可用作前体药物的修饰环孢菌素及其应用 本发明涉及由环状十一肽组成的前体药物及其作为药用产品的用途，特别是用于治疗眼睛的病理状况。
环孢菌素构成一类结构独特的环状肽，其共同特点在于它们由十一个氨基酸的链构成，某些因其D构型或因其侧链的复杂化学结构、或因所述胺基团被烷基化而是非典型的。
迄今已从真菌源中分离出约三十种环孢菌素，而且已通过半合成或全合成获得许多类似于这些天然产物的环状十一肽。这些环状十一肽类似物中还包括peptolides或缩肽类，即其链中还含有酯键的环状多肽。
下文中，除非另有说明，术语“环孢菌素”将意指由天然源得到的环状十一肽及通过半合成或全合成得到的其类似物，包括由天然源得到的peptolides或通过半合成或全合成得到的其类似物。
已分离出此环孢菌素家族的第一个成员，将其定为环孢菌素A。构成其十一肽环的肽链如下：
-MeBmt-Abu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-
其扩
环孢菌素A
此环状十一肽所包含的非典型氨基酸中，1-位的氨基酸即N-甲基-(4R)-4-((E)-2-丁烯基)-4-甲基-L-苏氨酸(称为MeBmt)特别引入关注。
此氨基酸是环孢菌素特有的，可任选地使所述烯基还原。它有甲基化的胺基。此外，它所带的羟基在其是整个环状十一肽中唯一能产生化学修饰的基团地这个意义上非常值得注意。可能还已注意到它位于具有高度空间位阻的环境中使得利用试剂接近它的任何方法变得极其微妙。
这些环状十一肽(不论是天然源的还是通过合成得到的)都表现出广谱生物活性，其中最公知的是抑制亚氨基、抗炎或抗寄生虫活性或能抵抗或降低恶性肿瘤对其它治疗的耐药性的活性。已发现这些环状十一肽中的一些有期望的抗病毒活性，特别是在通过抑制1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的复制来治疗AIDS中。
这方面，由本申请人提出的WO00/01715中描述了通过半合成得到的、结构类似于环孢菌素A的一些环状十一肽，但其中相对于所述MeBmt氨基酸4-位或3-和4-位氨基酸的性质已被修饰。
近来药理学的发展已使环孢菌素特别是环孢菌素A的免疫调节作用(该作用是可逆和非骨髓毒性的，几乎未列举出副作用)可被利用的期望成为可能，特别是在眼科领域，尤其用于眼睛及其周围附属器的表面病理状况的局部疗法。
这些病理状况包括干性角膜结膜炎(也称为干眼综合症)、Sjogren’s综合症、过敏性角膜结膜炎尤其是耐皮质类固醇的那些、产生粘液和粘连的结膜炎、疱疹性基质角膜炎、与免疫力有关的边缘角膜炎和Thygeson’角膜炎，和角膜移植排斥反应的预防，以及作为过滤外科手术的辅佐疗法。
环孢菌素家族的环状十一肽是高度疏水性的，这使其在水中的溶解度更低。此特性与其多数氨基酸侧链的性质有关，但与某些氨基酸的胺基被甲基化也有关，因而限制了所述环状十一肽与例如水增溶介质之间形成分子间氢键的可能数量。
结果，这些环孢菌素的静脉内(i.v.)给药需要开发很复杂的药物制剂，主要为乳液型，有时具有不稳定性而难以处理，其是不利副作用的来源。
例如，以商标Sandimmun商购的用于i.v.输注环孢菌素A的制剂之一由用以商标Cremophor商购的聚氧乙烯化蓖麻油作赋形剂的微乳剂构成。该制剂以浓缩物形式保存并且必须在邻近给药之前稀释。
由于使用此蓖麻油(已知其溶解合成材料的某些组分)，因此厂商建议在处理此制剂时只用玻璃或符合“Standards of the EuropeanPharmacopia for receptacles intended to contain blood”(欧洲药典关于要容纳血液的容器的标准)的合成材料，所有这些材料必须不含硅油和脂肪。
此外，还警告临床医师此蓖麻油能引起过敏反应，因此建议仅在不能口服的情况下静脉内给药。
由于很难开发出局部耐受性特别好而不因存在粘性试剂引起视力模糊的合适药物制剂，环孢菌素通过局部给药在眼科应用的开发进展缓慢。
例如，Robert等最近在J.Fr.Opthalmol.，2001，24(5)，527中回顾了由于在眼科局部使用环孢菌素A的药物制剂的亲脂性而必须解决的所有技术难题和这些制剂所引起的局部耐受性问题。
由此回顾可得到的结论之一是迄今还不存在可局部给药用于治疗眼睛及其周围附属器的病症的眼药水形式的制剂。此结论可扩大至环孢菌素用于粘膜的病症或皮肤病症的局部治疗。
因此，还需要使临床医师可使用环孢菌素(不管是天然源还是合成源的)或这些环孢菌素的衍生物，使容易对患者给药特别是局部或静脉内给药，以避免使用不稳定、难以处理且为不利副作用根源的复杂药物制剂。
如果这些天然或合成源的环孢菌素必须局部地用于眼睛或其周围附属器则更有此需要。
面临使疏水的药理活性分子在生理介质中可同化的问题时，专家可能采用的手段之一是进行化学修饰以赋予亲水性。
为避免改变此药理活性分子的药理特性，此化学修饰可存在于制备此药理活性分子的前体(如果可能的话为非活性前体)中，一旦给药时在体内局部存在的生理条件作用下将发生化学或酶促的修饰而释放所述药理活性分子，如果可能的话在其药理作用必须发生的部位或在输送此药理活性分子的血液中从而释放至其作用部位，这对应于“前体药物”的概念。本说明书的其余部分中，所述药理活性分子的前体称为“前体药物”。
对环孢菌素A的结构进行化学修饰使所得产品具有亲水性是已知的实践。
Rothbard等在WO01/13957中描述了一种改进药理活性分子的给药使之能穿过皮肤和上皮膜的方法，其在于在这些分子上可逆地接枝由聚精氨酸链的片段组成的侧链。所述药理活性分子为疏水性分子如环孢菌素A。
此接合物(conjugate)极难操纵和保存因为如所引用的申请中所述当介质的pH超过7时就释放所述药理活性分子。此外，释放此药理活性分子时，所述聚精氨酸链片段也释放在体内。因其毒性及其刺激性是已知的，这些聚精氨酸将产生刺激从而无法期望此环孢菌素接合物可在眼科领域使用。
Crooks等在WO00/67801中描述了抗炎药如氟比洛芬的前体药物的制备，使之能局部给药与眼睛接触，同时避免任何局部刺激。他们通过引入含氧化或多氧化链对一些药物产品实现此制备。
另一方面，当希望使环孢菌素A经同样的化学修饰时，他们仅在获得他们称为稳定的产品方面获得成功，换言之，所述产品无论与人类血清接触还是在pH7.4的磷酸盐缓冲液中都不断裂而释放环孢菌素A。
因而，本发明的目的是使临床医师可使用环孢菌素家族环状十一肽的前体药物，首先可在生理介质内给药而不必开发复杂的药物制剂，其次，可储存然后处理并给药而不必特别担心周围介质的pH条件。
本发明另一目的是使临床医师可使用环孢菌素家族环状十一肽的前体药物，其可在全身、特别是在眼睛的表面上或在粘膜上局部给药，然后可以适合的半衰期释放药理活性的环状十一肽而无局部刺激。
为此，本发明涉及一种由环状十一肽组成的前体药物，其中所述肽链包含至少一个以下通式(I)的氨基酸残基：
其中：
-所述碳原子Ca构成所述十一肽环的环节之一；
-所述取代基Y均代表氢原子或一起构成键；
-所述取代基R1和R3独立地代表氢原子、芳烷基、烷芳基、杂烷基、杂环基、烷基杂环基、杂环烷基或有1至6个碳原子的直链或支链烷基，所述基团可任选地被至少一种选自-COOH、-CONHR8、-NHC＝NH(NH2)、-NHC＝NR8(NH2)、-NH2、-NHR8、-NR82、-N+R83、-OH、-OPO(OR8)2、-OPO(OH)(OR8)、-OPO(OH)2、-OSO(OR8)2、-OSO(OH)(OR8)、-OSO(OH)2、和这些基团的各种成盐形式的基团取代，每个取代基R8独立地代表有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
-取代基R2和R4独立地代表氢原子、烷芳基、或有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
-取代基R5和R6独立地代表氢原子、芳烷基、或有1至6个碳原子的直链或支链烷基；和
-取代基R7代表芳烷基、烷芳基、杂烷基、杂环基、烷基杂环基、杂环烷基、或有1至6个碳原子的直链或支链烷基，所述基团可任选
地被至少一种选自-COOH、-CONHR8、-NHC＝NH(NH2)、-NHC＝NR8(NH2)、-NH2、-NHR8、-NR82、-N+R83、-OH、-OPO(OR8)2、-OPO(OH)(OR8)、-OPO(OH)2、-OSO(OR8)2、-OSO(OH)(OR8)、-OSO(OH)2、和这些基团的各种成盐形式的基团取代，每个取代基R8有以上定义。
当两个取代基Y一起构成键时，所述通式(I)的氨基酸残基由N-甲基-(4R)-4-((E)-2-丁烯基)-4-甲基-L-苏氨酸残基衍生，其中所述苏氨酸的羟基已用适当方式酯化，所述前体药物在体内断裂时释放的药理活性分子由环状十一肽组成，其中所述肽链包含至少一个N-甲基-(4R)-4-((E)-2-丁烯基)-4-甲基-L-苏氨酸残基(MeBmt)。
类似地，当两个取代基Y均代表氢原子时，所述通式(I)的氨基酸残基由N-甲基-(4R)-4-丁基-4-甲基-L-苏氨酸残基衍生，其中所述苏氨酸的羟基已用适当方式酯化，所述前体药物在体内断裂时释放的药理活性分子由环状十一肽组成，其中所述肽链包含至少一个N-甲基-(4R)-4-丁基-4-甲基-L-苏氨酸残基(Dh-MeBmt)。
优选地，在定义所述氨基酸残基的通式(I)中，取代基R1和R3至少之一代表芳烷基、烷芳基、杂烷基、杂环基、烷基杂环基、杂环烷基或有1至6个碳原子的直链或支链烷基，所述基团均被至少一种选自-COOH、-CONHR8、-NHC＝NH(NH2)、-NHC＝NR8(NH2)、-NH2、-NHR8、-NR82、-N+R83、-OH、-OPO(OR8)2、-OPO(OH)(OR8)、-OPO(OH)2、-OSO(OR8)2、-OSO(OH)(OR8)、-OSO(OH)2、和这些基团的各种成盐形式的基团取代，每个取代基R8有以上定义。这些基团(已知是极性的)极大地改善赋予所述前体药物的亲水性。
更优选地，所述芳烷基、烷芳基、杂烷基、杂环基、烷基杂环基、杂环烷基或上述烷基被至少一种选自-NR82、-N+R83、-OPO(OH)2或这些基团的各种成盐形式的基团取代，每个取代基R8有以上定义。
更优选地，所述取代基R1和R3至少一个代表具有1-6个碳原子且至少一种选自-NR82，-N+R83，-OPO(OH)2或这些基团的各种盐形式的基团取代的直链烷基，每个取代基R8有以上定义。
当所述取代基R1和R3代表被至少一种选自-NR82、-N+R83、-OPO(OH)2或这些基团的各种成盐形式的基团(每个取代基R8有以上定义)取代的有1至6个碳原子的直链烷基时，相应的氨基酸残基优选衍生自：
-(D)或(L)构型之任一、优选(L)构型的丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、别苏氨酸(allothreonine)、N-甲基丝氨酸、N-甲基苏氨酸或N-甲基高丝氨酸残基，其中所述羟基已用适当方式官能化以使这些氨基酸残基的侧链带有极性和/或增溶基团；
-或(D)或(L)构型之任一、优选(L)构型的赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-δ-甲基精氨酸、N-α-甲基精氨酸或N-甲基赖氨酸残基，其中各胺或亚胺基已用适当方式官能化以使这些氨基酸残基的侧链带有极性和/或增溶基团。
当成对(R1、R2)和/或(R3、R4)的取代基R1、R2和/或R3、和R4为有1至6个碳原子的烷基时，它们可在每对内形成亚烷基链，与携带它们的碳原子和氮原子形成环。优选地，它们构成脯氨酸残基的侧链。
当取代基R1和R3独立地代表氢原子、芳烷基、烷芳基、杂烷基、杂环基、烷基杂环基、杂环烷基或有1至6个碳原子的直链或支链烷基但所述基团未被至少一种选自-COOH、-CONHR8、-NHC＝NH(NH2)、-NHC＝NR8(NH2)、-NH2、-NHR8、-NR82、-N+R83、-OH、-OPO(OR8)2、-OPO(OH)(OR8)、-OPO(OH)2、-OSO(OR8)2、-OSO(OH)(OR8)、-OSO(OH)2、和这些基团的各种成盐形式的基团取代时，则它们优选代表(D)或(L)构型、优选(L)构型的氨基酸残基或保护和/或活化形式的可选地其胺基被烷基化的氨基酸(通常是商购的)的残基的侧链。更优选所述氨基酸残基选自通常称为天然氨基酸的二十种氨基酸。
还优选在通式(I)中，所述取代基R5和R6不同时代表氢原子。还优选所述取代基R5和R6至少之一代表有1至6个碳原子的直链或支链烷基，所述取代基R7代表芳烷基或有1至6个碳原子的直链或支链烷基。
更优选所述取代基R5和R6独立地代表氢原子或甲基。
优选地，所述前体药物由其中肽链包含一个通式(I)的氨基酸残基的环状十一肽组成，从而形成有以下通式(II)的十种氨基酸的线性序列的十一肽环：
-T-U-V-W-MeLeu-Ala-X-MeLeu-Z-MeVal- (II)
其中：
-T选自氨基酸Ala、Abu、Nval、Val和Thr；
-U选自氨基酸Sar、(D)MeSer、(D)MeAla和(D)MeSer(OCOR9)，R9代表氢原子、烷芳基、或有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
-V代表通式(N-R10)aa的氨基酸，aa选自氨基酸Val、Leu、Ile、Thr、Phe、Tyr和Thr，R10为有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
-W选自氨基酸Val、Nval和Leu；
-X选自氨基酸(D)Ala、(D)Ser、(D)Hiv、(D)Val和(D)Thr，(D)Hiv代表D-2-羟基异戊酸残基；和
-Z选自氨基酸Leu和MeLeu。
因此，在所述通式(I)的氨基酸残基中，当两个取代基Y均代表氢原子时，在所述前体药物于体内断裂过程中释放的药理活性分子将由环孢菌素家族环状十一肽组成，其中所述肽链含有N-甲基-(4R)-4-丁基-4-甲基-L-苏氨酸残基(Dh-MeBmt)。
类似地，在所述通式(I)的氨基酸残基中，当两个取代基Y一起构成链时，在所述前体药物于体内断裂过程中释放的药理活性分子将由环孢菌素族环状十一肽组成，其中所述肽链包含N-甲基-(4R)-4-((E)-2-丁烯基)-4-甲基-L-苏氨酸(MeBmt)残基。
优选这些环状十一肽对应于文献中已描述有药理特性的环孢菌素，而且其肽链中都有N-甲基-(4R)-4-((E)-2-丁烯基)-4-甲基-L-苏氨酸(MeBmt)残基或N-甲基-(4R)-4-丁基-4-甲基-L-苏氨酸残基(Dh-MeBmt)。
更优选地，与所述通式(I)的氨基酸残基一起构成所述环状十一肽的其余十种氨基酸残基的线性序列选自以下式(III)至(XIV)的序列：
-Abu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-
(III)；
-Abu-(D)MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-
MeVal-(IV)；
-Thr-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-
(V)；
-Val-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-
(VI)；
-Nval-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-
(VII)；
-Val-(D)MeAla-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-
MeVal-(VIII)；
-Val-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Val-MeLeu-Leu-MeVal-
(IX)；
-Val-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Thr-MeLeu-Leu-MeVal-
(X)；
-Abu-(D)MeSer(OAc)-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-
Leu-MeVal-(XI)；
-Abu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ser-MeLeu-MeLeu-MeVal-
(XII)；
-Thr-Sar-MeLeu-Leu-MeLeu-Ala-(D)-Hiv-MeLeu-Leu-MeVal-
(XIII)；
和-Abu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Val-MeLeu-Leu-
MeVal-(XIV)。
所述前体药物在体内断裂过程中释放的药理活性分子将分别是适当时含有由具有丁烯基(MeBmt)或丁基(Dh-MeBmt)链的苏氨酸衍生的残基的以下环孢菌素之一：
环孢菌素A(CsA)；(D)MeAla3EtVal4CsA(WO00/01715)；环孢菌素C(CsC)；环孢菌素D(CsD)；环孢菌素G(CsG)；(D)MeAla3CsD；(D)Val8Csl；(D)Thr8Csl；(D)MeSer(Oac)3CsT；(D)Ser8CsA(Progressin Medicinal Chemistry，Vol 25，ed.Ellis and West，ElsevierScience Publ.，Biomedical Division，1998，pp 1-33)；Thr2Leu5(D)Hiv8Leu10CsC(The Journal of Biological Chemistry，1991，266(24)，15570)；(D)Val8Leu10CsA；环孢菌素A、C、D、G、I和T描述在Progress in the Chemistry of Organic Natural Products，1986，50，124中，其余环孢菌素通过类似于Helvetica Chimica Acta，1984，67，502中所述方法制备。
更优选地，本发明前体药物分别具有以下式(XV)和(XVI)：
本发明前体药物可通过肽化学、特别是环孢菌素化学方面的技术人员所公知的化学合成方法制备。
通过适当选择定义通式(I)的氨基酸残基的各取代基，已发现本发明前体药物具有比所述前体药物断裂过程中产生的药理活性分子明显增强的亲水性。例如，断裂后产生环孢菌素A的某些本发明前体药物的溶解度比环孢菌素A大至少3000倍。
因而，本发明前体药物可很容易地掺入水性药物制剂中。
还值得注意的是，未发现本发明前体药物对pH条件敏感，这是当它们在水溶液中时此类应用常遇到的问题。
此外，本发明前体药物与生物体液中存在的酶接触时以完全适合治疗应用的半衰期释放药理活性分子而充分地发挥其作用。
本发明还涉及上述前体药物作为药用产品的用途。
此药用产品优选用于治疗需要预先使用环孢菌素的病理状况或生理状况，特别是需要局部地或通过静脉注射全身地使用环孢菌素A的所有病理状况。
此药用产品尤其希望用于使肾、心、肝、胰、肺、小肠或骨髓等器官的同种异体移植的成活率延长。还希望能抑制1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的复制。
在此应用中，通过静脉注射全身给药时本发明前体药物的剂量是能使断裂过程中产生的环孢菌素例如环孢菌素A的浓度对应于通常推荐的治疗浓度的剂量。
更优选地，此药用产品用于眼科领域，尤其是用于治疗眼睛及其周围附属器的病理状况。
这些病理状况特别包括干性角膜结膜炎(也称为干眼综合症)、Sjogren’s综合症、过敏性角膜结膜炎尤其是耐皮质类固醇的那些、产生粘液和粘连的结膜炎、疱疹性基质角膜炎、与免疫力有关的边缘角膜炎和Thygeson’角膜炎，和角膜移植排斥反应的预防，以及作为过滤外科手术(filtering surgery)的辅佐疗法。更优选本发明药用产品用于治疗干性角膜结膜炎。
此应用中，本发明前体药物的剂量是通过局部给药使所述前体药物断裂过程中产生的环孢菌素例如环孢菌素A的眼泪水中浓度大于0.5μg/l。
本发明药用产品可局部给药，特别是用于粘膜病症或皮肤病症的局部治疗、或肠胃外特别是静脉内给药。为改善环孢菌素例如环孢菌素A的生物利用度，其也可口服。
本发明药用产品肠胃外给药时，适用的药物制剂可以是无菌的浓缩水溶液或用于可注射制剂的粉末。
本发明药用产品优选静脉内给药。适用于如此给药的药物制剂是技术人员公知的注射或输注用水溶液。
本发明药用产品更优选局部给药。适用于如此给药、特别是眼科使用的药物制剂是无菌水溶液形式的眼药水、眼药膏、眼用凝胶和眼用嵌入物。
实施例中借助附图详细地(但不限制)描述本发明及其有利特性，其中
-图1代表本发明前体药物被酯酶水解的体外转化动力学曲线和环孢菌素表观动力学曲线；
-图2a代表环孢菌素A以油性形式在大鼠中i.v.给药后血液中环孢菌素A的水平；
-图2b和2c代表两种本发明前体药物的水溶液分别在大鼠中i.v.给药后血液中环孢菌素A的水平；和
-图3分别代表环孢菌素A和本发明前体药物在兔子眼泪中的浓度随时间的变化。
在实施例中描述所得产品的命名法中，环孢菌素A的残基将用缩写CsA表示，相对片段的残基与此环状十一肽的唯一可官能化基团相连，即处于1-位的N-甲基-(4R)-4-((E)-2-丁烯基)-4-甲基-L-苏氨酸(MeBmt)上的羟基。由环孢菌素A衍生的中间产物的化学结构式将仅代表1-位有相应侧链的氨基酸残基。
实施例1
式(XV)的环状十一肽的制备
1.MeBmt(O-Sar-Lys(Nε+Me3)-COOCH(CH3)OCOCH3))1-CsA(XV)的制备
1.1.对硝基苯基碳酸α-乙酰氧基乙酯(2)的制备
1.1.1.对硝基苯基碳酸α-氯乙酯(1)的制备
在0℃下将2.6ml(23.7mmol，1.1eq)氯甲酸α-氯乙酯加至3g(21.6mmol，1eq)对硝基苯酚和1.7ml(21.7mmol，1eq)吡啶的氯仿(108ml)溶液中。将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在环境温度下搅拌16小时。将该反应混合物用水、0.5％NaOH溶液、然后再用水萃取。有机相经Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发，得到黄色油，从己烷中结晶后得到纯白色固体(5.8g)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)；δ：8.32(d，2H)，7.44(d，2H)，6.52(q，1H)，1.95(s，3H)。
1.1.2.对硝基苯基碳酸α-乙酰氧基乙酯(2)的制备
将7.8g(24.4mmol，1.5eq)乙酸汞加至溶于100ml乙酸的4g(16.3mmol，1eq)(1)的溶液中。将该反应混合物在环境温度下搅拌1天，然后再加入1g(3.13mmol，0.2eq)乙酸汞。在环境温度下再搅拌1天后，反应结束。在高真空下蒸出乙酸，使残余物溶于乙醚。有机相用盐水溶液萃取，然后经Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发，得到黄色油。粗产品在硅胶上层析分离得到无色油(4.4g)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)；δ：8.31(d，2H)，7.43(d，2H)，6.87(q，1H)，2.16(s，3H)，1.64(s，3H)。
1.2.α-乙酰氧乙氧羰基-赖氨酸(Nε(Fmoc))(5)的制备
1.2.1.α-乙酰氧乙氧羰基-赖氨酸苄酯(Nε(Z))(3)的制备
使500mg(1.23mmol，1eq)H-Lys(Z)Obn.HCl悬浮于2.5ml二噁烷中。在环境温度下加入231μl(1.35mmol，1.1eq)N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)和396mg(1.47mmol，1.2eq)的(2)。在环境温度下搅拌1天后，反应结束。在减压下蒸出二噁烷，使残余物溶于20ml乙酸乙酯。有机相用6％柠檬酸溶液(20ml)、饱和NaHCO3溶液(20ml)和饱和NaCl溶液(20ml)萃取三遍，经Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在硅胶上层析分离得到无色透明的油(576mg)。
ESI-MS：m/z：501.34[M+H+]；518.28[M+H2O+H+]。
1.2.2.α-乙酰氧乙氧羰基-赖氨酸(4)的制备
将50mg钯/活性炭加至509mg(1.02mmol)(3)的乙醇(10ml)溶液中。在氢气流下于环境温度搅拌3小时后，反应结束。该反应混合物经硅藻土过滤，使滤液减压蒸发得到浅褐色晶体形式的粗产品，直接用于以下步骤(254mg)。
ES-MS：m/z：276.87[M+H+]。
1.2.3.α-乙酰氧乙氧羰基-赖氨酸(Nε(Fmoc))(5)的制备
将1.11ml DIPEA(6.53mmol，1.7eq)和1.555g(4.61mmol，1.2eq)Fmoc-O-Suc加至溶于38ml二噁烷的1.062g(3.84mmol，1eq)溶液中。在环境温度下搅拌1小时后，反应结束。在减压下蒸出二噁烷，使残余物溶于20ml EtOAc。有机相用6％柠檬酸溶液(20ml)和饱和NaCl溶液(20ml)洗一遍，经无水Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在硅胶上层析分离得到白色泡沫状产物(1.026g)。
ES-MS：m/z：499.37[M+H+]；516.29[M+H2O+H+]。
1.3.MeBmt(O-Sar-Lys(Nε+Me3)-COOCH(CH3)OCOCH3))1-CsA.I-(XV)的制备
1.3.1.MeBmt(O-COCH2Br)1-CsA(6)的制备
在氩气下使4g(3.33mmol，1eq)干CsA溶于66ml(0.76mol)溴代乙酰溴。分成小份加入2g(16.64mmol，5eq)二甲氨基吡啶，将该反应混合物在环境温度下搅拌40分钟。反应结束。将反应混合物小心地在剧烈搅拌下倒入碳酸氢钠(kydrogen carbonate)(77g，0.91mol)、水(500ml)和碎冰的混合物中。可再加少量NaHCO3使溶液的pH达到7-8。分离的水相用二氯甲烷萃取两遍，总的有机相用饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液萃取三遍，经无水Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在硅胶上层析分离得到白色泡沫(3.2g)状产物。
ESI-MS：m/z：622.6[M+2H+]；673.9[M+Na++H+]。
1.3.2.MeBmt(O-Sar-H)1-CsA(7)的制备
使300mg(0.23mmol，1eq)(6)溶于2.3ml乙醇。在环境温度下加入95μl(0.68mmol，3eq)三乙胺(TEA)和31mg(0.45mmol，2eq)附加的氯化甲铵。在环境温度下搅拌3天后，通过加入TEA和15mg(0.23mmol，1rq)氯化甲铵调至pH 12，1小时后反应结束。在减压下蒸出乙醇，使残余物溶于乙酸乙酯。有机相用水和饱和NaCl溶液萃取，经无水Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在硅胶上层析分离得到白色泡沫(200mg)状产物。
ESI-MS：m/z：1273.7[M+H+]。
1.3.3.MeBmt(O-Sar-Lys(Nε(FMOC-COOCH(CH3)OCOCH3))1-CsA.(8)的制备
在氩气下使79mg(0.06mmol，1eq)(7)溶于0.5ml二氯甲烷(DCM)。在氩气下相继加入31.6μl(0.18mmol，3eq)DIPEA、35mg(0.09mmol，1.5eq)六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)(HATU)和溶于0.8ml DCM的40mg(0.08mmol，1.3eq)(5)。在环境温度下搅拌3小时后，反应结束。在减压下蒸出DCM，使残余物溶于20ml EtOAc。有机相用6％柠檬酸溶液(20ml)、饱和NaHCO3溶液(20ml)和饱和NaCl溶液(20ml)洗一遍，经Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在硅胶上层析分离得到白色泡沫(59mg)状产物。
ES-MS：m/z：1754.36[M+H+]；877.86[M+2H+]。
1.3.4.MeBmt(O-Sar-Lys(Nα-COOCH(CH3)OCOCH3))1-CsA(9)的制备
将90μl(0.86mmol，10eq)二乙胺加至溶于900μl乙腈的150mg(0.09mmol，1eq)(8)溶液中。在环境温度下搅拌3小时后，反应结束。在减压下蒸出溶剂，粗产品在硅胶上层析分离得到白色泡沫(52mg)状产物。
ES-MS：m/z：1532.79[M+H+]；766.79[M+2H+]。
1.3.4.MeBmt(O-Sar-Lys(Nε+Me3)-COOCH(CH3)OCOCH3))1-CsA.I-(XV)的制备
使49ml(0.03mmol，1eq)(9)溶于640μl无水DCM，然后加入30μl(0.48mmol，15eq)MeI，再加入14μl(0.08mmol，2.5eq)DIPEA。在环境温度下搅拌1小时后，反应结束。在减压下蒸出DCM，粗产品通过半制备HPLC提纯以分离出冻干(lyophilisate)形式的纯化合物(30mg)。
ES-MS：m/z：1574.37[M+H+]；787.83[M+2H+]。
实施例2
式(XVI)的环状十一肽的制备
1.MeBmt(O-Sar-Ser(OPO(OH2))-COOCH(CH3)OCOCH3))1-CsA(XVI)的制备
1.1.α-乙酰氧乙氧羰基-丝氨酸(11)的制备
1.1.1.α-乙酰氧乙氧羰基-丝氨酸苄酯(10)的制备
使1.4g(6.04mmol，1eq)H-Ser-OBn.HCl悬浮于12ml二噁烷中。在环境温度下加入1.14ml(6.64mmol，1.1eq)DIEA和2.1g(7.85mmol，1.3eq)按实施例1得到的(2)。在环境温度下搅拌过夜后，反应结束。在减压下蒸出二噁烷，使残余物溶于乙酸乙酯。有机相用6％柠檬酸溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液萃取三遍，经无水Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在硅胶上层析分离得到白色泡沫(1.7g)状产物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)；δ：7.34-7.41(m，5H)，6.79-6.85(m，1H)，5.72-5.82(m，1H)，5.24(s，2H)，4.47(m，1H)，3.94-4.05(m，2H)，2.06和2.08(s，3H)，1.49和1.50(d，3H)。
1.1.2.α-乙酰氧乙氧羰基-丝氨酸(11)的制备
将40mg钯/活性炭加至400mg(1.23mmol)(10)的乙醇(13ml)溶液中。在氢气流下于环境温度搅拌4小时后，反应结束。该反应混合物经硅藻土过滤，使滤液减压蒸发得到半透明沉积物形式的粗产品，直接用于以下步骤(328mg)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)；δ：6.3-6.8(m，1H)，5.8-6.3(m，1H)，4.3-4.4(m，1H)，3.7-4.1(m，2H)，2.08(s)，1.49和1.50(d，3H)。
1.2.MeBmt(O-Sar-Ser(OPO(OH)2)-COOCH(CH3)OCOCH3)1-CsA(XVI)的制备
1.2.1.MeBmt(O-Sar-Ser(OPO(OH)2)-COOCH(CH3)OCOCH3)1-CsA(12)的制备
在氩气下使170mg(0.13mmol)按实施例1得到的(7)溶于3ml二氯甲烷。在氩气下相继加入92μl(0.53mmol，4eq)DIEA、51mg(0.26mmol，2eq)HATU和60mg(0.25mmol，2eq)(11)。在环境温度下搅拌5小时后，反应结束。在减压下蒸出二氯甲烷，使残余物溶于乙酸乙酯。有机相用6％柠檬酸溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液萃取三遍，经无水Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在硅胶上层析分离得到白色泡沫(143mg)状产物。
ESI-MS：m/z：1513.32[M+Na+]，1508.34[M+H2O+H+]，1491.36[M+H+]，746.36[M+2H+]。
1.2.2.MeBmt(O-Sar-Ser(OPO(Oall)2)-COOCH(CH3)OCOCH3))1-CsA(13)的制备
使130mg(0.09mmol，1eq)(12)溶于880μl无水CH2Cl2。然后加入20mg(0.27mmol，3eq)1H-四唑，再加入52μl(0.17mmol，2eq)(AllO)2PN(iPr)2。在环境温度下搅拌4小时后，使反应混合物冷却至-60℃，加入44mg(0.17mmol，2eq)间氯过苯甲酸，所述搅拌在-60℃下持续30分钟，在0℃下15分钟，在环境温度下45分钟。在0℃下向反应介质中加入0.5ml 10％Na2S2O5溶液以破坏过量的氧化剂，然后用二氯甲烷萃取。有机相用10％Na2S2O5溶液洗涤，然后在减压下蒸出二氯甲烷。使残余物溶于甲基叔丁基醚，此有机相用6％柠檬酸溶液和饱和NaCl溶液萃取，经无水Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在硅胶上层析分离得到白色泡沫(98mg)状产物。
ESI-MS：m/z：1651.38[M+H+]；826.35[M+2H+]。
1.2.3.MeBmt(O-Sar-Ser(OPO(OH)2)-COOCH(CH3)OCOCH3)1-CsA(XVI)的制备
在氩气和环境温度下将206μl(1.55mmol，8eq)Me3SiN3和1.12g(0.97mmol，5eq)(PPh3)4Pd0加至184mg(0.58mmol，3eq)Bu4N+F-H2O的CH2Cl2(2ml)溶液中。在环境温度下搅拌10分钟后，加入320mg(0.19mmol，1eq)(13)，将反应混合物在环境温度下搅拌30分钟。反应结束。加入6％柠檬酸溶液使反应混合物水解，在减压下蒸出二氯甲烷。使残余物溶于乙酸乙酯，所得有机相用6％柠檬酸溶液和饱和NaCl溶液萃取三遍，经无水Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸出溶剂。所得粗产品在Sep-Pack柱筒上层析分离，然后在制备HPLC上层析分离，以分离出冻干形式的纯化合物(342mg)。
ESI-MS：m/z：1593.32[M+Na+]，1571.81[M+H+]。
实施例3
式(XV)和(XVI)的环状十一肽的物理化学性质
1.式(XV)和(XVI)的环状十一肽的水溶性
使称量过的环状十一肽直接溶于Sorensen型67mM磷酸盐缓冲液通过在实验室的环境温度下目视检查评价水溶性。结果示于表1中。
表1环状十一肽 在以下pH下的水溶性 pH＝5 pH＝6 pH＝7 pH＝8(XV) ＞7mM(XVI) ＞20mM ＞20mM ＞20mM ＞20mM
作为说明，据称环孢菌素A在20℃和pH 7下最大水溶性为33μg/ml，这相当于最大浓度为0.027mM。
2.式(XV)和(XVI)的环状十一肽的化学和酶稳定性
在pH 7和4、20和37℃的温度下，先在由甘露醇组成的等渗溶液中，然后在磷酸盐缓冲液(PBS)中评价式(XV)的环状十一肽的化学稳定性随时间的变化。
检测到的环孢菌素A的百分率示于下表2中：
表2 4℃ 甘露醇 20℃ 甘露醇 37℃ 甘露醇 37℃ PBS30天 3.5％ 17.0％ 25.0％ 90.0％90天 5.0％ 38.0％
可见，在4℃的温度下在甘露醇溶液中，所述环状肽可稳定至少90天。
在存在和不存在酯酶的情况下，对在37℃下溶于pH 7.4的50mMHepes缓冲液中的式(XV)和(XVI)两种环状十一肽进行第二项稳定性研究(化学和酶稳定性)。在37℃下保温过程中，以适当的时间周期采集40μl等分试样，通过HPLC和ESI-MS分析。
不存在酶的情况下，观察到两种环状十一肽都具有大于3天的化学稳定性。
在酯酶存在下水解过程中所得结果示于图1中。环状十一肽(XVI)的转化动力学曲线用菱形表示，而表观(appearance)环孢菌素A的动力学曲线用正方形表示。根据该图可见，在酯酶存在下，所述环状十一肽(XVI)迅速降解释放环孢菌素A。环状十一肽(XV)得到类似的观察结果。
使环状十一肽(XV)和(XVI)在37℃的牛血清中保温。评估所述环状十一肽转化成环孢菌素A的半衰期，其分别为3.66和3.50小时。
实施例4
以水溶液形式静脉内给药应用
式(XV)和(XVI)的环状十一肽的药物动力学研究
为使临床医师可利用通常以聚氧乙烯化蓖麻油微乳液形式使用的环孢菌素A的药物制剂(它有不稳定性、较难处理而且引起副作用)的替代品，针对静脉内应用评价简单水溶液形式的本发明前体药物。
因此，将这两种环状十一肽(XV)和(XVI)以磷酸盐缓冲液溶液以相当于10mg/kg环孢菌素A的剂量给大鼠静脉内投药。
作为参考，以商标Sandimmun商购的环孢菌素的可注射液试样在适当稀释后使用。
以规则的时间间隔取血样，然后进行分析以检验环孢菌素A。
环孢菌素A的i.v.给药后血液中环孢菌素A的含量示于图2a中。两种前体药物(XV)和(XVI)水溶液的i.v.给药后所得结果分别示于图2b和2c中。由图2a、2b和2c中曲线整理的结果示于下表3中。
表3十一肽 环孢菌素A (XV) (XVI)AUC0-infμg.h.L-1 69229 66626 44699CL L/h/kg 0.14 0.15 0.22MRT h 15.2 15.3 14.9Vss L/kg 2.2 2.2 3.4T1/21h 0.31 0.55 0.20T1/22h 11.1 11.8 11.8
该表中缩写有以下意义：
-AUC：曲线下的面积；
-CL：间隙；
-MRT：平均停留时间；
-Vss：稳态分布体积；
-T1/21：初始半衰期；和
-T1/22：最终半衰期。
从图2和表3可见，用环孢菌素A进行的对照实验的药物动力学参数与文献中报告的相当。环状十一肽(XV)断裂过程中产生的环孢菌素A的曲线下面积与对照实验中环孢菌素A的相当，而环状十一肽(XVI)断裂过程中产生的环孢菌素A的曲线下面积比对照实验中环孢菌素A的减小25％。
两种环状十一肽(XV)和(XVI)均显示出类似的环孢菌素A的血液释放分布图。这些分布图与基于聚氧乙烯化蓖麻油的药物形式的环孢菌素A的类似。
从这些结果得出：对于等效的环孢菌素A释放分布图而言，本发明前体药物与现有环孢菌素A的药物制剂相比提供以下重要优点：
-通过简单地溶于水而易于使用；和
-不需使用毒性赋形剂；和
-不需用特殊材料处理。
实施例5
以水溶液形式局部给药用于眼睛
式(XV)的环状十一肽的药物动力学研究
为使临床医师可将环孢菌素A局部给药用于眼睛而无刺激或不愉快的感觉或不产生视力模糊，评价简单水溶液形式的本发明前体药物。
1.溶液的制备
制备环状十一肽(XV)的含5％甘露醇的pH7.0的等渗水溶液。环孢菌素A当量浓度为1％(重量/体积)。使溶液通过0.22μm硝基纤维素过滤器消毒。制备1％橄榄油溶液形式的环孢菌素A的参考制剂。
2.式(XV)的环状十一肽的耐受性的测定
按两种方法即按改型Draize试验和用共焦点激光扫描检眼镜(opthalmoscope)测定眼睛的耐受性。
2.1.改型Draize试验(急性耐受性试验)
对六只雄性白化病兔进行此评价。每只动物的一只眼睛接受50μl上述溶液的滴注，另一只眼睛(未处理的)起对照作用。
通过按下表4中所述分类目测评价眼睛流泪(ocular discharge)、结膜水肿和结膜充血进行可能的刺激作用的临床评价：
表4眼睛流泪 正常轻微流泪严重流泪遮盖角膜的小部分表面严重流泪遮盖角膜的大部分0123水肿 正常轻微水肿包括瞬膜严重水肿，眼睛部分闭合严重水肿，眼睛闭合0123 发红 正常血管一些血管充血扩散发红，个别血管不易辨别明显扩散发红012 3
滴注后的48小时内以给定的时间间隔按以上规则观察每只动物可能的刺激作用，由所评估指数的总和计算总刺激指数(Iirr)。所得结果在下面2.3中示于表4中。
2.2.共焦点激光扫描检眼镜法(在给药的4天内评价亚急性毒性的试验)
此试验用与前面相同类型的动物进行。将25μl如上所述溶液滴注至右眼的角膜上，每天三次，共滴注四天，在第四天滴注一次后就进行观察。最终滴注后，给兔子服用盐酸氯胺酮和甲苯噻嗪使之镇静。在眼睛上滴注0.5％(重量/体积)荧光素钠溶液共25μl以选择性地标记可能损伤的表面。然后将眼睛用37℃的盐水溶液冲洗1分钟。
最后，按Furrer et al.，J.Ocular Pharmacol.，1997，13，559中所述方法用共焦点激光扫描检眼镜观察眼睛。该检眼镜与图像分析系统连接能重新构成三维图像而且可评价损伤面积。
作为角膜损伤的百分率的函数按以下规则评价耐受度：
-0至25％：良好的耐受性；
-25至40％：可接受的耐受性；
-40至60％：低耐受性；和
-约60％：不能接受的耐受性。
应注意一般知道低于或等于5％的损伤率对应于未给任何处理的正常体内普通细胞死亡率。
所得结果在下面2.3中示于表5中。
2.3.眼睛对式(XV)的环状十一肽的耐受性结果
表5 十一肽(XV) 环孢菌素ADraize，Iirr 1.8 1.9CLSO，％损伤 7 23
从表5可见式(XV)的环状十一肽的Draize试验中所得总刺激指数为1.8，使用该产品损伤7％的角膜。这两个结果证明对所述环状十一肽的耐受性极好，此耐受性比环孢菌素A在橄榄油中给药时所得结果明显改善。
由于很明显的原因，未对所述动物评价使用水溶液比使用油性溶液时视觉舒适性的主观改善。
3.式(XV)的环状十一肽的稳定性
将上述溶液的试样分别在4℃和20℃下保存。有规则地进行HPLC分析3个月。发现这些试样在此条件下有良好的稳定性。
4.式(XV)的环状十一肽的体外转化动力学
此转化动力学试验如下进行：将25μl上述溶液的试样在轻轻搅拌下与8μl新鲜兔泪一起于37℃下保温。在1、2、3和30分钟的间隔时间取2μl试样，然后通过HPLC分析。
所得结果显示式(XV)的环状十一肽从与兔泪接触的第一分钟就发挥其前体药物的作用，释放环孢菌素A。在3分钟时，3％的前体药物已转化，30分钟后则为4.7％。
5.式(XV)的环状十一肽的体内转化动力学
此体内转化动力学试验如下进行：在雄性白化病兔(4kg)的右眼内滴注25μl上述溶液的试样。在1、2、3、4和20分钟的间隔时间取泪样，然后通过HPLC分析。
所得结果示于图3中。可见，此试验证实了在体外试验中已经得到的结果。式(XV)的环状十一肽(正方形)从与兔泪接触的第一分钟就发挥其前体药物的作用，释放环孢菌素A(圆形)，此释放在以后20分钟内持续。在1分钟时，泪中环孢菌素的浓度为0.025mg/ml。
6.结论
从这些结果得出结论：对于眼睛的局部给药，本发明前体药物提供以下优点：
-通过简单地溶于水溶液而不必使用油性助剂易于制备药物制剂如眼药水；和
-急性耐受性良好而且亚急性耐受性极好，大于用油性形式的环孢菌素药物制剂所得耐受性；
-良好的稳定性；和
-适合眼科使用的半衰期。