利用胸腺素Α－1治疗胶质母细胞瘤.pdf

利用胸腺素α－1作为佐剂与卡莫司汀(BCNU)联合用于对恶性胶质母细胞瘤进行有效治疗。

1.  一种治疗胶质母细胞瘤的方法，其包括联合给予氯乙基亚硝脲以及胸腺素-αl(TAl)肽。

2.  权利要求1的方法，其中所述氯乙基亚硝脲为BCNU。

3.  权利要求2的方法，其中BCNU以150-200mg/m²的剂量给药。

4.  权利要求1的方法，其中(TAl)肽为胸腺素-αl，其以0.001mg/kg体重/天至10mg/kg体重/天的剂量给药。

5.  权利要求4的方法，其中胸腺素-αl以0.02mg/kg体重/天的剂量给药。

利用胸腺素α-1治疗胶质母细胞瘤
相关申请资料
本申请要求2001年12月10日递交的临时申请60/337,149的优先权。
本发明背景
胶质母细胞瘤是成人中最常见的原发性CNS恶性肿瘤，占原发性CNS恶性肿瘤的近75％。尽管由于神经显像术、显微外科手术以及放射疗法等的进步使得胶质母细胞瘤的治疗方法已经有了稳固的进步，但是该疾病仍然是不可治愈的(McDonald，2001；Burton，2000；Prados，2000)。诊断后的平均预期寿命少于1年，采用包括对可视肿瘤进行切除等急切治疗后的五年生存率少于10％(Burton，2000；Nieder，2000；Napolitano，1999；Dazzi，2000)。胶质母细胞瘤通过在脑中的快速、侵略性和浸润性的生长而引起死亡。浸润性生长的特性是这类肿瘤不能被切除的原因。
胶质母细胞瘤还对放射疗法以及化学治疗具有相应的抗性，因此治疗后的复发率很高。此外，切除和放射治疗后通过对肿瘤细胞的免疫反应并不能完全清除残余的肿瘤细胞(Roth，1999；Dix，1999；Sablotzki，2000)。
恶性胶质瘤细胞通过产生能够损害T-细胞增殖和IL-2生成的免疫抑制肽来逃避宿主免疫系统的探测(Dix，1999)。甚至CNS也给予恶性胶质瘤细胞某些特权使之能够悄然生长。迄今仍在继续寻找对患者进行胶质母细胞瘤的有效治疗手段。已经利用许多模型来研究通过免疫治疗、或者通过恢复免疫系统进行治疗来对抗这些肿瘤细胞。在所研究的具有对抗恶性肿瘤能力的免疫相关因子中，胸腺素组分5(TF5)、胸腺素α-1(胸腺法新)、IFN-α、以及IL-2是其中的几个。
卡莫司汀(双氯乙基亚硝脲，BCNU或BiCNU)是氯乙基亚硝脲家族的化学治疗剂，该家族还包括其它的化学治疗剂，如氯脲菌素(DCNU)(Anderson，1975)、环己亚硝脲(CCNU)(Carter，1968)、尼莫司汀(Sai jo，1980)以及雷莫司汀(Sekido，1979)。多年以来氯乙基亚硝脲类仅被用原发性脑瘤的单一化学疗法的治疗剂；但是，历史数据表明，采用这些化合物作为单一药剂来治疗脑部肿瘤并非特别有效(e.g.，Aquafedda，et al.)。与仅采用放射疗法相比，采用卡莫司汀与放射疗法联合进行治疗能够适度增加恶性胶质母细胞瘤病人的长期存活时间(18个月)，尽管生存曲线之间并未具有0.05水平的显著性差异(Walker，1980)。
胸腺素α-1(胸腺法新)是一种28个氨基酸的肽，其为循环中天然存在的化合物的合成形式(Bodey，2000；Bodey，2001)。胸腺法新刺激胸腺细胞生长和分化，生成IL-2、T细胞IL-2受体、IFN-γ以及IFN-α(Andreone，2001；Sztein，1989；Knutsen，1999；Spangelo，2000；Tijerina，1997；Garbin，1997；Attia，1993；Cordero，1992；Baxevamis，1994 & 1990；Beuth，2000)。胸腺法新在临床试验中被用于治疗乙型肝炎病毒感染(Chan，L-Y，2001)、丙型肝炎感染(Chan，H.L.，2001；Sherman，1998；Schinazi)、肺或头和颈部癌症、黑色素瘤(Bodey，2000& 2001；Garaci，2000)、以及AIDS(Billich，2002)。这些研究所得到的有希望的结果及T细胞对胶质母细胞瘤的反应性降低的证据引导了本发明对采用胸腺素免疫疗法来治疗恶性胶质瘤的潜在治疗益处进行研究，并确定了胸腺法新抗肿瘤作用的机理。
发明概述
胶质母细胞瘤是高级、恶性的中枢神经系统肿瘤，通常在诊断后12个月内致命。近来的研究表明采用诸如IL-2或IL-12等炎症前细胞因子能够延长胶质母细胞瘤病人的存活时间。胸腺素α-1(胸腺法新)是一种能作为免疫调节剂的胸腺肽，其能增加IL-2的生成以及T-细胞的增殖。本发明的工作证实，与其它组相比，在以胸腺法新+BCNU进行治疗的患者中，显著降低了肿瘤负荷并增加了淋巴-单核炎症细胞的反应。体外试验证实，胸腺法新对培养的9L细胞的生存能力或者线粒体的功能都没有直接的影响。但是，胸腺法新能显著增加促细胞凋亡基因的表达，包括FasL，FasR以及TNFa-IR(分别为65.89％，44.08％和22.18％)。此外，胸腺法新还增加了9L细胞对氧化应激的敏感性，例如用常规非致死剂量的H₂O₂就能杀死30~50％的胸腺法新处理后的9L细胞。进一步的研究表明胸腺法新增强了9L细胞对端粒酶B-(T细胞)或BCNU介导的杀伤的敏感性。这些结果表明胸腺法新在体内增强了氯乙基亚硝脲对胶质母细胞瘤的清除作用，胸腺法新的上述作用是通过活化促细胞凋亡机制，使肿瘤细胞对氧化应激的敏感性增加，以及通过端粒酶B(T细胞)的杀伤作用或者化学治疗等来实现的。
附图说明
图1显示胸腺法新对9L细胞的存活性以及线粒体功能的最小作用。
图2显示了胸腺法新作用72小时后9L细胞中促细胞凋亡基因表达的增加。
图3显示了胸腺法新使9L胶质母细胞瘤细胞对氧化应激或者BCNU化学治疗的杀伤作用更加敏感。
图4显示了胸腺法新使9L胶质母细胞瘤细胞对端粒酶B-介导的杀伤作用更加敏感；图4A显示将细胞与药物溶剂或胸腺法新(24小时-急性，72小时-慢性)相接触，然后再用药物溶剂处理1小时后的效果；图4B显示将细胞与药物溶剂或胸腺法新(24小时-急性，72小时-慢性)相接触，然后再用药物溶剂处理3小时后的效果。
图5显示向成年Long Evans大鼠的右额叶植入10,000的9L胶质母细胞瘤细胞后临床神经病理异常发展的时间曲线。
图6显示了BCNU和BCNU+胸腺法新(THY)在体内对胶质母细胞瘤发展的作用。
图7显示了用BCNU+胸腺法新(THY)处理大鼠降低了胶质母细胞瘤的负荷并且治愈了25％。
发明详述
现今已经发现胸腺法新能够增强对胶质母细胞瘤细胞地免疫介导杀伤作用，这使得它能作为佐剂与氯乙基亚硝脲类化学治疗化合物联合使用从而有效治疗胶质母细胞瘤。
本发明可应用的胸腺法新(TA1)肽类包括天然存在的TA1、具有天然TA1的氨基酸序列的合成TA1和重组TA1、与其基本类似的氨基酸序列或其简短序列形式(abbreviated sequence form)、以及与TA1具有基本相似生物活性的取代、缺失、延长、替换、或者修饰的序列的生物活性类似物，例如，与TA1具有足够同源性的TA1衍生肽，其与TA1几乎通过同样的方式产生几乎同样的活性。
利用胶质母细胞瘤实验模型的体内研究表明，尽管BCNU确实能够明显降低肿瘤负荷，但反应各不同，有许多实验模型都检测不到有反应产生。但是，采用胸腺法新+BCNU进行治疗却具有同时能够降低平均肿瘤负荷并治愈约25％的肿瘤的治疗益处。胸腺法新+BCNU所介导的对肿瘤负荷的降低作用与其增加脑中肿瘤细胞内以及肿瘤细胞周围的淋巴-单核细胞的浸润相关。对于找不到残存肿瘤的试验模型，仅能检测到与原发性肿瘤细胞浸润相关联的胶质增殖组织以及不足的炎症。在低剂量和高剂量的胸腺法新+BCNU处理组观察到约25％的胶质母细胞瘤被治愈。
一个未曾预料的发现就是仅用胸腺法新治疗的组与对照组相同或者更差。由于炎症以及与肿瘤生长相关的浮肿，使得胸腺法新处理大鼠的脑经常具有更加严重的肿胀及疝出。在这里需要注意的是，以低浓度胸腺法新±BCNU处理的大鼠比用高浓度的胸腺法新±BCNU处理的大鼠具有更好的结果，这是由于在两种处理方式中肿瘤细胞的杀伤是类似的，但是接受高浓度胸腺法新组具有更普遍性的浮肿及疝出。
因此，仅采用胸腺法新进行治疗并不能消除胶质母细胞瘤，而且由于不能杀灭肿瘤细胞而导致过度的肿胀还可能产生有害的作用。这些结果进一步表明胸腺法新几乎没有或者没有直接的杀伤肿瘤细胞的作用，而这种作用却在胸腺法新+BCNU的治疗中得到了，且其中的作用是通过胸腺法新的间接作用介导的。在胸腺法新处理大鼠的脑中，发现主要为T细胞和巨噬细胞的淋巴-单核炎症细胞的密度增加，这说明胸腺法新在增加针对恶性细胞的效应免疫细胞中发挥重要的作用。
进行了一系列的体外实验来确定胸腺法新介导的抗胶质母细胞瘤作用的机理。最初的研究表明胸腺法新对胶质母细胞瘤细胞并没有显著的直接的细胞毒作用。其对包括神经母细胞瘤细胞以及有丝分裂后皮质神经原等其它的细胞种类的作用相同。为扩充这一研究，我们对胸腺法新是否反过来影响细胞功能以及是否使细胞更容易凋亡进行了研究。因此，我们检测了促凋亡和促存活基因以及生长和看家基因的表达水平。这些研究揭示，胸腺法新处理24或72小时显著增加9L胶质母细胞瘤细胞中促细胞凋亡基因的水平。在Sy5y神经母细胞瘤细胞中也得到类似的结果。同样记录了在293细胞中的现象，但在该细胞中，促存活机制被抑制，促凋亡基因并未受影响。这些发现暗示，尽管胸腺法新没有直接的细胞毒作用，但是其可以通过增加促细胞凋亡基因的基础表达或者降低存活基因的基础表达使细胞对细胞毒试剂的敏感性增加。为了验证这一假说，我们检测胸腺法新处理的细胞是否对氧化应激或者氯乙基亚硝脲类介导的细胞杀伤作用更加敏感。该研究表明，胸腺法新处理24或72小时以后，亚致死浓度的H₂O₂或者BCNU分别杀死了25％或40％的9L细胞。因此，胸腺法新的至少一部分作用是通过其对肿瘤细胞的作用而介导的，而不完全是源于免疫调节以及T细胞和巨噬细胞数的增加。
已经确定了胸腺法新及相关分子的免疫调节特性。其主要作用是增加致炎细胞因子的生成以及淋巴细胞的增殖。活化的T淋巴细胞通过FasL-FasR的相互反应以及通过活化穿孔素-端粒酶系统来杀伤靶细胞。在胸腺法新处理的9L胶质母细胞瘤细胞中发现FasL/FasR的表达增加，这说明活化的T细胞能够通过FasL/FasR的相互作用来有效杀伤这些靶细胞。但是，利用通过SLO(透化剂)以及重组端粒酶B而非活化的T细胞构建的新的体外检测方法，我们证实，胸腺法新处理的9L胶质母细胞瘤能够被所接触的SLO和端粒酶B快速杀死。这些发现证实，胸腺法新通过下述途径有效促进免疫介导杀伤胶质母细胞瘤细胞的作用：1)增加促细胞凋亡基因表达的基础水平，从而使细胞对氧化应激和细胞毒/化学治疗制剂更加敏感；2)增加FasR的水平，使之能够与活化了的T细胞上的FasL相反应，从而增加凋亡；以及3)增加活化T细胞和巨噬细胞并增加穿孔素-端粒酶介导的对肿瘤靶细胞的杀伤作用。此外，这些结果还明显表明，对胶质母细胞瘤采用胸腺法新和氯乙基亚硝脲联合应用进行治疗是有效的，但是胸腺法新并不能作为单独应用的制剂。这一结果为单独应用胸腺法新是有害的提供了实质的证据，其中胸腺法新的有害作用是由于肿胀和炎症，而只有极小的根除肿瘤细胞的作用。因此，在治疗胶质母细胞瘤中，胸腺法新最适宜的用途是做为提高宿主免疫反应的佐剂并根除逃过了传统的化学治疗的残余肿瘤细胞。
总的说来，本文的工作证实了胸腺法新具有抗胶质母细胞瘤的作用，该作用是通过以下几个途径介导的：1)调节促凋亡/存活基因，从而增加肿瘤细胞对氧化应激或者细胞毒/化学治疗制剂的敏感性；2)促进FasR-FasL介导的免疫细胞杀伤级联反应；以及3)增加靶细胞对穿孔素-端粒酶介导的免疫细胞杀伤作用的敏感性。但是，胸腺法新抗胶质母细胞瘤的治疗作用依赖于共同给予氯乙基亚硝脲，这强调了胸腺法新最适于作为辅佐免疫调节剂而非纯粹的抗肿瘤剂。类似地，当与其它化疗化合物联合应用时，胸腺法新具有类似的协助降低肿瘤负荷的积极作用，可观察到比传统的化学治疗更显著的好转速度。
本发明可使用天然的(即，天然存在的)胸腺法新，也可以使用含有天然胸腺法新的氨基酸序列的合成胸腺法新和重组胸腺法新、与其基本类似的氨基酸序列或其简短序列形式、以及与胸腺法新具有基本相似生物活性的具有取代、缺失、延长、替换、或者修饰序列的生物活性类似物，其与胸腺法新几乎通过同样的方式产生几乎同样的活性。
在诸如美国专利No.4,079,127、No.4,353,821、No.4,148,788、以及No.4,116,951中描述了胸腺法新的分离、特征以及应用。能够通过常规的剂量滴定实验来确定能够产生BCNU化学治疗所需的增强效果的胸腺法新的剂量。已经发现当给予高至16mg/kg体重/天的胸腺法新时，其对人体仍是安全的。胸腺法新的优选剂量在0.001mg/kg体重/天至10mg/kg体重/天的范围内，最优选的剂量为约0.02mg/kg体重/天。
氯乙基亚硝脲的给药剂量为约90-250mg/m²，可通过注射、口服、通过可生物降解的薄片、或本领域已知的其它任意方便的方式进行给药。其可通过单剂量进行给予，或者分成连续两天每天注射75至100mg/m²的剂量。应根据前一剂量病人的血液学反应来对最初剂量进行调整。应每周监测血球计数，并且由于血液毒性的延迟性和蓄积性，不应在6周之前给予重复的疗程。优选的氯乙基亚硝脲应能够每六周通过静脉内注射150-200mg/m²的剂量。BCNU还可通过直接向肿瘤床植入可生物降解的薄片(例如Gliadel，Guilford Pharmaceuticals)来进行给药。如果是通过可生物降解的薄片给药的，则共同给予的胸腺法新能够方便地直接在薄片上与BCNU进行联合。
实施例1：用胸腺素α1处理9L和293肿瘤细胞系
肿瘤细胞系：用添加了5％ FCS、2mM L-谷氨酰胺、以及100μM非必需氨基酸(Gibco-BRL，Grand Island，NY)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)对大鼠9L胶质母细胞瘤细胞以及293人肾细胞进行培养。所有细胞系置于含有5％ CO₂的37℃的湿润大气环境下。所有细胞系购自美国典型培养物中心且证实不含有病原体。
胸腺素a1处理：对胸腺法新急性处理，将细胞种于96孔培养板中，细胞密度为20,000细胞/孔，用10^-5M的胸腺法新处理24小时。用胸腺法新慢性处理的细胞接种于培养瓶中，在进行处理的期间内(3天)每24小时用10^-5M的胸腺法新(加入至新鲜培养基中)进行处理。此外，为了确定9L细胞对胸腺法新的剂量反应曲线，将细胞用系列稀释剂量的胸腺法新进行处理，其中胸腺法新的浓度在50uM至0.022uM的范围内。
用H₂O₂刺激细胞的氧化应激。将采用胸腺法新或者药物溶剂处理24小时的细胞用浓度为9μM至1.8mM的H₂O₂进行处理，然后利用所述的CV和MTT检测来评价存活率和线粒体功能。在采用系列稀释剂量的胸腺法新处理细胞的实验中，采用固定的1.8mM的H₂O₂来处理细胞。为了确定处理9L细胞的准确H₂O₂浓度，制作了H₂O₂曲线。
为确定胸腺法新处理和/或H₂O₂诱导的氧化应激对细胞线粒体功能的影响，对9L和293细胞进行了MTT实验。处理后，向每个含有100μl培养基的孔中加入10μl的MTT溶液。将加入了MTT染料的培养板在37℃的培养箱中培养15分钟~1小时，该时间取决于细胞种类。然后移去培养基，每孔加入200μl的酸性异丙醇。将培养板在室温下震摇至细胞裂解，然后在Packard SpectraCount^TM仪器上读540nm的值。
还利用结晶紫(CV)来对96孔培养板上的细胞进行染色。弃去培养基后，每孔中加入20μl的结晶紫，在室温下震摇10分钟。然后将培养板用温水洗涤几次并干燥。向每孔中加入100-200μl(依赖于细胞密度)的PBS w/1％ SDS。将培养板置于震荡器上于室温下孵育直至细胞充分裂解。在540nm下读数，以检测所测试的不同组之间细胞存活率的差别。
对9L和293细胞进行了微量滴定免疫细胞化学ELISA(MICE)检测(dela Monte，1999)。将细胞接种于96孔板，用10^-5M的胸腺法新处理24小时，在用MICE检测分析前组织固定过夜。将固定的细胞用溶于Tris-缓冲盐水(50mM Tris，pH7.5，0.9％ NaCl；TBS)中的0.05％的皂甙进行渗透，以Superblock-TBS(Pierce，Rockford，IL)进行封闭，然后与增殖细胞核抗原(PCNA)、bcl-2、p21/Wwaf-1、p53、FasL、FasR、TNF-R1、或者GAPDH的一抗在4℃过夜孵育，其中所有抗体都以含有0.05％ Tween-20和0.5％牛血清白蛋白的TBS(TBST-BSA)稀释为0.5-lμg/ml的浓度。利用偶联了辣根过氧化物酶的二抗(Pierce，Rockford，IL)以及TMB可溶性底物(Pierce，Rockford，IL)来检测免疫反应性。通过加入1M H₂SO₄来停止反应，利用Spectracount microplate reader(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)测量450nm的吸光度。接下来，通过考马斯亮蓝染料对附着的细胞进行染色并测定洗脱染料的吸光度(de la Monte，1999)，以此来测定细胞密度。在同一培养孔中计算TMB和考马斯亮蓝吸光度的比值并以此作为MICE指数。利用16个重复培养孔所得结果的Mean±S.D.值进行组间统计比较。
采用不同浓度的胸腺法新处理24小时的9L细胞的实验表明，线粒体功能显著降低，如MTT检测所示(图1)。之所以检测线粒体功能是由于细胞死亡可通过线粒体功能障碍来介导而非通过凋亡或者坏死来介导。该研究显示，在药物溶剂处理的对照组以及胸腺法新处理的培养物中具有类似水平的存活率以及MTT活性(图1)，显示胸腺法新对9L胶质母细胞瘤细胞并没有直接的细胞毒作用，这与体内实验是一致的。在对包括293肾细胞以及SH-Sy5y神经元细胞的其它细胞系也得到了类似的结果(数据未显示)。
由于胸腺法新并没有直接的细胞毒作用，因此探索了胸腺法新抑制胶质母细胞瘤的其它可能机制。在这一方面，利用看家基因的表达作为对照，检测了促进凋亡或细胞存活的基因产物的表达。在96孔板上进行微量滴定免疫细胞化学ELISA(MICE)检测(de la Monte，1999)以得到多个重复培养物的数据。胸腺法新处理24小时后，于药物溶剂对照相比，下述物质的表达水平显著增加(P＜0.01；图2)：FasR(44.08％)、FasL(65.89％)、以及TNF-R1(22.18％)。但是，胸腺法新处理并未显著影响bcl-2和GAPDH的表达水平。还利用293细胞进行了研究，结果显示bcl-2显著降低(36.67％；P＜0.01)，但是FasR，FasL，或TNF-R1的表达水平没有显著变化(数据未显示)。因此，MICE检测的结果表明，胸腺法新对这两种细胞系通过不同的途径来增加细胞通过凋亡途径死亡的敏感性。
利用H₂O₂诱导的氧化应激实验来检测胸腺法新增加9L和293细胞对凋亡敏感性的能力。如MTT检测结果所示，与仅用H₂O₂处理24小时的9L细胞相比较，以胸腺法新处理24小时并随后用H₂O₂处理24小时的9L细胞的确表现出存活率显著降低(图3)。与仅用270μM H₂O₂处理的9L细胞相比，以胸腺法新和270μM H₂O₂处理的9L细胞通过MTT测定的线粒体功能下降了26.6％(图3)。在以293细胞作为把细胞也得到了类似的结果(数据未显示)。
实施例2：端粒酶诱导的凋亡研究
上述的MICE检测研究证实，胸腺法新在9L胶质母细胞瘤中诱导了TNF-R1、FasL和FasR的表达。为了确定以胸腺法新处理(或未处理)的9L胶质母细胞瘤细胞对细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)诱导的凋亡的敏感性的差别，进行下述实验检测：将9L细胞用胸腺法新急性处理24小时以及慢性处理72小时，然后收集细胞，重新接种于96孔黑培养板中(7.5×10⁵细胞/75μl/孔)，然后与20,000单位/ml的链球菌溶血素O(SLO)加上100ng重组端粒酶B(反应体积为100μl)在37℃相接触1或3小时。以SLO代替穿孔素穿透细胞，利用重组端粒酶B使检测标准化。对照研究包括无SLO、无端粒酶B、或者二者皆无的平行反应。利用ATPlite对细胞密度为每培养孔10³至10⁶的细胞进行检测(Packard Instrument Company，Meriden，CT)以测量存活细胞的密度，该检测具有与相对光单位有关的宽线性动力学范围。
在体内，恶性肿瘤细胞被细胞毒T细胞和巨噬细胞所杀伤，所述的细胞毒T细胞和巨噬细胞可通过诸如IL-2以及IL-12等致炎细胞因子而得到补充。细胞毒T细胞通过释放穿孔素和端粒酶B进行杀伤，其中穿孔素能够在靶细胞膜产生孔洞，端粒酶B能够破坏酶，从而引起靶细胞的死亡。为了研究胸腺法新增强T细胞介导的9L胶质母细胞瘤细胞的杀伤作用机理，使用了一种体外检测，在该检测中，胸腺法新或者对照处理的9L细胞在链球菌溶血素0(穿透剂)存在或不存在的条件下与端粒酶B一同孵育1或3小时。利用ATP发光实验来检测生存能力，在组内进行比较以确定与SLO+端粒酶B处理相关联的相对杀伤。该项研究证实，与仅由SLO、端粒酶B或者药物溶剂对照进行处理的胸腺法新处理物相比较，胸腺法新处理的培养物采用SLO+端粒酶B进行处理后细胞存活力显著降低(p＜0.001；图4A和4B)。此外，端粒酶B介导的杀伤作用随着时间的延长而增强，这可由与SLO+端粒酶B孵育3小时后比孵育1小时后具有更多的细胞损失而得到证实(图4A和4B)。但是，当采用SLO、端粒酶B、药物溶剂、或者SLO+端粒酶B处理时，药物溶剂对照的培养物表现出类似的生存力。在这些研究中，与在检测前以胸腺法新处理72小时(慢性)相比，急性(24小时)胸腺法新处理具有更高程度的端粒酶B+SLO介导的细胞杀伤作用(图4)。
实施例3：胸腺法新对原代神经元细胞培养物的细胞存活力的作用
研究了原代皮质神经元细胞培养物以确定不会对非肿瘤脑细胞产生毒性的胸腺法新的剂量。由于前述研究已经表明随着细胞密度从每孔1×10⁴至5×10⁵进行变化，CV和MTT吸光度亦随之呈线性增加(de la Monte，2001 & 2000)，因此利用结晶紫(CV)和MTT实验来测定细胞存活力以及线粒体功能。
用系列稀释的胸腺法新(终浓度在3.3×10^-5M to 1×10^-9M范围内变化)处理96孔培养板中的原代神经元皮质细胞，发现在所用的实验剂量下，细胞存活力并未降低。通过MTT检测可以发现，所用的最高浓度的胸腺法新(3.3×10^-7M)确实使存活力降低了30％。但是，该剂量要高于所用的实验以及临床剂量。
实施例4：对大鼠胶质母细胞瘤采用胸腺法新体内辅佐治疗
大鼠9L胶质母细胞瘤细胞源自美国典型培养物中心(Washington，D.C.)并证实不含有病原体。将细胞置于添加了5％胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)中。未向培养基中加入抗体。在注射前，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，用0.25％胰蛋白酶/0.05％EDTA使细胞从培养表面脱离，游离为单细胞悬液。用无血清的DMEM洗涤游离的细胞3次，最后将其悬浮于无血清的DMEM中，细胞密度为5×10⁶活细胞/ml。利用台盼蓝排除以及血细胞计数器来确定活细胞密度。
设计实验以确定：与给予双氯乙基亚硝脲(BCNU)相比，单独给予胸腺法新或者与BCNU联合给予是否能显著降低胶质母细胞瘤负荷。利用成年(250-300克)Long Evans大鼠创建胶质母细胞瘤的体内模型。将大鼠通过单次腹腔注射溶于50％乙醇的100mg/kg氯胺酮和100mg/kg赛拉嗪进行麻醉。麻醉后，剔光头部，用聚乙烯吡咯碘酮预处理(prep)，然后将大鼠置于立体定位架上。在额叶沿正中线切开，用3mm钻锥钻孔，利用与Hamilton注射器相连的26号针头直接向脑中注射2μl的9L胶质瘤细胞悬液(总共10,000细胞)，注射深度为3.5mm。移走针头后，用无菌生理盐水洗涤伤口，将动物移下定位架，用可吸收缝合线缝合皮肤。将大鼠放回笼中，观察任何恶化的信号，包括体重降低、食水摄取减少、轻微偏瘫、癫痫、或者不活动等。如果观察到任何程度的患病，则用120mg/kg的戊巴比妥钠对动物实施安乐死。每天观察动物，每周称取动物的体重。一般经验是，如注射10,000个9L细胞，则在26天内100％的动物会被杀死。
让肿瘤生长5天，然后进行抗肿瘤治疗。将大鼠分成6组：药物溶剂对照组；低剂量(45μg/kg)胸腺法新组；高剂量(200μg/kg)胸腺法新组；低剂量胸腺法新+BCNU组；高剂量胸腺法新+BCNU组；以及仅给予BCNU(9.4mg/kg)组。在脑内肿瘤接种后第6天通过单剂量腹腔注射(I.P.)给予BCNU。用胸腺法新处理的大鼠，从肿瘤接种后第6天开始连续3天单剂量腹腔注射胸腺法新。在肿瘤接种后第20天处理动物。通过腹腔注射120mg/kg的戊巴比妥钠杀死动物。取脑，切片，用Histochoice(Amresco Co.，Solon，Ohio)浸润固定，然后石蜡包埋。利用全组织块和以苏木精-伊红染色的组织切片对肿瘤负荷进行评测。还采用免疫组织化学染色研究对组织切片的免疫细胞浸润进行了研究。
胶质母细胞瘤模型：用10,000个9L大鼠胶质母细胞瘤细胞对成年Long Evans大鼠进行脑内接种，该细胞可再生地产生肿瘤，并逐渐增大，在21天内导致死亡。肿瘤生长的时间依赖性过程以及相关的临床症状具有下述特性：1)在第7天时肿瘤直径为4-5mm，身体活动增加；2)在第14天时肿瘤直径为7-8mm，经常观察到与体内肿瘤有关的出血，具有高反应性；以及3)在第21天时肿瘤块为10-12mm，形成小脑疝，动物嗜睡(图5)。用苏木精-伊红对组织切片染色的结果证实了含有浸润性恶性肿瘤细胞的大肿瘤块的存在。利用全脑对冠状切片的组织病理学研究证实，9L细胞接种5天内，肿瘤细胞形成小肿瘤块，该小肿瘤块位于表层皮质层，覆盖软脑膜。在14天内，肿瘤块延伸至包括基底核和侧脑室壁的深层结构中，具有中度水肿，但无疝出(移至正中线结构)。至第21天，肿瘤块几乎占据了全部的右额叶，并对另一侧面的脑半球具有不同程度的延伸(图3)。扩张的肿瘤块造成标志性的脑浮肿、出血、以及疝出。
利用半定量的组织学分级量表来评估肿瘤负荷从而进行组间比较：0-治愈，没有残余肿瘤；1-被限制在表层皮质层的显微可见的肿瘤(＜1mm)；2-肿瘤块占据了少于25％的脑半球横切面(1-2mm)；3-肿瘤块占据了多至50％的脑半球横切面(2-3mm)，并延伸至深层结构；4-占据了50-90％脑半球横切面的大肿瘤负荷，并有疝出。分别由两个不知道如何对组别进行处理的人对切片进行编号并同时分级。为了保证分级的一致性，将所有样品打乱根据编号重新观察。
胸腺法新和BCNU对胶质母细胞瘤生长的作用(图6)：由于在最初的研究中并未观察到自发的肿瘤排斥，因此在9L胶质母细胞瘤植入20天后终止所有的实验。以药物溶剂处理的大鼠与未处理的动物表现出同样的时间依赖性肿瘤生长以及临床征状。与药物溶剂对照组相比，以BCNU治疗的大鼠表现出肿瘤块的明显减小。但是，反应性却并不同一，几乎一半的组没有明显的治疗反应。在其余的动物中，肿瘤负荷降低至50％。仅用胸腺法新治疗的大鼠具有与对照组类似的肿瘤生长以及临床恶化。而且，与包括对照组的其它组相比，胸腺法新治疗的大鼠具有严重的脑内肿胀以及高程度的疝出(脑组织通过钻孔突出)。相反，胸腺法新+BCNU组具有最低的肿瘤负荷，其肿瘤具有肉眼可见的缩小。采用标准化的分级方案来评估肿瘤负荷，我们证实：与药物溶剂或者胸腺法新(低剂量或高剂量)治疗组相比，仅用BCNU进行治疗显著降低了肿瘤负荷(P＜0.001)，以低剂量(45μg/kg)或者高剂量(200μg/kg)胸腺法新+BCNU进行治疗的大鼠具有最小的平均肿瘤负荷(图6)。进一步的研究证实了胸腺法新+BCNU治疗组降低了肿瘤负荷并具有25％的治愈率，因此增加了临床和病理改善(P＜0.001；图7)。
组织病理学也证实了与肿瘤灶相接部位以及肿瘤灶内存在淋巴-单核炎症细胞。在药物溶剂或者BCNU处理的大鼠脑内，浸润并不完全，主要分布在血管周间隙。在胸腺法新或胸腺法新+BCNU进行治疗的大鼠中，炎症细胞的浸润很显著并与肿瘤块以及毗邻的脑实质相连，且覆盖了软脑膜。免疫组化染色研究证明这些细胞为T淋巴细胞和巨噬细胞。以高剂量胸腺法新或高剂量胸腺法新+BCNU治疗的大鼠比仅以低剂量胸腺法新处理的大鼠具有更严重的脑肿胀。组织病理学以及免疫组织化学染色研究证实了高剂量胸腺法新处理组中，更严重的浮肿以及炎症反应与肿瘤块相关联。
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