万带兰的无菌播种和组织培养技术.pdf

本发明涉及万带兰的无菌播种和组织培养技术。万带兰(Vanda)，又名万代兰，与卡特兰、石斛兰、蝴蝶兰一起被称为“四大观赏兰花”之一。万带兰的常规繁殖方法有分蘖和扦插等，但繁殖速度慢，而万带兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发。因此，无论是杂交育种还是原生种的繁殖，采用无菌播种是最有效的繁殖方法之一。本发明采用人工营养基利用无菌播种的方法能获得大量试管苗，并利用无菌实生苗的茎尖或茎节能进行丛生芽的增殖并通过生根培养能形成完整植株。本发明提供万带兰的无菌播种和组织培养繁殖的方法及所使用的培养基，可操作性强，应用价值高。

1、  一种万带兰的无菌播种和组织培养技术，其特征在于该技术包括以下步骤：
1)、材料：采用大花万带兰和鸟舌兰为亲本，开花时选取生长健壮的母株进行大花万带兰的自交授粉及其进行大花万带兰和鸟舌兰杂交，授粉后果实120-150天成熟时，做为外植体用于播种；
2)、无菌播种：取基本成熟的果实，用75％的酒精浸泡30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗4～5次后切开果实，用接种针将白色粉末状种子接种到种子萌发培养基中30-40天胚萌发，60天形成完整植；当培养基中无菌实生菌太密而实生苗较小时，可在相同的培养基上进行壮苗培养；培养温度26±2℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天；
3)、丛生芽增殖：为获得更多的种苗，利用无菌实生苗的茎尖或茎节培养在增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在相同的培养基上能进行继代增殖。培养温度26±2℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天；
4)、生根壮苗：将播种形成的植株或继代增殖得到的丛生芽切割成单个芽，接种在生根培养基上进行生根培养；40天能形成株高3-4厘米的完整植株；培养温度26±2℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天；
5)、试管苗移栽：当试管苗能长至3-4厘米高时，转移到自然光下炼苗7-14天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭和粗椰壳的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度。

2、  根据权利要求1中所述万带兰的无菌播种和组织培养技术，其特征在于2)中所述种子萌发培养基为：V&W培养基+6-苄基嘌呤0.2-1毫克/升+萘乙酸0.2-1毫克/升+10-20％椰子汁，附加蔗糖20克/升，pH5.4-5.6，琼脂0.7％。

3、  根据权利要求1中所述万带兰的无菌播种和组织培养技术，其特征在于3)中所述增殖培养基为：MS培养基+6-苄基嘌呤1.0-2.0毫克/升+萘乙酸0.5-1.0毫克/升+10-20％的椰子汁，附加蔗糖20克/升，pH5.4-5.6，琼脂0.7％。

4、  根据权利要求1中所述万带兰的无菌播种和组织培养技术，其特征在于4)中所述生根培养基为：含花宝一号3克/升+蔗糖15克/升+香蕉汁100克/升+马铃薯100克/升+6-苄基嘌呤0.1-0.5毫克/升+萘乙酸0.5-2毫克/升+活性碳0.5-2克/升，附加蔗糖20克/升，pH5.4-5.6，琼脂0.7％。

万带兰的无菌播种和组织培养技术
技术领域
本发明涉及万带兰的无菌播种和组织培养技术。
背景技术
万带兰(Vanda)，又名万代兰，与卡特兰、石斛兰、蝴蝶兰一起被称为“四大观赏兰花”之一。万带兰原产于亚洲热带与亚热带地区，该属植物全球有70多个原生种，600多个杂交种，我国已发现14个种和1个变种，主要分布在南部地区。
万带兰是单轴类茎的洋兰，有明显的茎干和气生根。它的根粗壮，不但能依靠本身发达的根系使整株植物附生在其它植物或岩石上并支撑其茎干向上生长，而且发达的根系还负责水分和养料的吸收，特别是有些种类根端暴露在外面成绿色，含有叶绿素，能与叶片一样进行光合作用；有些种类在高湿度的条件下，茎节处能着生成百上千的白根，有如美髯公的一把洁白的胡子，又如万千飘带，别具一格，十分引人注目。万带兰的叶片在茎的两侧整齐密生排成两列，似君子兰，但叶较长，带状。万带兰的花为总状花序，通常从叶腋抽出，泰国、新加坡等东南亚地区产的万带兰每个叶腋几乎都可抽出一枝花，每株有时可开15~20枝，万带兰每枝花的花大而密集，一般有花10~20朵，每朵花能开放2~3周，通常从下而上依次开放，所以每枝花即使在高温条件下都可开放一个多月，在温度较低时可达到两个多月。
万带兰花的结构与其它兰花尽管基本相似，但各部分的比例相差较大。如一般兰花的唇瓣与花瓣十分发达而显著，但万带兰的杂交种花瓣较小，唇瓣更小，在观赏上已不占重要地位，而3枚萼片则特别发达，尤其是两枚侧萼片更大，且具有椭圆形、圆形、长形、三角形等多种形状，已变成欣赏的重点。万带兰花萼色彩鲜艳、五彩缤纷，有粉红色、黄色、紫红色、纯白色以及其它兰花少见的茶褐色和天蓝色等，花朵上具有各种颜色与形状的斑点，十分艳丽，观赏价值高。可用于盆栽或吊盆观赏，也广泛应用于切花，在我国市场上也将可能成为蝴蝶兰、大花蕙兰之后的一个新的热带兰销售热点。
目前，在花卉市场上销售的万带兰多为杂交种，但部分原生种如大花万带兰(Vandacoerulea)等本身也具有很高的观赏价值。尤为重要的是万带兰的杂交亲和力强，能与兰科20多个属进行杂交获得观赏价值高的新品种。
万带兰的常规繁殖方法有分蘖和扦插等，但繁殖速度慢，而万带兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发。因此，无论是杂交育种还是原生种的繁殖，采用无菌播种是最有效的繁殖方法之一。
本专利采用人工营养基利用无菌播种的方法能获得大量试管苗，并利用无菌实生苗的茎尖或茎节能进行丛生芽的增殖并通过生根培养能形成完整植株。
目前，国内外未有万带兰的无菌播种和组织培养及大规模生产和专利申请的报道。
本发明专利提供万带兰的无菌播种和组织培养繁殖的方法及所使用的培养基，可操作性强，应用价值高。
发明内容
本发明的目的是采用人工营养基利用无菌播种的方法能获得大量试管苗，并利用无菌实生苗的茎尖或茎节能进行丛生芽的增殖并通过生根培养能形成完整植株。本发明提供万带兰的无菌播种和组织培养繁殖的方法及所使用的培养基，可操作性强，应用价值高。
本发明技术特点为：
万带兰的繁殖可采用扦插和分株，但繁殖速度慢，而万带兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发。本专利采用人工营养基利用无菌播种的方法能获得大量试管苗，并利用无菌实生苗的茎尖或茎节能进行丛生芽的增殖并通过生根培养能形成完整植株。
本发明所述技术能成功地进行万带兰种苗的无菌播种和组织培养快速繁殖。具有投入少，产出高的特点。
实施本技术只需有简单的植物组织培养设备即可进行。
本发明所述万带兰的无菌播种和组织培养技术包括下述步骤：
1.材料：采用大花万带兰(Vanda coerulea)和鸟舌兰(Ascocentrum ampullaceum)为亲本，开花时选取生长健壮的母株进行大花万带兰的自交授粉及其进行大花万带兰和鸟舌兰杂交，授粉后果实120-150天基本成熟时做为外植体用于播种。
2.无菌播种：取基本成熟的果实，用75％的酒精浸泡30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗4～5次后切开果实，用接种针将白色粉末状种子接种到种子萌发培养基：V&W培养基+6-苄基嘌呤0.2-1毫克/升+萘乙酸0.2-1毫克/升+10-20％椰子汁。30-40天左右胚萌发，60天左右形成完整植。当培养基中无菌实生菌太密而实生苗较小时，可在相同的培养基上进行壮苗培养。
3.丛生芽增殖：为获得更多的种苗，利用无菌实生苗的茎尖或茎节培养在MS培养基+6-苄基嘌呤1.0-2.0毫克/升+萘乙酸0.5-1.0毫克/升+10-20％的椰子汁的增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在相同的培养基上能进行继代增殖。
4.生根壮苗：将播种形成的植株或继代增殖得到的丛生芽切割成单个芽，接种在含花宝一号(Hyponex 1)3克/升+蔗糖15克/升+香蕉汁100克/升+马铃薯100克/升+6-苄基嘌呤0.1-0.5毫克/升+萘乙酸0.5-2毫克/升+活性碳0.5-2克/升的生根培养基上进行生根培养。40天左右能形成株高3-4厘米的完整植株。
5.试管苗移栽：当试管苗能长至3-4厘米高时，转移到自然光下炼苗7-14天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭和粗椰壳地混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95％以上。
在实验中所用的培养基都附加蔗糖20克/升，pH 5.4-5.6，琼脂0.7％。培养温度(26±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。
此发明所述技术与现有技术相比具有出苗快，稳定性高，苗壮，种苗品质好、抗性强、生长良好等优势。同时本发明可做为万带兰属其它种、属内或与其它属间杂种的无菌播种和组织培养的方法。
具体实施方式：
实施例1：
1.材料：选取生长健壮的大花万带兰(Vanda coerulea)母株在开花时进行自交授粉，授粉后果实140天时，果实基本成熟，以成熟果实中的种子做为外植体用于播种。
2.无菌播种：取基本成熟的果实，用75％的酒精浸泡30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗4次后切开果实，用接种针将白色粉末状种子接种到种子萌发培养基：V&W培养基+6-苄基嘌呤1.0毫克/升+萘乙酸0.5毫克/升10％+20％椰子汁。40天左右胚萌发，60天左右形成完整植。当培养基中无菌实生菌太密而实生苗较小时，可在相同的培养基上进行壮苗培养。
3.丛生芽增殖：为获得更多的种苗，利用无菌实生苗的茎尖或茎节培养在MS培养基+6-苄基嘌呤2.0毫克/升+萘乙酸1.0毫克/升+20％的椰子汁的增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在相同的培养基上能进行继代增殖。
4.生根壮苗：将播种形成的植株或继代增殖得到的丛生芽切割成单个芽，接种在含花宝一号(Hyponex 1)3克/升+蔗糖15克/升+香蕉汁100克/升+马铃薯100克/升+6-苄基嘌呤0.5毫克/升+萘乙酸2毫克/升+活性碳1.0.克/升的生根培养基上进行生根培养。40天左右能形成株高3-4厘米的完整植株。
5.试管苗移栽：当试管苗能长至3-4厘米高时，转移到自然光下炼苗7天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭和粗椰壳的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95％以上。
在实验中所用的培养基都附加蔗糖20克/升，pH 5.4-5.6，琼脂0.7％。培养温度(26±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。
实施例2：
1.材料：采用大花万带兰(Vanda coerulea)和鸟舌兰(Ascocentrum ampullaceum)为亲本，开花时选取生长健壮的母株进行杂交，授粉后果实130天基本成熟时做为外植体用于播种。
2.无菌播种：取基本成熟的果实，用75％的酒精浸泡30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗5次后切开果实，用接种针将白色粉末状种子接种到种子萌发培养基：V&W培养基+6-苄基嘌呤1.0毫克/升+萘乙酸0.2毫克/升10％椰子汁。30-天左右胚萌发，60天左右形成完整植。当培养基中无菌实生菌太密而实生苗较小时，可在相同的培养基上进行壮苗培养。
3.丛生芽增殖：为获得更多的种苗，利用无菌实生苗的茎尖或茎节培养在MS培养基+6-苄基嘌呤1.0-毫克/升+萘乙酸0.5毫克/升+10的椰子汁的增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在相同的培养基上能进行继代增殖。
4.生根壮苗：将播种形成的植株或继代增殖得到的丛生芽切割成单个芽，接种在含花宝一号(Hyponex 1)3克/升+蔗糖15克/升+香蕉汁100克/升+马铃薯100克/升+6-苄基嘌呤0.2毫克/升+萘乙酸1.0毫克/升+活性碳1.5克/升的生根培养基上进行生根培养。40天左右能形成株高3-4厘米的完整植株。
5.试管苗移栽：当试管苗能长至3-4厘米高时，转移到自然光下炼苗7天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭和粗椰壳的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达100％。
在实验中所用的培养基都附加蔗糖20克/升，pH 5.4-5.6，琼脂0.7％。培养温度(26±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。