一种治疗2型糖尿病的基因工程干细胞.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201410388700.2

申请日:

2014.08.09

公开号:

CN104164451A

公开日:

2014.11.26

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 15/864申请公布日:20141126|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/864申请日:20140809|||公开

IPC分类号:

C12N15/864; C12N5/10; C12N5/0775(2010.01)I; A61K48/00; A61P3/10

主分类号:

C12N15/864

申请人:

高连如

发明人:

高连如; 张宁坤; 杨晔; 朱智明

地址:

100048 北京市海淀区阜成路6号海军总医院心脏中心

优先权:

专利代理机构:

北京知本村知识产权代理事务所 11039

代理人:

周自清

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内容摘要

一种基因工程干细胞,它是选用betatrophin基因cDNA质粒,应用腺相关病毒AAV6载体携带,转导入间充质干细胞,使之过表达betatrophin分子,即为betatrophin基因工程干细胞,可静脉输入人体,用于治疗2型糖尿病,既调控刺激内源胰岛ß细胞增殖,恢复衰竭的ß细胞功能,还发挥干细胞的旁/自分泌的免疫调节及改善胰岛素抵抗作用,根本改善2型糖尿病患者的预后。

权利要求书

1.  一种基因工程干细胞,可静脉输入人体,用于对2型糖尿病的治疗,其特征在于,它是按以下方法制作的:首先合成betatrophin基因cDNA质粒,构建腺相关病毒AAV6载体,应用AAV6载体携带betatrophin基因,然后将AAV6-betatrophin基因转导入间充质干细胞,使之过表达betatrophin分子,即为betatrophin 基因工程干细胞。

2.
  根据权利要求1所述的基因工程干细胞,其特征在于,制备该基因工程干细胞所使用的间充质干细胞为骨髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞或任何一种成体间充质干细胞。

3.
  根据权利要求1所述的基因工程干细胞,其特征在于,制备该基因工程干细胞所使用的间充质干细胞为新生儿脐带、脐血、胎盘来源的间充质干细胞或任何一种胚外来源的间充质干细胞。

4.
  根据权利要求3所述的基因工程干细胞,其特征在于,制备该基因工程干细胞所使用的间充质干细胞为脐带华通胶源间充质干细胞。

5.
  根据权利要求4所述的基因工程干细胞,其特征在于,所述脐带华通胶源间充质干细胞是按以下方法制作的:取人新鲜脐带,以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液,去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜,剥离华通胶并剪切成小块,再以等渗的平衡盐溶液或无血清培养液冲洗后,浸泡于0.05-0.3%胶原酶溶液中,置于35-37.5℃温箱中10-30小时,组织块消化,液体呈粘稠状,然后加入相当于原液1-10倍量的含胎牛血清的培养基终止消化,分装于培养瓶或培养皿,置CO2培养箱,待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液,以后每隔2-4天换液一次,细胞贴壁融合后传代培养;传代培养2-4代,即时使用或冷冻保存备用。

6.
  根据权利要求5所述的基因工程干细胞,其特征在于,将AAV6-betatrophin cDNA转染入脐带华通胶源间充质干细胞的方法为:收集第二代或第三代间充质干细胞,计数后使用无血清细胞培养基稀释,间充质干细胞浓度为2×105细胞/毫升,在75cm2的培养瓶中,加入10毫升间充质干细胞悬液充分混匀,放置于37℃、饱和湿度、含5%CO2的细胞培养箱中培养;贴壁细胞达到60%~80%融合时,弃培养瓶中的培养基,加入10毫升AAV6-betatrophin cDNA转染培养基,AAV6-betatrophin cDNA转染培养基的成份是无血清培养基,其中AAV6-betatrophin cDNA含量为2.68×1010vg/毫升,含Etoposide 浓度为2μM;间充质干细胞在AAV6-betatrophin cDNA转染培养基中培养48小时后,吸弃AAV6-betatrophin cDNA转染培养基,加入磷酸盐缓冲液轻洗间充质干细胞两遍后,加入4毫升0.125%胰蛋白酶消化1~2分钟,显微镜下观察转染AAV6-betatrophin cDNA后的间充质干细胞完全脱离培养瓶底,加入200微升人血清混匀中和胰蛋白酶,将AAV6-betatrophin-间充质干细胞悬液移入50毫升离心管中,以1500r/min速度离心10分钟后弃上清,用生理盐水再稀释AAV6-betatrophin-间充质干细胞,再以1500r/min速度离心10分钟后弃上清洗涤2遍,用生理盐水再稀释AAV6-betatrophin-间充质干细胞至2ml。

说明书

一种治疗2型糖尿病的基因工程干细胞
技术领域
本发明涉及医用生物材料及其制备方法,特别涉及用于治疗2型糖尿病的基因工程干细胞及其制备方法。
背景技术
糖尿病是严重危害人类健康的疾病,在糖尿病患者中90-95%是2型糖尿病。2型糖尿病的发病机制是由于胰岛?细胞对胰岛素抵抗的长期代偿,导致?细胞功能毁损,?细胞去分化、凋亡与丢失,以至最终不可逆的胰岛?细胞功能衰竭及细胞数量锐减。重建内源功能胰岛?细胞是治愈糖尿病的唯一途径。
近年来细胞生物学研究的一个重要发现是,新的?细胞产生都是来自于内源?细胞的自我复制,并不是来源于胰岛残存的前体细胞,说明胰岛?细胞还保留有潜在的自我复制及增殖能力,并且是在机体复杂内环境中精密的调控的。有报道称,胰岛素、促黄体素、催产素、肝细胞生长因子、肠促胰岛素-1(GLP-1)、葡萄糖依赖促胰岛素肽(GIP)等对?细胞增殖及胰岛素分泌有调控作用,但最近的研究证椐表明,这些激素并不能特异的,强有力的调控胰岛?细胞增殖。
2013年5月美国哈佛大学Peng Yi等发现了一个对胰岛?细胞具有高度特异调控作用的因子,称之为“Betatrophin”。所述betatrophin基因系正常人体19号染色体上的一个基因,由597个碱基构成,如下序列:
ATGCCAGTGCCTGCTCTGTGCCTGCTCTGGGCCCTGGCAATGGTGACCCGGCCTGCCTCAGCGGCCCCCATGGGCGGCCCAGAACTGGCACAGCATGAGGAGCTGACCCTGCTCTTCCATGGGACCCTGCAGCTGGGCCAGGCCCTCAACGGTGTGTACAGGACCACGGAGGGACGGCTGACAAAGGCCAGGAACAGCCTGGGTCTCTATGGCCGCACAATAGAACTCCTGGGGCAGGAGGTCAGCCGGGGCCGGGATGCAGCCCAGGAACTTCGGGCAAGCCTGTTGGAGACTCAGATGGAGGAGGATATTCTGCAGCTGCAGGCAGAGGCCACAGCTGAGGTGCTGGGGGAGGTGGCCCAGGCACAGAAGGTGCTACGGGACAGCGTGCAGCGGCTAGAAGTCCAGCTGAGGAGCGCCTGGCTGGGCCCTGCCTACCGAGAATTTGAGGTCTTAAAGGCTCACGCTGACAAGCAGAGCCACATCCTATGGGCCCTCACAGGCCACGTGCAGCGGCAGAGGCGGGAGATGGTGGCACAGCAGCATCGGCTGCGACAGATCCAGGAGAGACTCCACACAGCGGCGCTCCCAGCCTGA
Betatrophin是编码198个氨基酸的活性肽,其氨基酸序列如下:
MPVPALCLLWALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA
Betatrophin高度保守存在于哺乳类动物,作为分泌蛋白,betatrophin已在其转染的293细胞(实验用细胞)上清液及betatrophin基因过表达的小鼠血浆中检出。人类betatrophin主要在肝脏表达。当应用定量PCR分析时,在胰岛素受体拮抗剂S961诱导胰岛素抵抗小鼠模型上,发现肝脏betatrophin上调6倍,白脂肪组织中上调4倍,均伴有胰岛?细胞明显增殖。当把betatrophin基因在小鼠上过表达,与无基因转染对照组小鼠相比,胰岛?细胞增殖率高达17倍,最高可达33倍。进一步,应用葡萄糖激发胰岛素释放试验(GSIS)、葡萄糖耐量试验证实了这些增殖的胰岛?细胞具有正常调控糖代谢功能。
此外,发明人在对脐带华通胶源间充质干细胞(Wharton’jelly mesenchymal stem cells, WJMSCs)的研究中发现,给予2型糖尿病患者静脉或胰背动脉输入脐带华通胶源间充质干细胞,可部分改善高血糖症状。分析认为,是华通胶源间充质干细胞的旁/自分泌效应,调节了机体免疫功能,部分改善了胰岛素抵抗及敏感性,从而部分改善了高血糖症状,但并没有解决2型糖尿病功能?细胞缺乏的本质问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,应用基因工程方法制备一种干细胞,将该干细胞输入人体后能够调控胰岛?细胞增殖,恢复濒于衰竭的?细胞功能,改善2型糖尿病患者的病情和预后。
本发明一种治疗2型糖尿病的干细胞是按以下方法制备的:首先合成betatrophin基因cDNA质粒,构建腺相关病毒AAV6载体,应用AAV6载体携带betatrophin基因,然后将AAV6-Betatrophin基因转导入人间充质干细胞,使之过表达betatrophin分子,即为betatrophin基因工程干细胞,或称betatrophin基因修饰干细胞,可静脉输入人体,用以调控胰岛?细胞增殖,恢复濒于衰竭的?细胞功能。
所述人间充质干细胞可以是任何一种成体间充质干细胞,如骨髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞;也可以是任何一种胚外来源的间充质干细胞,如新生儿脐带、脐血、胎盘等来源的间充质干细胞;而其中优选脐带华通胶源间充质干细胞。
本发明所称“Betatrophin基因工程干细胞”英文名称为“Betatrophin Gene Engineering Stem Cells”。
制备Betatrophin基因工程干细胞的工艺流程如下:
(1)合成Betatrophin cDNA质粒;
(2)载体选择与构建:选择腺相关病毒载体AAV6;
(3)构建AAV6-betatrophin:检测表达效率;
(4)制备间充质干细胞:按当代医学界公知的方法制备成体间充质干细胞或胚外来源的间充质干细胞。其中脐带华通胶来源的间充质干细胞按本发明人的ZL200910157731.6号中国专利方法制备;
(5)将AAV6-betatrophin cDNA转染入脐带华通胶源间充质干细胞的方法为:收集第二代或第三代间充质干细胞,计数后使用无血清细胞培养基稀释,间充质干细胞浓度为2×105细胞/毫升,在75cm2的培养瓶中,加入10毫升间充质干细胞悬液充分混匀,放置于37℃、饱和湿度、含5%CO2的细胞培养箱中培养。贴壁细胞达到60%~80%融合时,弃培养瓶中的培养基,加入10毫升AAV6-betatrophin cDNA转染培养基,AAV6-betatrophin cDNA转染培养基的成份是无血清培养基,其中AAV6-betatrophin cDNA含量为2.68×1010vg/毫升,含Etoposide 浓度为2μM。间充质干细胞在AAV6-betatrophin cDNA转染培养基中培养48小时后,吸弃AAV6-betatrophin cDNA转染培养基,加入磷酸盐缓冲液轻洗间充质干细胞两遍后,加入4毫升0.125%胰蛋白酶消化1~2分钟,显微镜下观察转染AAV6-betatrophin cDNA后的间充质干细胞完全脱离培养瓶底,加入200微升人血清混匀中和胰蛋白酶,将AAV6-betatrophin-间充质干细胞悬液移入50毫升离心管中,以1500r/min速度离心10分钟后弃上清,用生理盐水再稀释AAV6-betatrophin-间充质干细胞,再以1500r/min速度离心10分钟后弃上清洗涤2遍,用生理盐水再稀释AAV6-betatrophin-间充质干细胞至2ml。
按本发明方法制得的AAV6-betatrophin-间充质干细胞经静脉注射输入。同时准备未经转染的纯化间充质干细胞1×107,用生理盐水稀释至2ml,同时进行静脉推注。适应症为按1999年世界卫生组织规定标准确诊的2型糖尿病患者。
本发明将betatrophin基因转导入间充质干细胞,构建betatrophin基因工程干细胞,借助干细胞作为载体使betatrophin在体内长期表达。Betatrophin基因具有特异调控胰岛?细胞自我增殖功能,干细胞具有旁分泌、自分泌效应、靶病变归巢效应,表达大量生长因子、细胞因子及特异的干细胞趋化因子。Betatrophin基因与干细胞两方面联合,共同作用于2型糖尿病,既干预靶点调控刺激内源胰岛?细胞增殖,恢复衰竭的?细胞功能,同时发挥干细胞的旁/自分泌的免疫调节作用,两者结合,有望取代胰岛素每日注射,根本改善糖尿病患者的预后。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1  制备脐带华通胶来源的间充质干细胞
按ZL200910157731.6号中国专利记载的方法制备脐带华通胶来源的间充质干细胞。具体方法为:取人新鲜脐带,以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液,去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜,剥离华通胶并剪切成小块,再以等渗的平衡盐溶液或无血清培养液冲洗后,浸泡于0.05-0.3%胶原酶溶液中,置于35-37.5℃温箱中10-30小时,组织块消化,液体呈粘稠状,然后加入相当于原液1-10倍量的含胎牛血清的培养基终止消化,分装于培养瓶或培养皿,置CO2培养箱,待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液,以后每隔2-4天换液一次,细胞贴壁融合后传代培养;传代培养2~4代,即时使用或冷冻保存备用。
所称“脐带华通胶来源的原始间充质干细胞”在生物学表型鉴定中,具有以下技术特征:① 在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿生长;②表达CD90、CD105、CD44;HLA-ABC;不表达CD45、CD34, HLA-DR;③体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。本发明方法所用UW-MSCs细胞移植材料,可以即时使用刚刚完成传代培养2-4代的UW-MSCs新鲜品,也可以使用冷冻保存的传2-4代UW-MSCs备用品。
实施例2  将AAV6-betatrophin cDNA转染入WJMSCs,制备AAV6- betatrophin-WJMSCs
收集第二代或第三代的脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs),计数后使用完全细胞培养液稀释,WJMSCs浓度为2×105细胞/毫升,在75cm2的培养瓶中,加入10毫升WJMSCs悬液充分混匀,放置于37℃、饱和湿度、含5%CO2的细胞培养箱中培养。贴壁细胞达到60%~80%融合时,弃培养瓶中的培养基,加入10毫升AAV6-betatrophin cDNA转染培养基,培养48小时后,吸弃AAV6-betatrophin cDNA转染培养基,加入磷酸盐缓冲液轻洗WJMSCs两遍后,加入4毫升0.125%胰蛋白酶消化1~2分钟,显微镜下观察转染后的脐带华通胶源间充质干细胞完全脱离培养瓶底后,加入2毫升含10%血清的培养基和胰蛋白酶,将AAV6-betatrophin-WJMSCs悬液移入50毫升离心管中,以速度1500r/min离心10min后弃上清,用生理盐水稀释AAV6-betatrophin-WJMSCs至0.5ml,进行静脉推注。本实施例所述剂量为一只大鼠应用量。
上述完全细胞培养液的成分为:8%~10%小牛血清,90%~92%DMEM-F12培养基。
上述AAV6-betatrophin cDNA转染培养基的成份为:AAV6-betatrophin cDNA含量为2.68×1010vg/毫升、8%~10%小牛血清,90%-92% DMEM-F12培养基,含Etoposide浓度为2μM。
实施例3  Betatrophin基因工程干细胞治疗2型糖尿病有效性及安全性实验观察
以大鼠为实验动物,按下述步骤进行实验观察。
① 合成betatrophin cDNA质粒;
② 构建AAV6-betatrophin;
③ 按实施例1方法制备三代WJMSCs;
④ 按实施例2方法制备AAV6-betatrophin-WJMSCs,备用;
⑤ 建立大鼠2型糖尿病模型:以高脂高糖饲料喂养另加小剂量左链菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠2型糖尿病模型。高脂高糖饲料成分为:猪油18%、蔗糖20%、蛋黄3%、基础饲料59%。高糖高脂饲料喂养2个月的大鼠诱发出胰岛素抵抗,禁食12小时,腹腔注射STZ,STZ剂量为30mg/kg。STZ 注射5d后测定尾静脉随机血糖,随机血糖>16.7mmol/L者为2型糖尿病造模成功;
⑥ 随机分组:a.经鼠尾静脉注射试验品AAV6-betatrophin-WJMSCs;b.对照品WJMSCs-AAV6-EGFP(绿色荧光蛋白基因);注射量为:每只大鼠WJMSCs-AAV6-betatrophin 2×1011或WJMSCs-AAV6-EGFP 2×1011
⑦ 随访观察:观测项目包括每日二次血糖测定,定期血浆胰岛素、C肽、血脂测定,糖耐量试验,短时效胰岛素耐量试验(ITT):胰岛素释放试验(IRTs),胰岛素敏感指数(ISI)测定;
⑧ 观察betatrophin-WMSCs移植后的安全性,动态观察血CD3,CD4,IgG,IgM等T、B细胞功能变化,进行致肿瘤性相关检查;
⑨ 分别在满一个月、满两个月时各处死一批大鼠,进行以下检查:a.免疫荧光检测:胰腺、肝、白脂肪组织免疫荧光染色,应用抗Myc-DDK抗体观察betatrophin表达水平,应用Ki67抗体观察胰岛 ?细胞分裂增殖状态,应用抗胰岛素抗体行胰岛?细胞成熟鉴定,应用共聚焦显微镜双标抗体鉴定2型糖尿病经betatrophin-WMSCs移植后胰岛?细胞增殖率;b.组织病理检测:胰腺、肝、脂肪进行HE染色病理组织检查;c.胰腺、肝、脂肪组织免疫组织 检测betatrophin、胰岛素、C肽水平。
结果:大鼠经高脂高糖饮食1.5月后,较基础饲养前体重平均增加1.4±0.3倍,血糖较前增加33.6±4.1%,血脂较前增加18.2±3.8%,经STZ诱导后96%大鼠都出现了典型2型糖尿病特征,平均随机血糖25.6±4.8 mmol/L;血清胰岛素平均3.1±0.3mU/L;血清C肽平均0.43±0.1;而经WJMSCs-AAV6-betatrophin cDNA移植后,3天血糖开始下降,7天血糖下降到移植前水平2/3-1/2,14天后血糖基本稳定在随机血糖8.1-11.3 mmol/L,偶有波动;移植后前7天胰岛素用量逐渐减少,7-14天间断应用,14天后基本停用胰岛素,偶尔个例血糖波动曾加用普通胰岛素1ul;血清胰岛素升至平均7.0±0.6 mU/L;血清C肽平均1.3±0.4;而对照组血糖持续在25-33 mmol/L,血清C肽0.26±0.1;每日外源补充人胰岛素30R,1/2死于一周内,1月存活仅1/5。
实施例4  体内对比观察betatrophin基因工程干细胞,或单独betatrophin基因静脉输入有效性与安全性对比
80只Wester大鼠,63只成功诱导成2型糖尿病模型,另设8只空白健康对照,63只2型糖尿病大鼠按治疗随机分为:①单独细胞组,给予WJMSCs-AAV6-EGFP;②基因工程干细胞组,给予WJMSCs-AAV6-betatrophin;③单独基因组,给予AAV6-betatrophin;④对照组,给予AAV6-EGFP。每组12只大鼠,分批存活1个月、2个月,全部按实施例3所列技术指标观察。
本实验目的是为了鉴定直接注射AAV6-betatrophin是否可达到上述WJMSCs-AAV6-betatrophin同样效果,故本组增加单独AAV6-betatrophin及对照AAV6-EGFP;并与原WJMSCs-AAV6-betatrophin及WJMSCs-AAV6-EGFP实验组对比观察对2型糖尿病的治疗效果。
结果:在WJMSCs-AAV6-betatrophin及WJMSCs-AAV6-EGFP组发现上述类似实验结果,但直接基因注射(AAV6-betatrophin)结果显示:2型糖尿病大鼠经鼠尾静脉注射AAV6-betatrophin后,5天内血糖未下降,需持续外源补充胰岛素,但6天后血糖有下降趋势,胰岛素用量逐渐减少,14天随机血糖水平为13.6±3.2mmol/L,至20天逐渐下降到随机血糖9.2-11.6mmol/L,30天保持稳定。而个别大鼠血糖始终未降,分折可能与注射方法不当等因素有关。
综上发现表明:WJMSCs联合betatrophin,由于借助WJMSCs的旁/自分泌效应,显示WJMSCs-AAV6-betatrophin对于胰岛?细胞及其介导的糖代谢效应显著优于单独AAV6-betatrophin注射。

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1、10申请公布号CN104164451A43申请公布日20141126CN104164451A21申请号201410388700222申请日20140809C12N15/864200601C12N5/10200601C12N5/0775201001A61K48/00200601A61P3/1020060171申请人高连如地址100048北京市海淀区阜成路6号海军总医院心脏中心72发明人高连如张宁坤杨晔朱智明74专利代理机构北京知本村知识产权代理事务所11039代理人周自清54发明名称一种治疗2型糖尿病的基因工程干细胞57摘要一种基因工程干细胞,它是选用BETATROPHIN基因CDNA质粒,应用。

2、腺相关病毒AAV6载体携带,转导入间充质干细胞,使之过表达BETATROPHIN分子,即为BETATROPHIN基因工程干细胞,可静脉输入人体,用于治疗2型糖尿病,既调控刺激内源胰岛细胞增殖,恢复衰竭的细胞功能,还发挥干细胞的旁/自分泌的免疫调节及改善胰岛素抵抗作用,根本改善2型糖尿病患者的预后。51INTCL权利要求书1页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN104164451ACN104164451A1/1页21一种基因工程干细胞,可静脉输入人体,用于对2型糖尿病的治疗,其特征在于,它是按以下方法制作的首先合成BETATROPH。

3、IN基因CDNA质粒,构建腺相关病毒AAV6载体,应用AAV6载体携带BETATROPHIN基因,然后将AAV6BETATROPHIN基因转导入间充质干细胞,使之过表达BETATROPHIN分子,即为BETATROPHIN基因工程干细胞。2根据权利要求1所述的基因工程干细胞,其特征在于,制备该基因工程干细胞所使用的间充质干细胞为骨髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞或任何一种成体间充质干细胞。3根据权利要求1所述的基因工程干细胞,其特征在于,制备该基因工程干细胞所使用的间充质干细胞为新生儿脐带、脐血、胎盘来源的间充质干细胞或任何一种胚外来源的间充质干细胞。4根据权利要求3所述的基因工程干细胞,。

4、其特征在于,制备该基因工程干细胞所使用的间充质干细胞为脐带华通胶源间充质干细胞。5根据权利要求4所述的基因工程干细胞,其特征在于,所述脐带华通胶源间充质干细胞是按以下方法制作的取人新鲜脐带,以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液,去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜,剥离华通胶并剪切成小块,再以等渗的平衡盐溶液或无血清培养液冲洗后,浸泡于00503胶原酶溶液中,置于35375温箱中1030小时,组织块消化,液体呈粘稠状,然后加入相当于原液110倍量的含胎牛血清的培养基终止消化,分装于培养瓶或培养皿,置CO2培养箱,待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液,以后每隔24天换液一次,细胞贴壁融合后。

5、传代培养;传代培养24代,即时使用或冷冻保存备用。6根据权利要求5所述的基因工程干细胞,其特征在于,将AAV6BETATROPHINCDNA转染入脐带华通胶源间充质干细胞的方法为收集第二代或第三代间充质干细胞,计数后使用无血清细胞培养基稀释,间充质干细胞浓度为2105细胞/毫升,在75CM2的培养瓶中,加入10毫升间充质干细胞悬液充分混匀,放置于37、饱和湿度、含5CO2的细胞培养箱中培养;贴壁细胞达到6080融合时,弃培养瓶中的培养基,加入10毫升AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基,AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基的成份是无血清培养基,其中AAV6BETATRO。

6、PHINCDNA含量为2681010VG/毫升,含ETOPOSIDE浓度为2M;间充质干细胞在AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基中培养48小时后,吸弃AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基,加入磷酸盐缓冲液轻洗间充质干细胞两遍后,加入4毫升0125胰蛋白酶消化12分钟,显微镜下观察转染AAV6BETATROPHINCDNA后的间充质干细胞完全脱离培养瓶底,加入200微升人血清混匀中和胰蛋白酶,将AAV6BETATROPHIN间充质干细胞悬液移入50毫升离心管中,以1500R/MIN速度离心10分钟后弃上清,用生理盐水再稀释AAV6BETATROPHIN间充质干细胞,再以。

7、1500R/MIN速度离心10分钟后弃上清洗涤2遍,用生理盐水再稀释AAV6BETATROPHIN间充质干细胞至2ML。权利要求书CN104164451A1/5页3一种治疗2型糖尿病的基因工程干细胞技术领域0001本发明涉及医用生物材料及其制备方法,特别涉及用于治疗2型糖尿病的基因工程干细胞及其制备方法。背景技术0002糖尿病是严重危害人类健康的疾病,在糖尿病患者中9095是2型糖尿病。2型糖尿病的发病机制是由于胰岛细胞对胰岛素抵抗的长期代偿,导致细胞功能毁损,细胞去分化、凋亡与丢失,以至最终不可逆的胰岛细胞功能衰竭及细胞数量锐减。重建内源功能胰岛细胞是治愈糖尿病的唯一途径。0003近年来细胞。

8、生物学研究的一个重要发现是,新的细胞产生都是来自于内源细胞的自我复制,并不是来源于胰岛残存的前体细胞,说明胰岛细胞还保留有潜在的自我复制及增殖能力,并且是在机体复杂内环境中精密的调控的。有报道称,胰岛素、促黄体素、催产素、肝细胞生长因子、肠促胰岛素1(GLP1)、葡萄糖依赖促胰岛素肽(GIP)等对细胞增殖及胰岛素分泌有调控作用,但最近的研究证椐表明,这些激素并不能特异的,强有力的调控胰岛细胞增殖。00042013年5月美国哈佛大学PENGYI等发现了一个对胰岛细胞具有高度特异调控作用的因子,称之为“BETATROPHIN”。所述BETATROPHIN基因系正常人体19号染色体上的一个基因,由5。

9、97个碱基构成,如下序列ATGCCAGTGCCTGCTCTGTGCCTGCTCTGGGCCCTGGCAATGGTGACCCGGCCTGCCTCAGCGGCCCCCATGGGCGGCCCAGAACTGGCACAGCATGAGGAGCTGACCCTGCTCTTCCATGGGACCCTGCAGCTGGGCCAGGCCCTCAACGGTGTGTACAGGACCACGGAGGGACGGCTGACAAAGGCCAGGAACAGCCTGGGTCTCTATGGCCGCACAATAGAACTCCTGGGGCAGGAGGTCAGCCGGGGCCGGGATGCAGCCCAGGAACTTCGGGCAAGCCTGTTG。

10、GAGACTCAGATGGAGGAGGATATTCTGCAGCTGCAGGCAGAGGCCACAGCTGAGGTGCTGGGGGAGGTGGCCCAGGCACAGAAGGTGCTACGGGACAGCGTGCAGCGGCTAGAAGTCCAGCTGAGGAGCGCCTGGCTGGGCCCTGCCTACCGAGAATTTGAGGTCTTAAAGGCTCACGCTGACAAGCAGAGCCACATCCTATGGGCCCTCACAGGCCACGTGCAGCGGCAGAGGCGGGAGATGGTGGCACAGCAGCATCGGCTGCGACAGATCCAGGAGAGACTCCACACAGCGGCGCTC。

11、CCAGCCTGABETATROPHIN是编码198个氨基酸的活性肽,其氨基酸序列如下MPVPALCLLWALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPABETATROPHIN高度保守存在于哺乳类动物,作为分泌蛋白,BETATROPHIN已在其转染的293细胞实验用细胞上。

12、清液及BETATROPHIN基因过表达的小鼠血浆中检出。人类BETATROPHIN主要在肝脏表达。当应用定量PCR分析时,在胰岛素受体拮抗剂S961诱导胰岛素抵抗小鼠模型上,发现肝脏BETATROPHIN上调6倍,白脂肪组织中上调4倍,均伴有胰岛细胞明显增殖。当把BETATROPHIN基因在小鼠上过表达,与无基因转染对照组小鼠相比,胰岛细胞增殖率高达17倍,最高可达33倍。进一步,应用葡萄糖激发胰岛素释放试说明书CN104164451A2/5页4验GSIS、葡萄糖耐量试验证实了这些增殖的胰岛细胞具有正常调控糖代谢功能。0005此外,发明人在对脐带华通胶源间充质干细胞(WHARTONJELLYM。

13、ESENCHYMALSTEMCELLS,WJMSCS)的研究中发现,给予2型糖尿病患者静脉或胰背动脉输入脐带华通胶源间充质干细胞,可部分改善高血糖症状。分析认为,是华通胶源间充质干细胞的旁/自分泌效应,调节了机体免疫功能,部分改善了胰岛素抵抗及敏感性,从而部分改善了高血糖症状,但并没有解决2型糖尿病功能细胞缺乏的本质问题。发明内容0006本发明要解决的技术问题是,应用基因工程方法制备一种干细胞,将该干细胞输入人体后能够调控胰岛细胞增殖,恢复濒于衰竭的细胞功能,改善2型糖尿病患者的病情和预后。0007本发明一种治疗2型糖尿病的干细胞是按以下方法制备的首先合成BETATROPHIN基因CDNA质粒。

14、,构建腺相关病毒AAV6载体,应用AAV6载体携带BETATROPHIN基因,然后将AAV6BETATROPHIN基因转导入人间充质干细胞,使之过表达BETATROPHIN分子,即为BETATROPHIN基因工程干细胞,或称BETATROPHIN基因修饰干细胞,可静脉输入人体,用以调控胰岛细胞增殖,恢复濒于衰竭的细胞功能。0008所述人间充质干细胞可以是任何一种成体间充质干细胞,如骨髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞;也可以是任何一种胚外来源的间充质干细胞,如新生儿脐带、脐血、胎盘等来源的间充质干细胞;而其中优选脐带华通胶源间充质干细胞。0009本发明所称“BETATROPHIN基因工程干细。

15、胞”英文名称为“BETATROPHINGENEENGINEERINGSTEMCELLS”。0010制备BETATROPHIN基因工程干细胞的工艺流程如下(1)合成BETATROPHINCDNA质粒;(2)载体选择与构建选择腺相关病毒载体AAV6;(3)构建AAV6BETATROPHIN检测表达效率;(4)制备间充质干细胞按当代医学界公知的方法制备成体间充质干细胞或胚外来源的间充质干细胞。其中脐带华通胶来源的间充质干细胞按本发明人的ZL2009101577316号中国专利方法制备;(5)将AAV6BETATROPHINCDNA转染入脐带华通胶源间充质干细胞的方法为收集第二代或第三代间充质干细胞,。

16、计数后使用无血清细胞培养基稀释,间充质干细胞浓度为2105细胞/毫升,在75CM2的培养瓶中,加入10毫升间充质干细胞悬液充分混匀,放置于37、饱和湿度、含5CO2的细胞培养箱中培养。贴壁细胞达到6080融合时,弃培养瓶中的培养基,加入10毫升AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基,AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基的成份是无血清培养基,其中AAV6BETATROPHINCDNA含量为2681010VG/毫升,含ETOPOSIDE浓度为2M。间充质干细胞在AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基中培养48小时后,吸弃AAV6BETATROPHINCDNA转染培养。

17、基,加入磷酸盐缓冲液轻洗间充质干细胞两遍后,加入4毫升0125胰蛋白酶消化12分钟,显微镜下观察转染AAV6BETATROPHINCDNA后的间充质干细胞完全脱离培养瓶底,加入200微升人血清混匀中和胰蛋白酶,将AAV6BETATROPHIN间充质干细胞悬液移入50毫升离心管中,以1500R/说明书CN104164451A3/5页5MIN速度离心10分钟后弃上清,用生理盐水再稀释AAV6BETATROPHIN间充质干细胞,再以1500R/MIN速度离心10分钟后弃上清洗涤2遍,用生理盐水再稀释AAV6BETATROPHIN间充质干细胞至2ML。0011按本发明方法制得的AAV6BETATROP。

18、HIN间充质干细胞经静脉注射输入。同时准备未经转染的纯化间充质干细胞1107,用生理盐水稀释至2ML,同时进行静脉推注。适应症为按1999年世界卫生组织规定标准确诊的2型糖尿病患者。0012本发明将BETATROPHIN基因转导入间充质干细胞,构建BETATROPHIN基因工程干细胞,借助干细胞作为载体使BETATROPHIN在体内长期表达。BETATROPHIN基因具有特异调控胰岛细胞自我增殖功能,干细胞具有旁分泌、自分泌效应、靶病变归巢效应,表达大量生长因子、细胞因子及特异的干细胞趋化因子。BETATROPHIN基因与干细胞两方面联合,共同作用于2型糖尿病,既干预靶点调控刺激内源胰岛细胞增。

19、殖,恢复衰竭的细胞功能,同时发挥干细胞的旁/自分泌的免疫调节作用,两者结合,有望取代胰岛素每日注射,根本改善糖尿病患者的预后。具体实施方式0013以下通过实施例对本发明作进一步说明。0014实施例1制备脐带华通胶来源的间充质干细胞按ZL2009101577316号中国专利记载的方法制备脐带华通胶来源的间充质干细胞。具体方法为取人新鲜脐带,以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液,去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜,剥离华通胶并剪切成小块,再以等渗的平衡盐溶液或无血清培养液冲洗后,浸泡于00503胶原酶溶液中,置于35375温箱中1030小时,组织块消化,液体呈粘稠状,然后加入相当于原液110。

20、倍量的含胎牛血清的培养基终止消化,分装于培养瓶或培养皿,置CO2培养箱,待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液,以后每隔24天换液一次,细胞贴壁融合后传代培养;传代培养24代,即时使用或冷冻保存备用。0015所称“脐带华通胶来源的原始间充质干细胞”在生物学表型鉴定中,具有以下技术特征在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿生长;表达CD90、CD105、CD44;HLAABC;不表达CD45、CD34,HLADR;体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。本发明方法所用UWMSCS细胞移植材料,可以即时使用刚刚完成传代培养24代的UWMSCS新鲜品,也可以使用冷冻保存的传24代UWMSCS备用品。001。

21、6实施例2将AAV6BETATROPHINCDNA转染入WJMSCS,制备AAV6BETATROPHINWJMSCS收集第二代或第三代的脐带华通胶源间充质干细胞WJMSCS,计数后使用完全细胞培养液稀释,WJMSCS浓度为2105细胞/毫升,在75CM2的培养瓶中,加入10毫升WJMSCS悬液充分混匀,放置于37、饱和湿度、含5CO2的细胞培养箱中培养。贴壁细胞达到6080融合时,弃培养瓶中的培养基,加入10毫升AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基,培养48小时后,吸弃AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基,加入磷酸盐缓冲液轻洗WJMSCS两遍后,加入4毫升0125胰蛋白。

22、酶消化12分钟,显微镜下观察转染后的脐带华通胶源间充质干细胞完全脱离培养瓶底后,加入2毫升含10血清的培养基和胰蛋白酶,将说明书CN104164451A4/5页6AAV6BETATROPHINWJMSCS悬液移入50毫升离心管中,以速度1500R/MIN离心10MIN后弃上清,用生理盐水稀释AAV6BETATROPHINWJMSCS至05ML,进行静脉推注。本实施例所述剂量为一只大鼠应用量。0017上述完全细胞培养液的成分为810小牛血清,9092DMEMF12培养基。0018上述AAV6BETATROPHINCDNA转染培养基的成份为AAV6BETATROPHINCDNA含量为2681010。

23、VG/毫升、810小牛血清,9092DMEMF12培养基,含ETOPOSIDE浓度为2M。0019实施例3BETATROPHIN基因工程干细胞治疗2型糖尿病有效性及安全性实验观察以大鼠为实验动物,按下述步骤进行实验观察。0020合成BETATROPHINCDNA质粒;构建AAV6BETATROPHIN;按实施例1方法制备三代WJMSCS;按实施例2方法制备AAV6BETATROPHINWJMSCS,备用;建立大鼠2型糖尿病模型以高脂高糖饲料喂养另加小剂量左链菌素STZ腹腔注射建立大鼠2型糖尿病模型。高脂高糖饲料成分为猪油18、蔗糖20、蛋黄3、基础饲料59。高糖高脂饲料喂养2个月的大鼠诱发出胰。

24、岛素抵抗,禁食12小时,腹腔注射STZ,STZ剂量为30MG/KG。STZ注射5D后测定尾静脉随机血糖,随机血糖167MMOL/L者为2型糖尿病造模成功;随机分组A经鼠尾静脉注射试验品AAV6BETATROPHINWJMSCS;B对照品WJMSCSAAV6EGFP绿色荧光蛋白基因;注射量为每只大鼠WJMSCSAAV6BETATROPHIN21011或WJMSCSAAV6EGFP21011;随访观察观测项目包括每日二次血糖测定,定期血浆胰岛素、C肽、血脂测定,糖耐量试验,短时效胰岛素耐量试验ITT胰岛素释放试验(IRTS),胰岛素敏感指数ISI测定;观察BETATROPHINWMSCS移植后的安。

25、全性,动态观察血CD3,CD4,IGG,IGM等T、B细胞功能变化,进行致肿瘤性相关检查;分别在满一个月、满两个月时各处死一批大鼠,进行以下检查A免疫荧光检测胰腺、肝、白脂肪组织免疫荧光染色,应用抗MYCDDK抗体观察BETATROPHIN表达水平,应用KI67抗体观察胰岛细胞分裂增殖状态,应用抗胰岛素抗体行胰岛细胞成熟鉴定,应用共聚焦显微镜双标抗体鉴定2型糖尿病经BETATROPHINWMSCS移植后胰岛细胞增殖率;B组织病理检测胰腺、肝、脂肪进行HE染色病理组织检查;C胰腺、肝、脂肪组织免疫组织检测BETATROPHIN、胰岛素、C肽水平。0021结果大鼠经高脂高糖饮食15月后,较基础饲养。

26、前体重平均增加1403倍,血糖较前增加33641,血脂较前增加18238,经STZ诱导后96大鼠都出现了典型2型糖尿病特征,平均随机血糖25648MMOL/L;血清胰岛素平均3103MU/L;血清C肽平均04301;而经WJMSCSAAV6BETATROPHINCDNA移植后,3天血糖开始下降,7天血糖下降到移植前水平2/31/2,14天后血糖基本稳定在随机血糖81113MMOL/L,偶有波动;移植后前7天胰岛素用量逐渐减少,714天间断应用,14天后基本停用胰岛素,偶尔说明书CN104164451A5/5页7个例血糖波动曾加用普通胰岛素1UL;血清胰岛素升至平均7006MU/L;血清C肽平均。

27、1304;而对照组血糖持续在2533MMOL/L,血清C肽02601;每日外源补充人胰岛素30R,1/2死于一周内,1月存活仅1/5。0022实施例4体内对比观察BETATROPHIN基因工程干细胞,或单独BETATROPHIN基因静脉输入有效性与安全性对比80只WESTER大鼠,63只成功诱导成2型糖尿病模型,另设8只空白健康对照,63只2型糖尿病大鼠按治疗随机分为单独细胞组,给予WJMSCSAAV6EGFP;基因工程干细胞组,给予WJMSCSAAV6BETATROPHIN;单独基因组,给予AAV6BETATROPHIN;对照组,给予AAV6EGFP。每组12只大鼠,分批存活1个月、2个月,。

28、全部按实施例3所列技术指标观察。0023本实验目的是为了鉴定直接注射AAV6BETATROPHIN是否可达到上述WJMSCSAAV6BETATROPHIN同样效果,故本组增加单独AAV6BETATROPHIN及对照AAV6EGFP;并与原WJMSCSAAV6BETATROPHIN及WJMSCSAAV6EGFP实验组对比观察对2型糖尿病的治疗效果。0024结果在WJMSCSAAV6BETATROPHIN及WJMSCSAAV6EGFP组发现上述类似实验结果,但直接基因注射AAV6BETATROPHIN结果显示2型糖尿病大鼠经鼠尾静脉注射AAV6BETATROPHIN后,5天内血糖未下降,需持续外源补充胰岛素,但6天后血糖有下降趋势,胰岛素用量逐渐减少,14天随机血糖水平为13632MMOL/L,至20天逐渐下降到随机血糖92116MMOL/L,30天保持稳定。而个别大鼠血糖始终未降,分折可能与注射方法不当等因素有关。0025综上发现表明WJMSCS联合BETATROPHIN,由于借助WJMSCS的旁/自分泌效应,显示WJMSCSAAV6BETATROPHIN对于胰岛细胞及其介导的糖代谢效应显著优于单独AAV6BETATROPHIN注射。说明书CN104164451A。

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