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具有药效的梅提取物及 含有该提取物的组合物
    【技术领域】

    本发明涉及具有药效的梅提取物及含有该提取物的组合物。

    背景技术

    迄今为止，为获得食用梅栽种了大量梅树。但是，目前的现状是梅肉和青梅提取物以外的梅树部分均作为工业废弃物处理。例如，在梅树的栽培过程中，每年秋季要剪去徒长的荒枝，这个量非常大，每年为数千至数万吨。修剪的树枝作为废弃物燃烧处理。另外，即使采集青梅提取物和梅肉后的果壳，其大部分也废弃了。因此，从有效利用资源和保护环境的观点出发，这些均是不希望发生的。

    另一方面，在药物等领域中，来源于自然界生物的药物(包括所谓中药和生药)比化学合成的药物更能引起人们的注意。这是因为合成药物尽管功效优良，但仍存在副作用的问题。对此，可以认为从自然界存在的生物，特别是自古人们食用的生物分离得到的物质，据有较好的安全性。另外，由于生物生存环境是多种多样的，这就隐藏着由它们分离得到的物质作为药物的未知可能性，特别是梅自古以来被认为对人体的健康有益，并在宗教活动中也使用，是被视为神圣地植物，所以能够特别引起人们的期待。因此，如果开发出针对目前特别成问题的疾病的药物，也是对社会的贡献。

    因此，本发明的目的在于提供一种可能对梅的有效利用作出贡献的具有药效的梅提取物及含有该提取物的组合物。

    发明公开

    本发明人为了实现上述目的，对梅各个部分的提取物的药效进行了一系列悉心研究。结果得到了具有如下所示优良药效的梅提取物。

    也就是说，本发明的第1种梅提取物是由选自梅树的干、梅树的枝、梅树的叶、梅树的茎、梅树的根、梅肉、梅的果壳和梅的果仁中至少一种提取的具有药效的梅提取物，是能够作为抗氧化剂、胃粘膜损伤抑制剂、具有醛糖还原酶抑制活性的糖尿病性白内障预防剂、具有醛糖还原酶抑制活性的糖尿病性神经疾病预防剂、血糖值上升抑制剂、酒精吸收抑制剂、血小板凝集促进剂、肝炎抑制剂、抗炎剂和具有酪氨酸酶抑制活性的黑色素生成抑制剂使用的梅提取物。

    其中，由梅树的叶和梅树的茎中至少一方得到的提取物作为抗氧化剂、糖尿病性白内障预防剂、糖尿病性神经疾病预防剂、血小板凝集促进剂、抗炎剂或黑色素生成抑制剂效果非常优良，因而优选。另外，梅树的茎是指存在于树叶和树枝之间支撑树叶的部分。以下，将树叶和茎并称为叶茎部。

    上述第1种提取物作为胃粘膜损伤抑制剂或酒精吸收抑制剂使用时，梅提取物优选从梅的果仁得到的提取物。这是由于该提取物的上述药效优良。

    上述第1种提取物中，上述梅提取物作为血糖上升抑制剂或肝炎抑制剂使用时，梅的果仁和叶茎部中的任意一种提取物均显示优良的药效。

    上述第1种提取物优选含有选自下述化学式(1)～(6)表示的6种物质中的至少一种。这是由于推测这些物质与上述各种药效有关。(式1)(式2)(式3)(式4)(式5)(式6)

    以下，分别将上述化学式(1)的物质称为PM-1，将上述化学式(2)的物质称为PM-2，将上述化学式(3)的物质称为PM-3，将上述化学式(4)的物质称为PM-4，将上述化学式(5)的物质称为PM-5，将上述化学式(6)的物质称为PM-6。另外，这些物质的名称如下所示。PM-1：3β-羟基-12-夹竹桃(olean)-28-酸PM-2：2α，3β-羟基-12-乌森(ursen)-28-酸PM-3：3β，19α-二羟基-2-氧-12-乌森-28-酸PM-4：3β-羟基-12-乌森-28-酸PM-5：2α，3β-二羟基-12-夹竹桃-28-酸PM-6：2α，3β-二羟基-12-夹竹桃-28-酸

    其次，本发明的第2种提取物是从梅花得到的提取物，是能够作为具有醛糖还原酶抑制活性的糖尿病性白内障预防剂、具有醛糖还原酶抑制活性的糖尿病性神经疾病预防剂、抗炎剂、抗氧化剂、具有酪氨酸酶抑制活性的黑色素生成抑制剂和血小板凝集抑制剂使用的提取物。另外，本发明中，梅花是指梅的生殖器官，是由雌蕊、雄蕊、花瓣、萼片、花柄、花苞等构成的部分。

    上述第2种提取物优选含有选自下述化学式(7)～(14)表示的8种物质中的至少一种。这是由于推测这些物质与上述各种药效有关。(式7)(式8)(式9)(式10)(式11)(式12)(式13)(式14)

    以下，分别将上述化学式(7)的物质称为PM-7，将上述化学式(8)的物质称为PM-8，将上述化学式(9)的物质称为PM-9，将上述化学式(10)的物质称为PM-10，将上述化学式(11)的物质称为PM-11，将上述化学式(12)的物质称为PM-12，将上述化学式(13)的物质称为PM-13，将上述化学式(14)的物质称为PM-14。另外，这些物质的名称如下所示。PM-7：乙酰基芸香苷PM-8：异鼠李醚3-鼠李糖苷PM-9：芸香苷PM-10：栎精3-O-鼠李吡喃糖苷基(1→6)半乳糖PM-11：栎精3-O-新橙皮苷PM-12：丁子香基葡糖苷PM-13：苄基吡喃萄糖苷PM-14：苄醇木糖醇基(1→6)葡糖苷

    本发明中，上述梅提取物优选有机溶剂提取物，特别优选醇提取物。上述醇提取物优选乙醇提取物和甲醇提取物中的至少一种，特别优选甲醇提取物。另外，上述梅提取物优选干馏提取物。

    本发明中，上述梅提取物的形态没有特别的限定，例如可以是粉末状，也可以是液体状(包括糊状)。

    其次，本发明的组合物含有上述本发明的梅提取物。该组合物只要含有上述本发明的梅提取物作为主要成分或有效成分即可，对于其它成分并没有特别限定，可以根据其用途适当确定。例如，组合物为药物时，其剂型是以上述梅提取物作为主成分或有效成分，由固体或液体赋形剂构成，内服剂型通常包括散剂、片剂、胶囊剂、搽剂、颗粒剂、液体制剂(酒精剂、酊剂、流浸膏剂、糖浆剂等)的形式。另外还包括注射剂、软膏剂、液体制剂、湿布剂、生药、喷雾剂、滋养灌肠剂、乳剂等形式。上述赋形剂可以使用本领域公知的物质。散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂等内服粉末制剂的赋形剂例如乳糖、淀粉、糊精、磷酸钙、碳酸钙、合成或天然硅酸铝、氧化镁、干燥氢氧化铝、硬脂酸镁、碳酸氢钠、干燥酵母等。另外，外用散剂的赋形剂例如氧化锌、滑石、淀粉、カキリン、硼酸粉末、硬脂酸锌、硬脂酸镁、次没食子酸铋、硫酸铝钾粉末等。液体制剂中的赋形剂例如水、甘油、丙二醇、糖浆、乙醇、脂肪酸、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇等。软膏中的赋形剂例如由脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木蜡、石蜡、液体石蜡树脂、高级醇、塑料、醇类、水、表面活性剂等组合配制而成的疏水性基质或亲水性基质(包括乳剂性基质、水溶性基质、悬浊性基质)。

    另外，作为健康食品和食品添加剂使用上述本发明的上述组合物时，能够以片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂等形式使用，优选以能够明显区别于药品的形式使用。另外，此时的赋形剂可以使用上述物质。

    本发明的组合物中，梅提取物的含有比例相对于全部组合物为1～60重量％的范围，优选10～40重量％的范围。附图的简要说明

    图1是本发明一个实施例的梅提取物的血小板凝集促进作用的确认图，图2是本发明其它实施例的梅提取物中的药效成分的精制过程示意图，图3是本发明其它实施例的梅提取物的红外吸收图谱测定图，图4是本发明其它实施例的梅提取物的红外吸收图谱的测定图，图5是本发明其它实施例的梅提取物的血小板凝集促进作用的确认图，图6是本发明其它实施例的梅提取物的血小板凝集促进作用的确认图，图7是本发明其它实施例的梅提取物的血小板凝集促进作用的确认图，图8是本发明其它实施例的梅提取物中的药效成分的精制过程示意图。发明的最佳实施方式

    本发明的梅提取物例如可以按照下述方式制备。

    首先，用有机溶剂提取时，将梅树的技或叶茎部加工成片状。该加工过程，对于梅树的干、枝、根等硬的部分，可以使用木材用切割器等进行，对于梅花或叶茎部等柔软的部分，可以使用烹饪用刀或搅拌器等进行。

    然后，将块状的梅树的技等浸渍在有机溶剂中进行提取。上述有机溶剂如甲醇、乙醇、己烷、丙酮、乙酸乙酯、甘油、丙二醇、正丁醇等。其中如上所述优选甲醇或乙醇，特别优选甲醇。另外，这些有机溶剂可以只使用一种，也可以两种以上并用。另外，有机溶剂的用量通常是使用上述片状物的5～10倍体积量，优选约5倍体积量。浸渍(提取处理)可以是1次，优选进行2次以上。另外，提取优选加热回流。此时，提取所需要的时间通常为1小时～3小时，优选约3小时，有机溶剂的温度根据有机溶剂的种类适当决定，优选提取溶剂产生回流的温度，具体优选约50～80℃的范围。另外，室温下进行提取时，提取时间优选一昼夜。通过这种提取，从梅树的枝、叶茎部、梅花等中将药效成分提取到有机溶剂中。然后，用滤器等分离梅树的枝等片状物，回收提取液。

    而且，上述提取液可以直接使用，也可以将有机溶剂蒸发(减压干燥等)制成粉末或糊状物使用。

    其次，采用干馏时，首先与前述同样将梅树的枝或叶茎部等加工成片状。然后隔绝空气对其进行加热处理(干馏)。此时的加热温度通常为90～300℃，加热时间通常为1～3小时。这种干馏可以使用蒸馏釜和干馏用釜。以通过这种干馏流出的液体作为提取液与上述树枝等分类回收。该干馏提取液可以直接使用，也可以干燥成粉末状或糊状使用。

    本发明中使用梅的种类没有特别的限定，例如可以使用南高梅、小粒南高、古城、改良内田、白加贺、养青、林州、惊宿、甲州小梅、红さし、皆平等。

    其次，说明本发明的实施例。另外，下述实施例中使用的梅是南高梅。(实施例1)

    本实施例是确认梅的果仁和叶茎部甲醇提取物的胃粘膜损伤抑制作用的实施例。(叶茎部提取物的制备)

    将细粉碎的梅的叶茎部5.1kg在其5倍体积量的甲醇中加热回流3小时进行提取。过滤提取液后，与上述同样再次用甲醇加热回流对残渣进行提取。然后合并得到的提取液，减压干燥，得到338g的提取物。其物理性质如下所示。(外观和性状)

    黑褐色糊状物，有少许特殊气味。(薄层色谱法)

    (1)条件：载体：硅胶(60F254，メルルク公司制)展开溶剂：氯仿∶甲醇∶水＝10∶3∶1的混合液(体积比)显色：在10％硫酸铈和10％硫酸水溶液中加热

    (2)Rf值

    斑点1：0.70(红色)

    斑点2：0.63(茶色)(红外吸收图谱)

    (1)测定仪器：Shimadzu FT-IR DR-8000 spectrometer

    (2)测定结果(单位：cm-1)

    具有3432(羟基)、2936(甲基、亚甲基、甲烷基)、1736(羰基)、1655(不饱和键)、1383(甲基、亚甲基、甲烷基)、1109、1082、1037(羟基、醚键)、792、760(不饱和键)的特征吸收。其结果如图3所示。(梅的果仁提取物的制备)

    将细粉碎的梅的果仁2.5kg在其5倍体积量的甲醇中加热回流3小时进行提取。过滤提取液后，与前述同样再次用甲醇加热回流对残渣进行提取。然后合并得到的提取液，减压干燥，得到223g的提取物。其物理性质如下所示。(外观和性状)

    茶褐色糊状物，有少许特殊气味。(薄层色谱法)(1)条件：同上(2)Rf值

    斑点1：0.10(茶色)

    斑点2：0.95(茶色)(红外吸收图谱)(1)测定仪器：同上(2)测定结果(单位：cm-1)

    具有3453(羟基)、2928(甲基、亚甲基、甲烷基)、2500～2000(酚性羟基、羧基)、1746(羰基)、1655(不饱和键)、1072、1051(羟基、醚键)的特征吸收。另外，其结果如图4所示。(抑制胃粘膜损伤效果的确认)

    给SD雄性大鼠(体重约250g)断食约24小时后，口服给与上述甲醇提取物。经过1小时后，以1.5ml/只的比例口服给与甲醇，再经过1小时后，摘除胃。用福尔马林处理胃，求出胃腺发生损伤部分的最大直径(损伤系数(mm))，并根据下述标准求出分值(0～9)。另外，作为对照，对于不给与上述甲醇提取物的大鼠同样求出损伤系数(mm)和分值(0～9)。另外，按照下式求出抑制率(％)。其结果如下述表1所示。另外，在同一表中，值用平均值±标准误差表示(显著差异：*P＜0.05、**P＜0.01)，其它表也同样。

    抑制率(％)＝100－〔(C/A)×100〕

           A：给与甲醇提取物的大鼠的损伤系数

           C：对照大鼠的损伤系数(分值)0：无损伤1：全长5mm以下、宽2mm以下的轻度损伤不足5个2：全长5mm以下、宽2mm以下的轻度损伤在5个以上3：全长5mm以上、宽2mm以下的中度损伤不足5个4：全长5mm以上、宽2mm以下的中度损伤在5个以上5：全长5mm以下、宽2mm以上的中度损伤出血点为1至3个6：全长5mm以下、宽2mm以上的中度损伤出血点为4个以上7：全长5mm以上、宽2mm以上的重度损伤出血点为1至3个8：全长5mm以上、宽2mm以上的重度损伤出血点为4至6个9：全长5mm以上、宽2mm以上的重度损伤出血点在7个以上(表1)  梅提取物种类    用量    N    损伤系数       抑制率     分值

                (mg/kg)  (匹)    (mm)          (％)

    对照        -          8    173.4±16.9     -       7.8±0.2

    梅的叶茎部  250        6    92.8±22.8**    46.5    5.7±0.7*

    梅的叶茎部  500        6    24.0±12.4**    86.2    2.2±0.7**

    梅的果仁    250        6    46.1±4.4**     73.4    3.5±0.8**

    梅的果仁    500        6    25.8±11.7**    85.1    1.7±0.7**(*P＜0.05、**P＜0.01)

    由上述表1可知，通过给与梅甲醇提取物能够抑制胃粘膜损伤，这种效果梅的果仁一方优良。(实施例2)

    本实施例是确认梅的叶茎部甲醇提取物的抗氧化作用的实施例。另外，叶茎部甲醇提取物的制备与实施例1同样进行。(抗氧化作用的确认方法)

    利用稳定游离基1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼基(DPPH)的乙醇溶液在517nm处有蓝色吸收，如果加入游离基补充物质蓝色吸收会根据添加量会退色这一性质。首先，混合乙醇1ml、上述提取物的乙醇溶液(浓度0～100μg/m1)1ml、0.2M乙酸缓冲液(pH5.5)2ml和DPPH溶液(2.0×10-7mol/ml乙醇溶液)1ml，放置30分钟。然后测定该混合液在517nm处的吸光度。另一方面，以使用乙醇1ml代替DPPH溶液的混合液作为空白，与上述同样测定其在517nm处的吸光度。然后，计算出吸光度达到1/2时所必需的上述提取物的量，将其作为抗氧化的指标。另外，作为比较例，用α-生育酚和绿茶代替上述提取物，考察其抗氧化能力。其结果如表12所示。(表2)

      样品                抗氧化能力

    梅的叶茎部提取        10μg

    a-生育酚              21μg

    绿茶                  20μg(抗氧化能力：捕捉1.0×10-7mol  DPPH所需要的量)

    由上述表2可知，梅的叶茎提取物具有优良的抗氧化能力，其强度是作为食品等的抗氧化剂使用的α-生育酚的2倍以上。(实施例3)

    本实施例是确认梅的果仁和叶茎部的血糖上升抑制作用的实施例。本实施例中，梅的果仁甲醇提取物和梅的叶茎部甲醇提取物采用与实施例1同样的方法制备。(抑制血糖上升作用的确认)

    将上述提取物(500mg/kg)口服给与断食约20小时的Wistar系雄性大鼠(体重150～180g)，30分钟后口服给与蔗糖(1.0g/kg)。30分钟后、1小时后和2小时后由眼窝静脉取血约0.2m1。以3000rpm的速率离心分离采集的血液，得到血清，按照使用市售试剂盒(葡萄糖CII试验WCO，和光纯药公司制)的葡萄糖氧化酶法测定血糖值。另外，作为正常组，同样测定未给与上述提取物和蔗糖的上述大鼠的血糖值，作为对照组，测定未给与上述提取物而只给与了蔗糖的上述大鼠的血糖值。结果如下述表3所示。另外，用于实验的大鼠各个处理组均为6只。(表3)  处理组                    血糖值(mg/100ml)

                0.5h          1.0h          2.0h  正常组        73.1±4.6**   81.9±6.8**   80.2±5.3**  对照组        182.0±5.7    163.1±4.5    109.4±3.5  梅的果仁      172.7±4.8    155.8±9.5    107.8±4.4  梅的叶茎部    174.5±9.7    157.5±4.5    109.8±4.6

    由上述表3可知，通过给与梅的果仁和梅的叶茎部的提取物，能够抑制血糖的上升。另外认为该效果在果仁与叶茎部之间没有明显差异。(实施例4)

    本实施例是确认梅的果仁甲醇提取物和叶茎部甲醇提取物的酒精吸收抑制作用的实施例。另外，上述各甲醇提取物与实施例1同样制备。(抑制酒精吸收作用的确认)

    将上述提取物(500mg/kg)口服给与断食约20小时的Wistar系雄性大鼠(体重约210～240g)，30分钟后口服给与乙醇(20％(v/v)，5ml/kg)。30分钟后、1小时后和2小时后由眼窝静脉取血0.5ml，按照酶法(使用Belin garman him公司生产的市售测定试剂盒——血中酒精测试“BMY”)测定血中乙醇的浓度。另外，作为对照组，对未给与上述提取物而给与了乙醇大鼠同样测定血液中乙醇的浓度。结果如下述表4所示。另外，用于实验的大鼠各个处理组中均为5只。(表4)

    处理组                血液中乙醇的浓度(mg/ml)

              0.5h            1.0h            2.0h  对照组      0.825±0.051    0.671±0.022    0.337±0.003  梅的果仁    0.571±0.154    0.586±0.079    0.332±0.029  叶茎部      0.783±0.147    0.760±0.086    0.512±0.067

    由上述表4可知，通过给与梅的果仁甲醇提取物和叶茎部甲醇提取物，能够抑制酒精的吸收。另外，梅的果仁提取物一方效果优良。(实施例5)

    本实施例是确认梅的果仁甲醇提取物和叶茎部甲醇提取物对来源于大鼠晶状体的醛糖还原酶抑制活性的实施例。醛糖还原酶是与糖尿病性白内障和糖尿病性神经疾病有关的酶。上述各甲醇提取物与实施例1同样制备。(醛糖还原酶溶液的制备)

    在磷酸缓冲液(135mM，pH7.0，含有0.10mM巯基乙醇)20ml中，将Wistar系雄性大鼠(6周龄)的晶状体5g均化，以100000xg离心分离30分钟，将得到的上清液作为酶溶液使用。(抑制醛糖还原酶活性的确认)

    30℃下，将含有1mM DL-甘油醛、0.03mM NADPH、0.1M硫酸锂、上述来源于大鼠晶状体的醛糖还原酶溶液和上述提取物的DMSO溶液(浓度0～30μg/ml)的135mM磷酸缓冲液(pH7.0)培养30分钟。反应通过加入NADPH开始，通过加入盐酸停止。用强碱处理反应停止后的反应液之后，60℃下加热10分钟，放置至室温。然后，测定上述反应液的荧光强度(激发波长：360nm，放射波长：460nm)。以使活性降低至50％的上述提取物的量(IC50(μg/ml))作为醛糖还原酶抑制活性进行评价。

    结果，梅的叶茎部提取物的IC50为4.96μg/ml，极微量即显示抑制活性。另外，梅的果仁提取物在30μg/ml的浓度下显示29.3％的抑制活性。(实施例6)

    本实施例是确认梅的叶茎部甲醇提取物的血小板凝集促进作用的实施例。梅的叶茎部甲醇提取物与实施例1同样制备。

    首先，按照常规方法由日本白色种雄性兔的全血制备洗涤血小板(5×105cells/ml)，37℃、1ml Ca2+存在的条件下，用梅的叶茎部甲醇提取物(100μg/ml)刺激，测定此时光透过率的变化(血小板凝集计：Model PAT-4A，二光生物科学公司制)。作为阳性对照，用血小板活化因子(PAF)代替上述提取物进行刺激，同样测定光透过率的变化。然后，以上述阳性对照的凝集率为100％，用相对于它的相对比率表示梅的叶茎部甲醇提取物的血小板凝集促进作用。结果如图1所示。另外，该图中Ca表示添加Ca2+时，S表示凝集刺激开始时。

    由图1可以看出，如果添加梅的叶茎部甲醇提取物，立即引起血小板凝集，1分钟后，相对凝集率上升至约45％。(实施例7)

    本实施例是确认梅的果仁甲醇提取物和叶茎部甲醇提取物的肝炎抑制作用的实施例。上述各种甲醇提取物与实施例1同样制备。(抑制D-半乳糖胺/LPS诱发性急性肝炎的确认)

    以1000mg/kg的比例将上述梅提取物口服给与断食约20小时的ddY系雄性小鼠(10只，体重25～30g)，1小时后，分别以350mg/kg和10μg/kg的比例腹腔内给与D-半乳糖胺、脂多糖(LPS)。10小时后，取血，通过离心分离(3000rpm，10分钟，4℃)得到血清，使用市售试剂盒(STI试验WCO)测定血清中的转氨酶(s-GPT、s-GOT)活性。另外，除不给与上述梅提取物以外同样进行处理的小鼠(10只)作为对照组。然后，计算出给与上述梅提取物的小鼠的上述转氨酶活性相对于该对照组的比例作为抑制率(％)。结果如下述表5所示。(表5)

              s-GPT        s-GOT抑制率(％)    26.6±15.8    32.6±11.7(大鼠原代培养肝细胞中D-半乳糖胺诱发急性肝炎的抑制作用)

    将采用胶原酶灌流法由Wistar系雄性大鼠(体重120～150g)采集的肝实质细胞悬浊在含有10％幼牛血清(CG)的William’s培养基中，以4×104cells/ml播种在96孔平底微孔板上，培养4小时。接着，将上述培养基更换为含有1mM D-半乳糖胺和上述梅提取物(浓度：3，10，30，100，300μg/ml)的培养基，培养44小时后，分别添加5mg/ml 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)10μl，培养4小时。其次，除去培养基，用含有0.04NHCl的2-丙醇提取甲，测定其吸光度(测定波长：570nm，参比波长：655nm)。另外，除不向培养基中加入上述梅提取物以外与上述同样进行操作的组作为对照。然后，计算出添加上述梅提取物时的测定值相对于上述对照的比例作为抑制率(％)。结果如下述表6所示。(表6)提取物浓度(μg/ml)    3         10        30         100         300抑制率(％)  5.2±0.5  9.4±0.8  15.4±1.0  7.9±0.7    2.8±0.2

    由上述表5和表6可知，通过给与梅提取物，能够抑制急性肝炎。(实施例8)

    本实施例是确认梅的叶茎部甲醇提取物的炎症抑制作用的实施例。梅的叶茎部甲醇提取物与实施例1同样制备。(炎症抑制作用的确认)

    考察LPS(10μg/ml)刺激引起的小鼠腹腔内巨噬细胞的NO产生，评价炎症抑制作用。(巨噬细胞的NO的测定)

    将由ddY系雄性小鼠(体重约30g)的腹腔采集的巨噬细胞悬浊在含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中，以5×105cells/ml接种到96孔平底微孔板上，培养14时(37℃，5％CO2)。接着，将上述培养基更换为含有10μg/ml LPS和上述梅提取物(浓度：3，10，30，100，300μg/ml)的培养基，培养20小时。由于NO不稳定，难以直接测定，所以使用格里斯(Griess)试剂定量NO的代谢产物——NO2(Griess法)。也就是说，将上述培养上清液和等量的格里斯试剂(1％磺酰胺/0.1％ N-1-萘基乙二胺/5％磷酸)混合，室温下放置10分钟后，测定吸光度(测定波长：570nm，参比波长：655nm)，将用上述培养基稀释的NaNO2作为标准进行定量。另外，除不加入上述梅提取物以外与上述同样进行操作的组作为对照。然后，计算出添加上述梅提取物时的测定值相对于该对照的比例作为抑制率(％)。结果如下述表7所示。(表7)提取物浓度(μg/ml)    3          10        30        100        300抑制率(％)  26.8±2.2  2.7±1.7  5.7±1.6  13.5±1.4  30.5±0.9

    由上述表7可知，通过给与梅提取物，能够抑制炎症。(实施例9)

    本实施例是确认梅的叶茎部甲醇提取物的黑色素生成抑制作用的实施例。梅的叶茎部甲醇提取物与实施例1同样制备。(抑制黑色素生成作用的确认)

    通过对来源于蘑菇的酪氨酸酶的抑制活性进行评价。也就是说，向40mM磷酸缓冲液含有上述梅提取物(浓度：30、100、300μg/ml)和底物(L-多巴)的混合液(1.9ml)中加入0.25mg/ml酪氨酸酶(来源于蘑菇)0.1ml，25℃下培养5分钟。然后，测定475nm处的吸光度。另外，除不加入上述梅提取物以外与上述同样进行操作的组作为对照。然后，计算出添加上述梅提取物时的测定值相对于该对照的比例作为抑制率(％)。结果如下述表8所示。(表8)提取物浓度(μg/ml)      30     100     300抑制率(％)    3.4    10.5    34.3

    由上述表8可知，通过给与梅提取物，能够抑制黑色素的生成。(实施例10)

    本实施例是对于推测对上述各种药效有用的物质进行精制的实施例。

    首先，与实施例1同样制备梅的叶茎部甲醇提取物(338.0g)。然后，用乙酸乙酯(AcOEt)10升和蒸馏水(H2O)10升分液萃取该提取物326.7g，分离成AcOEt可溶性部分(93.4g)和水可溶性部分(233.3g)。然后，使用硅胶柱色谱法将AcOEt可溶性部分(80.0g)分成8个部分(Fr.1～Fr.8)。对于这些部分，最初使用己烷(Hex)-AcOEt的混合液(体积比，10∶1→5∶1→3∶1)，接着使用CHCl3-甲醇(MeOH)的混合液(体积比，10∶1→5∶1→3∶1)，最后使用MeOH液。结果Fr.4(CHCl3∶MeOH＝10∶1)的部分中，得到了PM-1(49mg)、PM-2(61mg)、PM-3(25mg)和PM-4(81mg)，另外，Fr.5(CHCl3∶MeOH＝5∶1)的部分中，得到了PM-5(38mg)和PM-6(20mg)。另外，其精制过程如图2所示。(实施例11)

    本实施例是确认梅花的甲醇提取物对来源于大鼠晶状体的醛糖还原酶抑制活性的实施例。醛糖还原酶是与糖尿病性白内障和糖尿病性神经疾病有关的酶。上述梅花的甲醇提取物可以按照下述方法制备，并按照下述方法用其研究醛糖还原酶抑制活性。(梅花甲醇提取物的制备)

    将细粉碎的梅花3.0kg在其5倍体积量的甲醇中加热回流3小时进行提取。过滤提取液后，与上述同样再次用甲醇加热回流对残渣进行提取。然后合并得到的提取液，减压干燥，得到250.1g的提取物。其物理性质如下所示。(外观和性状)

    黑褐色粉末状物，有少许特殊气味。(薄层色谱法)(1)条件：载体：硅胶(60F254，メルルク公司制)展开溶剂：氯仿∶甲醇∶水＝10∶3∶1的混合液(体积比)显色：在10％硫酸铈和10％硫酸水溶液中加热(2)Rf值

    斑点1：0.70(黄色)

    斑点2：0.63(黄色)(醛糖还原酶溶液的制备)

    在磷酸缓冲液(135mM，pH7.0，含有0.10mM巯基乙醇)20ml中，将Wistar系雄性大鼠(6周龄)的晶状体5g均化，以100000xg离心分离30分钟，将得到的上清液作为酶溶液使用。(抑制醛糖还原酶活性的确认)

    混合1mM DL-甘油醛、0.03mM NADPH、0.1M硫酸锂、上述来源于大鼠晶状体的醛糖还原酶溶液和上述提取物的DMSO溶液(浓度：1、3、10、30g/ml)、135mM磷酸缓冲液(pH7.0)，30℃下培养30分钟。反应通过加入NADPH开始，通过加入盐酸停止。用强碱处理反应停止后的反应液之后，60℃下加热10分钟后，通过荧光法(激发波长：360nm，发射波长：460nm)定量生成的NADP，将得到的值代入下式计算醛糖还原酶的抑制率。结果如下述表9所示。

    抑制率(％)＝〔(A－B)/A〕× 100

           A：未添加提取物时NADP的产量

           C：添加提取物时NADP的产量(表9)提取物浓度(μg/ml)      1       3       10      30抑制率(％)    29.9    51.2    76.8    89.6

    由上述表9可知，梅花的甲醇提取物具有优良的醛糖还原酶抑制活性(IC50＝3μg/ml)。(实施例12)

    本实施例是确认梅花甲醇提取物的炎症抑制作用的实施例。梅花甲醇提取物与实施例11同样制备。(炎症抑制作用的确认)

    考察LPS(10μg/ml)刺激引起的小鼠腹腔内巨噬细胞的NO产生评价炎症抑制作用。(巨噬细胞的NO的测定)

    将由ddY系雄性小鼠(体重约30g)的腹腔采集的巨噬细胞悬浊在含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中，以5×105cells/ml播种至96孔微孔板上，培养1小时(37℃，5％CO2)。接着，将上述培养基更换为含有10μg/ml LPS和上述梅提取物(浓度：3，10，30，100，300μg/ml)的培养基，培养20小时。由于NO不稳定，难以直接测定，所以使用格里斯(Griess)试剂定量NO的代谢产物——NO2(Griess法)。也就是说，将上述培养上清液和等量的格里斯试剂(1％磺酰胺/0.1％ N-1-萘基乙二胺/5％磷酸)混合，室温下放置10分钟后，测定吸光度(测定波长：570nm，参比波长：655nm)，将用上述培养基稀释的NaNO2作为标准进行定量。另外，除不加入上述梅提取物以外与上述同样进行操作的组作为对照。然后，计算出添加上述梅提取物时的测定值相对于该对照的比例作为抑制率(％)。结果如下述表10所示。(表10)提取物浓度      3         10        30        100         300(μg/ml)抑制率(％)  8.04±4.5  1.7±4.8  5.0±3.8  51.6±6.0*  94.8±1.2*

    由上述表10可知，梅花甲醇提取物显示优良的炎症抑制效果(IC50＝100μg/ml)。(实施例13)

    本实施倒是确认梅花甲醇提取物的黑色素生成抑制作用的实施例。梅花甲醇提取物与实施例11同样制备。(抑制黑色素生成作用的确认)

    通过对来源于蘑菇的酪氨酸酶的抑制活性进行评价。也就是说，25℃下，将含有上述梅提取物的DMSO溶液(浓度：1、3、10、30、100、300、1000μg/ml)、0.1mg/ml的L-多巴和500U/ml酪氨酸酶(来源于蘑菇)的40mM磷酸缓冲液(pH6.8)培养5分钟。然后，测定475nm处的吸光度。另外，除不加入上述梅提取物以外与上述同样进行操作的组作为对照。然后，计算出添加上述梅提取物时的测定值相对于该对照的比例作为抑制率(％)。结果如下述表11所示。(表11)提取物浓度   1    3    10    30   100   300   1000(μg/ml)抑制率(％)  2.3  7.5  11.3  24.1  46.3  63.5  77.5

    由上述表11可知，通过给与梅提取物，能够抑制黑色素的生成。(实施例14)

    本实施例是确认梅花甲醇提取物的抗氧化作用的实施例。梅花的甲醇提取物与实施例11同样制备。(抗氧化作用的确认方法)

    混合0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)1.0ml、乙醇0.5ml、2.0×10-4M的DPPH乙醇溶液0.5ml和梅花甲醇提取物的乙醇溶液0.5ml，室温下放置30分钟后，测定517nm的吸光度。由得到的值计算出使2.0×10-7M的DPPH游离基减少50％所必需的上述提取物的量。结果使上述DPPH游离基减少50％所必需的上述提取物的量为44μg。根据该结果可以说梅花提取物具有优良的抗氧化能力。(实施例15)

    本实施例是确认梅花甲醇提取物的血小板凝集抑制作用的实施例。梅花的甲醇提取物与实施例11同样制备。

    首先，由日本白色种雄性兔的耳缘动脉采集全血后，通过离心分离得到多血小板血浆。将其用含有0.4mM EGTA的Tyrode-Hepes溶液洗涤，制备洗涤血小板(5×105cells/ml)。然后，在梅花乙醇提取物存在的条件下，用0.05U/ml的凝血酶刺激5分钟，用上述血小板凝集计测定此时光透过率的变化。将该测定值代入下式计算血小板凝集的抑制率(％)。结果如下述表12和图5所示。

    抑制率(％)＝〔(A－B)/A〕×100

           A：未添加提取物时的最大凝集率

           C：添加提取物时的最大凝集率

    而且，用乙酸乙酯和水将上述梅花甲醇提取物分液，用上述方法考察乙酸乙酯相和水相的血小板凝集抑制作用。结果如下述表12和图6所示。然后，再使上述水相转移至正丙醇中，用上述方法考察正丙醇相的血小板凝集抑制作用。结果如下述表12和图7所示。另外，图5、图6和图7中，标明样品的位置表示加入上述提取物或各相的时间点，标明凝血素的位置表示加入凝血酶的时间点。(表12)

    浓度(μg/ml)    10    30    100

    (抑制率(％))

    甲醇提取物      0     10    28

    乙酸乙酯相      -     -     5

    水相            11    27    89

    正丁醇相        96    87    96

    由上述表12和图5、图6和图7可以确认梅花甲醇提取物具有抑制血小板凝集的作用。另外，将该甲醇提取物用乙酸乙酯和水分液时，确认乙酸乙酯相无血小板凝集抑制作用，并可确认水相具有显著的抑制血小板凝集的作用。另外，用正丁醇提取上述水相时，可以看到正丙醇相汇集了活性。另一方面，梅花的甲醇提取物几乎不抑制血小板活性因子(PAF)引起的血小板凝集(无图示)。由以上结果可以确认，梅花的提取物特异地抑制凝血酶凝集。根据该结果可以说梅花提取物对心肌梗塞或脑梗塞等血栓引起的病症具有预防、改善效果。(实施例16)

    本实施例是对梅花甲醇提取物中上述各种物质进行精制的实施例。(梅花甲醇提取物的制备)

    将细粉碎的梅花3.0kg在其5倍体积量的甲醇中加热回流3小时进行提取。过滤提取液后，与上述同样再次用甲醇加热回流对残渣进行提取，过滤。然后合并得到的滤液，进行减压干燥，制得梅花的甲醇提取物250.1g。然后，用乙酸乙酯(AcOEt)10升、丁醇(BuOH)10升和蒸馏水(H2O)10升分液萃取该提取物250.1g，分成AcOEt可溶性部分(39.2g)、BuOH可溶性部分(51.2g)和水可溶性部分(150.0g)。然后，使用正向硅胶柱色谱法将BuOH可溶性部分(25.1g)分成16个部分(Fr.1～Fr.16)。对于这些部分，作为溶剂最初使用氯仿(CHCl3)-MeOH的混合液(体积比，10∶1→5∶1)，接着使用CHCl3-MeOH-H2O的混合液(体积比，6∶4∶1)，最后使用MeOH液。结果，Fr.7(CHCl3∶MeOH＝5∶1)的部分中，得到PM-12(丁子香基萄糖苷)和PM-13(苄基吡喃萄糖苷：54mg)，Fr.10(CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1)的组分中，得到PM-7(2”’-O-乙酰基芸香苷)、PM-8(异鼠李醚：36mg)、PM-10(栎精3-O-鼠李吡喃糖苷基(1→6)半乳糖苷：48mg)和PM-14(苄醇木糖基(1→6)萄糖苷：14mg)，Fr.12(CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1)的部分中，得到PM-9(芸香苷：20mg)和PM-11(栎精3-O-新橙皮苷：69mg)。另外，其精制过程如图8所示。工业实用性

    如上所述，本发明提供具有上述各种药效的梅提取物。因此，按照本发明有助于实现梅的有效利用，同时还可以提供对成为社会问题的疾病有用的药品。