一种结核分枝杆菌Ag85B抗原与人IL-2重组融合蛋白及其用途 【技术领域】
本发明涉及一种基因工程重组蛋白：Ag85B/IL-2融合蛋白，及其在制备用于肿瘤免疫治疗，尤其是膀胱肿瘤治疗和预防其复发的药物或蛋白疫苗的用途。
技术背景：
膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，具有发病率高、易浸润转移和易复发等临床特点。
卡介苗(BCG)作为一种活的减毒牛型结核分枝杆菌，是一种有效的生物免疫修饰剂。自1976年Merales等首先报道应用BCG治疗膀胱癌后(Morales A，et al.Intracavitary BacillusCalmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors.J Urol 1976Aug；116(2)：180-183)，多年来的实践证实：膀胱腔内灌注BCG免疫预防与治疗浅表性膀胱肿瘤是一种成功的免疫治疗法，在预防肿瘤复发，治疗残留的肿瘤与原位癌方面和腔内化疗相比，已显示出明显的优势，成为预防膀胱肿瘤复发，治疗原位癌的一线药物和首选方法(Meyer JP，et al.Use of baci lle Calmette-Guerin in superficial bladder cancer.Postgrad.MedJ.2002 Aug；78(922)：449-54)。
细胞因子白介素-2(IL-2)由激活的T淋巴细胞产生，它不仅能促进T、B细胞增殖分化，增强T细胞活性，还能活化NK细胞、诱导其它细胞因子和LAK细胞、以及TIL细胞的产生。Den Otter等(Den Otter W，et al.Intravesical interleukin-2 in T1 papillary bladdercarcinima：regression of marker lesion in 8 of 10 patients.J Urol 1998Apr；159(4)：1183-1186)应用IL-2对10个术后有明显残留的病人行膀胱灌注，连续治疗5天为一疗程，治疗2个月后进行膀胱镜检及残留部位的重复活检以观察疗效，结果10个病人有8个残留部位愈合且反复活检未见肿瘤。作者认为TUR后行IL-2灌注治疗是一种有效的方法，可产生较强的抗肿瘤效应。尽管单独使用IL-2治疗膀胱肿瘤取得了一定地效果，但通过实验人们也发现单独应用IL-2由于与剂量成正比的关系，存在着使用剂量越大，副作用越大的问题(Velotti F，et al.Local activation of immune response in bladder cancer patientstreated with intraarterial infusion of recombinant interleukin-2.Cancer Res 1991Mayl，51(9)：2456-2462)。
已有多项研究证实BCG与IL-2联合膀胱灌注在预防膀胱肿瘤复发优于单用BCG或IL-2灌注。BCG联合IL-2灌注膀胱在预防膀胱癌复发和治疗表浅型膀胱癌方面能发挥相互协同作用。BCG能够激活机体NK细胞、T细胞和巨噬细胞，IL-2有助于NK细胞和细胞毒性T细胞(CTL)的成熟。
无论是BCG还是IL-2在临床治疗膀胱癌均存在着剂量大、疗程长、毒副作用大等缺点。BCG作为一种活的减毒牛型结核分枝杆菌，其生物活性仍具有很强的抗原性、致敏性和残余毒性。临床应用时常引起膀胱炎、发热反应、膀胱孪缩，严重时出现全身性BCG感染与败血症进而危及生命。大剂量IL-2应用时常可引起血管通透性增高，低血压，肾功能损害，骨髓造血抑制等。
Ag85B又称为α-Ag或MPB59，是BCG、结核杆菌及其它分枝杆菌最主要的分泌蛋白，约占分枝杆菌外分泌蛋白总量的1/4(Harth G，Lee BY，Wang J，et al.Novel insights into thegenetics，biochemistry，and immunocytochemistry of the 30-kilodalton majorextracellular protein of mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，1999，64(8)：3038-3047)。在不同的分枝杆菌中，Ag85B在氨基酸和DNA水平，均具有高度的同源性。Ag85B基因长858bp，编码285个氨基酸残基，分子量约30KD。Ag85B是BCG在体外和体内发挥生物学作用的主要成分，也是广泛分布于结核分枝杆菌以及其它非典型分枝杆菌中具有交叉反应性的蛋白，能够诱导机体强烈的Th1型免疫反应。利用分枝杆菌Ag85B的免疫原性，在膀胱癌及其它肿瘤治疗中的应用研究近年来受到重视。Ag85B蛋白能够诱导膀胱癌患者外周血单个核细胞(PBMC)的增殖反应，并能诱导Th1细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-12等细胞因子(Zlotta AR，Drowart A，Vooren JV，et al.Superficial bladder tumors and increased reactivity againstmycobacterial antigens before bacillus calmette-guerin therapy.J Urol，1998，159，1885-1891)；(Kuromatsu I，Matsuo K，Takamuta S，et al.Induction of effective antitumorimmune responses in a mouse bladder tumor model by using DNA of α antigen frommycobacteria.Cancer Gene Therapy，2001，8(7)：483-490)利用转染Ag85B基因的膀胱肿瘤细胞疫苗免疫动物后，抗原递呈细胞(APC)分别通过MHC I类和II类分子，既能递呈CTL表位肽，又能递呈Th表位肽，从而比其它的基因修饰的肿瘤细胞疫苗具有更大的抗肿瘤优势。
鉴于BCG和IL-2在治疗膀胱肿瘤和预防其复发时的不足，我们设想利用基因工程手段，将分枝杆菌中的主要分泌抗原基因Ag85B与人IL-2基因融合，构建Ag85B/IL-2融合基因，原核表达获得Ag85B/IL-2融合蛋白。Ag85B/IL-2融合蛋白用于治疗膀胱肿瘤及预防其复发，既发挥两者的免疫协同作用，又能减少BCG和IL-2引起的毒副作用。
发明内容：
本发明的目的是提供一种重组蛋白，它是将结核分枝杆菌主要分泌抗原Ag85B或其它分枝杆菌分泌Ag85B抗原与人IL-2融合而形成的基因工程重组融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明重组融合蛋白的基因序列。
本发明的再一个目是提供了该重组融合蛋白在制备用于肿瘤免疫治疗，尤其是膀胱肿瘤治疗和预防其复发的药物或蛋白疫苗中的用途。
本发明提供的重组融合蛋白中，结核分枝杆菌主要分泌抗原Ag85B或其它分枝杆菌分泌Ag85B抗原可以位于该融合蛋白的氨基端，也可位于该融合蛋白的羧基端，Ag85B与IL-2之间可以没有连接子，亦可由富含甘氨酸的连接子(Linker)连接，从而增加融合蛋白的柔韧性，有利于两种蛋白单体的正确折叠。连接子氨基酸序列可以为SEQ ID NO：1，也可为SEQ ID NO：2。
SEQ ID NO：1 GGGGS
SEQ ID NO：2 GGGGSGT
本发明所述的Ag85B抗原还可以为卡介苗、耻垢分枝杆菌中的Ag85B抗原。
本发明还提供了一种编码本发明的重组融合蛋白的基因。该基因可以具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3
TTCTCCCGGCCGGGGCTGCCGGTCGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGCGACATCAAGGTTCAGTTCC
AGAGCGGTGGGAACAACTCACCTGCGGTTTATCTGCTCGACGGCCTGCGCGCCCAAGACGACTACAACGGCTGGGATAT
CAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTACTACCAGTCGGGACTGTCGATAGTCATGCCGGTCGGCGGGCAGTCCAGCTTCTAC
AGCGACTGGTACAGCCCGGCCTGCGGTAAGGCTGGCTGCCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAGCTGC
CGCAATGGTTGTCCGCCAACAGGGCCGTGAAGCCCACCGGCAGCGCTGCAATCGGCTTGTCGATGGCCGGCTCGTCGGC
AATGATCTTGGCCGCCTACCACCCCCAGCAGTTCATCTACGCCGGCTCGCTGTCGGCCCTGCTGGACCCCTCTCAGGGG
ATGGGGCCTAGCCTGATCGGCCTCGCGATGGGTGACGCCGGCGGTTACAAGGCCGCAGACATGTGGGGTCCCTCGAGTG
ACCCGGCATGGGAGCGCAACGACCCTACGCAGCAGATCCCCAAGCTGGTCGCAAACAACACCCGGCTATGGGTTTATTG
CGGGAACGGCACCCCGAACGAGTTGGGCGGTGCCAACATACCCGCCGAGTTCTTGGAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAAC
CTGAAGTTCCAGGATGCGTACAACGCCGCGGGCGGGCACAACGCCGTGTTCAACTTCCCGCCCAACGGCACGCACAGCT
GGGAGTACTGGGGCGCTCAGCTCAACGCCATGAAGGGTGACCTGCAGAGTTCGTTAGGCGCCGGCGGTGGCGGAGGCTC
TGGTACCGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATT
TTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCA
CAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAA
CTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTC
ATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCT
CAACACTGACTTGA
本发明提供的重组融合蛋白具有如SEQ ID NO：4氨基酸序列。该融合蛋白即结核分枝杆菌分泌抗原Ag85B与人IL-2融合而成的融合蛋白，被灌注入膀胱肿瘤患者膀胱内后，可以通过Ag85B与膀胱壁纤维粘连蛋白(FN)结合的特性(Naito M，et al.The novel fibronectin-binding motifand key residues of mycobacteria.J Bio Chem，1998，273(5)，2905-2909)，介导该融合蛋白与膀胱壁粘附，Ag85B经过MHC II类途径加工提呈，可以诱导机体的Th1型细胞免疫反应，分泌Th1型细胞因子IFN-γ和IL-12等，并刺激膀胱癌患者外周血单个核细胞(PBMC)的增殖反应；IL-2能促进T、B细胞增殖分化，增强T细胞活性，活化NK细胞、诱导其它细胞因子和LAK细胞、以及TIL细胞的产生。两者在诱导机体免疫反应方面发挥协同作用，通过机体局部和全身性的免疫反应来灭杀肿瘤细胞，达到预防复发和治疗作用。
SEQ ID NO：4
MFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSS
FYSDWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDP
SQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFV
RSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAGGGGGSGTAPTSSSTKKTQLQLEHLLL
DLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELK
GSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
本发明的重组融合蛋白可以用已知的基因工程方法，通过原核表达或者真核表达获取。
发明的用途：
适用于制备用于肿瘤免疫治疗的药物，尤其适用于制备膀胱肿瘤治疗和预防其复发的药物或蛋白疫苗。
发明的优点：
本发明与BCG和IL-2相比，在治疗膀胱肿瘤和预防膀胱肿瘤复发时有如下优点：1.具有Ag85B和IL-2的双功能活性，能同时发挥两者免疫作用；2.Ag85B为分枝杆菌的主要分泌性蛋白，具有BCG的免疫原性，但又不具有BCG活菌疫苗的毒副作用；3.Ag85B与IL-2融合，两者具有免疫协同作用，从而相应减少IL-2的临床用量，其毒副作用也降低；4.Ag85B具有与膀胱壁纤维粘连蛋白(FN)结合的特性，从而靶向性的引导融合蛋白粘附于膀胱壁，延长药物的作用时间。
【附图说明】
本发明通过实施例进一步说明，实施例包括如下附图：
附图1为Ag85B PCR扩增产物DNA电泳图；
附图2为质粒pUC18-Ag85B的限制性内切酶切电泳图；
附图3为hIL-2 PCR扩增产物DNA电泳图；
附图4为质粒pUC18-IL-2的限制性内切酶切电泳图；
附图5为质粒pUC-Ag85B/IL-2的限制性内切酶切电泳图；
附图6为质粒pG Ag85B/IL-2的限制性内切酶切电泳图；
附图7 Ag85B/IL-2融合基因的部份序列的测序报告；
附图8为质粒pG-Ag85B/IL-2重组大肠杆菌BL21表达的SDS-PAGE电泳图；
附图9为pG Ag85B/IL-2重组大肠杆菌BL21诱导表达产物的Western blot图；
附图10为Ag85B/IL-2融合蛋白经RP-HPLC纯化后SDS-PAGE电泳图；
附图11为Ag85B/IL-2融合蛋白RP-HPLC纯度分析图；
附图12为Ag85B/IL-2融合蛋白刺激作用下的人外周血单个核细胞培养上清中的IFN-γ含量对比图；
附图13为Ag85B/IL-2融合蛋白刺激作用下的人外周血单个核细胞培养上清中的IL-12含量对比图；
附图14为Ag85B/IL-2融合蛋白激活的杀伤细胞对膀胱肿瘤细胞的细胞毒作用对比图。
【具体实施方式】
实施例1
获取结核分枝杆菌(Edman株)Ag85B抗原的编码基因
结核分枝杆菌(Edman株)来源于山东省医学科学院基础医学研究所。采用7H9液体培养基培养结核杆菌，培养温度37℃，2周后离心培养物，收集菌体，从中提取结核杆菌基因组DNA。
提取结核分枝杆菌基因组DNA的方法参照Molecular clonging一书(J.Sambrook，Isolation of high-molecular-weight DNA from mammaliancells，9.16-9.22，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
采用PCR法自结核杆菌基因组DNA中扩增Ag85B结构基因。采用的5`端引物序列为；5`CGGAATTCTTCTCCCGGCCG 3`(SEQ ID NO：5)；3`端引物序列为5`GGGGTACCAGAGCCTCCGCCACC GCCGGCGCCTAACG 3`(SEQ ID NO：6)。
所述PCR操作程序为：在一50ul微量离心管中加入下列反应试剂：
模板DNA 2ul
10×PCR缓冲液(含氯化镁)5ul
dNTPs(10mmol/L)4ul
5`端和3`端引物(0.01mmol/L)各1ul
TaqDNA聚合物(5u/ul)1ul
加去离子水至终体积50ul
反应条件：94℃，5min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec；30个循环后，72℃充分延伸10min。
Ag85B PCR结果参见附图1。
Ag85B目的基因经纯化后用EcoRI+KpnI双酶切，与同样用EcoRI+KpnI双酶切的pUC18质粒(购自Promega公司)连接，酶切、连接、转化及重组克隆的筛选按Molecular clonging进行。构建含有结核杆菌Ag85B结构基因的质粒pUC18-Ag85B。
质粒pUC18-Ag85B的限制性内切酶切鉴定结果参见附图2。
该实施例成功获取结核分枝杆菌(Edman株)Ag85B抗原的编码基因，并构建出含有结核杆菌Ag85B编码基因的质粒pUC18-Ag85B。
实施例2
获取人IL-2的编码基因
自丝裂原刺激的人Jurkat T淋巴瘤细胞(来自中科院细胞所)中提取总RNA，提取方法按上海生工公司RNA提取试剂盒进行。采用RT-PCR法获得人Jurkat T细胞瘤cDNA。
自上述cDNA中用PCR法扩增人IL-2的编码基因。采用的5`端引物序列为：5`GG GGTACCGCACCTACTTC 3`(SEQ ID NO：7)；3`端引物序列为5`CGGGATCCTCAAGTCAGTGT 3`(SEQ ID NO：8)
所述PCR操作程序为：在一50ul微量离心管中加入下列反应试剂：
模板DNA 1ul
10×PCR缓冲液(含氯化镁)5ul
dNTPs(10mmol/L)4ul
5`端和3`端引物(0.01mmol/L)各1ul
TaqDNA聚合物(5u/ul)1ul
加去离子水至终体积50ul
反应条件：94℃，5min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec；30个循环后，72℃充分延伸10min。
hIL-2 PCR扩增结果参见附图3。
人IL-2目的基因经纯化后用KpnI+BamHI双酶切，与同样用KpnI+BamHI双酶切的pUC18质粒(购自Promega公司)连接，酶切、连接、转化及重组克隆的筛选按Molecular clonging进行。构建含有人IL-2编码基因的质粒pUC18-IL-2。
质粒pUC18-IL-2的限制性内切酶切鉴定结果参见附图4。
该实施例成功获取人IL-2编码基因，并构建出含有人IL-2编码基因的质粒pUC18-IL-2。
实施例3
构建Ag85B-IL-2原核表达质粒：pG-Ag85B/IL-2。
采用KpnI+BamHI双酶切pUC18-IL-2，胶回收IL-2基因片段，与同样用KpnI+BamHI双酶切的pUC18-Ag85B质粒连接，酶切、连接、转化及重组克隆的筛选按Molecular clonging进行。构建含有Ag85B/IL-2融合基因的质粒pUC-Ag85B/IL-2。
质粒pUC-Ag85B/IL-2的限制性内切酶切鉴定结果参见附图5。
采用EcoRI+SalI双酶切质粒pU-Ag85B/IL-2，胶回收Ag85B/IL-2融合基因片段，与同样用EcoRI+SalI双酶切的pGEX4T-1质粒(购自Promega公司)连接，构建含有Ag85B/IL-2融合基因的原核表达质粒pG-Ag85B/IL-2。
质粒pG-Ag85B/IL-2的限制性内切酶切鉴定结果参见附图6。
基因序列测定：用ABI公司的DNA测序仪进行。结果表明：Ag85B/IL-2融合基因的序列与设计的完全一致。Ag85B/IL-2融合基因的部份序列的测序结果参见附图7。
该实施例成功构建了含有Ag85B/IL-2融合基因的原核表达质粒pG-Ag85B/IL-2。
实施例4
质粒pG-Ag85B/IL-2转化大肠杆菌BL21并诱导表达。
1.BL21感受态菌的制备。
(1)将-20℃冻存的大肠杆菌BL21划线接种于含氨苄青霉素(100ug/ml)LB琼脂板上，37℃孵育箱内培养过夜(16～18h)。
(2)取单菌落接种于3～5ml含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡(200rpm/min)培养过夜。
(3)取250μl菌液加入25ml LB液体培养基中，37℃振荡培养约2～4h，至OD600＝0.4～0.5时，停止培养。
(4)将菌液移入离心管中，冰浴10min，5000rpm离心10min。
(5)弃培养液，沉淀用5ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬后，5000rpm，10min离心洗涤一次。
(6)上述沉淀中加入10ml冰冷的100mmol/L CaCl2，冰浴2～4小时即可用于转化实验。
2.质粒pG-Ag85B/IL-2的转化
(1)在3只预冷的1.5ml的消毒EP管中按表加入感受态细菌和质粒DNA。
EP管号 感受态细菌 质粒DNA
①转化组 95μl 5μl
②阴性对照组 100μl -
③阳性对照组 98μl 2μl
(2)将上述EP管冰浴30min～1h，42℃热休克90sec，冰浴2min。
(3)各管加入不含抗生素的LB液体培养基400μl，37℃水浴5min，置摇床37℃振荡培养45min～1.5h。
(4)分别用消毒枪头吸取100μl上述的培养液，加入含氨苄青霉素的LB平板和普通LB平板，用弯头消毒玻棒将液体均匀涂于板上，于37℃培养箱中正向放置1h后，倒置过夜培养。用限制性酶切方法鉴定重组克隆。
(5)质粒和菌种的保存：质粒冰冻保存于-20℃。菌种在含有20-50％甘油的培养液中-70℃保存。
3.Ag85B/IL-2融合基因的原核表达
(1)用鉴定好的阳性重组子菌液划板，挑取新鲜的单菌落接种入3ml的LB(含Amp 100μg/mL)，37℃振摇过夜。
(2)将饱和菌液以1∶100的稀释度加入5ml LB(含Amp100μg/mL)，37℃振摇到OD600为0.6左右。
(3)加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续37℃振摇培养4h。4℃离心5min(5000rpm)，收集细菌体，立即使用或冻存。
(4)取适量菌体，加10μl灭菌去离子水彻底悬浮后，加入10μl×SDS加样缓冲液于细菌中，100℃加热3min以使蛋白变性。同样方法处理高分子量蛋白Marker。用SDS-PAGE(浓缩胶5％，分离胶11％)分析以上样品，确定融合蛋白有无表达。
(5)SDS-PAGE电泳分析检测重组蛋白。结果参见附图8。
图中表明：pG-Ag85B/IL-2在BL21菌中获得了高效表达，表达量约40％。由于表达载体pGEX4T-1启动子后带有GST基因，所以Ag85B/IL-2蛋白是以GST-Ag85B/IL-2融合蛋白的形式表达的，分子量约为71KD，并以不溶解的包涵体的形式存在。
4.GST-Ag85B/IL-2融合蛋白的Westrn blot鉴定
pG-Ag85B/IL-2重组菌诱导表达后，行SDS-PAGE，电转印至PVDF膜。利用兔抗人IL-2单克隆抗体免疫鉴定表达产物，结果参见附图9。
图中显示：在71KD处出现一明显条带，与GST-Ag85B/IL-2融合蛋白理论大小一致。
实施例5
Ag85B/IL-2融合蛋白的纯化。
1.细菌收集与包涵体的提取
(1)收集1L诱导表达的工程菌，4℃5000rpm离心10min收集表达后菌体。
(2)加入10mmol/L PBS(pH7.5)，磁力搅拌30min，4℃5000rpm离心10min，收集沉淀。
(3)同上重复洗涤两次。
(4)在冰浴中超声破菌2min/次，共10次，间隔10sec，输出功率70W。用细菌裂解缓冲液悬浮。
(5)4℃8000rpm离心20min，收集沉淀。
细菌裂解缓冲液的配制
PBS(pH7.5) 10mmol/L
EDTA 1mmol/L
2.洗涤包涵体
(1)按每克包涵体加入10ml新配制的预冷4℃的包涵体洗涤液，以磁力旋涡悬浮之。
(2)4℃，8000rpm离心20min，弃去上清。
(3)同上处理，重复5次。
包涵体洗涤液的配制
Triton X-100 0.5％(V/V)
PBS(pH7.5) 10mmol/L
尿素 1mmol/L
3.溶解包涵体
向洗涤后包涵体中加入30ml新配制的预冷的包涵体溶解液，以磁力轻柔搅拌，放置于4℃冰箱溶解过夜。次日，在4℃下以15000rpm离心20min，小心吸取上清，放置于4℃保存备用。
包涵体溶解液的配制
尿素 8mol/L
β-巯基乙醇 0.1mmol/L
4.包涵体的复性
向溶解的包涵体中加入9倍体积的复性缓冲液，室温放置30min，用KOH保持pH到10.7；用HCL调pH至8.0，至少在室温放置30min。10000rpm，4℃离心15min，收集上清，装入透析袋(截留分子量50～80kD)以去离子水透析48h，透析完成后收集透析袋中蛋白溶液，浓缩冻干。置-70℃保存。
复性缓冲液的配制
KH2PO4(pH10.7) 50mmol/L
EDTA(pH8.0) 1mmol/L
还原型谷胱甘肽 2mmol/L
氧化型谷胱甘肽 1mmol/L
5.Ag85B/IL-2融合蛋白的Glutathione Sepharose亲和层析及凝血酶(Thrombin)酶切
采用Pharmacia AKTA explore 100仪对包涵体复性液进行Glutathione Sepharose亲和层析。层析柱为XK 2b，柱床体积50ml。样品流速10ml/min。用10mMolPBS pH7.5，10mMol谷胱甘肽GSH溶液洗脱GST-Ag85B/IL-2融合蛋白。紫外监测波长为280nm，收集蛋白峰。将重组蛋白样品用10mMolPBS pH7.5稀释至1mg/ml，每ml样品溶液中加入凝血酶(sigma)0.2u混匀，室温下作用5h，酶解率大于90％。
5.Ag85B/IL-2融合蛋白的离子交换层析
采用Pharmacia公司的Q Sepharase Fast Flow介质对亲和层析后的融合蛋白进一步纯化。预装一根20cm长Q Sepharase Fast Flow柱，10mMol PBS pH7.5冲洗层析柱，1Mol Nacl，10mMolPBS pH7.5平衡后上柱。流速2.5ml/min。先以0-100％Nacl连续浓度梯度洗脱以确定最适冼脱条件，再行Nacl分步洗脱，收集紫外吸收峰样品。
6.Ag85B/IL-2融合蛋白的RP-HPLC纯化
将离子交换层析收集到的目的蛋白样品在AKTA Explore 100上进行RP-HPLC纯化。选用3ml Resource RPC反相柱，柱长15cm，直径3.5cm。离子交换层析后的样品稀释5倍后上柱，流动相为乙腈溶液，流速1.0ml/min，紫外监测波长为280nm，在10倍柱床体积内经0％～60％溶液梯度洗脱，收集主峰，低温冻干备用。
7.Ag85B/IL-2融合蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定及纯度分析
用11％的分离胶、4％浓缩胶对纯化的样品进行电泳分析，初始电压8V/cm，待样品进入分离胶时增加电压至15V/cm，电泳3h。电泳结束后，揭下凝胶置于玻璃平皿中，加入3～5倍胶体积的固定液室温固定1h以上；倒掉固定液，用考马斯亮蓝R-250染色液染色4h以上，吸出染色液，加适量固定液洗涤凝胶一次，加入脱色液进行漂洗，其间更换脱色液数次，直至蛋白条带清晰为止。以Bio-Rad凝胶扫描分析系统进行扫描。附图10表明Ag85B/IL-2融合蛋白分子量大小约45KD，纯度大于95％。用等电聚焦法测定其等电点约为5.31。
将目的蛋白再用RP-HPLC进行纯度分析结果参见附图11。结果表明Ag85B/IL-2融合蛋白的纯度大于98％。
8.Ag85B/IL-2融合蛋白的N末端氨基酸序列测定
Ag85B/IL-2融合蛋白的SDS-PAGE电泳结束后，电转印至PVDF膜，进行N末端氨基酸序列测定，由北京大学生命科学院完成。
测序结果：Ag85B/IL-2融合蛋白N末端氨基酸序列测定与设计完全一致。
实施例6
Ag85B/IL-2融合蛋白的生物学活性试验
一、Ag85B/IL-2融合蛋白的IL-2活性测定：用IL-2依赖性细胞株CTLL-2细胞测定Ag85B/IL-2融合蛋白的IL-2活性。
1、方法
(1)用RPMI1640稀释IL-2标准品和待测样品，IL-2标准品从100U/ml浓度开始倍比稀释，待测样品也为倍比稀释，稀释后于96孔板中终体积为100ul，每个浓度设3个重复孔；
(2)含10-15％小牛血清(FCS)，200u/ml rIL-2的RPMI-1640培养CTLL-2传代2-4次后，收集对数生长期的CTLL-2细胞(第三军医大学免疫教研室提供)，用RPMI-1640细胞培养液1500rpm，10min，4℃洗涤细胞2-3次，然后重悬于2-5ml含10％FCS的RPMI1640中，制成细胞悬液，用0.5％台盼蓝检测细胞存活率(大于95％)。
(3)调整浓度为1×105/ml。在稀释样品的培养板中，每孔加100ul细胞：
(4)将细胞培养板置37℃，5％CO2，饱和温度中培养32-40h(待阴性孔90％细胞死亡时)；
(5)加入MTT(5mg/ml)20ul/孔，于振荡器上振荡1min，37℃，5％CO2培养2-5h；
(6)取出培养板，以2000r/min离心5min，吸弃上清液，每孔加入DMSO120ul，振荡30s后，在酶标仪上测OD570值。
(7)实验结果观察分析：以IL-2待测样品和标准品的稀释度为横轴，以检测细胞OD值为纵轴作图，求出标准品的最高OD值的50％的稀释度，找出待测样品相应50％IL-2标准品最高OD的稀释度。
2、结果：Ag85B/IL-2融合蛋白的IL-2比活性为2500u/mg。
二、Ag85B/IL-2融合蛋白对人外周血单个核细胞(PBMC)Th1型细胞因子释放的促进作用
1、人外周血单个核细胞(PBMC)的分离
健康供血者的肝素抗凝血5ml，加入等量37℃Hank’s液混匀，取稀释血液10ml距分离液面上约1cm沿管壁轻轻叠加于5ml淋巴细胞分层液上，保持淋巴细胞分层液与血样品之间的界限清晰，2000rmp，离心30min。吸取中层白膜状的单个核细胞层液体，加入8ml 37℃ Hank’s液洗涤2次，每次1500rmp离心10min。沉淀的细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液配成1.0×106/ml单细胞悬液，置细胞培养瓶中，37℃、5％CO2孵箱孵育，待用。
2、效应细胞的诱导
于6孔培养板中加入新鲜制备的PBMC(细胞浓度为1×106/ml)，每孔1ml，分别加入0.8ug/ml Ag85B/IL-2重组蛋白、Ag85B蛋白、500u/ml rIL-2、0.8ug/ml Ag85B蛋白联合500u/ml rIL-2、0.8ug/ml BCG，置37℃，5％CO2孵箱中培养，于第3天测定细胞培养上清中Th1型细胞因子的含量。
3、细胞培养上清中Th1型细胞因子IL-12和IFN-γ的测定(ELISA法)
(1)分别取用抗人IL-12和IFN-γ单抗包被的96孔板，加入IL-12和IFN-γ标准品和不同蛋白刺激的PBMC培养上清(100ul/孔)，另设空白对照孔，每组三个复孔，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃孵箱孵育60分钟。
(2)甩尽孔内液体，每孔加入洗涤液350ul/孔，洗板4次。
(3)除空白孔外，加入生物素化的抗体工作液(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃孵箱孵育60分钟。
(3)尽孔内液体，每孔加入洗涤液350ul/孔，洗板4次。
(4)除空白孔外，加入辣根过氧化物酶标记的亲合素工作液(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃孵箱孵育60分钟。
(5)甩尽孔内液体，每孔加入洗涤液350ul/孔，洗板4次。
(6)加入显色剂(100ul/孔)，避光37℃孵箱孵育20分钟。
(7)加入终止液(100ul/孔)，混匀后5分钟内测量OD450值。
4、结果
表1：不同刺激物作用下的人外周血单核细胞培养上清中的IL-12和IFN-γ含量(pg/ml)
不同刺激物
检测指标
Ag85B/IL-2 Ag85B IL-2 Ag85B+IL-2 BCG
IL-12 99.072±4.502 37.452±2.131* 25.362±1212* 71.521±3.562▲ 51.855±3.087*
IFN-γ 100.135±2.837 10.367±4.834** 81.067±1.804▲ 98.667±1.001 6.667±4.202**
与Ag85B/IL-2组相比，*表示P＜0.01；**表示P＜0.001；▲表示P＜0.05
上述表的柱形对比图参见附图12、13。
5、结论
Ag85B/IL-2重组蛋白刺激的人外周血单个核细胞培养上清中的IL-12浓度显著高于Ag85B，IL-2，Ag85B+IL-2和BCG刺激组；Ag85B/IL-2重组蛋白刺激的人外周血单个核细胞培养上清中的IFN-γ浓度显著高于Ag85B，IL-2和BCG刺激组，与Ag85B+IL-2刺激组无显著性差异。
结果说明：Ag85B/IL-2重组蛋白具有较强的促进人外周血单个核细胞Th1型细胞因子释放的功能。
三、Ag85B/IL-2融合蛋白激活的人外周血单个核细胞(PBMC)对膀胱肿瘤细胞的杀伤活性
1.制备效应细胞
于6孔培养板中加入新鲜制备的PBMC(调整浓度为1×106/ml)，每孔1ml，按0.8ug/ml的浓度加入Ag85B/IL-2诱导AIAK效应细胞，以0.8ug/ml Ag85B蛋白诱导的AAK效应细胞、500u/ml rIL-2诱导的LAK细胞、0.8ug/ml Ag85B蛋白联合500u/ml rIL-2联合诱导的ALAK效应细胞、以及0.8ug/ml BCG诱导的BAK效应细胞作为对照，置37℃，5％CO2孵箱中培养，于第3天收获细胞作细胞毒测定。
2.细胞毒实验(MTT法)
(1)6孔培养板上以效靶比40∶1先加入效应细胞，再加入相应靶细胞(T24，BIU-87，BTT739，EJ)，另设各靶细胞对照孔，效应细胞对照孔，分设3个重复孔。
(2)于37℃，5％CO2培养24h.
(3)每孔加MTT(5mg/ml)20ul，继续培养4h.
(4)2000rpm，离心5min，弃上清。
(5)各孔加DMSO120ul
(6)震荡10min，充分溶解MTT还原产物甲肷。
(7)在酶标仪上测570nm处OD值。
(8)杀伤活性的计算公式：
3.实验结果及结论
表2：不同效应细胞对膀胱肿瘤细胞的细胞毒活性(％)(n＝3，效靶比40∶1)
效应细胞 BIU-87 T24 EJ BTT739
融合蛋白诱导的 60.4±2.1 94.6±4.3 89.4±3.5 77.7±1.5
AIAK细胞
IL-2诱导的LAK细胞 43.0±1.3▲ 92.5±2.5▲ 62.9±6.1▲ 61.1±3.8▲
Ag85B诱导的AAK细 48.8±1.6▲ 93.4±4.3★ 75.7±2.4▲ 71.6±2.5▲
胞
Ag85B+IL-2诱导的 52.6±2.7▲ 94.4±1.5 89.1±3.8 75.2±1.5▲
ALAK细胞
BOG诱导的BAK细胞 52.0±2.2▲ 49.7±2.5▲ 73.6±2.5▲ 53.9±3.4▲
注：▲表示与AIAK细胞组相比P＜0.01；★表示与AIAK细胞组相比P＜0.05
上述表的柱形对比图参见附图14。
结果表明：Ag85B/IL-2融合蛋白诱导的AIAK细胞对BIU-87和BTT739膀胱肿瘤细胞的细胞毒活性显著高于LAK细胞、AAK细胞、ALAK细胞及BAK细胞；对T24和EJ膀胱肿瘤细胞的细胞毒活性显著高于LAK细胞、AAK细胞及BAK细胞。
结论：Ag85B/IL-2融合蛋白诱导的AIAK细胞对膀胱肿瘤细胞具有较强的细胞毒活性，比单用Ag85或IL-2诱导的杀伤细胞的细胞毒活性高。
实施例7
Ag85B/IL-2融合蛋白对膀胱癌荷瘤小鼠的抑瘤效应观察
1.材料：
BTT739为一种在T739小鼠体内建立可移植膀胱移行细胞癌的细胞株，南京铁道医学院提供，本科室冻存，T739小鼠购自中国医学科学院动物室。
2.分组
5周龄的T739小鼠40只，分Ag85B/IL-2融合蛋白疫苗组和空白对照组，每组20只
3.实验方法
(1)膀胱肿瘤动物模型制备
鼠源性膀胱移行癌细胞BTT739在RPMI1640培养基中常规培养，即用含15％小牛血清的RPMI-1640培养基，添加适量抗生素(100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，置37℃、5％CO2混合气体孵箱中培养。细胞换液时间2-3天，2-4天传代，传代前以0.25％胰蛋白酶消化2min，调整细胞浓度为3×106/ml，待用。荷瘤鼠模型采用细胞悬液接种法：5周龄近交系同基因鼠T739，无菌条件下右前腋下皮下接种BTT739肿瘤细胞100μl/鼠(3×105个细胞/只)，制备荷瘤小鼠动物模型。
(2)给药方法：
空白对照组：荷瘤鼠给予PBS 0.1ml瘤内注射；治疗组：荷瘤鼠给予Ag85B/IL-2融合蛋白(200ug/ml)0.1ml瘤内注射
两组分别于接种肿瘤细胞后第0、3、7、13、18天于接种肿瘤部位给药，第21天脱臼法处死小鼠，称取瘤重，根据下列公式计算移植瘤生长抑制率，然后将肿瘤组织液氮中冻存，备用。
结果：
表3：Ag85B/IL-2融合蛋白对膀胱癌荷瘤鼠的抑瘤效应
瘤生长抑制
组别 鼠数 平均瘤重(g)
率(％)
PBS组 20 9.26±1.15 -
Ag85B/IL-2融合蛋白 20 4.49±1.06★ 51.52
注：★表示与对照组相比P＜0.01
结论：Ag85B/IL-2融合蛋白能明显抑制膀胱肿瘤荷瘤鼠体内肿瘤的生长。
实施例8
Ag85B/IL-2融合蛋白对膀胱肿瘤荷瘤小鼠的存活期的延长作用的观察
1.材料及动物模型的制备同前
2.实验方法：
对照组：荷瘤鼠给予PBS 0.1ml瘤内注射；治疗组：荷瘤鼠给予Ag85B/IL-2融合蛋白(200ug/ml)0.1ml瘤内注射
两组分别于接种肿瘤细胞后第0、3、7、13、18天于接种肿瘤部位给药，观察两组荷瘤鼠存活天数。
结果：
表4：Ag85B/IL-2融合蛋白对膀胱癌荷瘤鼠的生存期的延长作用
鼠生存延长
组别 鼠数 存活天数(d)
率(％)
PBS组 20 23.88±3.56 -
Ag85B/IL-2融合蛋白 20 33.00±3.16★ 38.19
注：★表示与对照组相比P＜0.01
结论：Ag85B/IL-2重组融合蛋白能显著延长膀胱肿瘤荷瘤小鼠的存活期。
实施例9
Ag85B/IL-2融合蛋白对肿瘤的治疗方法
在治疗表浅型膀胱肿瘤和预防膀胱肿瘤术后复发时可以是这样实现的：膀胱肿瘤患者排空膀胱后，将Ag85B/IL-2融合蛋白用生理盐水溶解，按无菌导尿术将尿管置入膀胱，缓慢将Ag85B/IL-2融合蛋白溶液注入膀胱腔内。保留2小时，每15分钟更换1次体位，轮流更换为平位、仰位、俯位和左右侧卧位，以便使药物与膀胱壁广泛接触。每周灌注1次，连续6周为一个疗程。必要时可适当延长疗程。
在免疫治疗其它肿瘤时是这样实现的：根据肿瘤的特性，将一定量的Ag85B/IL-2融合蛋白用注射用生理盐水溶解后，通过定期皮下注射、肌肉注射或者瘤体内注射，激活机体免疫系统而发挥抗肿瘤作用。