重组人肌钙蛋白I在大肠杆菌中的表达及其在抗肿瘤中的应用 技术领域：
本发明涉及人快速骨骼肌型肌钙蛋白I(简称：人肌钙蛋白)英文简称：(TnI)基因的克隆含有该基因的大肠杆菌表达载体的构建以及将该基因产物在大肠杆菌中的表达，纯化及其在抑制血管形成和抗肿瘤治疗中的应用。背景技术：
实体瘤的生长与转移均依赖于新生血管的形成以提供肿瘤组织的营养。因此，应用新血管形成抑制剂抑制新生血管的形成，阻断肿瘤的血供是近年来出现的最具前途的抗癌手段之一。美国波士顿儿童医院科学家在研究抗癌新方法，寻找新血管生长抑制剂的过程中，近年来从无血管具有抗癌作用的软骨提取物中分离纯化到人肌钙蛋白I，并用大量的科学证据证明TnI是一种天然存在的、能抑制血管内皮细胞生长、抑制血管形成并通过阻断新血管的生长抑制实体瘤的生长与转移。其生物活性比目前正在研发已进入临床实验的所有地同类血管形成抑制剂包括endostatin和angiostatin要强100多倍。发明目的：
TnI在软骨、血液中的含量甚微。直接分离纯化显然有相当难度，也无法满足作为临床治疗药物的需要。本发明的目的在于提供一个高效的大肠杆菌表达系统以生产具有抑制血管形成与生长作用的重组人TnI，该表达系统与现有技术相比具有优良的表达率，易于纯化，产品纯度高，抑瘤效果好，本发明的制造的产品作为一种生物制剂可应用于实体瘤的治疗。发明内容：
本发明的人肌钙蛋白I的编码序列是用PCR法从人乳腺cDNA文库中获得的，全长546个碱基对，含有编码人肌钙蛋白I的182个氨基酸残基的序列，其DNA序列及其编码的氨基酸序列见序列表。PCR引物设计时，分别在其5’端添加内切酶NdeI识别序列(其中含起始密码ATG)，在其3’末端添加6聚组氨酸编码序列、终止密码TAA和内切酶BamHI的识别序列。构建含有人肌钙蛋白TnI基因的大肠杆菌表达质粒
按常规分子克隆方法，将PCR扩增的人肌钙蛋白I(TnI)编码基因片断用TA克隆方式克隆至TA克隆载体中，经过适当的限制性内切酶酶切下目的片断(含有编码人肌钙蛋白C182个氨基酸残基和6聚组氨酸的序列)，再进一步克隆至大肠杆菌表达载体pET3b中，所得表达质粒称为pET3b-TnI。其构建过程见图1。pET3b为一4.6kb的双链环状DNA质粒，在多克隆位点上游的调控区内含有噬菌体T7启动子，受T7RNA聚合酶的诱导而启动其下游基因的转录，该质粒含有一氨苄青霉素抗性基因，可转化以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为代表的一系列宿主细胞。
用pET3b-TnI-His6表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS，并筛选表达TnI-His6的表达株，称为BL21(DE3)/pLysS/pET3b-TnI-His6。BL21(DE3)/pLysS/pET3b-TnI-His6的培养与IPTG诱导
将单菌落接种于含200ug/ml Ampicillin(氨苄青霉素)的LB培养液，37℃振摇培养过夜，次日以1∶100稀释转种于较大体积的固种培养液，37℃继续培养至OD600≈0.5-0.6，加入诱导剂IPTG至最终浓度0.5-1.0mM，37℃诱导培养3-4小时后，离心收集细胞。重组人肌钙蛋白TnI-His融合蛋白的分离与纯化
由于本系统所表达的TnI-His融合蛋白大部分以不溶形成存在于包涵体内，因此纯化的大致流程为：包涵体分离→蛋白变性溶解→Ni柱纯化→柱内复活→洗脱，详细过程见实施例：
本发明所生产的人肌钙蛋白TnI对人脐静脉血管内皮细胞(HUV-EC)生长的抑制作用。
将所纯化的重组人肌钙蛋白TnI加入含有人血管内皮细胞HUV-EC的培养液中，三天后，用3H-胸腺嘧啶掺入法，测量人肌钙蛋白TnI对血管内皮细胞增殖的抑制活性。如图4所示，本发明所生产的人肌钙蛋白TnI对HUV-EC呈剂量依赖性抑制，其IC50为5μg/ml。这一结果与文献报导的结果相似(proceedingsof the National Academy of Sciences)。本发明所纯化的重组人肌钙蛋白TnI对动物肿瘤血管的抑制作用。
将纯化后重组人肌钙蛋白TnI对荷S180小鼠给药，连续给药7天后，脱颈处死动物，称体重，剖瘤称重，计算肿瘤抑制率，如表1所示，本发明所生产的人肌钙蛋白对肿瘤呈剂量依赖性抑制，其腹腔给药5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg组抑制率分别达到31％、46.6％、60.3％，皮下给药5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg组抑制率分别达到32.9％、45％、56.4％。
本发明的内容还包括制备一种TnI蛋白为活性成分的药物制剂，该药物制剂主要以非胃肠道途径给药，如普通注射剂、冷冻干燥注射剂、脂质体注射剂、靶向给药的注射剂等，也可制成胃肠道途径给药的制剂，如片剂、胶囊剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服液、混悬剂、冲剂、贴剂、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、栓剂、缓释制剂、控释制剂等。
本发明的药物制剂其中TnI蛋白的含量为1-99％，其他为药物可接受的载体。这些药物可接受的载体可以是，淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、纤维素类、硬脂酸镁、吐温-80、卡波姆、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、甘油、明胶、聚乙二醇、硫柳汞、尼泊金丙酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、三氯叔丁醇、苯甲酸钠、硼砂、新洁尔灭、山梨醇、丙二醇异丙醇，月桂氮桌酮，异丙醇/丙二醇(1∶1)，异丙醇/(1∶2)和异丙醇/丙二醇(2∶1)、三乙醇胺、氢氧化钠凡士林、硬脂酸、液状石蜡、羊毛脂、十八醇、十六醇。单硬脂酸甘油酯、月桂醇硫酸钠、司盘60、平平加0、甘露醇、山梨醇等。
本发明的药物制剂可以通过本领域通常的方法制备。以下为图表说明：序列表：本发明克隆的人肌钙蛋白TnI的DNA序列及由它所编码的氨基酸序列，以及本发明所生产的人肌钙蛋白TnI-His融合蛋白的氨基酸序列。图1、大肠杆菌表达质粒构建过程示意图图2、本发明表达纯化的人肌钙蛋白TnI-His融合蛋白的聚丙烯酰胺电泳图图3、本发明生产的重组TnI-His融合蛋白对人脐静脉内皮细胞生长的抑制作用具体实施方式：
以下通过实例对本发明作进一步说明。实施例一： 人肌钙蛋白TnI的制备：1、编码人肌钙蛋白TnI的基因的克隆
a、引物设计与合成
根据已知人肌钙蛋白TnI的cDNA序列，设计并合成两个引物，其序列如下：5′端引物：5′-ATG GGA GAT GAG AAG GCG AAC-3′3′端引物：5′-CTA GCA CTC GGA CTC AAA CAT CTT-3′b、PCR反应
以人乳腺cDNA文库为模板，用上述两个引物经PCR反应从文库中扩增出546碱基对长的人肌钙蛋白IcDNA片断。PCR反应条件为：人乳腺cDNA文库1微克，上述两种引物各0.5微克，10mM dNTPs 2微升，10×PCR缓冲液10微升，TagDNA聚合酶2.5单位，加水至最终体积100微升。PCR反应在PCR仪器按以下温度循环进行，第一循环：94℃ 2分钟，第二至第24循环：94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟，最后一个循环：94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 8分钟。将分离纯化后的PCR产物首先克隆至TA克隆载体PCRII-TOPO(美国Invitrogen公司产品)。经酶切和测序筛选得到含有人肌钙蛋白I正确编码序列的克隆命名为PCRII-TOPO/TnI。本发明所克隆得到的人肌钙蛋白I的DNA序列及其编码的氨基酸序列见序列表。2、人肌钙蛋白TnI-His融合蛋白表达载体的构建①PCR产生人肌钙蛋白与His融合蛋白的编码序列a、引物设计与合成，目的旨在导入酶切位点与6个组氨酸的编码序列。引物的序列如下：5′端引物：5′-66C ATA TG GGA GAT GAT GAG AAG CGG AAC-3′3′端引物：5′-CCG GGA TCC CTA ATG ATG ATG ATG GTG GTG GGA CTC GGA CTCAAA CAT CTT CTT CCG GCC-3′在5′端的同源序列之后，依次加工6个组氨酸编码序列、终止密码和BamHI酶切位点。b、PCR反应
以PCRII-TOPO/TnI-His6质粒DNA为模板，用上述两个引物进行PCR反应，扩增出TnI-His6的编码片断。反应条件同1.b，将PCR产物次级克隆至PCR-TOPO载体，经酶切和测序筛选，所得的正确克隆命名为PCRII-TOPO/TnI-His6。人肌钙蛋白TnI大肠杆菌表达载体的构建：
如图1所示，用限制性内切酶NdeI和BamHI，将人肌钙蛋白的TnI和6个组氨酸的编码cDNA从PCRII-TOPO/TnI-His6中切出，经凝胶电泳分离纯化后，再与经NdeI和BamHI，消化后的大肠杆菌表达载体pET3b连接，转化大肠杆菌DH5α，用酶切和测序分析筛选得到含正确的TnI-His6编码序列的质粒。将这一质粒命名为pET3b-TnI-His6。3、表达人肌钙蛋白TnI与组氨酸融合蛋白的菌株的建立
将pET3b-TnI-His6表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS，筛选具有氨苄青霉素和氯霉素抗性的转化体。4、人肌钙蛋白TnI-His融合蛋白的表达与纯化a、菌种培养与IPTG诱导
将单个新鲜大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/pLysS/pET3b-TnI-His接种于含200μg/ml氨苄青霉素34μg/ml氯霉素的LB培养液，37℃振摇，培养过滤。次日按1∶100稀释，将适量过夜培养液转种于较大体积的同样培养液(此处以1000毫升为例)，37℃振摇培养至OD600＝0.5-0.6加入IPTG至最终浓度0.5-1.0mM，继续培养3-4小时，离心收集细胞。b、重组人肌钙蛋白TnI-His融合蛋白的分离纯化
将离心收集的细胞称重，按每克细胞5毫升的比例，将细胞悬浮于缓冲溶液A(1％Triton X-100 0.1M NaH2PO4 0.01M Tris，pH8.0)，超声粉碎细胞，离心，12000×g，4℃，10min，弃上清，沉淀再次用缓冲溶液A重悬，离心，12000×g，4℃，10min，弃上清，得包涵体，将包涵体溶于缓冲液B(6M Guanidinehydrochloride 0.1M NaH2PO4 0.01M Tris pH8.0)中，离心，收集上清，将离心后的上清以0.6ml/min的速度上样于缓冲液B平衡达的Ni-NTA层析柱。
依次用20毫升缓冲液B，50毫升缓冲液C(8M Urea，0.1M NaH2PO4，0.01MTris pH8.0)，50毫升缓冲液D[8M Urea，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris pH6.5]，和40毫升缓冲液E(0.1M NaH2PO4 pH6.5)以2毫升/每分钟的速度洗柱。然后用以下梯度溶液洗柱使柱内已变性的TnI-His融合蛋白在被洗脱下来之前在柱内复性，速度为2毫升/每分钟。
缓冲液D 缓冲液E
25毫升 5毫升
20 10
15 15
10 20
5 25
0 30
0 30
用15-20毫升缓冲液F(0.1M NaH2PO4，300mM-600mM imdizale，2mM DTT，pH6.0)洗脱层析柱。
最后用centricon脱盐和浓缩蛋白样品，并用15％SDS-PAGE检测所纯化的人肌钙蛋白TnI-His的分子量和纯度(见图4)。
实施例二：
重组人肌钙蛋白TnI对体外人脐静脉内皮细胞生长的抑制作用。
将人脐静脉内皮细胞HUV-EC以1×104cell/well的密度培养于96孔平板，培养液为Hams F-12K含生长因子bFGF(3ng/ml)。将不同浓度的本发明所生产的人肌钙蛋白TnI加入细胞培养液共同培养三天，再加入1μci/每孔的3H-胸腺嘧啶，继续培养6-12小时后，收集细胞，检测3H-胸腺嘧啶在多个处理组细胞内的掺入量，结果见图5。如图5A所示，重组人肌钙蛋白TnI对HUV-EC细胞呈剂量依赖性抑制。其IC50值为5μg/ml，远低于文献报导的12μg/ml的浓度(Microvacular Research，63∶41-49，2002)，说明本发明所生产的人重组肌钙蛋白TnI的生物活性还优于文献报导的结果。
测试结果还进一步显示，重组人肌钙蛋白的TnI对人血管内皮细胞生长的抑制是特异的，它对其他细胞如人乳腺癌细胞如MCF-1仅在高浓度下(25μg/ml)呈极弱的抑制作用(见图3B)。实施例三：
重组人肌钙蛋白TnI对小鼠肿瘤的实验活性作用。取昆明小鼠66只，体重15-22g，雌雄兼用。取接种7-8天腹水瘤稀释之1000万个瘤细胞/ml，每鼠腋下接种0.2ml。次日随机均分5组，TnI 20mg/kg，TnI 10mg/kg，TnI 5mg/kg，环磷酰胺(cy)50mg/kg及(NS)对照组，药物组每天给药一次连续给药7天，对照组给予相应体积NS液，cy组间日给药一次，末次给药后停药一天，脱颈处死动物，称体重，剖瘤称重，
如表1所示，重组TnI对小鼠肿瘤呈剂量依赖性抑制。其腹腔给药5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg组的肿瘤抑制率分别达到31％、46.9％、60.3％，皮下给药5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg组的肿瘤抑制率分别达到32.9％、45％、56.4％。肉眼观察小鼠肿瘤，发现空白组肿瘤血供丰富，颜色红润，给药组肿瘤颜色苍白，血供明显不足，其进一步说明了TnI的抑制新生血管形成，阻断肿瘤血供的作用。发明的效果
根据已知人肌钙蛋白TnI的cDNA序列，设计了人肌钙蛋白I与6聚组氨酸的融合蛋白。
采用PCR法从人乳腺cDNA文库中获得肌钙蛋白I的编码序列，并在其C末断导入6聚组氨酸的编码序列，经PCR扩增，合成了编码人肌钙蛋白I与6聚组氨酸的融合基因片断。
构建了人TnI的原核表达载体pET3b-TnI，转化含T7RNA聚合酶的大肠杆菌宿主细胞，经IPTG诱导可表达人TnI。
构建的工程菌E.coli BL21(DE3)pLysS/pET3b-TnI，可高效地表达人TnI。该菌种现已保藏于武汉大学内中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNo.M202027。
建立了人TnI简便的纯化和复性工艺，纯化和复性同时进行，纯化蛋白的SDS-PAGE图谱灰度扫描显示纯度大于90％。
体外活性实验显示人TnI具有明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖活性；体内活性实验显示人TnI具有明显抑制动物肿瘤生长活性。
表1 重组TnI对动物肿瘤的实验治疗作用实验材料：(1)动物：昆明小鼠、体重18-22g由重庆市中药研究院实验动物研究室提供，合格证号：医动字310103001
(2)瘤株：S180引自重庆医科大学病生教研室。
(3)受试物：TnI两批，腹腔给药组0.5mg/ml，皮下给药组1mg/ml。纯度：≥90％表1结果一：组别 剂量 给药 动物数 体重 瘤重 抑制率 P值 mg/kg 途径 开始 药后 开始 药后 X±sd ％NS液 26 26 19.1 25.3 1.91±0.79TnI 20 ip 10 10 19.8 21.0 0.75±0.50 60.3 ＜0.001TnI 10 ip 10 9 19.8 22.1 1.02±0.60 46.6 ＜0.01TnI 5 ip 10 10 19.8 23.2 1.31±0.75 31 ＜0.05Cy 50 sc 10 10 19.7 21.4 0.26±0.18 86.4 ＜0.001表1结果二：组别 剂量 给药 动物数 体重 瘤重 抑制率 P值 mg/kg 途径 开始 药后 开始 药后 X±sd ％NS液 26 26 19.6 26.1 1.99±0.78TnI 20 sc 10 10 19.7 21.2 0.86±0.52 56.4 ＜0.001TnI 10 sc 10 9 19.8 22.5 1.09±0.59 45 ＜0.01TnI 5 sc 10 10 19.8 23.1 1.33±0.78 32.9 ＜0.05Cy 50 sc 10 10 19.7 21.4 0.24±0.19 87.9 ＜0.001
序列表<110>重庆康尔威药业股份有限公司<120>重组人快速骨骼肌型肌钙蛋白I在大肠杆菌中的表达及其在抗肿瘤治疗中的应用<160>3<210>1<211>546<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)…(546)<400>1atg gga gat gag gag aag cgg aac agg gcc atc acg gcc cgc agg cag 48Met Gly Asp Glu Glu Lys Arg Asn Arg Ala Ile Thr Ala Arg Arg Gln1 5 10 15cac ctg aag agc gtg atg ctg cag ata gcg gcc acg gag ctg gag aag 96His Leu Lys Ser Val Met Leu Gln Ile Ala Ala Thr Glu Leu Glu Lys
20 25 30gag gag agc cgc cgt gag gca gag aag cag aac tac ctg gcg gag cac 144Glu Glu Ser Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Glu His
35 40 45tgc ccg ccg ctg cat atc ccg ggc tcc atg tct gaa gtg cag gag ctc 192Cys Pro Pro Leu His Ile Pro Gly Ser Met Ser Glu Val Gln Glu Leu
50 55 60tgc aaa cag ctg cac gcc aag atc gat gcg gct gaa gag gag aag tac 240Cys Lys Gln Leu His Ala Lys Ile Asp Ala Ala Glu Glu Glu Lys Tyr65 70 75 80gac atg gag gtg agg gtg cag aag acc agc aag gag ctg gag gac 288Asp Met Glu Val Arg Val Gln Lys Thr Ser Lys Glu Leu Glu Asp
85 90 95atg aac cag aag cta ttt gat ctg cgg ggc aag ttc aag cgg ccc cca ctg 336Met Asn Gln Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Pro Leu
100 105 110cgg agg gtg cgc atg tcg gcc gat gcc atg ctc aag gcc ctg ctg ggc 384Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys Ala Leu Leu Gly
115 120 125tcg aag cac aag gtg tgc atg gac ctg agg gcc aac ctg aag cag gtc 432Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys Gln Val
130 135 140aag aag gag gac aca gag aag gag cgg gac ctg cga gac gtg ggt gac 480Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Arg Asp Leu Arg Asp Val Gly Asp145 150 155 160tgg agg aag aac atc gag gag aag tct ggc atg gag ggc cgg aag aag 528Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys
165 170 175atg ttt gag tcc gag tcc 546Met Phe Glu Ser Glu Ser
180<210>2<211>182<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Gly Asp Glu Glu Lys Arg Asn Arg Ala Ile Thr Ala Arg Arg Gln1 5 10 15His Leu Lys Ser Val Met Leu Gln Ile Ala Ala Thr Glu Leu Glu Lys
20 25 30Glu Glu Ser Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Glu His
35 40 45Cys Pro Pro Leu His Ile Pro Gly Ser Met Ser Glu Val Gln Glu Leu
50 55 60Cys Lys Gln Leu His Ala Lys Ile Asp Ala Ala Glu Glu Glu Lys Tyr65 70 75 80Asp Met Glu Val Arg Val Gln Lys Thr Ser Lys Glu Leu Glu Asp
85 90 95Met Asn Gln Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Pro Leu
100 105 110Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys Ala Leu Leu Gly
115 120 125Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys Gln Val
130 135 140Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Arg Asp Leu Arg Asp Val Gly Asp145 150 155 160Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys
165 170 175Met Phe Glu Ser Glu Ser
180<210>3<211>188<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Met Gly Asp Glu Glu Lys Arg Asn Arg Ala Ile Thr Ala Arg Arg Gln1 5 10 15His Leu Lys Ser Val Met Leu Gln Ile Ala Ala Thr Glu Leu Glu Lys
20 25 30Glu Glu Ser Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Glu His
35 40 45Cys Pro Pro Leu His Ile Pro Gly Ser Met Ser Glu Val Gln Glu Leu
50 55 60Cys Lys Gln Leu His Ala Lys Ile Asp Ala Ala Glu Glu Glu Lys Tyr65 70 75 80Asp Met Glu Val Arg Val Gln Lys Thr Ser Lys Glu Leu Glu Asp
85 90 95Met Asn Gln Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Pro Leu
100 105 110Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys Ala Leu Leu Gly
115 120 125Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys Gln Val
130 135 140Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Arg Asp Leu Arg Asp Val Gly Asp145 150 155 160Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys
165 170 175Met Phe Glu Ser Glu Ser His His His His His His
180 185