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1、10申请公布号CN104082123A43申请公布日20141008CN104082123A21申请号201410297284522申请日20140628A01H1/02200601A01H4/0020060171申请人玉林师范学院地址537000广西壮族自治区玉林市教育中路299号玉林师范学院72发明人梁钧淞莫昭展甘耀坤梁林英梁晓菊潘洁明严翠琼张燕飞吴凤娟74专利代理机构玉林市振盛专利商标代理事务所45109代理人吴安仪54发明名称一种四倍体金线莲的培育方法57摘要一种四倍体金线莲的培育方法，本发明包括金线莲（ANOECTOCHILUSROXBURGHII）人工授粉、非共生萌发、诱变剂处理、。
2、壮苗培养和试管苗移栽等各阶段。金线莲开花后采取人工方法授粉，将成熟的金线莲蒴果经消毒后切开把种胚接种到萌发培养基上培养形成原球茎，然后转入含有诱变剂的液体分化培养基进行诱变处理，再接种到壮苗培养基进行壮苗培养，最后进行试管苗移栽。本发明简单易行，诱变频率达到75以上，同时也可大幅度提高金线莲的药材产量，为金线莲多倍体育种、遗传改良和新品种培育开辟了一条新途径。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104082123ACN104082123A1/1页21一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于包括以下步骤（1。
3、）人工授粉按常规方法进行栽培管理，选定株系优良的金线莲植株作为亲本，在金线莲开花后进行异花授粉（2）非共生萌发在金线莲蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，经7580的酒精溶液消毒25分钟后，用无菌水冲洗25次后置于01升汞溶液消毒815分钟，经无菌水冲洗25次后用无菌滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，用接种针将黄色种胚接种到萌发培养基上培养，培养2030天后种子萌发成原球茎（3）诱变剂处理将非共生萌发开成的原球茎转入含有诱变剂的液体分化培养基中，在2528条件下进行间歇振荡诱变处理240480小时（4）壮苗培养将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形成58CM高。
4、的带根小苗（5）试管苗移栽将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗57天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（13）混合成的基质中并按常规的二倍体金线莲进行大田栽培管理上述（2）（4）各步骤中的培养条件均为培养温度2530，每天光照1015小时，光照强度15002000LX。2根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（2）所述的萌发培养基为0520G/L花宝1号0220G/L蛋白胨100200ML/L椰子汁2035G/L蔗糖3070G/L琼脂0310G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为5458。3根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的。
5、培育方法，其特征在于步骤（3）所述的液体分化培养基为1/2MS0212MG/L6BA0106MG/LNAA2035G/L蔗糖0220G/L蛋白胨0105G/L酸性水解酪蛋白0310G/L活性炭，PH为5458。4根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（3）所述的诱变剂为001005秋水仙碱（OLCHICINE）001003氟乐灵（TRIFLURALIN）的混合液。5根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（4）所述的壮苗培养基为0520G/L花宝1号0520G/L花宝2号0515MG/LNAA0220G/L蛋白胨0105G/L酸性水解酪蛋白2035。
6、G/L蔗糖3070G/L琼脂0310G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为5458。6根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（5）所述的试管苗为经染色体计数后选取染色体数目为2N80的试管苗。权利要求书CN104082123A1/4页3一种四倍体金线莲的培育方法技术领域0001本发明涉及植物新品种的培育方法，具体地说，涉及一种四倍体金线莲的培育方法。背景技术0002金线莲（ANOECTOCHILUSROXBURGHII），即花叶开唇兰，别名金线莲、金石松、虎头蕉、鸟人参等，为兰科开唇兰属珍稀药用植物。金线莲是我国传统珍贵药材，由于其治疗面广、疗效独特，有“神。
7、药”之称，享有“药王”等美誉。0003染色体是决定生物个体性状基因的载体，染色体加倍以后的植株与亲本之间会产生形态及性状上的变化，其中巨大性是多倍体最为显著的外部形态特征。与此同时，植物染色体倍性的变化也往往会导致次生代谢产物含量变化。中药材是一类具有特殊用途的经济植物，一般以其根、茎、叶等器官为收获对象。多倍体植物中的染色体加倍，往往表现出植株的巨大性，能较好地满足中药生产的需求。金线莲植株矮小、生长慢、生境苛刻，若能将其培育为多倍体并固定下来，则可能提高其药用价值，同时为选育优质金线莲提供珍贵的原始材料。发明内容0004本发明的目的在于提供一种四倍体金线莲的培育方法，通过人工授粉、非共生萌。
8、发、诱变剂处理、壮苗培养和试管苗移栽等各阶段，以秋水仙碱和氟乐灵混合液作为多倍体诱变剂处理金线莲类原球茎，提高了诱变率，处理一次即可获得数量可观的四倍体金线莲，从而实现了本发明的目的。0005本发明的一种四倍体金线莲的培育方法，包括以下的步骤（1）人工授粉按常规方法进行栽培管理，选定株系优良的金线莲植株作为亲本，在金线莲开花后进行异花授粉。0006（2）非共生萌发在金线莲蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，经7580的酒精溶液消毒25分钟后，用无菌水冲洗25次后置于01升汞溶液消毒815分钟，经无菌水冲洗25次后用无菌滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，用接种针将黄色种胚接种到萌发。
9、培养基上培养，培养2030天后种子萌发成原球茎。0007（3）诱变剂处理将非共生萌发开成的原球茎转入含有诱变剂的液体分化培养基中，在2528条件下进行间歇振荡诱变处理240480小时。0008（4）壮苗培养将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形成58CM高的带根小苗。0009（5）试管苗移栽将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗57天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（13）混合成的基质中并按常规的二倍体金线莲进行大田栽培管理。0010上述（2）（4）各步骤中的培养条件均为培养温度2530，每天光照10说明书CN104082123A2/4页415。
10、小时，光照强度15002000LX。0011上述步骤（2）所述的萌发培养基为0520G/L花宝1号0220G/L蛋白胨100200ML/L椰子汁2035G/L蔗糖3070G/L琼脂0310G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为5458；上述步骤（3）所述的液体分化培养基为1/2MS0212MG/L6BA0106MG/LNAA2035G/L蔗糖0220G/L蛋白胨0105G/L酸性水解酪蛋白0310G/L活性炭，PH为5458；上述步骤（3）所述的诱变剂为001005秋水仙碱（OLCHICINE）001003氟乐灵（TRIFLURALIN）的混合液上述步骤（4）所述的壮苗培养基为05。
11、20G/L花宝1号0520G/L花宝2号0515MG/LNAA0220G/L蛋白胨0105G/L酸性水解酪蛋白2035G/L蔗糖3070G/L琼脂0310G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为5458；上述步骤（5）所述的试管苗为经染色体计数后选取染色体数目为2N80的试管苗。0012本发明具有的特点,目前国内关于金线莲多倍体离体诱导有少量报道，但技术还不够成熟，而本发明具有简单、易行、诱变率高的特点。本发明处理一次即可获得数量可观的四倍体金线莲，可以为金线莲遗传育种提供亲本材料，也为金线莲的新品种培育提供新的思路。具体实施方式0013以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明。
12、的限制。0014实施例11、品种来源福建产组培苗经大田栽培2年后的优质金线莲；2、培育过程（1）人工授粉按常规方法进行栽培管理，金线莲开花进行异花授粉后120天蒴果成熟。0015（2）非共生萌发在金线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时，经75的酒精溶液消毒3分钟后，用无菌水冲洗2次后置于01升汞溶液消毒8分钟，经无菌水冲洗2次后用无菌滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，用接种针将黄色种胚接种到萌发培养基上培养，培养23天后种子萌发成原球茎。所采用的萌发培养基为15G/L花宝1号10G/L蛋白胨200ML/L椰子汁25G/L蔗糖45G/L琼脂05G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成。
13、分，PH为56。0016（3）诱变剂处理将非共生萌发开成的原球茎转入含有002秋水仙碱和001氟乐灵混合液的液体分化培养基中，在28条件下进行间歇振荡诱变处理240小时，经染色体计数，四倍体诱导率为72。所采用的液体分化培养基为1/2MS12MG/L6BA04MG/LNAA25G/L蔗糖10G/L蛋白胨05G/L酸性水解酪蛋白03G/L活性炭，PH为56。0017（4）壮苗培养将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形成58CM高的带根小苗。所采用的壮苗培养基为10G/L花宝1号10G/L花宝2号说明书CN104082123A3/4页505MG/LNAA20G/L蛋白胨05G/。
14、L酸性水解酪蛋白35G/L蔗糖30G/L琼脂10G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为56（5）试管苗移栽将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（13）混合成的基质中并按常规的二倍体金线莲进行大田栽培管理，四倍体金线莲成活率达92。0018上述（2）（4）各步骤中的培养条件均为培养温度28，每天光照13小时，光照强度1500LX。0019实施例二1、品种来源台湾产组培苗经大田栽培1年后的优质金线莲；2、培育过程（1）人工授粉按常规方法进行栽培管理，金线莲开花进行异花授粉后110天蒴果成熟。0020（2）非共生萌发在金。
15、线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时，经78的酒精溶液消毒2分钟后，用无菌水冲洗5次后置于01升汞溶液消毒10分钟，经无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，用接种针将黄色种胚接种到萌发培养基上培养，培养25天后种子萌发成原球茎。所采用的萌发培养基为10G/L花宝1号20G/L蛋白胨100ML/L椰子汁25G/L蔗糖60G/L琼脂03G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为58。0021（3）诱变剂处理将非共生萌发开成的原球茎转入含有001秋水仙碱和003氟乐灵混合液的液体分化培养基中，在25条件下进行间歇振荡诱变处理360小时，经染色体计数，四倍体诱导率。
16、为74。所采用的液体分化培养基为1/2MS04MG/L6BA02MG/LNAA25G/L蔗糖20G/L蛋白胨05G/L酸性水解酪蛋白05G/L活性炭，PH为58。0022（4）壮苗培养将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形成58CM高的带根小苗。所采用的壮苗培养基为15G/L花宝1号10G/L花宝2号15MG/LNAA10G/L蛋白胨03G/L酸性水解酪蛋白30G/L蔗糖30G/L琼脂10G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为58（5）试管苗移栽将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（13）混合成。
17、的基质中并按常规的二倍体金线莲进行大田栽培管理，四倍体金线莲成活率达95。0023上述（2）（4）各步骤中的培养条件均为培养温度25，每天光照10小时，光照强度2000LX。0024实施例三1、品种来源广西产组培苗经大田栽培15年后的优质金线莲；2、培育过程（1）人工授粉按常规方法进行栽培管理，金线莲开花进行异花授粉后95天蒴果成熟。0025（2）非共生萌发在金线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时，经80的酒精溶液消毒4分钟后，用无菌水冲洗3次后置于01升汞溶液消毒15分钟，经无菌水冲洗5次后用无说明书CN104082123A4/4页6菌滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，用接种针将。
18、黄色种胚接种到萌发培养基上培养，培养25天后种子萌发成原球茎。所采用的萌发培养基为15G/L花宝1号10G/L蛋白胨80ML/L椰子汁28G/L蔗糖70G/L琼脂08G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为58。0026（3）诱变剂处理将非共生萌发开成的原球茎转入含有003秋水仙碱和002氟乐灵混合液的液体分化培养基中，在26条件下进行间歇振荡诱变处理400小时，经染色体计数，四倍体诱导率为75。所采用的液体分化培养基为1/2MS10MG/L6BA04MG/LNAA35G/L蔗糖20G/L蛋白胨01G/L酸性水解酪蛋白06G/L活性炭，PH为58。0027（4）壮苗培养将经诱变处理的。
19、金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形成58CM高的带根小苗。所采用的壮苗培养基为18G/L花宝1号12G/L花宝2号06MG/LNAA15G/L蛋白胨03G/L酸性水解酪蛋白35G/L蔗糖40G/L琼脂10G/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，PH为58（5）试管苗移栽将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗6天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（13）混合成的基质中并按常规的二倍体金线莲进行大田栽培管理，四倍体金线莲成活率达96。0028上述（2）（4）各步骤中的培养条件均为培养温度26，每天光照12小时，光照强度1500LX。说明书CN104082123A。