p18AβrP基因和p18AβrP蛋白、通过与所述基因/蛋白相互作用抑制 细胞死亡的新型基因/蛋白(p60TRP)和促进细胞死亡的物质 【技术领域】
本发明涉及一种新型基因即p18AβrP，该基因的表达在少突胶质细胞中由于淀粉状蛋白-β蛋白(下文简称为Aβ)而增加。本发明基因及其产物即p18AβrP蛋白具有以下新的功能：通过与热激蛋白Hsp 70和肿瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，抑制神经营养因子对神经突延伸的促进作用和生存维持作用，从而促进细胞死亡。本发明也涉及应用这些事件的筛选系统、使用该筛选系统鉴定的细胞死亡抑制基因和蛋白(p60TRP)、以及细胞死亡促进物质和它们的基因。另外，本发明涉及应用这些细胞死亡抑制或促进物质诊断、治疗和预防与细胞死亡相关的疾病。
背景技术
目前，尚不了解早老性痴呆(Alzheimer’s disease)的病因。然而，有关其病理学特征—由细胞死亡引起的老年斑、神经纤维缠结、大脑皮质和海马的明显脑萎缩等已有报道。Hyman等(Science，225，1168(1984))和Braak等(Acta Neuropathol.，82，239(1991))分别在内嗅皮层区及其周围发现随早老性痴呆的早期病理学改变有特异性变性，并且Braak等报道了在内嗅皮层中，其病因怀疑是由于给神经细胞供应营养的少突胶质细胞的变性引起的(Alzheimer’s Res.，3，235(1997))。然而，尚未进行探索其查证法的任何研究。
发明的公开
鉴于这些情况，本发明人进行了深入的研究。结果，当使用大鼠少突胶质细胞并且加入Aβ(受早老性痴呆影响的大脑中存在的老年斑的主要成分)时，他们观察到细胞死亡。对参与所述细胞死亡的基因进行筛选，导致发现一个新型基因p18AβrP。另外，对该基因的功能进行检查，得到这样的一个结果：在表达该基因地细胞中，由神经营养因子触发的细胞分化的诱导受到抑制，从而引起细胞死亡。另外，证明本发明蛋白即该基因的转录产物具有以下新的功能：通过与热激蛋白Hsp 70和/或肿瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，抑制神经突的延伸和分支以及抑制生存维持，从而促进细胞死亡。此外，对抑制所述细胞死亡的基因/蛋白进行筛选，导致发现一个新型基因/蛋白p60TRP。
本发明人向大鼠少突胶质细胞CG-4细胞中加入Aβ1-42(含有β-淀粉状蛋白的氨基酸1-42；以10μg/ml、37℃下处理60小时)，后者为被认为是早老性痴呆的神经毒素的β-淀粉状蛋白(Aβ)的一个实施例，结果，在大约50％的细胞中观察到细胞死亡(Brain Aging，2，30(2002))。用其它Aβ肽例如Aβ25-35(含有β-淀粉状蛋白的氨基酸25-35)、Aβ1-40(含有β-淀粉状蛋白的氨基酸1-40)或Aβ1-43(含有β-淀粉状蛋白的氨基酸1-43)也鉴定出同上述一样的细胞死亡(参见例如Cell.Mol.Life.Sci.，57，705(2000)；J.Neurosci.，21，9235(2001))，因此，认为引起细胞死亡的特性对于Aβ肽而言是普遍性的。因而，本发明人对参与由Aβ诱导的细胞死亡的基因进行了筛选，结果，观察到本发明基因的表达增加(参见实施例和图2)。本发明cDNA表现出与已经发现的人类基因(J.Biol.Chem.，277.，7540(2002))和小鼠基因(Gene Data BankAK013396，AK018385，AK020147，AK011454；Hayashizaki，Y.等，2000)同源，但是它是一个新型基因并且在所编码的氨基酸序列中与人和小鼠的序列有差异。另外，证明p18AβrP蛋白具有以下新的功能：由于与热激蛋白Hsp 70和肿瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，因而抑制神经营养因子的神经突延伸效应，从而诱导细胞死亡(参见实施例和图3)。此外，对在表达本发明基因的细胞中观察到的所述细胞死亡的抑制因子进行筛选，导致发现一个新型基因/蛋白(p60TRP)。
因此，本发明提供依照以下(1)-(31)的DNA、蛋白质、物质、载体、转化子、药用组合物和试剂盒：
(1)一种p18AβrP cDNA，所述p18AβrP cDNA包含SEQ ID NO：3的核苷酸147-647的碱基序列；
(2)一种mRNA，所述mRNA与依照(1)的cDNA互补；
(3)一种p18AβrP蛋白，所述p18AβrP蛋白具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(4)一种编码p18AβrP蛋白的DNA，所述p18AβrP蛋白在依照(3)的蛋白质中有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代并且具有以下特性：
a)由于Aβ而增加表达，
b)与Hsp70和/或Tid-1相互作用，和
c)抑制细胞分化；
(5)一种DNA，所述DNA在严谨条件下可与依照(1)的DNA杂交并且编码一种具有以下特性的p18AβrP蛋白：
a)由于Aβ而增加表达，
b)与Hsp70和/或Tid-1相互作用，和
c)抑制细胞分化；
(6)一种由依照(4)或(5)的DNA编码的p18AβrP蛋白；
(7)一种载体，所述载体含有依照(1)、(4)和(5)中任一项的DNA；
(8)一种转化子，所述转化子借助依照(7)的载体经历了基因转移；
(9)一种筛选细胞死亡促进或抑制物质的方法，所述方法包括让表达p18AβrP的细胞与受试物质在存在分化诱导因子的情况下接触，并且测定细胞死亡的抑制或促进；
(10)一种与p18AβrP相互作用从而抑制细胞死亡的物质；
(11)一种与p18AβrP相互作用从而抑制细胞死亡的物质，其中所述物质通过依照(9)的细胞测定系统发现的；
(12)一种依照(10)或(11)的物质，所述物质通过影响p18AβrP与Hsp70和/或Tid-1的相互作用来抑制细胞死亡；
(13)一种cDNA，所述cDNA包含SEQ ID NO：5的核苷酸82-1701的碱基序列；
(14)一种mRNA，所述mRNA与依照(13)的cDNA互补；
(15)一种蛋白质，所述蛋白质具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(16)一种编码蛋白质的DNA，所述蛋白质在依照(15)的蛋白质中有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，并且具有与依照(15)的蛋白质相似的细胞死亡抑制作用；
(17)一种DNA，所述DNA在严谨条件下可与依照(13)的DNA杂交，并且编码一种具有与依照(15)的蛋白质相似的细胞死亡抑制作用的蛋白；
(18)一种蛋白质，所述蛋白质由依照(16)或(17)的DNA编码，并且具有与依照(15)的蛋白质相似的细胞死亡抑制作用；
(19)一种依照(15)的蛋白质，所述蛋白质是p60TRP或具有与p60TRP相似的细胞死亡抑制作用的其变异型蛋白；
(20)一种载体，所述载体含有依照(13)、(16)和(17)中任一项的DNA；
(21)一种转化子，所述转化子借助依照(20)的载体经历了基因转移；
(22)一种用于治疗与细胞死亡相关的疾病的药用组合物，所述药用组合物含有依照(10)-(21)中任一项的蛋白质、DNA、载体或转化子；
(23)一种与p18AβrP相互作用从而促进细胞死亡的物质；
(24)一种与p18AβrP相互作用从而促进细胞死亡的物质，其中所述物质是通过依照(9)的细胞测定系统发现的；
(25)一种依照(23)或(24)的物质，所述物质通过影响p18AβrP与Hsp70和/或Tid-1的相互作用来促进细胞死亡；
(26)一种用于治疗和/或预防由细胞增殖过多引起的疾病的药用组合物，所述药用组合物含有依照(23)-(25)中任一项的物质；
(27)一种用于诊断与细胞死亡相关的疾病的方法，其特征在于，测定p18AβrP基因或p18AβrP蛋白在得自受治疗者的细胞或组织中的表达水平；
(28)一种用于诊断与细胞死亡相关的疾病的试剂盒，其特征在于，测定p18AβrP基因或p18AβrP蛋白在得自受治疗者的细胞或组织中的表达水平；
(29)一种物质，所述物质通过与p60TRP相互作用抑制经由p18AβrP的细胞死亡信号，来增强p60TRP的细胞死亡抑制作用；
(30)一种物质，所述物质通过与p60TRP相互作用抑制对经由p18AβrP的细胞死亡信号的抑制作用，来减弱p60TRP的细胞死亡抑制作用；和
(31)一种依照(22)的药用组合物，所述药用组合物还含有依照(29)的增强p60TRP的细胞死亡抑制作用的物质。
附图简述
图1显示p18AβrP cDNA的碱基序列(图1a)和氨基酸序列(图1b)。图1c显示本发明的大鼠p18AβrP蛋白(R)、及人(H)和小鼠(M)同源蛋白、和人短同源蛋白(sH)的氨基酸序列的比较。在图1c中下划线的氨基酸序列表示推定的nNOS PDZ结构域。
图2(左图)显示在加入Aβ1-42(10μg/ml)于37℃保温60小时后大鼠CG4少突胶质细胞裂解液的DNA印迹：第1泳道，对照；第2泳道，Aβ处理(Aβ)。图2(右图)显示所述p18AβrP mRNA转录物的定量测定。数值以6个独立实验中p18AβrP的PCR产物和S12的光密度测定比±标准误表示(相对于对照组的显著性水准，**P＜0.01)。
图3显示在加入NGF后表达或不表达p18AβrP的细胞中的神经突延伸。在加入NGF后120小时时，p18AβrP阳性细胞没有显示出神经突延伸(箭头所指)，而不表达的细胞清楚地显示出神经突延伸。图面i的比例尺相当于25μm。该长度的比例尺在图面a中相当于75μm，而在图面b-h中相当于50μm。p18AβrP阳性细胞在其表达后存活不超过2周，并且全部被杀死。
图4显示p18AβrP表达模式的研究结果。显示在所检查的所有22种组织中其mRNA都被表达。所述表达在以下组织中得到证实：1，脑；2，心脏；3，肾；4，脾；5，肝；6，结肠；7，肝；8，小肠；9，肌肉；10，胃；11，睾丸；12，唾液腺；13，甲状腺；14，肾上腺；15，胰腺；16，卵巢；17，子宫；18，前列腺；19，皮肤；20，白细胞；21，骨髓；和22，胎脑。
图5a显示大鼠p60TRP cDNA的核苷酸序列，图5b显示大鼠p60TRP蛋白的氨基酸序列。
图6a显示人同源性p60TRP cDNA的核苷酸序列，图6b显示人p60TRP蛋白的氨基酸序列。
图7显示在存活细胞(PC12细胞)中存在p60TRP以及RT-PCR的结果。图A显示存活集落，图B显示培养3天的存活集落，图C显示RT-PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳。
图8显示通过RT-PCR对mRNA表达的半定量，代表p60TRP的组织特异性表达：M泳道，分子量标记；第1泳道，心脏；第2泳道，脑；第3泳道，肾；第4泳道，肝；第5泳道，脾；第6泳道，胰腺；第7泳道，肺；和第8泳道，骨骼肌。
图9显示p60TRP-GFP和p60TRP-DsRedI在CHO细胞中的荧光图象。每幅图都具有相同的放大倍数。图A代表p60TRP-CT-GFP，其它图(图B-F’)代表p60TRP-CT-DsRed1。图B显示在细胞质中存在p60TRP，而图C显示在细胞核中存在p60TRP。图D和图D’、图E和图E’、及图F和图F’分别显示其在细胞核中存在，并且从用撇号标记的图面也可以看出细胞周边的图象。在图F’中，比例尺的长度相当于50μm。
图10显示由于表达p60TRP对PC12细胞的影响。显示了荧光显微镜图象，所述图象是在借助p60TRP-IRES-GFP使p60TRP与GFP共表达，在表达后24小时加入NGF(50ng/ml)，然后再培养120小时后拍摄的。表达p60TRP的细胞可以根据从GFP发射的荧光来鉴别。在PC12细胞中，p60TRP不影响NGF诱导的神经突延伸。比例尺相当于50μm。每幅图都具有相同的放大倍数。
图11显示PP2A的蛋白质印迹分析的结果。第1泳道表示分子量标记，而第2泳道表示当使用已经导入p60TRP-IRES-GFP的PC12细胞时，用多克隆山羊抗PP2A抗体沉淀的蛋白。第3泳道表示用多克隆兔抗p60TRP抗体沉淀的蛋白，其中在大约60 kDa检测出单个条带。
图12显示经p60TRP基因敲除的PC12细胞的细胞存活百分率。将每个存活百分率以8个独立实验的平均值±标准误作图。相对于对照-1的存活百分率为100％而言，在仅表达GFP的对照-2中没有观察到变化，其存活百分率为102％，而p60TRP敲除的p60TRP-siRNA的存活百分率显著降至76％。显著性水准：*P＜0.05(相对于对照)。
发明详述
下文将进一步详细地描述本发明。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含SEQ ID NO：3的核苷酸147-647的碱基序列的p18AβrP cDNA。本发明也涉及一种与上述cDNA互补的mRNA。上述cDNA编码一种如SEQ ID NO：4中所示的p18AβrP蛋白，因此本发明的p18AβrP蛋白具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。通常可以通过使用实施例中方法一节中描述的方法，例如RT-PCR法、cDNA差别法等等其它方法，获得上述cDNA，所述方法是本领域技术人员已知的。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的p18AβrP蛋白。可以例如通过实施例中方法一节中描述的方法，对蛋白质的氨基酸序列进行分析。该蛋白质由SEQ ID NO：3的核苷酸147-647的碱基序列编码。该蛋白质具有以下特性：
a)由于Aβ而增加表达，
b)与Hsp70和/或Tid-1相互作用，和
c)抑制细胞分化。
就如上所述的特性a)而论，本发明人当进行通过使用大鼠少突胶质细胞并且向所述细胞中加入从其前体蛋白APP切割的Aβ蛋白(老年斑的主要成分)进行的实验时，鉴定出细胞死亡，因而对参与该细胞死亡的基因进行筛选，导致发现一个新型基因p18AβrP。也就是说，Aβ增加p18AβrP蛋白的表达。可以在mRNA和蛋白质水平上都观测到增加的表达：可以例如通过RT-PCR、互补杂交、RNA酶保护分析等，检查mRNA量的增加；以及可以例如通过蛋白质印迹法、放射免疫测定法、荧光抗体法、免疫抗体法等，检查蛋白质表达的增加。就特性b)而论，如上所述，本发明人揭示出新的功能：p18AβrP蛋白通过与热激蛋白Hsp70和/或肿瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，抑制分化诱导因子引起的神经突的延伸和分支以及存活的维持，从而促进细胞死亡(参见实施例)。此外，就特性c)而论，本发明人发现，表达该基因的细胞抑制由神经营养因子诱导的细胞分化并且导致细胞死亡(参见实施例)。因此，可以通过检查这种分化抑制和细胞死亡的程度(例如经历细胞死亡的细胞百分比，细胞死亡的时间)，测定该蛋白的活性。用于测量活性的方法的实例是包括下述步骤的方法：将编码p18AβrP蛋白的基因导入一种合适的载体中，用所述载体转化细胞、优选神经细胞，在分化诱导因子(例如NGF)的作用下培养所述转化细胞，将所述细胞死亡与在相同条件下培养的未转化细胞(对照)的细胞死亡进行比较。为了评价是否已经引起细胞死亡，常常采用显微镜检查法。当发生细胞死亡时，可观察到例如细胞凝聚、空泡形成、表面平滑化、细胞和细胞核碎裂等等。
本发明的p18AβrP蛋白也包括SEQ ID NO：4的蛋白的变异体。也就是说，具有上述特性a)、b)和c)的任何蛋白质，即使在SEQ ID NO：4的蛋白质中插入、缺失或取代一个或多个氨基酸，也在本发明的p18AβrP蛋白范围内。本发明也包括编码这种蛋白的任何DNA。通过已知的方法，例如定点诱变和PCR，可以进行一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代。因此，即使一种蛋白中有一个或多个氨基酸被插入、缺失或取代，这样的蛋白也保留上述特性a)、b)和c)，也属于本发明的p18AβrP蛋白。
本发明还涉及一种在严谨条件下可与包含SEQ ID NO：3的核苷酸147-647的碱基序列的cDNA杂交的DNA。该DNA编码具有上述特性a)、b)和c)的p18AβrP蛋白。严谨条件是本领域技术人员熟知的，并且例如在许多教科书和文献中有介绍。以下条件是严谨条件的例子：在含有6X SSC、5X Denhardt氏试剂、0.5％SDS和100μg/ml鲑精DNA的溶液中于42℃杂交。
本发明还涉及基于包含SEQ ID NO：3的核苷酸147-647的碱基序列的cDNA，核苷酸序列同源性为至少60％或60％以上、优选70％或70％以上、更优选80％或80％以上、最优选90％或90％以上且低于100％的DNA。
在本发明的p18AβrP蛋白中也包括由任一上述DNA编码的蛋白质。
在再一实施方案中，本发明涉及一种含有编码所述p18AβrP蛋白的任一上述DNA的载体。可以用来导入编码所述p18AβrP蛋白的任一上述DNA以转化神经细胞的载体，使用文献中描述的各种各样的载体或市售的载体，例如pVgRXR、pIND、pIND/V5-His、pIND/GFP、pcDNA3.1或pcDNA3.1/myc或pcDNA3.1/His或pcDNA3.1/V5-His或pcDNA3.1-CT-GFP-TOPO或诸如LNCX2的病毒载体。转化方法是已知的，例如，磷酸钙法、Super Fector试剂法和应用LipofectAMINE试剂的脂质介导法等等。进行筛选所用的细胞可以使用任何种类的细胞，最好是神经细胞。优选的神经细胞的实例包括PC12细胞、NB2a、Neuro-2A、B104、SHSY-5Y、原代培养神经细胞等。上述载体、细胞转化和培养细胞的条件根据不同的细胞来确定，并且在本领域技术人员的知识范围内或者可以容易地确定。这样的转化子包括在本发明内。最好是将可检测标志与待表达的p18AβrP蛋白连接，致使可以容易地检测出p18AβrP蛋白的表达。所述标志可以在DNA水平上连接：例如，可以表达与编码p18AβrP蛋白的DNA序列融合的绿色荧光蛋白DNA、红色荧光蛋白DNA、myc基因等。特别是，与绿色荧光蛋白融合既简便又灵敏，因此可以建议所述方法。在对表现出表达的细胞进行选择后，必需检查上述特性a)、b)和c)。
p18AβrP蛋白可以通过下述方法分离出来：用本领域技术人员已知的合适方法(例如使用p18AβrP特异性抗体的免疫沉淀)，对表达p18AβrP蛋白的细胞进行提取，然后纯化(例如使用上述抗体作为载体的Sepharose柱)。
本发明还涉及一种筛选细胞死亡促进或抑制物质的方法，所述方法包括让表达p18AβrP的细胞与受试物质在存在分化诱导因子的情况下接触，并且测定细胞死亡的抑制或促进。
筛选与p18AβrP相互作用从而抑制其功能或者通过影响p18AβrP与Hsp70和/或Tid-1的相互作用从而抑制细胞死亡的物质的方法的实例包括一种这样的方法：所述方法包括将编码p18AβrP蛋白的基因导入一种合适的载体中，用所述载体转化细胞、优选神经细胞，在分化诱导因子(例如NGF)的作用和受试物质的存在下培养所述转化细胞，就神经细胞而论，分析神经突延伸和细胞死亡，并且与没有受试物质和/或没有分化诱导因子(即对照系统)获得的结果进行比较。合适的载体和细胞是本领域技术人员已知的，并且包括上述实例。在表达p18AβrP的细胞中，也在给定浓度的分化诱导因子的存在下，神经突延伸受到抑制(就神经细胞而论)，致使可以观察到细胞死亡。另一方面，与p18AβrP相互作用从而抑制其功能或者通过影响p18AβrP与Hsp70和/或Tid-1的相互作用从而抑制细胞死亡的物质的存在，使神经突可以生长(就神经细胞而论)，从而避免细胞死亡。在这种情况下，可能所述受试物质是与p18AβrP相互作用抑制其功能进而抑制细胞死亡或者通过影响p18AβrP与Hsp70和/或Tid-1的相互作用从而抑制细胞死亡的物质。
筛选与p18AβrP相互作用从而促进其功能或者通过影响p18AβrP与Hsp70和/或Tid-1的相互作用从而促进细胞死亡的物质的方法的实例包括一种这样的方法：所述方法包括将编码p18AβrP蛋白的基因导入一种合适的载体中，用所述载体转化细胞、优选神经细胞，在分化诱导因的作用和受试物质的存在下培养所述转化细胞，测定神经突延伸和细胞死亡，并且与不存在受试物质的情况下获得的结果进行比较。合适的载体和细胞是本领域技术人员已知的，并且包括上述实例。在存在的分化诱导因子的浓度高于在筛选与p18AβrP相互作用从而抑制其功能的物质中所使用的浓度时，加入受试物质至神经突延长的神经细胞或不引起细胞死亡的细胞中，从而神经突的生长受到抑制(就神经细胞而论)或者观察到细胞死亡，则可能所述受试物质是与p18AβrP相互作用而促进其功能进而促进细胞死亡或者通过影响p18AβrP与Hsp70和/或Tid-1的相互作用从而促进细胞死亡的物质。
评价是否引起细胞死亡的方法的实例包括如上所述通过显微镜检查法的方法。
本发明还涉及与p18AβrP相互作用从而抑制或促进细胞死亡的物质。所述物质是与p18AβrP相互作用的物质，本发明也包括通过影响p18AβrP与Hsp70和/或Tid-1的相互作用从而抑制或促进细胞死亡的物质。细胞死亡抑制或促进物质最好是通过上述筛选方法获得的物质。这样的物质可以是任何种类的分子，包括例如蛋白质、肽和诸如其它低分子量有机化合物的小分子。
本发明的细胞死亡抑制物质可用于预防和/或治疗例如与神经细胞的细胞死亡相关的脑内神经变性性疾病，例如早老性痴呆、唐氏综合征(Down’s syndrome)、和其它痴呆、以及亨廷顿舞蹈病(Huntington’schorea disease)、肌萎缩性侧索硬化、脊髓小脑变性性疾病、帕金森病(Parkinson’s disease)等。因此，在一个实施方案中，本发明涉一种用于治疗和/或预防与细胞死亡相关的疾病的药用组合物，所述药用组合物含有如上所述的细胞死亡抑制物质。通常，药用组合物含有药学上可接受的载体或赋形剂。药用组合物的生产方法、剂型和药学上可接受的载体或赋形剂根据受治疗者的病症、待治疗的部位、给药途径和其它因素进行选择，并且可以容易地由本领域技术人员来选择。
在本发明的上述筛选期间，发现了一个编码抑制细胞死亡的p60TRP蛋白的60TRP新基因和由所述基因编码的p60TRP蛋白。
因此，在再一个实施方案中，本发明涉及一种包含SEQ ID NO：5的核苷酸82-1701的碱基序列的cDNA。本发明也涉及一种与上述cDNA互补的mRNA。上述cDNA是编码SEQ ID NO：6的蛋白的cDNA。SEQ ID NO：6的氨基酸序列为大鼠p60TRP蛋白的氨基酸序列，因而SEQ ID NO：5的核苷酸序列(核苷酸82-1701)编码大鼠p60TRP蛋白。在下文，大鼠p60TRP简称为p60TRP。因此，本发明的p60TRP蛋白具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。通常可以通过使用实施例中方法一节中描述的方法，例如RT-PCR法、cDNA差别法等等其它方法，获得上述cDNA，所述方法是本领域技术人员已知的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码变异型p60TRP蛋白的DNA，所述变异型p60TRP蛋白在所述p60TRP蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)中有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代并且表现出与具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白相似的细胞死亡抑制作用；本发明还涉及一种编码变异型p60TRP蛋白的DNA，所述DNA在严谨条件下可与上述DNA杂交，而所述变异型p60TRP蛋白表现出与具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白相似的细胞死亡抑制作用。严谨条件在许多教科书和文献中有介绍，并且是本领域技术人员熟知的。以下条件是严谨条件的例子：在含有6X SSC、5X Denhardt氏试剂、0.5％SDS和100μg/ml鲑精DNA的溶液中于42℃杂交。
本发明还涉及基于包含SEQ ID NO：3的核苷酸147-647的碱基序列的cDNA，其核苷酸序列同源性为至少高于60％、优选70％或70％以上、更优选80％或80％以上、最优选90％或90％以上且低于100％的DNA。
由任一上述DNA编码的蛋白也包括在本发明的p60TRP蛋白内。
在本说明书中，如上所述的变异型p60TRP蛋白可以称为p60TRP蛋白，只要它具有与具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白(也就是p60TRP蛋白)相似的细胞死亡抑制作用。另外，来自除大鼠以外的物种的p60TRP同源蛋白例如人p60TRP蛋白，可以称为变异型p60TRP蛋白或者简称为p60TRP蛋白，只要它具有与具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白(也就是p60TRP蛋白)相似的细胞死亡抑制作用。基于大鼠p60TRP蛋白，这样一种同源p60TRP蛋白的同源性为至少60％或60％以上、优选70％或70％以上、更优选80％或80％以上、最优选90％或90％以上且低于100％。
在再一个实施方案中，本发明涉及一种含有编码上述p60TRP蛋白(包括变异体)的DNA的载体，本发明还涉及一种用所述载体转化的转化子例如细胞。
可以用来导入编码p60TRP蛋白的任一上述DNA以转化神经细胞的载体，使用文献中描述的各种各样的载体和各种各样的市售载体，例如pVgRXR、pIND、pIND/V5-His、pIND/GFP、pcDNA3.1或pcDNA3.1/myc或pcDNA3.1/His或pcDNA3.1/V5-His或pcDNA3.1-CT-GFP-TOPO或诸如LNCX2的病毒载体。转化方法是已知的，例如，磷酸钙法、Super Fector试剂法和应用LipofectAMINE试剂的脂质介导法等等。进行筛选所用的细胞可以使用任何种类的细胞，最好是神经细胞。优选神经细胞的实例包括PC12细胞、NB2a、Neuro-2A、B104、SHSY-5Y、原代培养神经细胞等。上述载体的构建、细胞转化和培养细胞的条件根据不同的细胞来确定，并且在本领域技术人员的知识范围内或者可以容易地确定。这样的转化子也包括在本发明内。最好是将可检测标志与待表达的p60TRP蛋白连接，致使可以容易地检测出p60TRP蛋白的表达。所述标志可以在DNA水平上连接：例如，可以表达与编码p60TRP蛋白的DNA序列融合的绿色荧光蛋白DNA、红色荧光蛋白DNA、myc基因等。特别是，与绿色荧光蛋白融合既简便又灵敏，因此可以建议所述方法。在对表现出表达的细胞进行选择后，必需用本文中描述的筛选测定来检查细胞死亡抑制作用。
p60TRP蛋白可以通过下述方法分离出来：用本领域技术人员已知的合适方法(例如使用p60TRP特异性抗体的免疫沉淀)，对表达p60TRP蛋白的细胞进行提取，然后纯化(例如使用上述抗体作为载体的Sepharose柱)。
在再一个实施方案中，本发明涉及一种用于抑制细胞死亡的药用组合物，所述药用组合物含有上述p60TRP蛋白(包括变异体)、编码所述蛋白的DNA、含有编码上述p60TRP蛋白(包括变异体)的DNA的载体或用所述载体转化的转化子。另外，本发明也涉及一种用于抑制受治疗者体内细胞死亡的方法，其特征在于，将所述物质之一或所述转化子给予所述受治疗者；本发明还涉及它们用于生产抑制细胞死亡的药物方面的应用。药用组合物的生产方法、剂型和药学上可接受的载体或赋形剂根据受治疗者的病症、待治疗的部位、给药途径和其它因素进行选择，并且可以容易地由本领域技术人员来选择。用于抑制细胞死亡的这些组合物、方法和应用可供用于治疗和/或预防与细胞死亡相关的各种脑内神经变性性疾病，例如早老性痴呆、唐氏综合征、和其它痴呆、以及亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓小脑变性性疾病、帕金森病等。在上述治疗中，当使用p60TRP基因或含有所述基因的载体时，提供基因治疗，在基因治疗中可以将所述基因或载体导入得自受治疗者的细胞中，可以培养所述细胞，然后将其回输给所述受治疗者，或者可以将p60TRP基因或含有所述基因的载体直接引入受治疗者体内。
另外，本发明提供调节(促进或抑制)p60TRP的细胞死亡效应的物质。具体地说，这样的物质是通过与p60TRP相互作用抑制经由p18AβrP的细胞死亡信号而促进p60TRP的细胞死亡抑制作用的物质(p60TRP激动剂)，及通过与p60TRP相互作用抑制经由p18AβrP的细胞死亡信号来减弱p60TRP的细胞死亡抑制作用的物质(p60TRP拮抗剂)。这些调节p60TRP的细胞死亡抑制作用的物质包括但不限于天然或合成的蛋白质、肽、核酸等，并且可以是天然或合成的低分子量化合物。p60TRP激动剂的实例例如是PP2A、Ran BP5和其它蛋白质。为了筛选这类p60TRP激动剂和拮抗剂，一般可以如下所述使用的双杂交系统。
另外，例如，可以将p60TRP激动剂加入到含有p60TRP的药用组合物中，以进一步增强细胞死亡抑制作用，从而使得可以更有效地治疗或预防与细胞死亡相关的疾病，例如早老性痴呆。
本发明的细胞死亡促进物质可用于例如建立细胞死亡系统及各种与细胞死亡相关的研究，例如阐明与神经细胞的细胞死亡相关的疾病(例如早老性痴呆)的机理。此外，本发明的细胞死亡促进物质可用于治疗和/或预防由细胞增殖过多引起的疾病，例如癌症和自身免疫病。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗和/或预防由细胞增殖过多引起的疾病的药用组合物，所述药用组合物含有如上所述的细胞死亡促进物质。药用组合物的生产方法、剂型和药学上可接受的载体或赋形剂根据受治疗者的病症、待治疗的部位、给药途径和其它因素进行选择，并且可以容易地由本领域技术人员来选择。
本发明也涉及一种用于治疗和/或预防受治疗者体内由细胞增殖过多引起的疾病的方法，其特征在于，给予所述受治疗者一种如上所述的细胞死亡促进物质。本发明也涉及如上所述的细胞死亡促进物质在生产用于治疗和/或预防由细胞增殖过多引起的疾病的药物中的应用。如上所述的基因治疗也可以用于治疗和/或预防由细胞增殖过多引起的疾病。
本发明还涉及一种检查细胞、特别是神经细胞中细胞死亡的方法，以及涉及一种用于诊断与这种细胞死亡相关的疾病的方法，其特征在于，检查得自受治疗者的细胞和组织中p18AβrP基因或p18AβrP蛋白的表达水平。人们可以在例如在mRNA水平上检测得自受治疗者的细胞和组织样品中的p18AβrP基因，或者可以检测细胞样品中的p18AβrP蛋白。可以通过本领域技术人员熟知的方法，例如使用与p18AβrP基因互补的探针(最好是用例如放射性同位素、荧光团、酶等标记的探针)的杂交，或者通过利用与针对p18AβrP蛋白的单克隆抗体(最好是用例如放射性同位素、荧光团、酶等标记的单克隆抗体)的结合，实现所述检测。在这种情况下，通过检查所述标记的信号强度来测定p18AβrP基因的表达强度或p18AβrP蛋白的量是可行的。
本发明也涉及一种用于检测细胞、特别是神经细胞中细胞死亡的试剂盒，并且涉及一种用于诊断与这种细胞死亡相关的疾病的试剂盒，其特征在于，检查得自受治疗者的细胞和组织中p18AβrP基因或p18AβrP蛋白的表达水平。作为试剂盒的组分，包括例如与p18AβrP基因互补的探针(最好是用例如放射性同位素、荧光团、酶等标记的探针)和/或针对p18AβrP蛋白的单克隆抗体(最好是用例如放射性同位素、荧光团、酶等标记的单克隆抗体)。所述试剂盒通常附有其操作说明。
实施例
以下实施例描述了本发明，但绝对是用来说明本发明，而不是用来限制本发明的。
I.实验方法
大鼠细胞的制备：将CG4(一种少突胶质细胞前体细胞，由Kazuhiro IKENAGA教授馈赠，Department of Neuronal Information，National Institute for Physiological Sciences，Okazaki National ResearchInstitutes)在补充N1(5mg/l胰岛素、16.1mg/l腐胺、50mg/l运铁蛋白、4.6mg/l D-半乳糖、8mg/l亚硒酸钠、2.4g/l HCO3)的和30％(v/v)B104细胞无血清培养基的DMEM/F-12(1∶1v/v)培养基中培养。为了诱导少突胶质细胞的分化，将CG-4细胞培养24小时，加入无促细胞分裂因子的B104细胞，然后加入2％FCS(Gibco)，以提高存活率。
RT-PCR方法：采用RT-PCR(Heese等，Eur.J.Neurosci.，15，79(2002))，对mRNA进行分析，并且进行p60TRP的分离。简而言之，按照TRIzolReagent方案(Gibco BRL，NT，USA)，制备细胞的总RNA。用氯仿抽提mRNA后，向水层中加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，用75％乙醇冲洗，溶于无RNA酶的水中，在分光光度计上测量吸光度(260nm)。每个样品的总RNA(0.2μg/ml)首先反转录成cDNA(oligo(dT)-primed-SMARTTM cDNA-synthesis(Clontech，Tokyo，Japan)；Superscript IITM(Gibco BRL，NY，USA))，然后采用p18AβrP特异性引物(有义引物：5’-atgagtgaatggacgaagaaaagccccttagaatgggaggat-3’(SEQ IDNO：1)；反义引物：5’-tctgggaagctgaaagatggccttgaataagatcctgaattcggg-3’(SEQ ID NO：2))，使用0.5μl等份样品进行PCR反应(反应体积：25μl)。扩增每种cDNA所用的循环反应的次数依照the ElongaseTM酶混合物方案在线性范围内设定。在扩增步骤中于94℃进行1分钟的变性，用特异性引物，于65℃进行50秒的退火，然后再于68℃保温1分钟或更长时间(65℃，24个循环)。用来源于大鼠脑cDNA文库(pAP3neo，Takara)的引物，通过5’-RACE-RT-PCR制备大鼠p60TRP cDNA。用以下方法(Heese等，Eur.J.Neurosci.，15，79(2002))，进行p60TRP的分离。简而言之，按照TRIzolReagent方案(Gibco BRL)，分离细胞的总RNA。用氯仿抽提后，向水层中加入异丙醇，沉淀RNA，用75％乙醇冲洗，重新溶于无RNA酶的水中，在分光光度计上定量(260nm)。每个样品的总RNA(0.2μg/ml)首先转录成cDNA(oligo(dT)-primed-SMARTTM cDNA-synthesis；Clontech；Superscript IITM(Gibco))，然后采用大鼠(r)和人(h)p60TRP特异性引物(对于分离而言：有义引物：5’-gcgtaatacgactcactatagggaattcgacgt-3’(SEQ ID NO：9)，反义引物：5’-cgcgacgtacgatttaaattaaccctcactaaa-3’(SEQ ID NO：10)；r-有义引物：5’-atgactggctcaaagaataaggctcgggctcaggctaaactg-3’(SEQ ID NO：11)，r-反义引物：5’-ttacattctttcaataatccctttaacttcacggaatatggcagt-3’(SEQ ID NO：12)；h-有义引物：5’-atggctgggactaagaataagacaagagcccaggccaaaac-3’(SEQ ID NO：13)；h-反义引物：5’-cattgtttcaataatctctttaacttccctgaaaatggccatgag-3’(SEQ ID NO：14))，使用0.5μl等份样品进行PCR扩增反应(反应体积：25μl)。循环数依照theElongaseTM酶混合物方案(Gibco)在线性范围内设定。如下进行PCR：于94℃变性0.5分钟，于65℃退火50秒(退火温度)，然后于68℃延伸2分钟(退火温度：65℃，16个循环)。
用组成型表达核糖体蛋白S12的PCR扩增反应(60℃，16个循环)来测定所引入的RNA。用不进行逆转录、使用RNA样品或无RNA的对照来确定不存在DNA的污染。通过在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，分析PCR反应物，将DNA片段转移到尼龙膜上，让其与荧光标记的DNA探针杂交。用FluoroImager 595(Image Quant ver.5.0(MolecularDynamics，Tokyo，Japan))，对所述膜进行分析。除了非参数统计学分析(Kruskal-Wallis检验)之外，还应用方差分析(ANOVA)，对结果进行统计学分析，误差以标准误表示。
cDNA示差(differential)：为了测定加入Aβ1-42以诱导细胞死亡的多组细胞和对照细胞之间在已表达的mRNA方面的差别，进行PCR-SelectTM cDNA示差(Clontech)。简而言之，将CG-4细胞在胎牛血清(FCS)±Aβ1-42(10μg/ml)的条件下孵育60小时，然后进行cDNA示差(Heese等，Neurosci.Lett.，288，37(2000)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，289，924(2001))。用SMARTTM-PCR-cDNA synthesis(Clontech)并且使用一种经修饰的寡聚dT引物(CDS引物)，将每组的mRNA转变成cDNA，进行第一链的合成。用SMARTTM-寡核苷酸-锚定序列和polyA+序列作为用于从头到尾的cDNA扩增(LD-PCR)的通用引发位点。让来源于Aβ1-42处理细胞组的cDNA和来源于对照细胞组的cDNA进行杂交，以除去这些cDNA，而未经杂交的cDNA被称为用Aβ1-42活化的差别cDNA。将所述差别cDNA克隆到TOPO-T/A克隆载体(Invitrogen)中，通过蛋白质印迹法进行鉴定。在测序仪(ABIPRIMTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin-Elemer；测序仪：ABI PRISM 310型))上，分析碱基序列。
cDNA克隆：在cDNA扣除后，通过运用根据数据库的部分cDNA/EST序列(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)设计的寡核苷酸，并且在5’-RACE(cDNA末端快速扩增)和RT-PCR实验中，运用大鼠脑cDNA文库(ClonCapture ReadyTM Super DNA；Clontech，Tokyo，Japan)进行筛选，获得大鼠p18AβrP的EST序列的全长cDNA。通过将大鼠p18AβrPcDNA插入到pCRII-TOPOT/A克隆载体(Invitrogen，Tokyo，Japan)中，构建供分析用的p18AβrP构建体。通过将供表达绿色荧光蛋白(GFP)用的pcDNA3.1 CT-GFP-TOPO(Invitrogen，Tokyo，Japan)在p18AβrP的C末端插入到大鼠p18AβrP cDNA中，构建供表达用的p18AβrP构建体(p18AβrP-CT-GFP)。
p18AβrP cDNA序列和氨基酸的分析：除对于非重叠GenBankCDS翻译使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)Blastp 2.0程序(Nucleic Acids Res.，25，3389(1997))以及使用UniGene数据库(NCBI)(Nucleic Acids Res.，25，2289(1997))外，还运用PDB、SwissProt、PIF和PRF，对p18AβrP cDNA序列和氨基酸序列进行分析。运用Blast和FASTA(Wisconsin Package ver.10.0，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，WI)算法和BestFit(Eisconsin Package Version10.0 GCG)，进行同源性搜索。运用PROSITE-Profile和BLOCKS程序、ProDom程序、PRINTS程序、Pfam程序和PSORT II程序(Nucleic AcidsRes.，27，260(1999)，Intellig.Syst.Mol.Biol.，4，109(1996)；Intellig.Syst.Mol.Biol.，5，147(1997))，搜索氨基酸序列的基序。运用NetPhos 2.0(J.Mol.Biol.，294，1351(1999))，搜索磷酸化位点，而不仅运用ExPASywww服务器(http：//www.expasy.ch)，而且运用http：//www.sofiberry.com/index.html和氨基酸组成搜索(AACompIdent)http：//kr.expasy.org/tools/aacomp/，进行其它分析。已确测的p18AβrPcDNA序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：3(图1a)和SEQ ID NO：4(图1b)中。另外，图1c显示本发明的大鼠p18AβrP蛋白与人和小鼠同源蛋白的氨基酸序列的比较。
p18AβrP表达组织的分析：按照常规方法，获取大鼠的22种组织，以制备如下样品：1＝脑；2＝心脏；3＝肾；4＝脾；5＝肝；6＝结肠；7＝肝；8＝小肠；9＝肌肉；10＝胃；11＝睾丸；12＝唾液腺；13＝甲状腺；14＝肾上腺；15＝胰腺；16＝卵巢；17＝子宫；18＝前列腺；19＝皮肤；20＝白细胞；21＝骨髓；和22＝胎脑(编号对应于图4中的泳道编号)。用先前描述的方法(参见RT-PCR一节)，通过从每个组织样品制备cDNA，制备组织样品。为了检查p18AβrP的组织特异性表达，使用Rapid-ScanTM-Gene-Expression panels(OrigeneTechnologies，MD，USA)。用标准2％DNA电泳琼脂糖E-gelTM(Invitrogen)，分析PCR产物。
筛选细胞死亡抑制和/或促进物质的方法—获得细胞死亡抑制物质p60TRP的方法：在表达p18AβrP的PC12细胞中，尽管加入了NGF，但是没有观察到细胞分化、存活和神经突延伸，而当在这些细胞中表达大鼠cDNA文库时，尽管表达p18AβrP，但是导致发现存活细胞。因此，通过死亡陷阱筛选方法(death trap screening method)(Semin，Immunol.，9，17(1997))，从这些存活细胞中，用RT-PCR发现涉及该存活的基因，命名为p60TRP基因。此外，将由该基因编码的细胞死亡抑制蛋白命名为p60TRP蛋白。
p60TRP cDNA碱基序列和蛋白质一级结构的分析：运用作为搜索工具的、运用UniGene数据库(NCBI)(Nucleic Acids Res.，25，3389(1997))和GenBank CDS translation+PDB+Swiss Prot+PIR+PRF数据库的NCBI(National Center for Biotechnology Information)Blast 2.0程序，对p60TRP cDNA和p60TRP蛋白进行序列分析。对于同源性搜索，运用Blast和FASTA(Wisconsin Package Version 10.0，GCG(GeneticsComputer Group))算法，并且运用BestFit(Wisconsin Package Version10.0 GCG)，进行序列比对。运用ExPASy-www服务器(http：//www.expasy.ch)、softberry：http：//www/softberry.com/index.html和氨基酸组成搜索(AACompIdent)：http：//kr.expasy.org/tools/aacomp/，测定蛋白质序列。运用PROSITE Profile、BLOCKS-ProDom-PRINTS-Pfam程序和PSORT II程序(Nucleic Acids Res.，27，260(1999)，Mol.Biol.，4，109(1996)；Mol.Biol.，5，147(1997))，搜索所述氨基酸序列中的基序。运用NetPhos 2.0蛋白质磷酸化搜索服务器(J.Mol.Biol.，294，1351(1999))，搜索磷酸化位点。
各组织中p60TRP表达的分析：使用Rapid-ScanTM-Gene-Expressionpanels(Origene Technologies，Rockville，MD，USA)，分析p60TRP的组织特异性基因表达，对组织cDNA进行半定量RT-PCR分析。用标准1.5％DNA电泳琼脂糖E gelTM(Invitrogen，Brain Aging，2，30(2002))，分析PCR产物。
细胞培养：在5％CO2/95％空气的条件下，将大鼠成神经细胞瘤细胞B104(例如可得自Kazuhiro Ikenaka教授，National Institute forPhysiological Sciences，Okazaki National Research Institutes)和PC12细胞(例如可得自ATCC(American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心))，ATCC No.CRL-1721)在含有N2补充10％胎牛血清(FCS；Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)的Dulbecco氏改良Eagle培养基(D-MEM)/F12(1∶1v/v)中于37℃培养，而将CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系在补充10％FCS的DMED中于37℃培养。将CG4(一种少突胶质细胞前体细胞)在补充N1(5mg/l胰岛素、16.1mg/l腐胺、50mg/l运铁蛋白、4.6mg/l D-半乳糖、8mg/l亚硒酸钠、2.4g/l HCO3)和30％(v/v)B104细胞无血清培养基的DMEM/F-12(1∶1v/v)培养基中培养。为了诱导少突胶质细胞的分化，将CG-4细胞培养24小时，加入无促细胞分裂因子的B104细胞，然后加入2％FCS(Gibco)，以提高存活率。为了诱导细胞死亡，将细胞在加入FCS±Aβ(Peptide Institute，Inc.，Osaka，Japan；以1mg/l磷酸缓冲盐溶液(PBS)pH 7.4溶于无血清溶液中，至10μg/ml，然后于37℃孵育24小时)的情况下培养60-72小时，然后用Promega试剂盒(CellTiter96AQueous One Solution细胞增殖测定)，测量存活细胞。为了诱导神经突延伸，用p18AβrP-CT-GFP或对照载体对PC12细胞进行基因转移，然后用NGF(50ng/ml)诱导24小时。
将基因转移到细胞中：构建在p18AβrP的C末端引入GFP(绿色荧光蛋白)的p18AβrP-CT-GFP；构建分别在大鼠p60TRP cDNA的C末端引入GFP(pcDNA3.1 CT-GFP-TOPO(Invitrogen)或DsRed1(NheI和HindIII限制性酶克隆位点，Clontech，Tokyo，Japan)的p60TRP-CT-GFP和p60TRP-CT-DsRed1。另外，将p60TRP亚克隆到pIRES2-EGFP(Clontech)中，以便允许与GFP(p60TRP-IRES-GFP)一起从同一mRNA进行共表达。将p18AβrP-CT-GFP或p60TRP-DsRed1、p60TRP-GFP、p60TRP-IRES-GFP和GFP(Clontech，Tokyo Japan)表达载体或空载体(对照)瞬时基因转移到CHO细胞(例如可得自ATCC，ATCC No.CCL-61)和PC12细胞(例如可得自ATCC，ATCC No.CCL-1271)(SuperFector，B-Bridge，San Jose，Ca，USA)中，所述细胞用补充10％胎牛血清(FCS，Gibco BRL，Tokyo)的D-MEM/F12(1∶1)/含N2培养基在5％CO2/95％空气的条件下于37℃培养。基因转移的效率通过GFP和p53-/PKC-DsRed1(Clontech)的共表达加以证实，以便效率总是为50-60％(Eur.J.Neurosci.，15，79(2002))。在荧光显微镜(Olympus IX70，Olympus，Tokyo，Japan)下，在基因转移后48小时时，评估细胞死亡/存活。此外，24小时后，加入NGF(鼠类NGF 2.5S，50ng/ml；Invitrogen)至所述PC12细胞中，120小时后，用CellTiter96AQueous Assay(Promega，Madison，WI，USA)测量存活细胞，并且在荧光显微镜下进行观察。
双杂交系统：使用酵母菌株MaV203(例如可得自Invitrogen)。将大鼠p18AβrP或大鼠p60TRP亚克隆到具有来自pENTR/D-TOPO的GAL4 DNA结合结构域的pDESTTM32载体(Invitrogen)中。此外，用pEXP-AD502作为具有ProQuestTM双杂交大鼠脑cDNA文库(Invitrogen)的激活结构域的表达载体。为了根据活性进行选择，使用三个报道基因—HIS3、URA3和lacZ。这些基因中的每个基因都在不同位点稳定地整合到酵母基因中，HIS3、lacZ和URA3的启动子区是不同的，只是GAL4结合结构域除外。据报道ProQuestTM双杂交系统使得可以从各自不同的染色体上发生三个独立的转录，从而与标准双杂交系统相比，产生的假阳性反应减少。HIS3和URA3报道基因的诱导取决于所述双杂交，分别使得细胞也能够在缺乏组氨酸或尿嘧啶的平板上生长，致使可以将细胞区分开来。另一方面，lacZ基因的诱导可以用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)来进行，产生蓝色。另外，由于5-氟乳清酸(5-FOA)转变为5-氟尿嘧啶所产生的毒性，因此URA3的诱导使得细胞能够在缺乏尿嘧啶的培养基中生长，而在含有5-FOA的培养基中抑制细胞生长。因此，该系统使得能够对四种表型进行筛选，也就是说，通过His(3AT)、β-gal、Ura+和5-FOAs，蛋白质表现出真实的相互作用，因而消除了假阳性反应。ARS/CEN载体的应用也可以降低表达水平和毒性。通过重新转化，可以鉴定出阳性克隆。当含有互作蛋白质时，酵母细胞与db-大鼠p60TRP或db-大鼠p18AβrP和ad-Y(其中Y例如是PP2A或TID-1)结合。可以通过电穿孔，将来自含有上述基因的酵母菌株的质粒DNA导入大肠杆菌细胞中，转化子可以用氨苄青霉素进行选择，或者db-大鼠p18AβrP可以用庆大霉素进行选择。这些大肠杆菌细胞的质粒DNA即ad-Y(其中Y例如是PP2A或TID-1)可以与pDBleu或db-大鼠p18AβrP或db-大鼠p60TRP一起导入到MaV203中，并且用db-大鼠p18AβrP或pdb-大鼠p60TRP诱导报道基因将会得到真正的阳性反应。
抗p60TRP抗体的产生：制备并使用对p60TRP的N端结构域(氨基酸(aa)-35至aa-45；RGAGKNRDKGK-cys)具有高亲和性的兔抗p60TRP抗体。
蛋白质免疫沉淀和蛋白质印迹分析：将p60TRP-IRES-GFP瞬时基因转移到约5×106 PC12细胞后24小时，再连续培养48小时。此后，细胞用Tris盐水缓冲液(TBS，pH 7.2)洗涤两次，用0.5ml冰冷的缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH 8.0、1％NP40、2％甘油、1mMPMSF、10μg/ml抑蛋白酶肽、1μg/ml亮抑蛋白酶肽、0.5mM钒酸钠)于4℃裂解细胞，通过于4℃离心除出细胞核。于4℃与抗体(抗p60TRP)一起保温2小时后，加入500μl 50％ Protein-A SepharoseCL-4B，再保温2小时。洗涤免疫沉淀三次，加入50μl Laemmli-protein缓冲液(Bio-Rad，Tokyo，Japan)，然后进行蛋白质印迹分析。简而言之，将蛋白质在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以进行分离。将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)(Bio-Rad，Tokyo，Japan)中，然后与抗PP2A(调节亚基)抗体(SantaCruz，CA，USA)免疫反应，加入第二荧光素缀合的抗山羊抗体和第三碱性磷酸酶缀合的抗荧光素抗体，与碱性磷酸酶的底物(ECFTM)蛋白质印迹试剂盒，Amersham/Pharmacia，Tokyo，Japan)一起保温。
细胞死亡的评价：培养PC12细胞至50-80％汇合，基因转移前用胰蛋白酶处理24小时，在缺乏抗生素的新鲜培养基中稀释5倍(1-3×105细胞/ml)，转移至24孔板(500μl/孔)，然后进行培养。在用于评价细胞死亡的实验中，对不表达GFP的细胞(对照-1)、仅表达GFP的细胞(对照-2)和通过SiRNA敲除了p60TRP基因的细胞进行研究。使用Oligofectamine并且每孔导入0.5μg siRNA，通过SiRNA进行基因敲除(Brain Aging，2，44，(2002))。在1μg GFP表达载体和0.2μg siRNA共表达后，在荧光显微镜下测定基因转移的效率(Mol.Brain Res.，104，127，(2002)；Nature，411，494(2001))。通过the Cell-Titer 96AQueous Onesolution assay(Promega，Madison，WI：Neurosci.Lett.，288，37(2000))，在表达后48小时测定因SiRNA引起的细胞死亡/存活百分率。用于p60TRP的siRNA序列使用相对于起始密码子的nt 310至nt 330的序列。p60TRP特异性21聚体核酸(21-nucleic acid)双链体siRNA得自Dharmacon Research(Lafayetta，CO，USA；B-Bridge International，Tokyo，Japan)。
如上所述的实验程序通常是本领域已知的，本领域技术人员将会认识到或者应该容易地设想其变化和替代程序。
II.实验结果
依照本发明的实验结果描述如下：
(1)本发明的大鼠p18AβrP cDNA的碱基序列与人和小鼠序列同源，并且比较其氨基酸序列，结果示于图1c中。因此，证明本发明的大鼠p18AβrP cDNA的碱基序列是一种不同于上述文献中描述的人碱基序列和在the Gene Data Bank(基因数据库)中发现的序列的新型序列，从图1c可以看出，p18AβrP蛋白的氨基酸序列是一种不同于人和小鼠序列的新型序列。
(2)已经表明，在加入Aβ1-42(10μg/ml)于37℃保温60小时后，当通过蛋白质印迹法检查时，p18AβrP在大鼠CG4少突胶质细胞裂解物中的表达因Aβ1-42而增加(参见图2中的左图)：第1泳道，对照；第2泳道，Aβ处理(Aβ)。通过光密度测量法定量，导致发现p18AβrPmRNA转录的量因加入Aβ1-42而增加(参见图2中的右图)。
(3)在经历通过NGF诱导的分化的PC12细胞中，p18AβrP引起对神经突延伸的抑制，并且导致细胞死亡。为了研究p18AβrP在神经细胞中的功能，将GFP与p18AβrP的C末端融合的蛋白质的基因导入PC 12细胞中，48小时后鉴定其表达。接下来，24小时后，加入NGF(50ng/ml)，120小时后进行荧光显微镜观察，结果如图3所示，尽管存在NGF，但是神经突的延伸受到抑制，并且观察到细胞死亡，2周后，所有细胞全部被杀死。反之，在无所述基因表达(没有荧光)的细胞中，NGF明显地促进神经突延伸，使得细胞可以存活。这些模式中的某些模式示于图3中的图面a-i。例如，在图面c和f中观察到，发射GFP荧光的p18AβrP阳性细胞(如箭头所指)皱缩，引起细胞死亡和漂浮。也观察到在图面d中箭头所指的细胞保持细胞形态，尽管神经突延伸受到抑制。
(4)应用以上解释的双杂交系统，筛选与本发明p18AβrP相互作用的一种或多种蛋白质，结果，发现了这样一种与热激蛋白Hsp70和肿瘤抑制蛋白Tid-1相互作用的蛋白。可能如上所述的诱导细胞死亡和抑制细胞分化的效应由这种相互作用所致。
(5)关于p18AβrP mRNA在大鼠各种组织中的表达，通过RT-PCR对mRNA表达进行非定量分析。如图4所示，在包括脑在内的22种器官和组织中鉴定出其表达。
(6)p60TRP的分离、表征以及在组织和细胞中的表达
在p18AβrP和大鼠脑cDNA文库的基因转移后，通过RT-PCR在存活细胞中发现了p60TRP(图7)。这种新基因的大鼠cDNA的碱基序列示于SEQ ID NO：5和图5A中，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：6和图5B中，同时进行比较，其同源的人基因cDNA示于SEQ ID NO：7和图6A中，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：8和图6B中。由大鼠cDNA(SEQ ID NO：5的核苷酸82-1701)编码的蛋白是由SEQ ID NO：6的539个氨基酸组成的蛋白，其分子量约为59.72 kDa。该大鼠p60TRP cDNA的碱基序列及其氨基酸序列明显不同于人序列，因而是新型序列。大鼠p60TRP蛋白和人p60TRP同源蛋白之间的氨基酸同源性提示，人p60TRP同源蛋白也具有与大鼠p60TRP蛋白相似的细胞死亡抑制作用。根据其序列，p60TRP蛋白可能构成一个新的蛋白质家族并且具有bHLH结构域(SEQ ID NO：6序列的氨基酸491-507)。具有这样一种结构域的p60TRP蛋白质家族成员包括O43168、Q96D09、QBVZ3、Q9CVV3、Q9H969、Q920R4、Q9BE11、Q9C0G2、Q9CXQ7、Q9UJC4、Q8R095、O60267、Q9NPE4/Q9UH62、Q9NTS2、Q9BTM6、Q9H2Q0、Q9P291、Q9NWJ13、Q9CX19、Q9DC32、Q9CZ87、Q9CUN3、Q9D0L7、Q9CS81和Q9CX83。
此外，用RT-PCR研究组织中的表达模式，结果，在脑、肾和脾中鉴定出高表达水平的所述mRNA，并且也在心脏和骨骼肌中鉴定出所述mRNA，在而肺和肝中没有检测到表达(图8)。图9显示p60TRP-GFP和p60TRP-DsRed1在CHO细胞中的荧光图象。在CHO细胞中，p60TRP-GFP或p60TRP-DsRed1融合蛋白具体定位于细胞质中(图9中的图面A和B)，但也存在于细胞核中(图9中的图面C-F)。
另外，p60TRP在PC12细胞中并不影响由NGF诱导的神经突延伸。如图10所示，当p60TRP在PC12细胞中表达后24小时加入NGF(50ng/ml)、再培养120小时时，在共表达p60TRP和GFP的细胞中能够观察到NGF的神经突延伸作用不受抑制的事实。
(7)与p60TRP相互作用的蛋白质
双杂交系统揭示出，两种蛋白质即PP2A(蛋白质磷酸酶2A，在胞内信号转导中负责关键性的去磷酸化反应)和RanBP5(Ran结合蛋白5)与p60TRP的相互作用，涉及bHLH转录因子从细胞质至细胞核的转运。如图11所示，免疫沉淀及其蛋白质印迹分析表明，p60TRP与PP2A结合。可能p60TRP与这些蛋白质相互作用，并且抑制经由p18AβrP的细胞死亡信号，从而导致抑制细胞死亡。
(8)p60TRP和PP2A的免疫沉淀
图11表示p60TRP和PP2A的免疫沉淀的蛋白质印迹分析的结果。通过免疫沉淀实验证实，在PC12细胞中表达的p60TRP通过与PP2A相互作用并复合而在大约60kDa处共沉淀。
(9)通过p60TRP基因敲除使细胞存活百分率降低
与对照组相比，通过p60TRP特异性siRNA进行基因敲除，显著降低PC12存活细胞的百分率。也就是说，如图12所示，对照-1表现出存活百分率为100％，并且对照-2 GFP没有改变存活百分率，存活百分率为102％，而敲除p60TRP的p60TRP-siRNA显著降低存活细胞的百分率至76％(p＜0.05)。这进一步证实了p60TRP蛋白的细胞死亡抑制作用。
因此，参考实施例具体而详细地描述了本发明。然而，本领域技术人员可以进行以上所述之外的修改和变化，例如易选择合适的细胞系来实施本发明。
工业应用性
按照本发明，发现了一个其表达在少突胶质细胞中因淀粉状蛋白-β蛋白(下文称为Aβ)而增加的新型基因p18AβrP并且证明了其功能。也就是说，证明本发明基因及其产物p18AβrP蛋白具有以下新的功能：通过与热激蛋白Hsp70和肿瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，抑制通过神经营养因子促进神经突延伸的作用，支持细胞死亡、进而促进细胞死亡。因此，本发明提供应用这些事件的筛选系统、可使用这样的筛选系统获得的参与促进和抑制细胞死亡的物质、应用所述物质诊断和预防疾病。通过上述筛选系统，本发明还首次发现大鼠细胞死亡抑制蛋白p60TRP及其编码基因，也首次鉴定出p60TRP蛋白的作用和效应，即细胞死亡的抑制效应。因此，本发明提供应用所述基因/蛋白诊断和预防与细胞死亡相关的疾病。
序列表的独立文本
SEQ ID NO：1
有义引物，用于扩增p18AβrP cDNA。
SEQ ID NO：2
反义引物，用于扩增p18AβrP cDNA。
SEQ ID NO：3
编码p18AβrP蛋白的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4
p18AβrP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5
编码大鼠p60TRP蛋白的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6
大鼠p60TRP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7
编码人p60TRP蛋白的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8
人p60TRP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9
有义引物(对于大鼠/人p60TRP特异性的)，用于扩增p60TRPcDNA。
SEQ ID NO：10
反义引物(对于大鼠/人p60TRP特异性的)，用于扩增p60TRPcDNA。
SEQ ID NO：11
有义引物(对于大鼠p60TRP特异性的)，用于扩增p60TRPcDNA。
SEQ ID NO：12
反义引物(对于大鼠p60TRP特异性的)，用于扩增p60TRPcDNA。
SEQ ID NO：13
有义引物(对于人p60TRP特异性的)，用于扩增p60TRP cDNA。
SEQ ID NO：14
反义引物(对于人p60TRP特异性的)，用于扩增p60TRP cDNA。
序列表
<110>株式会社BF研究所(BF Research Institute，Inc.)
<120>P18AβRP基因和P18AβRP蛋白、以及抑制细胞死亡的新型基因/蛋白(P60TRP)和通过
与所述基因/蛋白相互作用促进细胞死亡的物质
<130>663496
<150>JP 2002-61749
<151>2002-03-07
<150>JP 2002-312715
<151>2002-10-28
<160>14
<210>1
<211>42
<212>DNA
<213>
<400>1
atgagtgaat ggacgaagaa aagcccctta gaatgggagg at 42
<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>
<400>2
tctgggaagc tgaaagatgg ccttgaataa gatcctgaat tcggg 45
<210>3
<211>1089
<212>DNA
<213>大鼠
<400>3
gcagctctgg gtatggcggc ctcaaggcag gacccagtct tcgagctcta gagcttcgct 60
ggagcgtcct cagcgcttta tgaggaaatt ggcgcaaacc ccgcggagaa tcatctagaa 120
agagtagatc tagccagctg gtaaccatga gtgaatggac gaagaaaagc cccttagaat 180
gggaggatca cgtttacaaa gaagtgagag tgatagccag tgagaaggag tataaaggat 240
ggctgctaac cacagaccca gtctctgcca acattgtcct cgtgaacttc cttgaagatg 300
gcagactatg tgtgactgga attatgggac attctgtgca gacagtggaa actgtaagcg 360
aaggggacca cagagtaaga gagaagctga tgcatctgtt cacacctgca gattgtaaag 420
ggtacagccc tgaggatctg gaaaagaaga aaaccagcct aaagaaatgg cttgagaaga 480
accacatccc tgtcactgaa gagggagaca cacaaaggac tctctgtgtg gctggggttc 540
ttactataga cccaccatat gctccagaaa attgcagcag ctctaacgag tttattctgt 600
cccgaattca ggatcttatt caaggccatc tttcagcttc ccagtgagag gccgcacgag 660
gagcacactg acttcactgt ttggttctgt attaaattct tccagtgtaa gttgattata 720
ttacaagact tcaaagcaca tgactactat gtgtatatgc gcacattttt ttttttcttt 780
ttcttttttt tcggagctgg ggaccgaacc cagggccttg cgtttgctag gcaagcgctc 840
taccactgag ctaaatcccc aaccccatat gcgtacattt taagtttttg tttaggtcaa 900
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caaatttgga aggagatttc cttgcatatg atttaagata aatcacccta tttgtgagac 1020
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tattaaagt 1089
<210>4
<211>166
<212>PRT
<213>大鼠
<400>4
Met Ser Glu Trp Thr Lys Lys Ser Pro Leu Glu Trp Glu Asp His Val
1 5 10 15
Tyr Lys Glu Val Arg Val Ile Ala Ser Glu Lys Glu Tyr Lys Gly Trp
20 25 30
Leu Leu Thr Thr Asp Pro Val Ser Ala Asn Ile Val Leu Val Asn Phe
35 40 45
Leu Glu Asp Gly Arg Leu Cys Val Thr Gly Ile Met Gly His Ser Val
50 55 60
Gln Thr Val Glu Thr Val Ser Glu Gly Asp His Arg Val Arg Glu Lys
65 70 75 80
Leu Met His Leu Phe Thr Pro Ala Asp Cys Lys Gly Tyr Ser Pro Glu
85 90 95
Asp Leu Glu Lys Lys Lys Thr Ser Leu Lys Lys Trp Leu Glu Lys Asn
100 105 110
His Ile Pro Val Thr Glu Glu Gly Asp Thr Gln Arg Thr Leu Cys Val
115 120 125
Ala Gly Val Leu Thr Ile Asp Pro Pro Tyr Ala Pro Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Ser Ser Asn Glu Phe Ile Leu Ser Arg Ile Gln Asp Leu Ile Gln Gly
145 150 155 160
His Leu Ser Ala Ser Gln
165
<210>5
<211>2701
<212>DNA
<213>大鼠
<400>5
agttaccaag tataaagata ccagcctgga acagagaact aaggataaga ctggacaggt 60
gtatataact gtgcttcaac catgactggc tcaaagaata aggctcgggc tcaggctaaa 120
ctggaaaaga gggcaagtgc acaagccaaa gctgcagcag agagagaggc tgctaatgca 180
ggcagaggtg caggcaaaaa ccgggacaaa gggaagggta aggcaggctc taaaacagat 240
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gcaagaccag aatctaaggc tgtagcaaaa ggcacatcag atttcaacca taaggctgag 360
aacaagtacg ctagatccgc acgtaaagat aagcccagta gtgatagctg gttttgggct 420
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tctcaggact catctgaggg aaggccctct tcatatattg ttctggcctc aaatgaagag 840
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t 2701
<210>6
<211>539
<212>PRT
<213>大鼠
<400>6
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Arg Ala Ser Ala Gln Ala Lys Ala Ala Ala Glu Arg Glu Ala Ala Asn
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Ala Gly Arg Gly Ala Gly Lys Asn Arg Asp Lys Gly Lys Gly Lys Ala
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Gly Ser Lys Thr Asp Ala Val Ala Glu Ala Lys Ala Gly Ser Lys Ser
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Lys Val Val Ala Glu Thr Lys Glu Gly Ala Arg Pro Glu Ser Lys Ala
65 70 75 80
Val Ala Lys Gly Thr Ser Asp Phe Asn His Lys Ala Glu Asn Lys Tyr
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Ala Arg Ser Ala Arg Lys Asp Lys Pro Ser Ser Asp Ser Trp Phe Trp
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Ala Gly Glu Asp Ser Gly Ile Asn Ser Trp Phe Trp Lys Gly Glu Glu
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130 135 140
Ile Gln Ala Arg Val Glu Glu His Thr Pro Arg Thr Ser His Lys Ser
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Arg Ser Gly Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Val Ile Gly Asn Trp
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Phe Trp Glu Gly Asp Asp Thr Gly Phe Asp Ser Asp Pro Lys Pro Val
180 185 190
Phe Lys Ile Val Lys Pro Gln Pro Val Asp Glu Ile Asn Glu Lys Asp
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Arg Pro Lys Asp Trp Ser Glu Val Thr Ile Trp Pro Lys Ala Pro Ala
210 215 220
Val Thr Pro Ala Val Leu Gly Tyr Arg Ser Gln Asp Ser Ser Glu Gly
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Arg Pro Ser Ser Tyr Ile Val Leu Ala Ser Asn Glu Glu Glu Thr Ser
245 250 255
Thr Thr Cys Thr Lys Asn Thr Arg Ser Ser Leu Gln Pro Ile Pro Glu
260 265 270
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Gln Gln Ile Lys Ile Arg Glu Glu Asn Gly Ile Lys Pro Phe Ala Cys
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Val Asn Ile Leu Lys Ser Thr Thr Asp Pro Leu Ile His Lys Ile Ala
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Gln Ile Ala Met Gly Ile His Lys Val His Pro Phe Ala Gln Glu Phe
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Ile Asn Glu Val Gly Val Val Thr Leu Ile Glu Ser Leu Leu Ser Phe
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Ser Ser Pro Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Val Ile Thr Leu Asn Ser
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Ser Gly Asp Asp Arg Gln Gln Met Val Glu Phe His Val Lys His Met
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Cys Lys Glu Thr Val Ser Phe Pro Leu Asn Ser Pro Gly Gln Gln Ser
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Leu Asn Ser Pro Gly Gln Gln Ser Gly Leu Lys Ile Leu Gly Gln Leu
420 425 430
Thr Thr Asp Phe Val His His Tyr Ile Val Ala Asn Tyr Phe Ser Glu
435 440 445
Leu Phe His Leu Leu Ser Ser Gly Asn Cys Lys Thr Arg Asn Leu Val
450 455 460
Leu Lys Leu Leu Leu Asn Met Ser Glu Asn Pro Thr Ala Ala Arg Asp
465 470 475 480
Met Ile Asn Met Lys Ala Leu Ala Ala Leu Lys Leu Ile Phe Asn Gln
485 490 495
Lys Glu Ala Lys Ala Asn Leu Val Ser Gly Val Ala Ile Phe Ile Asn
500 505 510
Ile Lys Glu His Ile Arg Lys Gly Ser Ile Val Val Val Asp His Leu
515 520 525
Ser Tyr Asn Thr Leu Met Ala Ile Phe Arg Glu Val Lys Glu Ile Ile
530 535 540
Glu Thr Met
545
<210>9
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<212>DNA
<213>
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gcgtaatacg actcactata gggaattcga cgt 33
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<211>33
<212>DNA
<213>
<400>10
cgcgacgtac gatttaaatt aaccctcact aaa 33
<210>11
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<212>DNA
<213>
<400>11
atgactggct caaagaataa ggctcgggct caggctaaac tg 42
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<212>DNA
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<400>12
ttacattctt tcaataatcc ctttaacttc acggaatatg gcagt 45
<210>13
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<212>DNA
<213>
<400>13
atggctggga ctaagaataa gacaagagcc caggccaaaa c 41
<210>14
<211>
<212>DNA
<213>
<400>14
cattgtttca ataatctctt taacttccct gaaaatggcc atgag 45