寄生型假丝酵母、热带假丝酵母和白隐球酵母检测鉴定方法 技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说是一种寄生型假丝酵母、热带假丝酵母和白隐球酵母快速检测鉴定方法。技术背景：
寄生性假丝酵母和热带假丝酵母同属于半知菌类假丝酵母属，寄生性假丝酵母是人类重要病原菌，热带假丝酵母也是重要机会性病原菌，这两种酵母菌在普通和发酵饮食品和饲料中检出率很高(Déak，T.and Beauchat，1996；Samson R.A.，etal.，1992；Alvaro F.，Gloria S.，and Jack W.F.，2000)，白隐球酵母菌Cryptococcusalbidus和白假丝酵母菌Candida albidus都是(尤其是女性)皮肤组织感染的重要真菌类病原菌，由此两种病原菌引起的疾病临床诊断名称分别为白隐球酵母病Cryptococcosis和白假丝酵母病Candidiasis。显而易见，此三种酵母的快速检测、鉴定方法具有重要理论和实用意义。由于酵母菌传统分类以及本身的复杂性和多样性，对于发酵饮食品和饲料中寄生性假丝酵母和热带假丝酵母的准确检测往往需要花费大量时间。尽管目前已经可以应用基因扩增等先进方法对物种进行准确鉴定，但由于(1)酵母种类的多样性和复杂性，(2)基因扩增要求的病原菌的最低生物量(灵敏度)各不相同，(3)种间特异性引物设计的难度，(4)种内特异性PCR扩增产物序列确认的难度，使得该方法应用于快速鉴定、检测尚有一定距离。至少在目前还没有能够应用于一般生产和应用领域的PCR快速鉴定与检测方法。至于其他鉴定方法如化学分类、数值分类等等均需要做多次继代、精细化学分析难以达到一般生产和应用领域的快速要求。1975年Chaskes和Tyndall首先发现了重要病原菌Cryptococcus neoformans具有利用芳香性化合物(DOPA)通过体内代谢产生并分泌特异性有色产物(黑色素)的特性，和具有快速检测意义的特异性鉴定培养基。在过去几十年，不断有报道指出一些酵母能够利用芳香类化合物作为碳源通过体内代谢产生和分泌有色产物(Cain，1980；Middelhoven，1993；Chaskesand Phillips，1973；Chaskes和Tyndall，1975；1978；Carreira et al.，1998)，但真正运用这一原理作为一种分类指标加以研究和应用只是近几年的事情，1998年里斯本理工大学Virgilio B.Loureiro小组(Carreira and Loureiro，1998)利用这一原理建立了快速鉴定培养基，他们发现重要病原菌Cryptococcus能够特异性地利用氨基酚和二氨基苯产生和分泌有色产物，并首次建立了另外一种重要病原菌Yarrowialipolytica的快速鉴定培养基，发现：该种酵母能够以酪氨酸作为唯一碳源通过代谢产生褐色产物，而且这一特性具有种的特异性，通过优化培养基成分和培养条件，可以使这种特异性鉴定培养时间控制在24小时之内。此外，对于另外一种重要的病原菌Candida albicans，以特异性酶联免役反应为基础已经建立起有效的快速鉴定方法，并且已经应用于临床诊断(Hoppe J.E.and Frey P.，1999；Campbell C.K.etal.，1998)，显然，特异性生色培养基和特异性酶联免役反应是目前简单有效的病原菌快速检测鉴定手段，相比而言，特异性生色培养基比特异性酶联免疫反应具更廉价的商业优势。但是关于寄生型假丝酵母Candida parapsilosis和热带假丝酵母Candida tropicalis，目前尚无特异性生色鉴定培养基。发明内容：
本发明提供一种专门用于寄生型假丝酵母、热带假丝酵母和白隐球酵母菌的特异性生色鉴定培养基，有效检测时间15-20小时。本发明检测培养基具备如下几个要素：一是待测菌株能够生长，二是产生特异性反应，三是反应指标明显易测，四是培养基中具有满足第二和第三条件的特殊成分。
一种用于检测鉴定寄生型假丝酵母、热带假丝酵母和白隐球酵母培养基，它除含有普通培养基所需的碳水化合物、生物素、维生素、琼脂，还含有对-氨基苯甲酸、螯合剂、生色反应促进剂以及三种碱性氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸。
本发明所述的培养基，其碳水化合物可以是葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖之一，适宜浓度范围是0.01％到1.00％。其中葡萄糖、果糖和蔗糖是适宜碳源，优选葡萄糖。葡萄糖和果糖优选0.05％。
本发明所述的培养基中对-氨基苯甲酸的浓度范围是0.1％--1.0％，优选0.8％。
本发明所述的培养基，其中的天冬酰胺，谷氨酰胺和甘氨酸地浓度范围是0.1％--1.5％，优选1.0％.。
本发明所述的培养基，其中生物素浓度范围10-30微克/升，优选20微克/升。
本发明所述的培养基，其中维生素可以是B1、B12，B1浓度范围0.5-1.0g/升，优选0.75g/升。B12浓度范围1.0-3.0mg/升，优选2.0mg/升。
本发明所述的培养基，其生色反应促进剂可以是Mn2+和/或Ca2+和/或Fe3+，它们能够强化该3种酵母Candida tropicalis，Candida parapsilosis，Cryptococcusalbidus的生色反应，优选阳离子为Mn2+。锰离子的形式为MnCl2或MnSO4，优选MnCl2。锰盐的浓度范围是0.1mMol/L-10mMol/L，优选1mMol/L。
本发明所述的培养基，其螯合剂可以是EDTA或EDTANa2Fe，优选EDTANa2Fe。浓度为0.1mMol/L-10mMol/L，优选1.0mMol/L。
本发明所述的培养基，其琼脂用量是本领域内技术人员公知的量。
本发明所述的培养基，其pH范围是pH4-7，优选4.0；该培养基的起始pH调节缓冲液体系是磷酸盐，浓度为1mol/L。
根据本发明提供的上述培养基的组成及用量，本领域内技术人员可配制出本发明的培养基。
应用含有0.1％环己酰亚胺的本发明培养基以及不同培养温度可以区分热带假丝酵母Candida tropicalis、Debaryomyces polymorphus与其他酵母。Candidatropicalis、Debaryomyces polymorphus与其他酵母都能够在本发明所述的培养基上生长和产生颜色，但是在含有0.1％环己酰亚胺的本发明培养基上能够生长的只有热带假丝酵母Candida tropicalis、Debaryomyces polymorphus，从而实现将热带假丝酵母Candida tropicalis、Debaryomyces polymorphus与其他酵母区分；实验证明Candida tropicalis能够在40℃下生长，而Debaryomyces polymorphus不能在40℃下生长，从而将Candida tropicalis与Debaryomyces polymorphus区别开来。
应用本发明的培养基可以区别白隐球酵母菌Cryptococcus albidus与其他具有生色反应的酵母，这些酵母都能够本发明的培养基上生长和产生颜色，但是只有Crptococcus albidus能够在含有硝酸盐或者亚硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长，从而区别该酵母与其他酵母。
本发明培养基中生色底物对-氨基苯甲酸、氨基酸、生物素、维生素、螯合剂、环己酰亚胺等成分通过过滤除菌，其它成分通过121℃高压灭菌，在50-55℃下在无菌条件下将培养基所有成分混合均匀，后分装、制作平板。
本发明检测和鉴定微生物方法为：本发明培养基在接种待测微生物样品后置于20℃--30℃下保温培养到24-96小时。
利用本发明的培养基，通过菌落表面红色特性可鉴别出对于本发明培养基同样具有生色反应的Rhodotorula属酵母菌株。利用本发明的培养基，通过嗅闻菌落散发出的芳香型发酵香味特性鉴别出对于本发明培养基同样具有生色反应的Pichia属酵母菌株。
本发明可以应用于来源于食品、饮料、饲料产品中Candida tropicalis和Candidaparapsilosis菌落计数和患者感染部位样品中Cryptococcus albidus菌落计数。
本发明较已有技术相比具有如下优点：(1)鉴定反应时间短；(2)鉴定反应具有分类意义上的特异性；(3)鉴定反应技术简单易操作；(4)检测反应成本低。实施方式：试验实施例11，供试样品与菌株分离
(1)从变质乳制品和乳饮料、女性白隐球酵母病Cryptococcosis和白假丝酵母病Candidiasis患者阴道分泌物取样，无菌稀释后作为接种用途；
(2)从实验室保存已知的饮食品、饲料变质酵母和人类病原菌菌株中取来自22个不同属的109个酵母；2，生色底物选择33种生色底物，用于特异性培养基的筛选。3，培养基和待测酵母的培养条件
所有菌种在4℃下斜面保存，斜面培养基为YM，其组成为酵母提取物，3.0g；细菌用蛋白胨，0.5g；葡萄糖，10g；麦芽提取物，3.0g；琼脂，20g；蒸馏水，1000ml。
筛选培养基以Chaskes-Tyndall(1975，简写为CT培养基)为基础，维生素类、生色底物和氨基酸物质等溶解于200ml溶液中，经过滤除菌，称为A液；另外800ml基础培养基在115℃下灭菌20分钟，冷却到50℃后与A液混合，并倒加厚平板。基础培养基组成为：4g KH2PO4，2.5g MgSO4.7H2O，0.5g葡萄糖和20g琼脂，加800ml蒸馏水。A瓶溶液组成为0.1或者1.0g生色底物，1.0g天冬酰胺，1.0g甘氨酸和1.0g谷氨酰胺，加20μg生物素、2mg维生素B12和1g维生素B1，溶解于蒸馏水200ml，经微孔滤膜过滤除菌(0.45μm孔径)。同时，设置由有机物组成的培养基为对照培养基(简称为YCB培养基)，对照培养基的有机培养基A液组成为0.1或者1.0g生色底物，11.7g酵母碳源，溶解于200ml溶液中，经过滤除菌；对照培养基的基础培养基组成为3g细菌用蛋白胨和20g琼脂溶解于800ml蒸馏水中，在115℃下灭菌20分钟，冷却到50℃后与A液混合，并倒加厚平板。培养基各组分在灭菌前用1M K2HPO4或1M KH2PO4调整培养基初始pH到5.5。4，微生物培养：微生物样品或者活化的酵母斜面接种到上述平板培养基上，每平皿接种三个菌种，24℃下倒置培养1-3天，每天记录菌体生长和颜色产生情况，将有色现象称为阳性反应。并用加号多少表示生长情况和颜色分泌量大小。然后将初筛具有颜色阳性反应的菌株进一步在单独平板上作重复验证，以排除在初步筛选中因为3个菌株共处于同1平板而产生的干扰效应。5，区别鉴定：对于具有生色阳性反应的酵母进一步做具有特异性的区别鉴定，5.1酵母菌落生色阳性效应与种属特异性
Candida tropicalis和Candida parapsilosis对4-氨基苯甲酸具有明显阳性反反应。在86个菌株中唯一只有此二种菌株具有阳性反应。表明该反应具有较高程度的特异性。5.2假丝酵母属Candida 12个种的菌株对4-氨基苯甲酸反应的特异性
从表1可以看出，12种假丝酵母均能够利用4--氨基苯甲酸正常生长，但是只有寄生型假丝酵母和热带假丝酵母具有阳性生色反应。这显示出该生色反应具有较强的特异性。具有建立鉴定培养基的可能性。5.3寄生型假丝酵母Candida parapsilosis和热带假丝酵母Candida tropicalis种内不同菌株在含0.1％4-氨基苯甲酸的CT培养基上的生色效应特异性
12株寄生型假丝酵母和9株热带假丝酵母分别仅各有2株具有阳性效应，从72h到192h生色强度不断增强。显然，该阳性反应在该培养基条件下对此二种生色底物均不具有种的特异性。因此该培养基不具备作为鉴定此二种变质微生物的基本条件。显然，0.1％4-氨基苯甲酸对于1922和1927此寄生型假丝酵母二株的生长具有明显的抑制效应。5.4阳离子对寄生型假丝酵母和热带假丝酵母在含4-氨基苯甲酸的CT培养基上的生色效应的影响
选择15种阳离子化合物研究了它们对寄生型假丝酵母和热带假丝酵母在4-氨基苯甲酸的CT培养基上的生色效应的影响。这15种阳离子化合物的形式是FeCl3·6H2O，NH4Fe(SO4)2·12H2O，FePO4·4H2O，柠檬酸三铁，FeSO4·7H2O，MnSO4·5H2O，MnCl2·5H2O，H24Mo7N6O24·4H2O，(NH4)2MoO2·4H2O，Na2·Mo4O4·2H2O，ZnSO4·7H2O，ZnCl2，Ca(NO3)2·4H2O，Co(NO3)2·6H2O，CuSO4·5H2O。处理1，2，3，4，5，......，14，15和16分别代表FeCl3·6H2O，NH4Fe(SO4)2·12H2O，FePO4·4H2O，柠檬酸三铁，FeSO4·7H2O，MnSO4·5H2O，MnCl2·5H2O，H24Mo7N6O24·4H2O，(NH4)2MoO2·4H2O，Na2·Mo4O4·2H2O，ZnSO4·7H2O，ZnCl2，Ca(NO3)2·4H2O，Co(NO3)2·6H2O，CuSO4·5H2O，和对照。处理1，2，5，6和7的阳离子在培养基中的终浓表1.Candida 12个种在含0.1％4-氨基苯甲酸的CT培养基上的生长和生色效应菌株(ISA No.)有色化合物强度菌落长势菌龄(h)菌株(ISA No.)有色化合物强度菌落长势菌龄(h)CT YCBCT YCBCT YCBCT YCBCandidatropicalis 18101+ -4+ 5+ 48Candidaalbicus 1862- -4+ 5+ 483.5+ -5+ 6+ 72- -5+ 6+ 724.5+ -6+ 7+ 96- -5+ 6+ 965.5+ -6+ 7.5+ 120- -6+ 7+ 1206.5+ 2+6.5+ 8+ 144- -7+ 8+ 1448+ 5+7+ 8+ 168- -7+ 9+ 168Candidaparapsilosis 1811- -3+ 5+ 48Candidazeylanoides 1864- -1+ 3+ 481+ -5+ 6+ 72- -1+ 4+ 723+ -6+ 6+ 96- -1+ 6+ 964+ -6+ 7+ 120- -2+ 6+ 1205+ -7+ 8+ 144- -2+ 6+ 1445+ -7+ 8+ 168- -2+ 6+ 168Candida vini 1007- -1+ 3+ 48Candidainconspicua 1874- -4+ 5+ 48- -1+ 5+ 72- -1+ 4+ 72- -1+ 6+ 96- -1.5+ 6+ 96- -1+ 6+ 120- -2+ 7+ 120- -1+ 6+ 144- -2+ 8+ 144- -1+ 6+ 168- -2+ 8+ 168Candidacatenulata 1771- -3+ 4+ 48Candidanorvegica 1879- -1+ 4+ 48- -4+ 6+ 72- -1+ 5+ 72- -5+ 7+ 96- -1.5+ 7+ 96- -6+ 7+ 120- -2+ 7+ 120- -7+ 9+ 144- -2+ 8+ 144- -7+ 9+ 168- -2+ 8+ 168Candidacatenulata 1772- -4+ 4+ 48Candidastellata 1890- -1+ 1+ 48- -5+ 6+ 72- -1+ 1+ 72- -5+ 7+ 96- -1+ 1+ 96- -7+ 7+ 120- -1+ 1+ 120- -7+ 8+ 144- -1+ 1+ 144- -8+ 9+ 168- -1+ 2+ 168CandidaSake 1789- -4+ 4+ 48CandidaCatenulata 1719- -2+ 4+ 48- -5+ 6+ 72- -4+ 6+ 72- -6+ 7+ 96- -4+ 7+ 96- -6+ 7+ 120- -5+ 8+ 120- -7+ 8+ 144- -6+ 8+ 144- -7+ 8+ 168- -6+ 9+ 168注：培养基中生色底物浓度0.1％(W/V)，如无特别说明以下各表生色底物均为此浓度。产生的褐色素分泌于菌体之外.不接种的对照平板无自氧化现象，不产生任何颜色。P代表菌落生色强度，数字表示强弱；G代表菌落长势，数字表示强弱。以下各表同，不再重复说明。度均为0.25mMol/l，其它处理均为0.10mMol/l。与对照比较，多数阳离子化合物能有效促进生色反应，尤其是Co(NO3)2·6H2O，CuSO4·5H2O效果最佳，次为MnSO4·5H2O、MnCl2·5H2O和NH4Fe(SO4)2·12H2O，其余化合物如FeCl3·6H2O，FePO4·4H2O，柠檬酸三铁，H24Mo7N6O24·4H2O，(NH4)2MoO2·4H2O，Na2·Mo4O4·2H2O，ZnSO4·7H2O和Ca(NO3)2·4H2O都能够程度不同的促进生色反应；FeSO4·7H2O不仅不能够促进生色反应强度，反而抑制颜色产生，ZnCl2效果也不理想。需要指出的是尽管如此多的化合物能够显著促进生色反应，但是没有一种化合物能够增加产生阳性反应的菌株数量。5.5螯合剂及螯合剂与阳离子互作对寄生型假丝酵母和热带假丝酵母在含4-氨基苯甲酸的CT培养基上的生色效应的影响
从表2知，与CT培养基比较，螯合剂具有明显的强化菌株生色阳性反应和增加阳性菌株的双重作用。而螯合剂和金属离子还具有正向互作效应，具有明显互作效应的处理组合是EDTANa2Fe+MnCl2+CT和EDTANa2Fe+MnSO4+CT，该二处理组合不仅强化了生色效应，更为重要的是增加了具有阳性效应的菌株数量，培养至48h，EDTANa2Fe+MnCl2+CT处理组合中热带假丝酵母的阳性反应率达到100％，寄生型假丝酵母菌株的阳性反应率也达到80％以上。两个种的部分菌株(1811，1914，1810，1988)阳性反应在16小时内就很明显(表中未列出)。其次是EDTANa2Fe+Co(NO3)2+CT处理组合也增加了具有阳性反应的热带假丝酵母菌株数量。但是当将EDTANa2Fe和盐浓度由1mMol/l提高到2mMol/l时(表3)，在48h内，EDTANa+MnCl2+CT处理组合中二菌种的阳性反应明显强化，二种假丝酵母21个菌株的阳性反应率均同时达到100％，显然，这是本发明最佳结果。而EDTANa2Fe+MnSO4+CT处理组合中的阳性反应率则没有因为浓度提高而发生变化。在处理组合EDTANa2Fe+MnCl2(1+0.1mMol/l)中，即使MnCl2浓度降低10倍，热带假丝酵母阳性反应率仍为100％；寄生型假丝酵母阳性反应率为90％以上。表2和表3结果充分说明：在影响此二菌种生色阳性反应中，螯合剂起主导作用，其次为金属离子作用，尤其以EDTANa2Fe+MnCl2效果最佳，其次为EDTANa2Fe+MnSO4。
表2螯合剂及螯合剂与阳离子互作对寄生型假丝酵母和热带假丝酵母在含4-氨基苯甲酸的CT培养基上的生色效应的影响注*：处理号1，2，3，4，5，6和7内容分别为EDTANa+MnCl2+CT，EDTANa+MnSO4+CT，EDTANa+CuSO4+CT，EDTANa+NH4FeSO4+CT，EDTANa+Co(NO3)2+CT，EDTANa+Ca(NO3)2+CT，EDTANa+CT(CK)和CT(CKo)；EDTANa和其它盐份终浓度均为1mMol/L.表3螯合剂与阳离子互作对寄生型假丝酵母和热带假丝酵母在4-氨基苯甲酸培养基上生色效应的影响*注*：处理号1，2，3，4，5，6和7分别是EDTANaFe+MnCl2(1+1mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnSO4(1+1mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnCl2(2+2mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnSO4(2+2mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnCl2(1+0.1mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnCl2(0.1+0.1mMol/l)+CT，EDTANaFe(2.0mMol/l)+CT(CK)和EDTANaFe(1.0mMol/l)+CT(CKo)。6.酵母对上述最佳生色(阳性)反应的种属特异性 表4.酵母23个属的70个种对上述特异性阳性反应的种和属的特异性效应* 属 种 菌株 种 属 Positive No. Tot. No. ％ Positive no. Tot.no ％ Positive no. Tot no. ％Candida Catenula 1 5 20 6(1)** 11 54.55 Inconspi 1 1 100 8(2)** 13 61.54 Parapsilisis 10 10 100 Rug 1 1 100 Sake 1 1 100 Tropicalis 9 9 100Clavispora Lusistanea 1 1 100 1 1 100Cryptoco- Albidus 4 4 100 2 4 50Ccus Humicola 4 10 40Debaryomy Carsonii 1 1 100 3 12 25Ces Polymorphus 1 1 100 Robertsia 1 1 100Pichia Anomala 1 3 33.33 2 6 33.33 FermentansRhodotorula Gluttinis 1 2 50 2 3 66.67 Mucilaginosa 2 2 100Sum.(1)** 20 90 22.22 14 70 20.00 7 2326.09Sum.(2) 39 109 35.78 16 72 22.22注：*培养基和培养条件同于表3中的1号处理。所有观测结果来自于120h；**(1)和(2)分别指不包括和包括Candida parapsilosis和Candida tropicalis在内的结果；***在90(1)或109(2)菌株中有26个至144h生长完全受到抑制，分别占总数28.89％和23.85％。
上述阳性反应的特异性是该生色反应能否成为鉴定培养基的重要特征，将这种生色培养基推广到23个属的70种，以检验其阳性反应的特异性发现：23个属中有7个具有阳性反应，阳性反应率约为26％，70个种中有14个种具有阳性反应，阳性反应率约为20％，90个菌株中共有20个菌株具有阳性反应，阳性反应率约为22％。具有较高的特异性(表4)，是建立鉴定培养基可以接受的范围。7.区分Candida parapsilosis与Candida tropicalis和其它具有阳性反应的菌株
根据该2种菌株固有特性，不难区别，Candida tropicalis具有抗环己酰亚胺能力，在0.1％环己酰亚胺的CT培养基能够生长，而Candida parapsilosis不具有这一能力，不能够在0.1％环己酰亚胺的CT培养基能够生长；应用含有0.1％对氨基苯甲酸和0.1％环己酰亚胺的CT培养基，即可以将区别此二菌种，从表5可以看出：在有0.1％对-氨基苯甲酸和0.1％环己酰亚胺的CT培养基上能够生长的菌株除了Candida tropicalis之外，还有Debaryomyces polymorphus(1587)，Debcast(1870)Can albi(1862)，1894 Deb occi，1899 Deb nep，但是能够生长而且又能够产生生色反应的只有Debaromyces polymorphus(1587)，因此，到此为止最后的任务就是进一步区别Candida tropicalis和Debaryomyces polymorphus。表5.对0.1％ p-氨基苯甲酸阳性反应的菌株在含有0.1％环己酰亚胺的CT培养基上的生长情况*(24℃，96h)菌株P G菌株P G菌株P G1005 Pichmem- -1842 Cryalbi+ -1935 Cryhum+ -1007 Canvini- -1843 Cryalbi+ -1936 Crylaur+ -1475 Pichano- -1844 Cryalbi+ -1937 Crylaur+ -1476 Pichano- -1862 Canalbi- +1940 Cryalibi+ -1478 Pichano+ -1863 Hidrbur- -1811 Canparaps+ -1526 Lssori- -1865 Pichfer+ -1901 Canparaps+ -1527 Issori+ -1869 Debetch- -1902 Canparaps+ -1567 Cryphumi+ -1870 Debcast- +1906 Canparaps+ -1568 Cryphumi- -1872 Debcars+ -1908 Canparaps+ -1569 Cryphumi+ -1873 Debrob+ -1913 Canparaps+ -1574 Cryphumi- -1874 Caninco+ -1914 Canparaps+ -1575 Cryphumi- -1876 Metreuk- -1920 Canparaps+ -1580 Cryphumi- -1877 Clavlusi+ -1922 Canparaps- -1528 Issori- -1878 Debpse- -1925 Canparaps+ -1587 Debpoly+ +1881 Debund- -1926 Canparaps+ -1719 Cancate- -1882 Debmill+ -1927 Canparaps- -1720 Cryneof- -1883 Picguil- -1359 Cantropica+ +1771 Cancate+ -1884 Canrug+ -1986 Cantropica+ +1772 Cancate- -1892 Pichsub- -1987 Cantropica+ +1789 Cansak+ -1894 Debocci- +1988 Cantropica+ +1790 Rhomuc+ -1898 Picburt+ -1989 Cantropica+ +1808 Metpul- -1899 Debnep- +1990 Cantropica+ +1827 Rhoglut+ -1900 Zygcidi+ -1991 Cantropica+ +1837 Rhomuc+ -1933 Cryhum+ -1992 Cantropica+ +1840 Crylaur- -1934 Cryhum+ -注：生色检测培养基组成：含有0.1％p-氨基苯甲酸，1mMol/l EDTANa2Fe和1mMol/l MnCl2的CT培养基；生长检测培养基组成：含有0.1％p-氨基苯甲酸和0.1％环己酰亚胺的CT培养基。8.区分Candida tropicalis和Debaryomyces polymorphus菌株
生长温度适应性检测：最后，简单快速区别Candida tropicalis和Debaryomycespolymorphus的办法是：前者能够在40℃下生长，而后者则不能够。实施例2：最佳检测培养基成分与配制
本发明培养基物质包括：A溶液+B溶液。
A溶液：1g维生素B1，2mg/L B12和20微克/L生物素、0.8％对-氨基苯甲酸，三种碱性氨基酸1.0％天冬酰胺，1.0％谷安酰胺和1.0％甘氨酸，1mMol/L MnCl2，1mMol/L EDTANa2Fe等溶解于200ml溶液中，经微孔滤膜(0.45μm孔径)过滤除菌。
B溶液：4g KH2PO4，2.5g MgSO4.7H2O，0.5g葡萄糖和20g琼脂，加800ml蒸馏水。800ml基础培养基在115℃下灭菌20分钟，冷却到50℃后与A液混合，并倒加厚平板。
该培养基的A和B溶液起始pH4.0；用磷酸钾盐缓冲液(1mol/L)调节培养基起始pH。
同时，设置由有机物组成的培养基为对照培养基(简称为YCB培养基)，对照培养基的有机培养基A液组成为0.1或者1.0g生色底物，11.7g酵母碳源，溶解于200ml溶液中，经过滤除菌；
对照培养基的基础培养基组成为3g细菌用蛋白胨和20g琼脂溶解于800ml蒸馏水中，在115℃下灭菌20分钟，冷却到50℃后与A液混合，并倒加厚平板。培养基各组分在灭菌前用1M K2HPO4或1M KH2PO4调整培养基初始pH到5.5。实施例3.检测培养基在食品和病牛尿样品检测中的使用
在本发明最佳检测培养基上接种来自于超级市场过期开口盒装酸奶的分离稀释液10-5，10-6，10-8三个稀释度，各三皿，100ul/皿；另外接种活化的酵母菌株Candidatropicalis，Candida parapsilosis和Cryptococcus albidus，Debaryomyces polymorphus，Pichia anomala，Rhodotorula mucilaginosa斜面等成熟细胞稀释液三个10-5，10-6，10-8稀释度，各三皿，100ul/皿；24℃下倒置培养1-3天，每天记录菌体生长和颜色产生情况，将有色现象称为阳性反应。并用加号多少表示生长情况和颜色分泌量大小。然后将初筛具有颜色阳性反应的菌株进一步在单独平板上作重复验证。并且按照本发明所述的检测鉴定方法，进行逐一鉴别、计数检测，所得结果如下：(1)在变质乳品中检出有病原菌酵母Cryptococcus albidus 21CFU/ml(3)至于所接种Candida tropicalis，Candida parapsilosis和Cryptococcus albidus，Debaryomyces polymorphus，Pichia anomala，Rhodotorula mucilaginosa均具有阳性生色反应。实施例4：检测培养基在饲料酵母样品中的检测使用
取河南、山东和河北酵母饲料厂家在有效货架期内产品各20克，分别标记为样品1，2，3，各取1克样品，用无菌水稀释制作形成10-6，10-7，10-8，10-9四个稀释度，各取100ul，涂布本发明检测平板，重复4次。并且按照本发明所述的检测鉴定方法，进行检测，所得结果如下：
样品1，2，3分别含有Candida tropicalis为0.65亿CFU/g，0.11亿万CFU/g，和1.5亿万CFU/g。实施例5：
接种Candida parapsilosis和Candida tropicalis在含有EDTANa2Fe，MnCl2和0.1％环己酰亚胺的CT培养基上，发现培养48h(24℃)后，二菌株生长特异性检测显示(表6)：Candida tropicalis能够耐受0.1％环己酰亚胺而生长并且还显示生色阳性反应，但是Candida parapsilosis则不能够生长。表6.Candida parapsilosis和Candida tropicalis在含有EDTANa2Fe，MnCl2和0.1％环己酰亚胺的CT培养基上生长性能差异菌株ISANo.24h48h72h96h120h144h(1)(2)(1)(2)(1)(2)(1)(2)(1)(2)(1)(2)Candida1811050800011010012Parapsilosis1901050800012011012190205080100120110121906050701001101001219080406080907010191305070100110100121914050709010090111920050709010011012192200000000000019250407010011012014192605080100110120141927000000000000Candida135926586107118121014tropicalis181015375851069811198606284104127129141987264851071191310141988366861071191310141989174851061181310141990265961071281210141991376971081191210141992476971081210131114*注：(1)和(2)分别指含和不含0.1％环己酰亚胺的CT培养基。培养基相同组成成分的浓度同表4。实施例6：接种Candida tropicalis和Debaryomyces polymorphus在含有EDTANa2Fe，MnCl2和0.1％环己酰亚胺的CT培养基上，发现培养48h(24℃)后，二菌株均能够生长，而且都显示生色阳性反应；但是进一步地接种此二种菌株在同上培养基上，只是将培养温度升高到40℃检测显示：Candida tropicalis能够耐受40℃高温而生长，但是Debaryomyces polymorphus在则不能够耐受40℃高温，在此温度下不能够生长。因而容易区别此二种菌株。实施例7：接种Crptococcus albidus与所有其他酵母如Candida tropicalis和Debaryomyces polymorphus等，在含有1mMol/L EDTANa2Fe，1mMol/L MnCl2的CT培养基上24℃下培养72h后，这些酵母都能够生长和产生生色阳性反应，但是当更换培养基中的氮源由硝酸盐或者亚硝酸盐作为唯一氮源保持其他培养基成分和培养条件不变的时候，只有Crptococcus albidus能够在含有硝酸盐或者亚硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长，而其他均不能够，从而将Crptococcus albidus与其他酵母区别开来。