巨噬细胞介导的疾病的治疗和诊断 【发明领域】
本发明涉及一种治疗和监测由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的方法。更具体地说，将与活化的巨噬细胞结合的配体和成像剂，或免疫原，细胞毒素，或改变巨噬细胞功能的试剂形成复合物，施用于患病的宿主，用以诊断和/或治疗巨噬细胞介导的疾病。发明背景和概述
哺乳动物的免疫系统提供了一种识别和排除外来地病原体的途径。虽然免疫系统通常提供了抵抗外来病原体的防线，但仍存在很多免疫应答本身参与疾病进展的例子。因宿主的自身免疫应答而引起或恶化的疾病的例子是自身免疫疾病，例如，多发性硬化、红斑狼疮、牛皮癣、肺纤维化、和类风湿性关节炎，以及免疫应答有助于发病机制的疾病，例如动脉粥样硬化、炎性疾病、骨髓炎、溃疡性结肠炎、克隆氏病，和常常引起器官移植排斥的移植物抗宿主疾病。
一般，巨噬细胞是首先遇到外来病原体的细胞，因此，它们在免疫应答中起重要的作用。然而，在某些情况下，活化的巨噬细胞可以有助于疾病的病理生理学。活化的巨噬细胞通过水解和氧化，侵袭外来病原体，造成其降解，从而非特异地将在巨噬细胞内的该外来病原体吞噬并杀灭。降解蛋白的肽展示在巨噬细胞的表面，并在该表面被T细胞所识别，同时可以与在B细胞表面的抗体直接相互作用，引起T和B细胞的活化并进一步刺激免疫应答。
类风湿性关节炎(RA)是一种全身性的疾病，其特征是慢性炎性的滑膜炎，通常涉及外周关节。滑膜的炎症引起软骨变质和对骨骼的侵蚀，随之破坏了关节的完整。在2/3以上的RA患者中，发现了与IgG的Fc区反应的自身抗体类风湿因子，表明RA含有自身免疫成分。
在全世界，高达2％的人口患有RA，其中80％的RA患者在35-50岁的年龄发病。RA的临床症状包括关节疼痛、肿胀、和触痛，造成运动受限制、虚弱、疲乏，以及体重减轻。RA是一种全身性的疾病，因此，患者还有关节外症状，尤其是类风湿因子滴度高的患者。这些症状包括含有坏死物质的内区，巨噬细胞的中间区和颗粒组织外区的类风湿结节、肌肉萎缩、骨质疏松、肺纤维化、和类风湿脉管炎，它可以引起皮肤溃疡、手指坏疽、或神经血管疾病。
类风湿滑膜炎是RA的特征，它可引起滑膜衬细胞数的增加、滑膜衬细胞的增生和肥大、微血管的损伤、水肿、以及，例如T细胞、巨噬细胞和树突细胞的细胞浸润。类风湿滑膜炎的特征在于免疫细胞分泌产物的存在，例如由T淋巴细胞所分泌的因子，包括IL-2、IFN-δ、IL-6、IL-10、GM-CSF和TGFα和β，以及由活化的巨噬细胞所分泌的因子，包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、巨噬细胞CSF和TGFβ。这些细胞因子的产生看来解释了很多RA的病理学，包括滑膜的炎症、滑膜细胞增殖、软骨和骨的变质、以及该疾病的全身症状。
RA可以用各种治疗方法来进行治疗，包括物理治疗、休息、和用夹板固定。治疗试剂也可以用来治疗RA，包括用阿斯匹林和非甾体类抗炎药，以控制局部的炎症。但是，这些试剂对疾病的疗效很小，而且具有毒性副作用。减轻疾病的抗风湿药物，例如α-青霉胺和柳氮磺胺吡啶也可以用来治疗RA，但从这些药物获得疗效要迟缓数周或数月，而且这些药物有毒性副作用。免疫抑制和细胞毒性药物抑制某些患者的症状，但是同时产生毒性。也曾使用过关节内的糖皮质素，但只是短暂缓解。因此，必须建立一种毒性降低的、对RA及其他由活化的巨噬细胞所引起或恶化的疾病的治疗有效的新治疗方法。
叶酸受体(FR)是38KDa的GPI锚定蛋白，它以高亲和性(＜1nM)与维生素叶酸结合。在与受体结合后，迅速的胞吞作用将维生素送入细胞内，并在细胞内转存在低pH的核内体区室内。重要的是，小分子、蛋白、甚至脂质体与叶酸的共价偶联并不改变维生素与叶酸受体结合的能力，因此，叶酸-药物偶联物很容易通过受体介导的胞吞作用而进入细胞。
由于大多数细胞使用不相关的还原型叶酸载体(RFC)来获得必需的叶酸，叶酸受体的表达仅限于少数几种类型的细胞中。除了肾脏和胎盘以外，正常组织的FR表达水平很低或检测不到。但是，很多恶性组织，包括卵巢癌、乳房癌、支气管癌、和脑癌的受体表达水平明显增高。实际上，估计有95％的卵巢癌过量表达叶酸受体。最近报道，叶酸受体的非上皮同工型FRβ在活化的(而不是静息的)滑膜巨噬细胞中表达。因此，申请人曾试图利用可能能够改变活化的巨噬细胞功能的叶酸连接的化合物，来治疗巨噬细胞介导的疾病。例如，申请人已发现，在关节炎的动物中，叶酸连接的免疫原可以用来改变宿主对炎症部位活化的巨噬细胞的免疫应答，以减少巨噬细胞和减轻关节炎。
闪烁照像成像剂的灵敏度比核磁共振成像(MRI)造影剂高百万倍以上，而且，通过其导向病变特异的细胞标记，可提高其选择性。实际上，放射性同位素99mTc已用非特异性IgG、抗CD4抗体、CD11b/CD14-糖脂肽配体、和E选择蛋白结合肽递送到关节炎组织中。用这样的放射成像剂进行的临床前研究已明显地显示出使关节炎组织在体内成像的价值，但是，目前在成像剂的选择上还不是最佳的，而且目前的化合物中，没有一种是只导向活化巨噬细胞的。鉴于巨噬细胞活化期间出现叶酸受体活性，申请人曾对叶酸导向的99mTc成像剂是否可以用于关节炎病变的体内成像进行过测定。
为了测定这种高亲和性FR的表达是否可以用于选择性地将药物导向在炎症部位活化的巨噬细胞，将叶酸与99mTc螯合剂偶联，并评价其在佐剂诱导的关节炎的大鼠的正常组织和病变组织中的分布。确实，发现称为EC20的叶酸连接的99mTc螯合复合物浓集在患病大鼠的关节炎肢端，而在健康大鼠的关节中未发现。在过量的竞争性叶酸存在下，发现受影响组织的γ闪烁成像的强度大大地降低。此外，患关节炎的动物的肝和脾也显示出对EC20摄取的增加和FR水平的提高，证实了巨噬细胞的全身活化与佐剂诱导的关节炎同时发生。患关节炎动物的巨噬细胞的耗竭减少了组织的FR含量，并与此一致，消除了EC20的摄取。此外，由佐剂诱导关节炎的大鼠中分离的枯氏细胞表现出的结合叶酸偶联物的能力明显高于健康大鼠的枯氏细胞。由此，申请人发现，EC20对于测定活化的巨噬细胞参与炎症，例如类风湿性关节炎的病理学是有用的。
本发明涉及一种治疗和监测由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的方法。根据本发明的一个实施方案，通过重新定向宿主对活化的巨噬细胞的免疫应答，或通过改变活化的巨噬细胞的功能，或直接杀灭活化的巨噬细胞来治疗由活化的巨噬细胞介导的疾病状况。在本发明的一个方面，为了促进杀灭活化的巨噬细胞，将与活化的巨噬细胞特异结合的配体与免疫原偶联，以重新定向宿主对活化的巨噬细胞群的免疫应答，或者将它们与直接杀灭巨噬细胞的细胞毒素偶联。可以用于本发明的偶联物中的配体包括与在活化的巨噬细胞上特异表达的受体结合的配体，例如与叶酸受体结合的配体；或以下所述的配体，例如，定位于在活化的巨噬细胞上特异表达的细胞表面标记的单克隆抗体。本发明的另一个方面，将与活化的巨噬细胞特异结合的配体与成像剂偶联，然后将偶联物施用于患者，以诊断和监测由活化的巨噬细胞介导的疾病的进展。
在一个实施方案中，提供了一种治疗或监测/诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的方法。此方法包括对患有巨噬细胞介导的疾病的患者施用有效量的组合物的步骤，该组合物包含通式为Ab-X的偶联物或复合物，其中的基团Ab包含能结合活化的巨噬细胞的配体，当偶联物用来治疗疾病状况时，基团X包含免疫原、细胞毒素、或能够改变巨噬细胞功能的化合物；当偶联物用来监测/诊断疾病状况时，基团X包含成像剂。
发明详述
根据本发明，提供了治疗或监测/诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的方法。已知由活化的巨噬细胞介导的疾病的例子包括类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、克隆氏病、牛皮癣、骨髓炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、肺纤维化、结节病、系统性硬化、器官移植排斥(GVHD)和慢性炎症。这种疾病状况可以通过如下方式监测，首先对患有该疾病状况的患者施用有效量的组合物，该组合物包含通式为Ab-X的偶联物，其中的基团Ab包含能结合活化的巨噬细胞的配体，基团X包括成像剂，然后用能够检测成像剂的仪器对患者进行扫描。巨噬细胞介导的疾病状况可以根据本发明，通过施用有效量的上述通式的组合物来治疗，通式中Ab包含能结合活化的巨噬细胞的配体，基团X包含免疫原、细胞毒素、或能够改变巨噬细胞功能的化合物。当这种导向巨噬细胞的偶联物施用于患有活化的巨噬细胞介导的疾病状况的患者时，可使偶联的细胞毒素、免疫原或细胞因子浓集，并与活化的巨噬细胞群结合，以杀灭活化的巨噬细胞，或改变巨噬细胞的功能。活化的巨噬细胞群的消除或失活，使得所治疗的由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的病理特征终止或减少。上述偶联物通常是以组合物形式通过胃肠外施用，该组合物包含偶联物及其可药用的载体。偶联物的施用通常是连续的，直至疾病状况的症状减轻或消失。
在本发明的一个实施方案中，通过施用偶联物Ab-X，在患者体内监测或诊断活化的巨噬细胞介导的疾病状况，其中Ab包含能结合活化的巨噬细胞的配体，X包含成像剂，然后，用能够检测成像剂的局部浓集的仪器对患者进行扫描。与以上概括的治疗偶联物类似，成像或诊断偶联物通常以诊断组合物的方式对患者施用，该组合物包含偶联物和可药用载体。该组合物通常配制成用于肠胃外施用的剂型施用于患者，施用量是使局部的活化巨噬细胞群能成像的有效量。偶联物的成像剂组分的性质根据成像方法学而决定。因此，举例来说，成像剂可以包含螯合剂部分和金属阳离子，例如放射性核素或核磁共振成像造影剂，如钆153。通常是将导向活化巨噬细胞的成像剂施用于患者，经过一段时间，使成像剂递送和浓集到活化的巨噬细胞群中，患者经过成像步骤即能够用导向成像剂成像。
本发明的方法可以用于人的临床医学和兽医的应用。因此，患有由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的宿主动物可以是人；或者，在兽医应用的场合，宿主动物可以是实验室、农业、家养或野生动物。根据本发明的方法，优选将用于施用的偶联物通过肠胃外施用于患有该疾病状况的动物或患者，例如，通过皮内、皮下、肌内、腹膜内、或静脉内施用。或者可将该偶联物通过其它医学上可用的方法施用于动物或患者，同时，可按照标准的方式或缓释剂型，例如使用缓速泵，施用有效的剂量。本发明的治疗方法可以单独使用，或与其他已知的治疗巨噬细胞介导的疾病状况的治疗方法联合。
本发明的通式为Ab-X的配体偶联物中，基团Ab是能够与活化的巨噬细胞结合的配体，很多结合巨噬细胞的部分中的任何一种都可使用。可采用的配体特别包括叶酸受体结合配体，以及能够与在活化的巨噬细胞中或巨噬细胞上独特或优先表达或呈递的表面部分结合的抗体、或抗体片段。在一个实施方案中，活化的巨噬细胞结合配体是叶酸、叶酸类似物或其他叶酸受体结合分子。活化的巨噬细胞表达38LD的GPI锚定的叶酸受体，该受体以亚nmol以下的亲和力(即＜1nM)与叶酸和叶酸衍生的化合物结合。在另一个实施方案中，活化的巨噬细胞结合配体是特异的单克隆抗体或多克隆抗体，或能与活化的巨噬细胞特异结合的抗体的Fab或scFv(即单链可变区)片段。
这样就形成了本发明的用于诊断和监测由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的导向活化巨噬细胞的偶联物，并用于导向，从而将成像剂浓集在患者的活化的巨噬细胞群的部位。在通式为Ab-X的偶联物中，Ab是能与活化的巨噬细胞结合的配体，X包含成像剂。在一个实施方案中，该成像剂包含螯合剂和金属阳离子，通常是放射性核素或核磁共振成像增强剂或造影剂，例如钆。这种其中的基团Ab是叶酸、叶酸的类似物、或其他叶酸受体结合的配体的偶联物在美国专No.5,688,488中有详细描述，该专利的说明书作为参考文献在此引入。上述的专利，以及在此引入作为参考文献的相关美国专利No.5,416,016和No.5,108,921，描述了制备本发明可用的螯合偶联物的方法和实施例。本发明中导向巨噬细胞的成像剂可以按照更早的专利中所述的一般方案制备和使用。本发明的诊断方法部分基于下述的发现，即叶酸导向的偶联物可以用于将偶联的成像实体浓集在活化的巨噬细胞群，从而能够监测和诊断以活化的巨噬细胞浓集在疾病部位为特征的疾病状况。
根据本发明的一个实施方案，提供了一种通过对患有由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的患者施用有效量的包含通式为Ab-X的偶联物的组合物，其中Ab的定义如以上所述，基团X包含细胞毒素、免疫原、或能够改变巨噬细胞功能的化合物而治疗由活化的巨噬细胞介导的疾病状况的方法。可用来形成用于本发明的方法的偶联物的细胞毒性部分的例子包括氯甲双磷酸、炭疽、假单胞菌外毒素，通常这些细胞毒性组成成分要经过修饰，使其不与正常的细胞结合，还包括其他毒素或细胞毒性试剂，包括本领域公知的化学治疗剂，如肾上腺皮质激素、烷化剂、抗雄激素药物、抗雌激素药物、雄激素、雌激素、抗代谢药，例如阿糖胞苷、嘌呤类似物、嘧啶类似物，以及氨甲蝶呤、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂和其他铂化合物、他莫昔芬、紫杉酚、环磷酰胺、植物性生物碱、强的松、羟基脲、替尼泊苷、以及博莱霉素、氮芥、亚硝基脲、长春新碱、长春碱、炎性和促炎剂等。这种毒素或细胞毒性成分可以直接与活化巨噬细胞结合部分偶联，例如与叶酸、或其他叶酸受体结合配体偶联，或者，通常可以通过与磷脂的共价连接而配制在脂质体内，该脂质体本身可以作为巨噬细胞结合实体的偶联物而被用来导向。同样，当基团X包含能够改变巨噬细胞功能的化合物，例如包含细胞因子IL-10或IL-11时，该细胞因子可以与导向部分Ab直接地共价连接，其中的Ab举例来说是叶酸受体结合配体、或者是叶酸受体的抗体或抗体的片段；或者，可以将改变巨噬细胞功能的细胞因子包入脂质体内，该脂质体本身通过悬垂的巨噬细胞的导向实体Ab，导向活化的巨噬细胞，其中的Ab与一个或多个作为脂质体成分的磷脂共价连接。
在另一个实施方案中，配体-免疫原偶联物可以与细胞毒性化合物联合施用。列于前面括号内的化合物属于适用于该目的的化合物。
在本发明的另一个治疗方法实施方案中，导向活化的巨噬细胞的偶联物Ab-X中的X基团包含免疫原，该配体-免疫原偶联物能够有效“标记”疾病患者体内的与该疾病的发病机制有关的活化巨噬细胞群，以便通过内源免疫应答或通过共同施用的抗体而特异地消除巨噬细胞。在本发明的治疗方法中，配体-免疫原偶联物的使用促进了活化巨噬细胞群的免疫应答介导的消除。这种免疫应答介导的消除可通过内源免疫应答，或通过由共同施用的抗体而实施的被动免疫应答来实现。上述的内源免疫应答可包括体液的应答、细胞介导的免疫应答、以及任何其他宿主动物的内源免疫应答，包括补体介导的细胞裂解、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、导致吞噬的抗体调理作用、引起细胞凋亡信号传递的基于抗体结合的受体簇集、抗增殖、或分化、以及递送的抗原/半抗原的直接免疫细胞识别。预期内源免疫应答会利用调节免疫细胞的增殖和迁移等过程的细胞因子的分泌。内源免疫应答可包括例如B细胞、T细胞的免疫细胞的参与，这些细胞包括辅助性和细胞毒性的T细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、中性粒细胞、LAK细胞等。
在另一个实施方案中，可以使配体-免疫原偶联物内化，并可将免疫原降解并呈递在巨噬细胞的表面，以便被免疫细胞所识别，从而引发直接对呈递降解的免疫原的巨噬细胞的免疫应答。
体液应答可以是由以下过程诱导的应答：例如正常计划的接种、用天然的抗原，或非天然的抗原或半抗原，例如异硫氰酸荧光素(FITC)的主动免疫、用非天然的抗原诱导新的免疫性。主动免疫包括正常的接种方案之外的多次非天然抗原或半抗原的注射，以诱导新的免疫性。体液应答也可以由先天的免疫性所产生，在这种情况下，宿主动物具有天然的预先存在的免疫性，例如对α-半乳糖基的免疫性。或者，可以通过对宿主动物施用抗体，例如由血清收集的天然抗体，或者由基因工程方法或不是基因工程方法制备的单克隆抗体，包括人源化的抗体，来建立被动免疫。在患者的预先存在的抗体滴度对其他可能存在的抗原无治疗效果的情况下，利用特定量的抗体试剂来建立被动免疫；以及使用配体-免疫原偶联物，其中被动施用的抗体是抗该免疫原的抗体，将提供一套标准试剂供使用的好处。被动施用的抗体可以与配体-免疫原偶联物“共同施用”，共同施用定义为将抗体在配体-免疫原偶联物的施用之前、同时、或之后的时间施用。预期预先存在的抗体、诱导的抗体、或被动施用的抗体会通过配体-免疫原偶联物与活化的巨噬细胞群的优先结合而转向活化的巨噬细胞，然后通过补体介导的裂解、ADCC、抗体依赖性吞噬、或受体的抗体簇集而将这种致病细胞杀灭。细胞毒性的处理也可以包括其他类型的免疫应答，例如细胞介导的免疫、以及第二应答，该第二应答在吸引的抗原呈递细胞吞噬活化的巨噬细胞时出现，并将该细胞的抗原呈递到免疫系统，以消除呈递这类抗原的其他的活化巨噬细胞。
用于制备本发明的治疗方法中所用的偶联物的可接受的免疫原是能够引起宿主动物产生抗体的免疫原；或者以前已经在宿主动物中引起抗体的产生、形成预先存在的免疫性的免疫原；或是构成部分先天免疫系统的免疫原。或者，可将抗该免疫原的抗体施用于宿主动物，以建立被动免疫。用于本发明的合适的免疫原包括抗原或抗原肽，对该抗原或抗原肽已经通过正常计划的接种，或以前自然与脊髓灰质炎病毒、破伤风、伤寒、风疹、麻疹、腮腺炎、百日咳、结核和流感抗原，以及α-半乳糖基的接触而建立了预先存在的免疫。在这种情况下，配体-免疫原偶联物可用来将先前获得的体液或细胞免疫重新定向到宿主动物的活化巨噬细胞群，以消除这些细胞。其他合适的免疫原包括宿主动物通过对非天然的抗原或半抗原，例如异硫氰酸荧光素(FITC)或二硝基苯的免疫已产生了新的免疫性的抗原或抗原肽，和对其存在先天免疫性的抗原，例如超抗原和胞壁酰二肽。还考虑到，MHC I限制性肽可以与配体连接，用于使细胞免疫性重新定向于巨噬细胞并引起T细胞杀灭巨噬细胞。
巨噬细胞结合配体和免疫原、细胞毒性试剂、细胞因子或成像剂，在根据本发明可能形成偶联物而使用时，可以通过使用任何一种本领域公知的形成复合物的方法而进行偶联。这种方法可以包括配体直接、或通过连接基团如二价的接头间接地与免疫原通过共价、离子、或氢键键合。偶联物一般通过配体与导向的实体间的共价键合而形成，该共价键通过复合物相应成分上的酸、醛、羟基、氨基、或叠氮基之间形成酰胺、酯或亚氨键而生成。另一种方法是如以上所述，配体复合物可以是包含脂质体的复合物，其中导向的实体(即成像剂、或免疫原、细胞毒性剂或巨噬细胞功能改变剂)包含在脂质体内，该脂质体本身与活化的巨噬细胞结合配体共价连接。
在本发明的一个实施方案中，配体是叶酸、叶酸的类似物、或任何其他叶酸受体结合分子，叶酸配体通过下述过程与导向实体偶联：利用三氟乙酸酐通过蝶酰基叠氮化物中间体制备叶酸的γ-酯。该过程引起叶酸配体的合成，通过叶酸的谷氨酸基团的γ-羧基与导向的实体偶联。或者，叶酸的类似物可以通过谷氨酸基团的α-羧基部分或α和γ羧酸实体进行偶联。
本发明的一个方面，根椐本发明的分子式Ab-X所采用的偶联物用于配制包含有效量的偶联物及其可药用载体的治疗或诊断组合物。通常，这种组合物是配制成肠胃外使用的形式。根据本发明，有效使用的该偶联物的量取决于很多参数，包括需要治疗或诊断的疾病性质、偶联物的分子量、它的施用途径及其在组织中的分布、以及与其他治疗或诊断试剂共同使用的可能性。施用于患者的有效量一般根据身体的表面积、患者的体重、医生对患者病情的估计。有效量的范围可以为约1ng/kg-约1mg/kg，更典型的是约1μg/kg-的500μg/kg，最典型的是约1μg/kg-约100μg/kg。
用于监测或诊断时，成像步骤通常在导向活化的巨噬细胞的成像剂施用后约1-6小时进行。
任何施用配体偶联物的有效方案都可采用。例如，配体偶联物可以按单次剂量施用，或可以分开按每天多次剂量的方式施用。此外，一种交错的方式，例如每周1-3天可以用来代替每天治疗的方式，为了对本发明加以限定，这种周期性的或交错的日常方案认为是与每天的治疗是等效的，并属于本发明的范围内。在一个实施方案中，采用多次注射配体偶联物的方式，例如以12-72小时的间隔或48-72小时的间隔，对患者治疗。初次注射后，可以按数天或数月的间隔对患者给予补充注射配体偶联物，补充注射可以防止疾病的复发。或者，可以预防性施用配体偶联物，以防止已知有形成巨噬细胞介导的病症倾向的患者发生疾病。在本发明的一个实施方案中，可以使用一种以上的配体偶联物，例如，宿主动物可以用异硫氰酸荧光素和二硝基苯预先免疫，随后用与相同或不同的活化巨噬细胞导向配体连接的异硫氰酸荧光素和二硝基苯，按照共同施用的方案进行治疗。
根据本发明，配体偶联物通过肠胃外施用，最典型的是腹膜内注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射或鞘内注射。配体偶联物也可以用渗透泵递送给患者。肠胃外剂型的例子包括偶联物的水溶液，例如等渗盐水的溶液、5％葡萄糖或其他众所周知的可药用液体载体，如乙醇、甘油、酯和酰胺。根据本发明所采用的肠胃外组合物可以是包含一剂或多剂可重配的冻干形式组合物。本发明的另一个方面，配体偶联物可以配制成本领域已知的许多缓释剂型中的任何一种，例如美国专利No.4,713,249；5,266,333；和5,417,982中所描述的生物可降解的碳水化合物基质，其公开的内容作为参考文献在此引入。
实施例1
材料
EC20(连接叶酸的螯合剂99mTc)、EC28(相同的99mTc螯合复合物，无叶酸)、以及叶酸-异硫氰酸荧光素(叶酸-FITC)由Endocyte，Inc.(West Lafayette，IN)馈赠。热灭活的丁酸支原体购自BD Biosciences(sparks，MD)。叶酸、轻矿物油、氯甲双磷酸、胶原酶-A和链霉抗生物素蛋白-R-藻红蛋白购自Sigma Chamical Co.(St.Louis，MO)，Dulbecco的改进的Eagle培养基(DMEM)购自Gibco-BRL(Gathersberg，MD)。3H-叶酸购自American RadiolabeledChemicals，Inc.(St.Louis，MO)，Microcon-30购自Millipore Corp.(Bedford，MA)。RK-4-生物素和ED2-R-藻红蛋白抗体分别由BachemBiosciences，Inc.(Pphiladepgia，PA)和Accurate Chemical andScientific Corp.(Westbury，NY)获得。
实施例2
关节炎的动物模型
对150-200g的雌性刘易斯大鼠(Charles RiverLaboratories，Inc.，Wilmington，MA)诱导关节炎，n＝4/剂量组。简单地说，将0.5mg悬浮于矿物油(5mg/ml)中的热灭活的丁酸支原体，在第0天，注射入用氯胺酮和甲卞噻嗪麻醉后的大鼠的左后足。使疾病进展21天，根据每日的基准对动物进行称重，以保证其健康状态。根据注射的脚爪明显肿胀、由于全身关节炎的全身进展而使所有未注射的肢体进展性肿胀、以及受影响肢体的X光照片分析，证明所有治疗的动物都患上了关节炎。所有的大鼠在叶酸-FITC施用之前，维持缺乏叶酸的饮食(DYEYS，Inc.，Bethlehem，PA)3周，以便将血清中的叶酸水平降低至生理上相关的浓度。对照大鼠也维持缺乏叶酸的饮食，但不诱导其形成关节炎。
实施例3
内源巨噬细胞的消除
通过用脂质体氯甲双磷酸杀灭内源的巨噬细胞来评价与巨噬细胞无关的叶酸连接的成像剂的摄取。将卵磷脂酰胆碱(60mol％)和胆固醇(40mol％)的簿膜在等渗的氯甲双磷酸溶液(250mg/ml)中再水合，形成了脂质体。然后用10ml热管挤出器(LipexBiomembranes，Vancouver，Canada)将脂质体通过100nm的聚碳酸酯薄膜挤出10次，产生小的单层泡。未包裹的氯甲双磷酸通过Spectrapor300,000 Mr-cutoff醋酸纤维素膜(Spectrum Laboratories，RanchoDomingues，CA)透析除去，并按照J.Microencapsul.3(2)109-14(1986)中所述测定余下的脂质体中氯甲双磷酸的浓度。在诱导关节炎17天之后，成像剂(EC20)的施用3天之前，使指定要耗尽巨噬细胞的大鼠接受单次含有20mg氯甲双磷酸的氯甲双磷酸脂质体的腹膜内注射。
实施例4
闪烁照相和生物分布分析
成像剂施用12小时之前，所有的动物接受5ml正常盐水的皮下注射，以保证未结合的成像剂的适当排泄。诱导关节炎21天后，对大鼠(每组的n＝3)腹膜内注射500μCi(2.3nmol/大鼠)的EC20(叶酸+螯合剂)、EC20+500倍摩尔过量的叶酸，或EC28(无叶酸部分)。4小时以后，大鼠经受核闪烁照相成像或生物分布分析。
为了进行闪烁照相，用氯胺酮和甲卞噻嗪麻醉大鼠，并以腹侧位放在图像采集表面。用Technicare Omega 500 Sigma 410放射性同位素γ照相机以每分钟50-75,000次的计数速度操作1分钟，以采集图像。在采集全身图像后，用1/8”铅板封闭上身(膝盖骨以上)的射线，得到后肢的图像。用装备Medasys TMPinnacle软件的基于MedasysTM MS-DOS的计算机对全部数据进行分析。
对于生物分布的分析，通过腹膜内注射nebutal或戊巴比妥钠使大鼠安乐死。然后收集肝、脾、心、肺、肠和肾，并用γ计数器(PackardBioScience Co.，Meridian，CT)通过计数测定每种组织的放射性。
实施例5
组织的叶酸受体水平的测定
每种组织的叶酸受体水平测定如下。简单地说，将组织均质化并通过离心分离细胞膜。使膜蛋白溶解过夜，然后转移至Microcon-30过滤装置，并用50nM 3H-叶酸温育。用于测定非特异结合的每个样本的2个重复试样同样也暴露于50nM 3H-叶酸治疗，但在1000倍过量的未标记的叶酸存在下进行。将未结合的3H-叶酸通过膜洗去后，回收结合3H-叶酸的膜蛋白，并在闪烁计数器(Packard BioScienceCo.)中计数，以确定每克组织中活性叶酸受体的数量。
实施例6
叶酸受体在肝脏中表达的细胞类型的鉴定
首先用氯胺酮和甲卞噻嗪使患关节炎的和健康的大鼠麻醉，然后从下腹部至胸腔切开中线切口。将24号的导管插入肝静脉，同时将24号的针插入左心室作为灌注液的出口。然后通过导管先输入普通的盐水，随后输入胶原酶A溶液(0.05％的Gey平衡盐溶液)，对大鼠进行灌注。每种溶液以20ml/分的速度灌注2分钟。灌注后，立即将肝取出，除去外层膜组织。剩下的胶状组织悬浮于胶原酶-A溶液(0.025％溶于DMEM的溶液)中，并在1μM叶酸-FITC+1mM叶酸存在下、37℃下温育2小时。然后将细胞洗涤3次以除去未结合的叶酸-FITC，并直接制备用于流式细胞术。
实施例7
流式细胞术的分析样品制备及分析
已暴露于叶酸-FITC的肝细胞制备物用氯化铵裂解缓冲液(150mMNH4Cl，10mM KHCO3，1mM EDTA，pH7.4)4℃下处理10分钟，以裂解红细胞。用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次后，剩余的细胞与用ED2R-藻红蛋白标记的小鼠抗-大鼠巨噬细胞抗体，或RK-4生物素标记的小鼠抗-大鼠粒细胞抗体一起在4℃下温育1小时。将细胞再洗2次，并将已接受生物素化的第一抗体的细胞进一步与链霉抗生物素蛋白-R-藻红蛋白温育30分钟。经过最后2次洗涤后，在FACScan Coulter XL流式细胞分析仪上检查细胞的FITC和藻红蛋白双重染色。
实施例8
免疫疗法介导的抗佐剂诱导的关节炎的保护作用
按照实施例2所述的方案诱导关节炎，研究叶酸-FITC偶联物(叶酸异硫氰酸荧光素偶联物)的抗佐剂诱导的关节炎。在施用丁酸支原体(佐剂)诱导关节炎之前的38和10天，用FITC-KLH(150μg)在用于试验中的每只大鼠的尾基部免疫，诱导抗FITC的抗体。FITC-KLH的免疫联合佐剂一起进行(该佐剂即为，例如TiterMax Gold(150μg)，明矾(150μg)，或GPI(150μg)，这些都是诱导抗FITC抗体的佐剂，与诱导关节炎的佐剂相反)。然后在第0天，在免疫动物的左足底注射0.5mg的热灭活的丁酸支原体(佐剂)，开始诱发关节炎。然后在佐剂(丁酸支原体)注射后第1，2，3，9，11和14天，对大鼠腹膜内注射盐水(对照大鼠)或2000nmole/kg的叶酸FITC(FF)。每天用卡尺测量左足和右足的尺寸。参照图9，将注射佐剂的足的测量值(上面的两条曲线)和未治疗的足(下面的两条曲线)的测量值作图。注射佐剂的足的肿胀突然增加是由于无叶酸受体的中性粒细胞的流入。因此，免疫治疗对脚爪肿胀的状况无影响。但是，约10天之后，活化的巨噬细胞侵袭注射的足和未注射的足，造成骨的降解，并进一步发炎。这些活化的巨噬细胞含有功能性的叶酸受体，并如图所示，通过与例如叶酸-FITC的叶酸半抗原偶联物的结合，可以使该细胞消失或减少。
实施例9
关节炎大鼠的叶酸导向的成像
按照实施例2和4所述方案。如以上所述，活化而不是静息的巨噬细胞表达维生素叶酸的受体。为了测定是否能利用叶酸将99mTc导向关节炎的炎症部位，将叶酸连接的99mTc螯合剂EC20(参见图8)通过腹膜内对大鼠(n＝5/组)施用，并用γ照相机获得闪烁照相的图像。由于EC20的快速清除，施用后至少经过4小时，可以得到良好的对比度(图1)。重要的是，关节炎大鼠的全身摄取明显比健康的大鼠更强，而且，EC20与饱和剂量的游离叶酸一起施用时，该摄取量明显减少。这说明了所有组织的摄取主要由叶酸特异的受体确定。
器官对EC20的强烈摄取防碍了关节炎大鼠全身图像中肢体的显现。但是，将身体中部和上部的放射遮蔽时，很容易获得后肢的图像。利用这样的遮蔽，关节炎的肢体呈现出比健康的肢端更强的EC20摄取，而且这种摄取在过量游离叶酸存在下完全消失(图1)。此外，炎症最严重的关节炎动物的左后足表现出比受影响较轻的右后足更强的摄取(图1)。
由上述的全身图像可以得出以下结论：在关节炎动物中，腹部器官摄取了大部分的EC20。为了证实该估计，将肝、脾和肾取出并分别成像(图2)。关节炎大鼠的肝表现出最高的EC20摄取，而健康大鼠的肝呈现最少的摄取。只有取自关节炎大鼠的脾脏能够显现。游离叶酸完全阻断了EC20在肝、脾脏的摄取，但游离的维生素仅部分地减少肾的摄取。
实施例10
巨噬细胞减少的作用
除了施用0.25mCi的EC20以外，其余按照实施例2、3和4中所述的方案进行。为了测定巨噬细胞是否摄取EC20，采用脂质体氯甲双磷酸制剂全身性消除存在的巨噬细胞(n＝3只大鼠/组)。氯甲双磷酸治疗后4天，对脚爪的大小评价显示氯甲双磷酸治疗的大鼠的炎症明显地比未治疗的大鼠轻(数据未表示)。为了测定巨噬细胞消除是否影响对叶酸连接的成像剂的摄取，对氯甲双磷酸治疗的大鼠进行EC20生物分布的分析，并与健康大鼠和未用氯甲双磷酸治疗的关节炎大鼠的同样分析进行比较。如图3所示(黑色条代表关节炎大鼠，浅灰色条代表健康大鼠，深灰色条代表用氯甲双磷酸治疗减少巨噬细胞的关节炎大鼠)，巨噬细胞的减少，使关节炎大鼠的肝对EC20的摄取降低约20倍，而保留在脾和肠中的EC20减少因数3。在大多数组织中，氯甲双磷酸治疗减少了EC20的摄取，甚至低至在健康大鼠中观察到的水平，证实了活化的巨噬细胞是大多数EC20保留在正常组织中的原因的假设。相反，在巨噬细胞减少的大鼠中，肾对EC20的摄取有提高，最可能的原因是活化的巨噬细胞减少了EC20的内化，提供更多的EC20用于与肾的叶酸受体结合。
实施例11
关节炎组织中叶酸受体介导的EC20的摄取
按照实施例2和4中所述的方案。进行2种补充的生物分布研究，以证实关节炎大鼠的组织对EC20的摄取是由叶酸受体介导的(n＝3只大鼠/组)。首先，在500倍过量的游离叶酸存在(浅灰色条)和不存在(黑色条)的情况下，检查EC20的生物分布。如图4所示，除肾以外，几乎所有的组织都可看到EC20摄取的完全消失，表明该结合确实是由叶酸受体介导的。实际上，过量的叶酸通适竞争将保留在肝、脾、心、肺、肠和血液中的EC20减少至接近本底水平(图4)。其次，为了证实叶酸在EC20介导的螯合的99mTc导向中所起的作用，对缺少叶酸部分的同样复合物(EC28)的生物分布也进行了检查(深灰色条)。仍如图4所显示，除了肾以外，在所有的组织中，EC28的摄取可忽略不计，这种情况下，非导向的复合物的保留类似于竞争的叶酸存在下的EC20的保留。
实施例12
叶酸受体在关节炎大鼠各种组织中的表达
采用实施例2、4和5中所述的方案。由上述的结果提示叶酸受体负责组织对EC20的摄取。为了证实该假定，申请人试图直接对各种大鼠组织中的叶酸结合蛋白进行定量。可以在每种被检查的主要器官中对活性叶酸受体进行检测，关节炎大鼠的FR水平明显增高(图5；黑色条＝关节炎大鼠；浅灰色条＝健康大鼠)。此外，在生物分布的研究中可以看到FR含量与EC20的摄取有很好的相关性。实际上，根据同一种器官对EC20类似的摄取，FR分析显示关节炎大鼠的肝和脾中的受体水平大致相等(图4)。显然，通过氯甲双磷酸治疗消除全身的巨噬细胞(深灰色条)降低了所有关节炎组织中的叶酸受体水平(图5)，该结果也与EC20生物分布的分析非常一致。最后，FR分析证实了关节炎的诱导和氯甲双磷酸的治疗都没有改变在肾或心中的FR水平，可以认为，在肾或心中，FR与活化的巨噬细胞无关。
实施例13
功能性叶酸受体在关节炎大鼠的肝巨噬细胞上的表达
采用实施例2、4、6和7中所述的方案。为了进一步证实关节炎大鼠的肝对EC20摄取量的提高是由于巨噬细胞群所引起的，将胶原酶A灌注的大鼠的肝切除，并用叶酸-FITC作为FR表达的荧光标记，检查其解聚细胞对叶酸偶联物的摄取。还通过用大鼠肝巨噬细胞特异的抗体标记同样的肝悬浮液，有可能表明该巨噬细胞确实是在关节炎动物中表达提高水平的叶酸受体的细胞类型(图6)。由此，流式细胞分析表明，与健康大鼠相比，关节炎大鼠的70％的肝巨噬细胞与叶酸-FITC结合，而健康大鼠与叶酸-FITC结合的肝巨噬细胞为30％(图6)。此外，关节炎巨噬细胞的FITC强度高于健康肝的巨噬细胞。因为叶酸-FITC的结合受到过量游离叶酸(1mM)存在的抑制，我们得出结论：肝巨噬细胞对叶酸偶联物的摄取是由叶酸受体介导的。
我们还采用对粒细胞特异的抗体检查组织浸润的中性粒细胞是否可能摄取叶酸偶联物。虽然在肝脏发现非常少量的中性粒细胞，这些被检测出的中性粒细胞未呈现出结合叶酸-FITC的能力(数据未示出)。对Mac-1+外周血细胞也进行了测试，同样发现没有结合叶酸偶联物的亲和力(数据未示出)。实际上，也不存在分类为FITC荧光阳性的外周血细胞，由此提示，只有存在的组织巨噬细胞(很明显，只有这些细胞的亚群)在肝中表达FR。
最后，为了开始测试是否有可能用叶酸连接的药物在患者体内导向活化的巨噬细胞，我们获得允许检查28位登记参加最近完成的γ成像剂，即111In-DTPA-叶酸临床试验的卵巢癌可疑患者的全身图像。如图7所示，一位患者的右膝呈现明显的成像剂摄取，但左膝无摄取。很明显，没有其他患者显示任何可测出的关节的摄取。根据要求，参与的医生与匿名的患者接触，询问她是否经历任何慢性的关节不适。该医生反映，患者报告为右膝关节炎。
讨论
活化的巨噬细胞被认为与类风湿性关节炎的病理发生密切相关。活化的巨噬细胞通过分泌金属蛋白酶直接破坏关节组织，并通过释放细胞因子吸引/激活其他免疫细胞。关节组织中活化的巨噬细胞的定量可能有诊断价值，因为活化的巨噬细胞含量与人的关节的破坏和不良的疾病预后密切相关。
接受EC20的大鼠的γ照相机闪烁照相表明关节炎的附属部分确实被叶酸导向的99mTc所照亮。相反，不能看见健康大鼠的腿和足，表明成像剂应用于关节炎的选择性。虽然佐剂诱导的关节炎中，内部器官的强度也增加，但来自这种组织的干扰看来并不影响该方法，因为来自内部器官的γ射线很容易屏蔽。在注射EC20后1-2小时之内可获得优良的对比度，该事实进一步表明成像剂的施用、γ照相机闪烁照相、图像的分析可以在同一试验中完成。
在佐剂诱导关节炎的大鼠中，已记载了巨噬细胞的全身活化。因此，在EC20摄取的提高中，巨噬细胞的具体参与是很重要的，因为以前从未在关节炎动物中检查过叶酸导向的成像剂。为此，进行3个实验。首先，采用载有氯甲双磷酸的脂质体全身性消除被处理大鼠的巨噬细胞。不仅引起组织的FR水平大大降低，而且EC20在富含巨噬细胞的器官中的摄取也几乎消除，表明存在的巨噬细胞确实可以解释是FR表达和EC20保留在RES器官内的原因。其次，用胶原酶处理使肝细胞解聚，并评价每个细胞对叶酸偶联物的摄取。如图6所指出，大量被测试为叶酸偶联物的摄取阳性的细胞也分类为巨噬细胞标记ED2的阳性，证实FR确实存在于巨噬细胞上。最后，由于已知其它免疫和髓细胞在佐剂诱导关节炎大鼠的组织中是增高的，可以想象，还有另外的外渗血细胞类型可能参与EC20的摄取。但是，无论是肝侵润的粒细胞，或是循环中的任何血细胞都不呈现任何与叶酸-FITC结合的能力。因此，活化的巨噬细胞看来是关节炎大鼠的器官中使叶酸偶联物内化的主要细胞类型。
令人惊奇的是在健康大鼠中竟发现高达30％的肝巨噬细胞也表达叶酸受体(图6)。因为在静息的滑膜巨噬细胞中未发现功能性的叶酸受体，这就引导人们去推测在健康大鼠的叶酸-FITC结合部分可能也构成活化的群体。两种观察到的结果支持这种假设。第一，健康的组织在受到例如外来抗原的免疫刺激后，也发现有活化的巨噬细胞。由于肝在清除体内外源物质中所起的作用，低水平的存留巨噬细胞的活化看来也不是不合理的。第二，基于局部炎症和全身巨噬细胞的活化的诱导，肝的叶酸-FITC(和EC20)结合群体显著地增加。
由于现已证实了利用叶酸将连接的分子递送至活化的巨噬细胞的能力，叶酸连接的成像剂可以对早期出现或继续进展的类风湿性关节炎进行估计。由于活化的巨噬细胞也可以引起/加重移植物抗宿主疾病、多发性硬化、克隆氏病、溃疡性结肠炎、牛皮癣、骨髓炎，甚至动脉粥样硬化，利用叶酸连接的成像/造影剂可能有助于对这些疾病的诊断/评价。关节炎的关节和肝的活化巨噬细胞表现出对叶酸偶联物的大量摄取，这表明了无论解剖部位如何，巨噬细胞在都可以被有效导向。
实施例14
免疫治疗介导的抗佐剂诱导的关节炎的保护作用
对于图10所示的测定，除了每天施用3000nmol/kg的叶酸-FITC(在第1、2、和3天施用3剂)和利用植入大鼠的腹膜腔的渗透泵递送叶酸-FITC以外，其余按实施例8中所述的方案进行。通过腹膜内注射，将氨甲蝶呤(MTX)按每剂0.15mg的量在施用佐剂后的第1、8、和15天每天注射1次。用MTX代替叶酸FITC，用于MTX治疗的动物。图10给出左脚爪(注射的)和右脚爪(未注射的)的结果。该结果表明叶酸-FITC(FF)以及MTX抑制佐剂诱导的关节炎。
实施例15
免疫治疗介导的抗佐剂诱导的关节炎的保护作用
除了只测量右脚爪的体积，以及叶酸-FITC按3000、600、和120nmol/kg的剂量(图11)施用之外，其余按照实施例14中所述的方案进行。FF还按3000nmol/kg如实施例14所述以3剂(在图11表示为“3剂”)施用，或如实施例8中所述在1、2、3、9、11、和14天(在图11中表示为FF3000)施用。结果表明，FF抑制在关节炎大鼠右脚爪的佐剂诱导的关节炎(由于关节炎的全身进展，假定炎症出现在未注射的右脚爪)，对于佐剂诱导的关节炎的治疗，用FF的延长治疗方式比3次初始剂量更有效。
实施例16
免疫治疗介导的抗佐剂诱导的关节炎的保护作用
除了用MTX代替FF按0.15mg的剂量(FF+低剂量、早期MTX、晚期MTX和晚期FFMTX)治疗某些动物之外，其余按照实施例8中所述的方案进行(图12)。其他动物用0.75mg MTX(FF+中剂量)或1.5mg MTX(FF+高剂量)治疗。对于“早期MTX”治疗，在诱导关节炎后1、8、和15天对大鼠注射MTX。对于“晚期MTX治疗”，在佐剂施用后8和15天对大鼠注射MTX。所有的测量都是对未注射的右脚爪进行。结果表明，叶酸-FITC与MTX的联合(早期或后期治疗，以及低、中、高剂量的MTX)对佐剂诱导的关节炎的抑制比单独用FF更好。
实施例17
免疫治疗介导的抗佐剂诱导的关节炎的保护作用
对于图13所示的结果，除了对某些动物在关节炎诱导后1、8和15天单独用MTX(0.15mg)治疗，或如实施例14中所述，用MTX(0.15mg；1、8、和15天)与FF联合治疗以外，其余按照实施例8中所述的方案进行。结果表明，FF和MTX的联合对佐剂诱导的关节炎的抑制程度高于单独使用MTX或FF。
实施例18
免疫治疗介导的抗佐剂诱导的关节炎的保护作用
除了将IL-10(10,000U；FF10)或IL-2(3μg/kg；FF2)与用FF治疗一起施用(即将该细胞因子在佐剂施用后1、2、3、9、11和14天通过腹膜内注射施用；参见图14)以外，其余按照实施例8中所述方案进行。对未注射的右脚爪进测量。结果表明IL-10或IL-2阻止了由FF治疗引起的对佐剂诱导的关节炎的抑制。将上述所有的免疫治疗结果一并考虑，表明对巨噬细胞有细胞毒性的叶酸连接剂可以用于治疗巨噬细胞介导的疾病状况。
实施例19
关节炎大鼠的叶酸导向的图像
对于图15所示的分析结果，除了某些动物分别如在实施例8和14中所述用FF(2000nmol/kg；1、2、3、9、11和14天)或MTX(0.15mg；1、8和15天)治疗以外，其余按照实施例2和4中所述的方案进行。结果表明，除肾以外，FF或MTX阻止了在所有被检查的器官中对EC20的摄取。在肾组织中，所检测的EC20增加的原因有可能是大多数器官对EC20摄取的减少提供了更多的EC20通过肾排泄。