM-1(CD31) 77 17 37398_at
MMPI 419 757 38428_at
整联蛋白α5 57 13 39753_at
生长因子
TSG-14 404 2294 1491_at
VEGF-C 17 12 1934_s_at
IGF BP 10 250 14 38772_at
BMP-6 87 12 39279_at
血管生成素-2 32 43 37461_at
P1GF 37 105 793_at
受体
Eph-A4 12 18 1606_at
TGF-βRII 92 10 1814_at
PECAM-1 133 61 268_at
TMP 58 12 37762_at
IL1受体1 27 12 40322_at
p27 24 13 425_at
杂项
Ras抑制剂SF4 11 36 1783_at
IPL 27 22 31888_s_at
溶质载体16 82 14 33143_s_at
内皮特异性-1 222 344 33534_at
RGS 5 62 11 33890_at
PLOD2 38 10 34795_at
细丝蛋白C 23 17 35330_at
肌球蛋白X 129 10 35362_at
SCHIP-1 30 22 36536_at
核糖核酸酶A 60 15 37402_at
HERMES 16 84 38049_g_at
PAI-I 187 52 38125_at
胰蛋白酶原IV 16 12 40043_at
丝氨酸蛋白酶SIG13 347 10 40078_at
MAP 5 13 11 41373_s_at
Von Willebrand因子 98 18 607_s_at
ESTs
EST AL080215 13 11 32454_at
EST AB023155 16 11 33235_at
EST AI672098 10 60 33407_at
EST AB007889 23 61 37363_at
EST Y09836 26 11 38396_at
EST AB014520 17 23 38671_at
EST AF000959 87 29 38995_at
EST AI743090 14 16 39549_at
EST AF001436 10 25 41658_at
序列表
SEQ ID NO：1
EST id N42007
CCAGCGAGGATGCAGACGAGTTGCACAAAATTTTACTGGAGAAAAAGGATGCCTGAACAC
GCAAAGTCGGCTGCAGAATTATTGCCAAGTTGCTGCTGCTTCCACCGCCCCTTAGTCAGT
TTTTCTTCTCTTCTTTGACATTCTAAGAACTTATAGATAACTTAAAACTTTTGTGAGGAA
GATTAATGTGGCCAATAAAACCTTTAAATGTTAAGTGTCAAGAAACTGCACTCTCCCTTC
TTAAGAACTGCCTAAAGTGTAAAATACATTTGAATGCAATTTTTGGAAGATTTTTTAATG
TTCGTTTATTAAACTAACCCTAAGTGATTTCTTCAAGGACTGCAATCAGGGTATCAATTT
GCTTTCCCAAAGGCTCTTCCAACCCGTGGGTTTTGGGGTCCACCGCCACCACCAGAGAGG
CTTTTGAACAGGTGCCTGGCTGTGTTCAGAAGGAAGCTGGCCTGTGTGCTTCTCTCCGGT
GGGCTCAGCCGACGTGTGAGACTTGTTCTGTTACCAAATGAACCGGGCTGCCACGCTGTG
ACAGGCGTTTGTCCTCTGCTTTATTTTTACTTTGAAGCTCAAATGCGAGTACTAAGTGTT
CACCTCAGCGTTCGAATCATGTAACCCTGTGGGCTGCTTCACGAGAATTCAGGA
CCTGCATTTTCATTCTAAAAAGAAATGAACAGCTTGTGAAGGAGTTTTTTGGCTTCATAG
TTTCTATTCATGAGGTAGTGTTACTTCTTTATCCCCCTAAAGACAAAATGAAGATAAAGG
GGGATTGCCAGGAATGGGTTTAAAAGCACAAATGTGGTAGCTTATCATCTACACCATGGA
GAGTGAACCCTTACGAAATGAAAGTCAAATGAGACCATCCGAGAAAAAGATGCGCATAGG
CATTTGTACCATGATCAACCCCACGCACATGAAAACTGTGACCAAGTGACGTGCCTGGGA
GCTTTGACACACGAGCCGTGTGAATTCACTAGGAAACATGTAATAAAGTCATGGAAGAGA
AAATCGTGTGTAAATTTTGCCTTTAACTTTAGACCGCAGTATATTATAATACATTTGATA
TCTGAAATATCTTTACTTTTTTAAGAGTAAGATTCCATATGTCTGTCTGGAAGGGAGCCA
TGGTTATTCACACGAATATCCCTGTCACTTCTCCAGAGGTGTCAGGTAACTAACACGAGC
ATTCTTTGAAGACTCTGGGCACATGAATGATACACAGAATTGAATGTTTAAATTTCCACT
TTGAGTCCTCATGAATCATTTGAGACTAGTACCAGCTGATCTTGTGTACAGGCTCAGGGT
CAGTGCCCAAGGGCTCCCGCGTGTGTGTTCTGATCTTCAGTGCGTAGCACATTCTCCATT
TAGAAAAGAGTGGTCAGAATAATTGTGGACGGTACAGTGGCTTTTTAAAACTACAGTCTT
TAGGTGTAAGGTTTGGCGCCGGGAGCAATTTTATGATCAAATATGATGAACTCCTAAGTC
ACTGAGGTGTGATTGGGCCAATGTTGGCATGAGGTTCTTGCTCTACTTCCAGTGTTTTGA
TTCCACTGGGAGAATTTGGCCTAGTGTGTGGCTTTGGATGAATCCGTGTAGAGAGAGGTG
AGCTTGTCCTGTTACAGATGCTGTCAGACATAGCGATAGTAGGCACCTAGGGAGGAAGTG
GCCGTTAGTTTTACACTGACTTTTTAAGAATGGAGAATGCACGTGGGTTTCTGTTGCGGA
TGATTCATAGTAAGCAAGCGGTTGATGCTGTTAATACCGGCCCCACCCGATTGACATTAA
GTTTATTCAGCTTTTAAAAWGATGAAGAACTARGGGGAACAAATTTAAGTTTGTTGCAAC
TTAGCCACACATGCTTCCCTGGTACCAGCTGGAATCAGCAGCTCACAGGCATCTTCAGGA
CACTTCAGTGTATATGACACAGTACTTTGTTAGCGTCTGCGTGTGTATGGAAAGTTGACA
AAAAATGGCATGAAAAGATCATGATTGGATTTTCTTTTAAACCTGCCCTTCTGTAAAAAA
TAGTTTATATATTTTTAAATTAGTAGGTATGTGTGGCTTCCTTTTTTCCTAACATTCCCA
GCAAATTTTTGCTGCTAAGACTATCACTGTTAAAGTGAAAATTACAGGGAAAAATGTGAT
GAATATACCGTAACTCAAAATGTGATATTTTCTTAAAATCACTCTTTTATGCTTTAGGAA
CTGGTTGGTCTCCACTTTGATTATTAGTGTAAAGAGCCTGAGTATACGTGGATTTCATTG
TAAAATTTAACTCCTTGTCTTTTACTTGGGGCACGGGGCCCCTGGAGGGCTTCCCTACTT
TCCCCACTATGTTAACAGGTAATTCTGATTTATGCGTTTAGTTTGACTTATTTTTAACAA
AATATTAGAAGTTATGCTTTAAAATGTTTAATGTGGACTGAAATTTTCATCTTTTGTTTG
AGAATCTATGAAGTGTATCATATACGTGGCCTAAAGCAAGGTGTGTATTTTGTTATTCTG
AAATTGTTTTGCATCTGGACAAATACTAAATATCCCAGTGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTT
TAAACCTGTGTATCCATCTCATCCTTTTGCGCATTCCTAGTAAGCAAAAAAATTTGTTAT
GCCATCTTCATTATTCGAATTACAGACTGAAAAAATATGGCCAGTTTTTAAAGAAGTTTA
GATTATGTTTTCCATGGAAGGACAAGTCTGACTGTTCATAGGCTGATTTTCTTTAAGAGG
ATTATTCTGTTTTACAATTTCAATTCTAGATCACATTTTATATATGCTGCATGCCAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：2
EST id AA663800
GAGCAGACTATTGCTGATATGTTGGTTTTAATTCAAAAGAAACGATGATGCCAAATGGTT
TGGAATTGACAGCAGCTAAGGAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAGAAAAGG
CTGGTGACACCCCCCTGGCGTGGTTGACCTGGTCCCAGTCGCAGTCCCTATGGCAGCAGG
CACGCGTAAAACAGAACCTGATGACGGCTGAAAATCAAGCCAGACTGCTGTGCGGCTAGC
TTGCCGCCGTGGAATGCCTTGTGTCTTGGCCATGTCCAGCCAAGGGTACAACGTGCTTGT
TCCCGATCACCCAGGTTTGCCATTGGAAGTCAAAGACAGAATCGCTTCATGGCACTACAG
ATGTGGAAAAATAAAAATCTCAGCTAGAAAGAACGTCCGATTTGGAGATAGCGGGAGGAC
ACGAAGGAGTGGGGGCCATTTTGGTGCTGAGAGGAGGGTGCCCCAACTTCAGGAGGACCA
TGTGACGGCTGTGGTTGTTTTCGGGGTCACTTGCAGCACACACAGCGTCCCCTTGATGCT
CGATGGGGACCGCAGACGGGCTGCAGACCTAACCCCTGGCTGTGGACAGAGAGGCTGCTC
CAGGCTTCTTTCCTTCTCAATGCTTTACACAGGATTTCCTTCATTTGTGCTTTCCTTTGG
TTTAACAGTTAAAAAAGAAGAGTGAGGGGGCAAAATGGTTTGTCACTTGTCCAAAACTGA
GAGAAGAGGTGGAAGTGGGCGCCAAATCTCCTGGGTGATGCTTCCTGGTCCTGGCGATCG
GTTGCTTGCTCAGGGTTTGGGAGCTGTTGCTCTGGAACCACCGCTGGCCTTCTGGGACCT
CGCTTCCGTGGTAGGGGACGTGAACCAGCCTCCTGGTGGAGCTTTGTGTTGCAGTGAGGC
CACAAAGCAAAGGCCCAGGAGCAGAGGCCTGACACTGGCTGTGGTCGACGGTCACACCTT
GACTCCCTCTCTCTCTCTGAATATACAACGTGTGGGTGGGCCCGTTCAGCAGATGTTACA
GGAAAAATAGCAAATTTTTAACTTATTCCATCTCCAAAGTTGAAAAAGATCAGACAGTTA
CTAAAATAAACGATTTCTCAATTGCATTCTGGTGCCGKGGCCCGGTGGCCGCGGCGTGGG
CGGGGCGTTGGAGGTGGGAGGGCCCCGGCTGAGTGAGGGGCTCACTCARAACAGGCACAG
TCAGCTGGGCTGAGCGAGGCTCARAGTAAGGCGGTGTTCCTCACAGAAGAACACATCGGA
AAAAGCTGCTCCTCTTCTGCTGGTCCGGTGTGATTTTGACTCCCTGGTTGCTCCCTGGGG
CTGTTGCCTTCCATTTTTTGTCCATTTTTGCTTTGATATCTCTGGCGAGAGTGAAAAATG
CATTTTCCACATTGATGTTGGCCTTCGCGCTGGTCTCCATGAACTTGATTCCATAGTCGA
GGGCCAGCTTTTCTCCCCGTTCCTTGGAAACTTGTCTCTTGTCATTCACATCACACTTGT
TCCCAAGTATCATCTTTTCGACGTCTGCAGAGGCGTGCTCCTCAATGTTGCGAATCCAGT
TCCGGATGTTGTCGAAGGACTTCTCGTTGGTGATGTCGTAGACCAGCATGATGCCCATTG
CACCCCTGTAGTAGGCCGTTGTGATCGTCCGAAACCGTTCCTGACCGGCTGTGTCCCATA
TCTGCAGTTTAATTCTCTTGCCATCGAGCTCTATGGKCCTAATTTAAAGTCAATTCCTAT
GGTGGAGATAAAAGTKGAGTTGAAGCGTCCTYSGAGAAGCGGAACAGGACACAGGTCTTY
CCCACCCCSKAGTCCCCGATCAGCAGCAGCTTGAACAGGTAATCGTAGGTCTTCGCCAT
SEQ ID NO：3
Est id AA492299
GGCCCTAACAGGAATGAAACTGAGGTGTCAAGAGGGCTCTCTGTGCACACTTTTGGCCAT
GACCCAGTGTCTTCTGCAGTCCTTACGCAGCCACATGAGGACACTCAGCACAGAGCAGCC
TGTGTGTCCCAGAGAGTGAGAGAACTGAAGTGGTGTCCCCAAGGCCACCCGGCAAGTTGG
TGGCAGAGCCAATACCTGAGCTACCCTTAGGCCCCGTATGTACCTGCTTCTCATGTGACG
CACAGGGAAATTGAGGCCTGGCCCCACCTCCCTCTGTTGCCCTGCTGGCCACATGCCCAG
GGGAAGGGATTTCCAGGGCTTACCCAGAGTGGCATTGCTGGGGAGAGACCAGATGCCTGG
GCTCCTGGGTTTCCCCAAGGGGACGGCCCTTAGGAATCCTGTGCCTCCTCCACTGCCACC
CCCTTCACAGCGGGTCATCCGGAGCCGCAGCCAGTCCATGGATGCCATGGGGCTGAGCAA
CAAGAAGCCCAACACCGTGTCCACCAGCCACAGCGGGAGCTTCGCGCCCAACAACCCCGA
CCTGGCCAAGGCGGCTGGAATAGTGAGTGCCCTCCCCCTCCCCAGGCCCCGGCCCCTCCC
TGGGGGGCCCTCAGCTCTCCTCTGCCTCCTGAGGCCTGACTCCAACTCTCTCTGTTGCCC
TGCTGCCCACATGCCCATCCTAGGCTCTGGATTTGGTCTAGCCACTACTTTCCATGGGAG
GGGGGTGAAGTGCCCAGGCCAGGACACTGCGGTGCTGACAGCTTGCAGCCTGCAGCCCCT
TCCCAAGCTCCTTGGCCCTCCCCTCCTCCTGGCCCTTTATGCATTGAGGTGTGACTTCCT
GCAGGTCAGCCCTGGGACAGCCTCTGTGTCTCATTCCTTATTGAGTATCTATCTGTTTGC
TGGGGACTGGGCTGCTGTGTGGGCACCTACTGTCAAGCCTTGGGTTTCTGGGAGCACCTA
CTGTGTGTCGGGCTGTGGGCACCCACTGTGTGTCAGGCCCTGGGCTGCTGTGTGGACATG
CACTCTGTGAGCATCTACTGTGGGCCTGGCCCTGAGTACCTGTGAGCACCCACTGTGTGT
CAGGTCCTGGGCTGCTGTGTGGGCATCAACTCTGTGAGCGCCTACTGTGTGCGCAGCCCT
GGGCTGCTGTGTGAGAACCTACTGTGTGTCAGAAAATGGACTGCTATGTGAGCACATCGT
GTGTGATAAGCCCTAGATGTCAGTGAACACCTACTGTGTGTCAGGAAGTGAGCTGTTGTG
TGGGTACTTTCTCTGTGAGCACCTCCTACTGTGTGTCCGCAGCAGCCAGGGCCTCTGTGG
TGTGGCTGCCTATTGTGTGTCGGGAATCTGGCTTCTGTGTGAGCATCTCCAGAGGGAGCA
CCTCCTGTGTGATCACTGACTGTTGTCCAGGTTCTGGGATTCTGCTGCTCACACTCAGGA
GTGCTGGGCACATGGATGAATACGGCCTATGGCTGTGGGCCTCACTGCTGTCCACTGCCT
AGTGGCCACCCCAGGACACTGCACCCACTGCTGTGCTCCCCACCCATCCATCCAGCCACC
CATCCATCCACCCACCCATCCATCCATCCACCCACCCATCCACCCATCTAGCTATCCACC
CACCCACCCATCCACCCACCTACCCATCTACCCATCCACCCACCCACCCACTCATCCATC
CACCCACCCATCCACCCACCCATCCACCCATCAATCCATCCATCCACCCACCCATCCACC
CATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCTCTATCCATCCC
TCTATCTCCATCCATCCATCCACCCACCCACCGATCCATCCATCCATCCATCCTTTATTG
ACTGTCTACTGCATGCCAAGCCCTGCGCTCAGTGCTGTGAGGCTATGTCACGTGGCAGGA
GGGAATTCCCCGACCTCTGCTGTCCAGCAGTCACCAAGCACACTGTCATGCGAGGAGCAG
GCCCAACCTCCCCCAACCCAGTTTTATCAACCACTCCCTTCCTCTCCACCAGAGTGACCC
AGCCTCCTGTGGGTGGCCGAGAGGGGCCCCAGGGACAGGACCAGGCCAGCAGCACCCACC
ATGGCAGTAACCGGACCCATTTCTGTTTTGTTTTTGCACAACTCTCCCTCTCTCTGTGTT
TCCTCCTTTCATTCTACTCTCTCTCCTTGTTTTTTTGTTCCCTCCTCCCTTCCCTTTCCC
CGTCCTGTGGCCTCTCTGCCCTTTGGCTCTCTGTTTCTCCTTCCTTCTTGCACCTGTCTT
TTTTTGCTCCCTCTCCTCCTTCCCTTCTCCGCTCTTCTCACCCTCGCTTTTTCCTTTCGG
CCTTCCCCTGGCTTCCTTCTCTGTCTCTGACCCTCCCTGGGCCTGTGTCTGTGTCCTTGC
GTCCCTGTCTCTCTGGATTTCCCTCTGTGCCCATCTGGTGTGCCCTCGCTGGCTCACGCG
TGTCCCTGTCTCCGGGTAACTGTCTGTCCATCTCTCCCCCGTCTCCCTTGTCCTCTGTCT
CTCCTTGTGCTTCTCGCCTTCCTTTCCCCGGCCCTATCTCTCCCATTGCCTCCTGCACCG
TTCTCTTCCTTTTTCTGTCTGTCTTCCTCCTTTCCCTGCCTCTCCTCCTCTCTGTGTCTC
CCTCCCACCATCTCTCTTGCTCTCTGACTCTCTCTCTGTCTCTCTCTCTCTGCCCCCGCC
CTCTGCTGCTTGCCAGTCATTGCTTATTCCTGGGAAAAGTGCGAGTAGATTCGGACGCCG
GGGCAGTGCCATAGGCATAGGAACCGTGGAAGAGGTTGTCGTCCGCGGGGCCGCCGGCTC
TGGAGGCTGCCTGCACGCGCTGTTCTCTGCTCGCTCTCAGGACGGAGGCCATATTGGGGA
CGTTGCCCCTCTGCCCCCGGGACAGGCCCCAGGGCGTGCGGGATGGAGTGGCGGCAGCTC
CGATGGCACTCAGCACCTGCTTTGGGGCCTGGTACCTGTGCCAGAGCCAGTGCCCCTCAC
CAGGGGCTTCTGGCCCTGCCTTGGCCCCTGGGACCCTGGCCCAGTCCCTGCCAGGATCCG
GTACCCAAAGGCCCTACACCCAGCCGCACGTCCCCCAATATCGCCGGTCTGCATGGAGCG
CCATCCCTCTCCTCTGCCCTGACTCCTCCTCCCCGCCACGAAGTGACCTGGGGTCCTACC
CCTTCCTGCCTCCAGAGAAGCTGGGGGCGGGCTTCTGGGGCCTGGGGCATCCCAGCACAG
TGTGTGGGAAGCTGGGGGAGTCTTCCAGCTGCTGGGCCAGAACCTCCCCCAGCCAATTTG
GAGGTTCCGGGGAGGGGCCCTAGCTGGCACGGGGTGGGACTTGGGTTGCTACACTGCCCT
CTGACCACTGCCCTTAGGCTGCAGATCCCACAGAGCCCTGGGGGGCGGGGAGCGGTAGCC
ATTCTGAGGACTCGGCCTCCTCCCACCCTAGCCCCCTCAGGATGCTGTCCTAATCCTGGG
CCAGTATTGACGTGCAGTCCTGCCGTGTGAGCTCGGGAGAGCCCCTTGCCCTCCTGGGGA
CTGTTTCCCTTTCGTAAACTGGGAGGCTGTCTCTGGGAATGGATATCTTCTCTCGTTCTT
TCTTGCTCATCAACTCTGCTTCAGGGCCTGGGGCAGCAGGATCCCCAGAGGGGATGTGGG
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