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小牛血去蛋白提取物、其眼膏制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及动物血液制品领域，更具体的说，涉及小牛血去蛋白提取物、其眼膏制剂及其制备方法。
背景技术
从小牛血液中提取的“小牛血去蛋白提取物”(protein-free calf bloodextract)是一种小分子的生物活性物质，含小分子多肽、氨基酸、核苷酸、酮酸等物质。其主要药理作用是增强细胞对氧和葡萄糖的摄取、利用，促进ATP的合成，促进营养物质的运送，促进组织的复原和再生。可用于治疗脑代谢紊乱和脑供血不全的病人，也可广泛用于治疗各种病因引起的角膜溃疡、皮肤溃疡和损伤、褥疮以及整容、
整形和矫形等外科手术后的修复和再生，具有非常广泛的临床用途。
瑞士素高(Solco)公司的素高捷疗系列产品(眼膏、软膏、口腔膏和注射液)及奥地利的爱维治注射液均已从八十年代中期开始进口我国，在临床上广泛应用，在大部分地区被列入公费医疗的品种。目前，国内有几家在生产小牛血去蛋白提取物注射液，但是尚无厂家生产小牛血去蛋白提取物眼膏。况且，受欧洲疯牛病的影响，我国已限制进口牛源性药品，目前市场上很难买到牛源性进口产品(包括素高捷疗眼膏)。
我国有丰富的自然资源，牛血原料来源广泛，未受疯牛病影响，研制小牛血去蛋白提取物及其眼膏可以利用国内资源，替代进口，节约外汇，同时提高国内厂家生化药物及制剂的研究能力和国际竞争力，具有广泛而深远的意义。
发明内容
本发明提供了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，它包括下述步骤：
(1)采集小牛血液，离心得红细胞；
(2)加水、冻溶，破坏红细胞膜，释放出内容物；
(3)离心，得到去除部分大分子量蛋白质的上清液；
(4)对上清液进行巴氏消毒，灭活牛血中的病毒；
(5)超滤，收集滤出液，即为小牛血去蛋白提取物中间体；
(6)纳滤脱盐；
(7)反渗透浓缩；
(8)医用活性炭脱色，得小牛血去蛋白提取物。
在上述的制备方法中，在上述的制备方法中，步骤(1)中所述的小牛优选为1～6月大的经检疫合格的健康奶牛，所述的离心优选为2000～4000转/分钟，10～20分钟。
在上述的制备方法中，步骤(2)中所述的加水的优选量为红细胞体积的2～6倍，所述的冻溶的温度优选为-20～-10℃，冻溶的时间优选为20～30小时。
在上述的制备方法中，步骤(3)中所述的离心优选为10000～15000转/分钟，20～30分钟。
在上述的制备方法中，步骤(4)中所述的巴氏消毒优选是，在无菌条件下，将上清液在50～70℃恒温加热6～15小时。
在上述的制备方法中，步骤(5)中所述的超滤优选分两步：第一步超滤使用的滤膜的截留分子量为5～10万道尔顿，第二步超滤使用的滤膜的截留分子量为0.5～1.5万道尔顿。
在上述的制备方法中，步骤(6)中所述的纳滤使用的膜优选为对一价阳离子截留率达80～90％的芳香聚酰胺膜。
在上述的制备方法中，步骤(7)所述的反渗透浓缩使用的膜优选为对一价阳离子截留率达94～99％芳香聚酰胺膜。
在上述的制备方法中，步骤(8)中所述的活性炭脱色条件优选为，脱色浓度为5～10g/L，脱色温度90～110℃，脱色时间为10～60分钟。
本发明还提供了一种含有小牛血去蛋白提取物的眼膏，其制备原料包括下述重量百分比的原料：10～40％的权利要求1-9中任意一项的方法制备的小牛血去蛋白提取物，0.5～1.5％的羧甲基纤维素钠，2～10％的甘油、0.04～0.1％的尼泊金乙酯。
本发明提供的方法及其产品的优点是：
(1)本方法是从红细胞中提取活性成份，同等条件下比从血清中提取活性成份的生物活性高56倍；其中呼吸活力(QO₂)为6.30μl·O₂/mg·h，刺激指数(SI)为5.40，同进口的素高捷疗眼膏成分一致，具有相同的药效作用和生物活性。动物药效学实验表明，本发明的眼膏对各种病因引起的角膜溃疡、术后修复有显著疗效，且用药安全，无任何刺激性。
(2)牛血中可能存在病毒，潜在的病毒会对人体造成或多或少的伤害，本方法采用巴氏消毒连同膜过滤的方法灭活牛血中常见的病毒。离心后的上清液先进行巴氏消毒，再经超滤、纳滤和反渗透等膜过滤方法，进一步保证牛血中的病毒灭活方法的完整性和有效性。本方法中病毒灭活方法验证地结果表明：加入指示病毒(牛腹泻病毒)作阳性对照，经巴氏消毒、超滤、纳滤和反渗透方法处理后，结果呈阴性，可以有效地去除和灭活指示病毒。
(3)本方法超滤过程中先采用截留分子量为5～10万道尔顿的滤膜超滤，滤去大分子量蛋白质，避免第二步超滤时堵膜；再采用截留分子量为0.5～1.5万道尔顿的滤膜超滤，得到的小牛血去蛋白提取物的分子量小于1.5万道尔顿，既最大限度地保留了生物活性成份，又避免了大分子量抗原的免疫反应。
(4)本方法中采用对一价阳离子截留率达80～90％的芳香聚酰胺纳滤膜对中间体进行纳滤脱盐，脱去小牛血去蛋白提取物中的部分生理盐，使眼膏的渗透压控制在人眼的耐受范围内。与传统的电渗析脱盐方法相比较，电渗析脱盐损失有效成分多达29％，而本方法只损失6％的有效成分，最大限度地保留了有效成分。
(5)本方法中采用对一价阳离子截留率达94～99％芳香聚酰胺反渗透膜进行浓缩，只有水和少量离子能通过，有效成分几乎被截留，无明显损失，浓缩倍数可高达60～100倍，作用时间短，方便快捷，有效成份的生物活性无明显损失。
(6)本方法中采用医用活性炭进行脱色。医用活性炭颗粒小，比表面积大，有效吸附本品中的杂质色素，使原料液在贮存过程中保持性质稳定。而且对有效成分的吸附较小，最大限度地保留了有效成分的生物活性。
(7)小牛血去蛋白提取物眼膏采用水凝胶型基质，维持药物的稳定性，使药物与眼球充分结合、缓慢释放、作用持久，且使用方便，用药安全，无局部刺激性。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1小牛血去蛋白提取物的制备
(1)制备红细胞：取不锈钢桶，预先加入3.8％的枸缘酸钠10L作为抗凝剂，无菌条件下采集1～6个月大的新鲜小牛血液100L，缓慢搅拌，以防血液凝固。采集后的血液以3000转/分钟离心20分钟，轻轻倒去上清。加入等量的生理盐水，混匀，3000转/分钟离心15分钟，弃上清，同法洗涤3次，收集沉淀的红细胞40L。
(2)破碎红细胞：按1∶5加入去离子水200L到红细胞中，搅拌均匀，置于-20℃冰箱速冻过夜。次日取出，于40℃水浴中快速升温融解，破坏红细胞膜，释放内容物，共得溶液240L。
(3)去除大分子量蛋白质：于14000转/分钟离心30分钟，去除部分大分子量蛋白质，收集上清液，约235L。
(4)巴氏消毒：在无菌条件下，将上述上清液保存在60℃条件下恒温加热10小时，进行巴氏消毒。
(5)超滤：在无菌条件下，将巴氏消毒后的溶液先用截留分子量为10万道尔顿的滤膜超滤5小时，滤出液再用截留分子量为0.8万道尔顿的滤膜超滤6小时，收集滤出液，得淡黄色澄清溶液190L，即为小牛血去蛋白提取物中间体。
(6)纳滤脱盐：用对一价阳离子截留率达88％的芳香聚酰胺纳滤膜对中间体溶液进行纳滤脱盐，循环7.5小时，得脱盐后溶液101L。
(7)反渗透浓缩：用对一价阳离子截留率达98％芳香聚酰胺反渗透膜对纳滤脱盐后的溶液进行反渗透浓缩，循环12小时，得小牛血去蛋白提取物浓缩液20L。
(8)将上述浓缩液用医用活性炭进行脱色，活性炭的脱色浓度为8g/L，在温度为105℃条件下，脱色40分钟。过滤去除医用活性炭，收集滤出液，即为小牛血去蛋白提取物，体积为19L。整个制备方法过程中有效成分浓缩了12.6倍。
实施例2小牛血去蛋白提取物眼膏的制备
(1)按表1所示的配方准备原料；
表1、原料配方

    成分    百分含量(％)    质量(g)    小牛血去蛋白提取物    30    1500    羧甲基纤维素钠    1.2    60    甘油    5    250    尼泊金乙酯    0.1    5    去离子水         加水至总重为5000g
(2)配制眼膏基质：取10L的容器，称取甘油250g，加入羧甲基纤维素钠60g，用玻棒搅拌，分散均匀，加入尼泊金乙酯5g，加入去离子水约3000g，搅拌均匀，置于高压灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，取出，冷却，备用。
(3)加入原料：无菌条件下向基质中加入小牛血去蛋白提取物1500g，再加去离子水至总重为5000g，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，分装至铝管中，5g/支，共得978支小牛血去蛋白提取物眼膏。
实施例3小牛血去蛋白提取物眼膏的生物活性和质量研究
(1)生物活性测定：本品为细胞呼吸激活剂，能促进细胞对氧的摄取和利用。通过WARBURG微量呼吸检压仪测定其在豚鼠肝细胞中促进细胞呼吸的活力，由耗氧增加量计算其生物活性。测定小牛血去蛋白提取物眼膏三批样品的生物活性，结果见表2。
表2、小牛血去蛋白提取物眼膏的生物活性检测结果    批号    20011027    20011028    20011029    QO₂(ul·O₂/mg·h)    6.32    6.30    6.35    SI    5.44    5.43    5.47
(2)质量研究：本品与素高捷疗眼膏的质量数据比较结果见表3。
表3、小牛血去蛋白提取物眼膏(批号为20011107)与素高捷疗眼膏(批号为869703)的质量数据比较    样品小牛血去蛋白提取物眼膏  素高捷疗眼膏    批号    20011107    869703    PH值    7.42    7.51    粘度(mm²/s)    376.5    364.7  生物  活性QO₂(ul·Ox/mg·h)    6.31    5.25SI    5.40    4.49
实施例4小牛血去蛋白提取物眼膏的药效学实验
治疗外伤性角膜炎
实验选用健康家兔24只，体重2.5-3.4kg，雌雄各半，雌性未孕。随机分为模型对照组(局部滴用眼膏的空白基质)、Solcoseryl组(局部滴用Solcoseryl)和小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组(分别局部滴用小牛血去蛋白提取物眼膏临床用浓度和1/2浓度)。各家兔实验前一日，双眼用0.5％的卡因局部麻醉后，用手术刀均匀刮除角膜上皮后滴0.25％氯霉素眼液，每日二次。实验当日，各家兔双眼均滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤面积，若有遗漏应补充，以达整个角膜100％损伤。然后根据不同组别和剂量进行给药(同时每日滴0.25％氯霉素滴眼液防止感染)。每日用药4次，连续5天。每日应滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤的愈合情况，随时记录。末次给药后取双眼角膜送病理学检查，以观察角膜上皮修复情况。结果进行统计学处理后列于表4。
家兔角膜上皮损伤范围⁽¹⁾：
0：无上皮损伤(即不着色)；
1+：角膜上皮损伤在25％以内；
2+：角膜上皮损伤在26％-50％之间；
3+：角膜上皮损伤在51％-75％之间；
4+：角膜上皮缺损大于75％。
表4、小牛血去蛋白提取物眼膏对家兔外伤性角膜炎的影响组别兔号    0天    1天    2天    3天    4天    5天  左    右  左    右  左    右  左    右  左    右  左    右模型对照组 1 2 3 4 5  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  3+    3+  4+    4+  3+    2+  3+    3+  3+    4+  3+    3+  4+    4+  3+    2+  3+    3+  3+    4+  2+    2+  3+    4+  3+    2+  3+    2+  3+    3+  2+    2+  2+    3+  2+    2+  3+    2+  2+    2+  2+    2+  2+    3+  2+    2+  2+    2+    6  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  3+    3+  3+    3+Solcoseryl组    7    8    9    10    11    12  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  3+    3+  3+    3+  3+    2+  2+    2+  2+    4+  3+    3+  2+    3+  2+    3+  2+    2+  2+    2+  2+    3+  1+    2+  2+    2+  2+    1+  2+    2+  2+    1+  1+    2+  1+    2+  1+    2+  1+    0  1+    1+  1+    0  1+    2+  0     1+  0     1+  1+    0  0     0  0     0  0     1+  0     0小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组    13    14    15    16    17    18  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  2+    1+  2+    3+  3+    2+  2+    2+  3+    3+  2+    3+  1+    0  2+    1+  1+    1+  1+    1+  3+    3+  2+    1+  1+    0  1+    1+  1+    1+  1+    0  3+    2+  1+    1+  0     0  0     0  1+    0  0     0  2+    1+  1+    0  0     0  0     0  0     0  0     0  1+    1+  0     0小牛血去蛋白提取物眼膏低剂量组    19    20    21    22    23    24  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  3+    3+  4+    4+  3+    3+  3+    4+  3+    3+  3+    3+  3+    3+  4+    3+  3+    3+  3+    3+  3+    2+  3+    3+  2+    2+  3+    3+  3+    3+  2+    2+  2+    2+  3+    3+  2+    2+  2+    2+  2+    2+  2+    1+  2+    2+  2+    1+  2+    1+  2+    2+  2+    1+  1+    0  1+    1+  1+    0
表4结果提示：给药后第一天，模型对照组角膜损伤面积在70-80％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在50-60％作用；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在40-50％和60-70％左右；给药后第二天，模型对照组角膜损伤面积在65-75％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在40-50％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在30％和50-60％左右；其中小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组13号右眼愈合；给药后第三天，模型对照组角膜损伤面积在55-70％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在30-40％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在20％和40-55％左右；其中小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组又有16号右眼愈合；给药后第四天，模型对照组角膜损伤面积在50-60％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积小于25％；小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组的角膜损伤基本愈合；小牛血去蛋白提取物眼膏低剂量组角膜损伤面积在40％左右。
治疗病毒性角膜炎
实验选用健康家兔24只，体重2.5-3.4kg，雌雄各半，雌性未孕。随机分为模型对照组(局部滴用眼膏的空白基质)、Solcoseryl组(局部滴用Solcoseryl)和小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组(分别局部滴用小牛血去蛋白提取物眼膏临床用浓度和1/2浓度)。各家兔实验前一日，双眼用0.5％的卡因局部麻醉后，用手术刀均匀刮除角膜上皮后滴单纯疱疹I型病毒(HSV-I)两滴。实验当日，各家兔双眼均滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤面积，若有遗漏应补充，以达整个角膜100％损伤。然后根据不同组别和剂量进行给药(同时每日滴0.25％氯霉素滴眼液防止感染)。每日用药4次，连续5天。每日应滴2％荧光素钠着色，观察角膜损伤的愈合情况，随时记录。末次给药后取双眼角膜送病理学检查，以观察角膜上皮修复情况。结果进行统计学处理后列于表5。(家兔角膜上皮损伤范围平分同上)。
表5、小牛血去蛋白提取物眼膏对家兔病毒性角膜炎的影响  组别兔号    0天    1d    2d    3d    4d    5d  左    右  左    右  左    右  左    右  左    右  左    右模型对照组  1  2  3  4  5  6  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    3+  3+    4+  4+    4+  4+    4+  4+    3+  4+    4+  3+    4+  3+    4+  4+    4+  3+    3+  4+    2+  3+    3+  3+    4+  3+    3+  4+    4+  3+    3+  3+    2+  2+    3+  3+    3+  3+    3+  3+    3+  3+    3+  3+    2+  2+    3+  3+    2+  2+    3+  3+    3+  7  4+    4+  3+    4+  3+    3+  3+    3+  2+    2+  1+    1+    8    9    10    11    12    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    3+    4+    4+    2+    3+    3+    4+    4+    3+    4+    3+    4+    3+    2+    3+    3+    3+    3+    2+    3+    3+    4+    3+    2+    2+    2+    1+    3+    2+    2+    2+    3+    3+    2+    2+    2+    1+    2+    1+    1+    1+    2+    2+    2+    1+    1+    0    2+    0  小牛血  去蛋白  提取物  眼膏高  剂量组    13    14    15    16    17    18    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    3+    3+    4+    3+    3+    3+    4+    2+    3+    4+    3+    3+    3+    2+    3+    2+    2+    2+    4+    2+    3+    3+    3+    2+    2+    1+    2+    1+    2+    1+    3+    2+    3+    2+    2+    2+    1+    1+    1+    1+    2+    0    2+    2+    2+    2+    1+    1+    0     0    1+    0    1+    0    1+    1+    0     1+    1+    1+  小牛血  去蛋白  提取物  眼膏低  剂量组    19    20    21    22    23    24    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    4+    3+    4+    4+    3+    4+    3+    4+    3+    4+    4+    4+    4+    3+    3+    3+    3+    4+    2+    3+    3+    3+    3+    3+    3+    3+    2+    3+    2+    3+    2+    2+    2+    2+    2+    3+    3+    2+    1+    2+    2+    2+    1+    1+    3+    2+    2+    2+    3+    2+    1+    1+    1+    1+    0     0    2+    2+    1+    1+
表5结果提示：给药后第一天，模型对照组角膜损伤面积在90％以上；Solcoseryl组角膜损伤面积在70-80％作用；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在65-75％和70-80％左右；给药后第二天，模型对照组角膜损伤面积在80％以上；Solcoseryl组角膜损伤面积在60-70％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在50-60％和60-70％左右；给药后第三天，模型对照组角膜损伤面积在65-80％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积在50-60％左右；小牛血去蛋白提取物眼膏高低两个剂量组的角膜损伤面积分别在30-40％和60-65％左右；给药后第四天，模型对照组角膜损伤面积在70％左右；Solcoseryl组角膜损伤面积小于40-50％；小牛血去蛋白提取物眼膏高剂量组的角膜损伤面积在30％以下(有个别愈合)；小牛血去蛋白提取物眼膏低剂量组角膜损伤面积在50％以上。
药效学实验结果
小牛血去蛋白提取物眼膏给家兔外伤性角膜炎和病毒性角膜炎滴眼，有明显促进角膜上皮愈合作用，与模型对照组比较有显著性差异，其作用优于阳性对照药(素高捷疗眼膏)，在促进外伤性角膜炎上皮愈合的时间上，有提前愈合的趋势；从促进角膜上皮愈合的疗效看，对外伤性角膜炎的作用强于病毒性角膜炎。
小牛血去蛋白提取物眼膏的临床适应症应为：治疗各种病因引起的角膜炎和角膜溃疡，促进角膜上皮愈合和组织修复。
实施例5小牛血去蛋白提取物眼膏的安全性实验
小牛血去蛋白提取物病毒灭活方法验证：小牛血去蛋白提取物中间体经过巴氏消毒和超滤、纳滤、反渗透等膜过滤方法处理后，应不含大分子量物质(包括病毒和大分子抗原)。为检测巴氏消毒和膜过滤等方法对病毒的灭活效果，以牛腹泻病毒为指示病毒，加到巴氏消毒前的样品中。含指示病毒的样品经60℃条件下加热10小时，再经截留分子量为8000道尔顿的超滤膜超滤，接着用对一价阳离子截留率达88％的芳香聚酰胺纳滤膜纳滤脱盐，最后用对一价阳离子截留率达98％芳香聚酰胺反渗透膜反渗透浓缩，收集最终样品进行病毒检测，结果为阴性，不含牛腹泻病毒。具体方法如下：
1.材料和设备
1.1牛肾原代细胞：用新鲜健康的新生牛肾制备的原代细胞。
1.2阳性对照：牛腹泻病毒(BA)株，由中国兽药监察所购进。作为指示病毒加到小牛血样品中，作为阳性对照。
1.3其它材料：小牛血去蛋白提取物中间体，显微镜等有关实验用品。
2.实验方法
2.1细胞株敏感性测定：牛肾细胞长满单层按1∶2传代，将细胞接种到96孔板上，培养细胞浓度为10⁴个/ml，每孔0.1ml，37℃ 1～2小时后，牛腹泻病毒稀释10^-1～10^-6，分别接种到经上述培养的细胞板中，每孔0.1ml，设立阴性对照，72～96小时镜下观察结果。
2.2直接病变法：将经敏感性测定的细胞代次细胞接种到96孔培养板，细胞浓度为10⁴个/ml，每孔0.1ml，37℃ 1～2小时后分别加入等量的待检样品(小牛血去蛋白提取物中间体)。同时接种含指示病毒(牛腹泻病毒)的小牛血去蛋白提取物样品的稀释液至经上述培养的细胞中，每孔0.1ml，为阳性对照。设立阴性对照。72～96小时镜下观察细胞病变结果。
3.结果判定：细胞感染病毒后出现病变反应，故而细胞出现不同程度的脱落。上述实验结果用5％的结晶紫染色液染色后判定结果，染色方法按常规。
4结果：含指示病毒的小牛血去蛋白提取物样品呈阳性，待检样品(小牛血去蛋白提取物)呈阴性。因此，对于小牛血去蛋白提取物而言，先经巴氏消毒，再用超滤、纳滤、反渗透等膜过滤方法处理，四种方法联合使用可以有效地去除和灭活指示病毒。
实施例6小牛血去蛋白提取物眼膏的安全性实验
本实验观察了小牛血去蛋白提取物眼膏(临床用药浓度)对家兔眼的刺激性实验。具体方法如下：
健康家兔4只(体重2-3kg)，雌雄不限，1次/天，连续一周右眼结囊内滴入受试物(小牛血去蛋白提取物眼膏)0.1g，左眼滴入小牛血去蛋白提取物眼膏的空白基质0.1g，做对照，给药后闭合眼睛8min。记录1至14天内眼的局部反应情况。眼刺激反应评分见表6。
表6、眼刺激反应评分
眼刺激反应
                                                    分值
角膜混浊(以最致密部位为准)
无混浊                                                          0
散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见                                  1
半透明区易分辨，虹膜模糊不清                                    2
出现灰白色透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清                3
角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认                              4
虹膜
正常                                                            0
皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应    1
出血，肉眼可见坏死，对光无反应(或出现其中一种反应)              2
结膜
充血(指睑结膜、球结膜部位)
血管正常                                                        0
血管充血呈鲜红色                                                1
血管充血呈深红色，血管不易分辨                                  2
弥漫性充血呈紫红色                                              3
水肿
无水肿                                                          0
轻微水肿(包括瞬膜)                                              1
明显水肿，伴有部分眼睑外翻                                      2
水肿至眼睑近半闭合                                              3
水肿至眼睑超半闭合                                              4
分泌物
无分泌物                                                        0
本实验观察了小牛血去蛋白提取物眼膏(临床用药浓度)对家兔眼的刺激性。结果表明，小牛血去蛋白提取物眼膏连续给药7天，未见对家兔眼有刺激性反应，4只家兔给药后均无异常反应，本眼膏用药安全。