17肽有机化合物及其应用 【技术领域】
本发明属有机化合物，主要涉及多肽类有机化合物，尤其是关于人工化学合成或用基因工程的方法获得的17肽有机化合物及其在医药领域的应用。技术背景
器官移植术后的排斥反应分为超急性、急性和慢性三类。超急性排斥(HAR)从免疫学上来说是由于移植器官细胞膜上的抗原和受者的循环抗体之间发生识别和结合所致。因为这些抗体都是预先存在于受体内，所以，超急性排斥反应在移植术后便迅速发生，一般在术后几分钟或几小时内即出现。由于人体器官的短缺，利用猪的器官代替人体器官是目前研究的热点。但由于猪的细胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal能与人体内预存的天然抗体结合产生超急性排斥反应而无法应用到临床。针对此问题，目前，国内外主要有以下几种方法：一种方法是转基因猪，主要是通过把猪身上表达此抗原的基因除去，从而使生产出来的猪不带有此抗原(例如日本已克隆出8只次类小猪)，一旦得到了转基因猪，通过常规的繁殖传代就可以得到大量的转基因猪，理论上应该说这是一种非常理想的解决途径，但是目前还因为一些问题而无法应用到临床。总的来说克隆和转基因还不是一种完全成熟的技术，许多通过此途径生产出地动物都存在着或多或少的生理上的不正常，容易夭折。其次，还要考虑由于转基因动物的某些未知的基因变异而对受移植者带来损害的可能性。第二种方法是通过对免疫抑制剂的开发和改良来解决问题，这是一种常规的思路。目前的免疫抑制剂有环孢素A、糖皮质激素、硫唑嘌呤、抗淋巴细胞球蛋白、环磷酰胺等，但遗憾的是不能解决超急性排斥反应问题，并且有各种各样的副作用，比如常见的就有骨髓抑制、肝肾毒性、上消化道出血、脱发等等。虽然有报道某些研发机构在进行新的免疫抑制剂的开发，但前景不明。
在临床上，如不慎将B型血输给了A型或O型的病人，由于A型或O型血的人体内有预存的抗B型血的抗体，故会出现针对B型血抗原的免疫反应，从而出现临床上危急的输血反应，如抢救不及时，有可能使病人失去生命。发明内容
本发明的目的之一是克服目前临床上在器官移植术中出现的超急性排斥反应及因血型不配造成输血反应等问题，设计并提供一种17肽有机化合物。
本发明提供的17肽有机化合物，包括a、b、c、d四种，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。
本发明提供的17肽有机化合物a的氨基酸序列为：CCWLLRQPVRFVRSIRS，分子量为1990；17肽有机化合物b的氨基酸序列为：CCWLLRQPVRFVRSIRP，分子量为2002；17肽有机化合物c的氨基酸序列为：CCWLLRQPVRFVRSIRT，分子量为2004；17肽有机化合物d的氨基酸序列为：CCWLLRQPVRFVRSIRA，分子量为1974。
本发明的目的之二是将17肽有机化合物用于器官移植术中控制异种移植中超急性排斥反应。
本发明的另一个目的是将17肽有机化合物用于血型不合输血后产生的输血反应。
本发明的优点有：
①本发明的17肽有机化合物，由于只有17肽，故可以用人工化学合成或基因工程的方法大量合成。以前者为例，可以得到大量较纯的小肽。
②本发明的17肽有机化合物能与抗B抗体特异性结合，所以能用于某些血型不合输血后而产生的输血反应。
③本发明的17肽有机化合物与抗B单克隆抗体的结合位点是特异性的，起到封闭抗B单克隆抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
④本发明的17肽有机化合物除了能与抗B单克隆抗体结合外，还能与人体内预存的抗猪抗原的抗体特异性结合，从而封闭它的作用，起到了抑制猪异种移植超急性排斥反应的发生。
⑤本发明的17肽有机化合物与人体内预存抗体的结合位点是特异性的，正好起到封闭抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
⑥由于本发明的17肽有机化合物的氨基酸数量较少，开发成药物后容易被机体利用而起效。附图说明
图1为随蜜二糖浓度增加竞争性ELISA(蜜二糖)抑制率曲线图。
图2为本发明抑制A型血人血清与猪红细胞的凝集反应结果图。
图3为本发明抑制西非单叶豆凝集素BS-I-B4与猪红细胞的凝集反应图。具体实施方式
本发明结合以下实施例及附图作进一步说明。
实施例1：用抗B型血单克隆抗体作为靶蛋白，用噬菌体展示的方法得到阳性噬菌体克隆。
噬菌体展示方法利用基因工程手段将合成的一组一定长度的随机序列寡核苷酸片段克隆到特定表达载体中，使其表达产物以融合蛋白的形式呈现在丝状噬菌体表面。由于肽库中包含了该长度小肽的所有可能的氨基酸排列顺序或其中的绝大部分，每一个噬菌体呈现其中的一种肽段，因而库容量极大，易于筛选和扩增。用噬菌体肽库感染大肠杆菌，使重组入噬菌体的随机的寡核苷酸片段在大肠杆菌内复制，并在噬菌体的外壳蛋白中表达出来。然后，把靶蛋白包被在酶标板上。用此噬菌体肽库与靶蛋白混合后，洗板。如果噬菌体上的外壳蛋白能与靶蛋白结合，就不会被洗掉。最后用酸或亲和洗脱液把噬菌体洗脱下来。连续这样筛3-4轮，就能筛出与靶蛋白结合力较强的噬菌体。测此噬菌体的DNA序列得到重组寡核苷酸的序列，亦知道了相应的17肽的序列。然后可通过人工化学或基因工程的方法得到17肽。本发明提供的17肽有机化合物包括a、b、c、d四种，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。
本发明提供的17肽有机化合物a的氨基酸序列为：CCWLLRQPVRFVRSIRS，分子量为1990；17肽有机化合物b的氨基酸序列为：CCWLLRQPVRFVRSIRP，分子量为2002；17肽有机化合物c的氨基酸序列为：CCWLLRQPVRFVRSIRT，分子量为2004；17肽有机化合物d的氨基酸序列为：CCWLLRQPVRFVRSIRA，分子量为1974。
以上实例说明本发明的17肽有机化合物能与抗B抗体特异性结合，所以能控制因某些血型不合输血后产生的输血反应。
实施例2：竞争性ELISA(蜜二糖)试验
试验方法：用100μL/孔的抗B型血单克隆抗体(滴度1：128)包被96孔酶标板，4℃过夜。5％BSA室温封闭2小时，用5mM的TBS缓冲液洗板3次后，加入的ELISA液为不同浓度的蜜二糖与噬菌体原液的混合液100μL。以下步骤同前。计算出抑制率＝(未加蜜二糖OD450-加入蜜二糖OD450)/未加蜜二糖OD450*100％
试验结果：蜜二糖能非常好的抑制抗B型血单克隆抗体与阳性克隆的结合，低达0.003mM的浓度就可以看出作用，随着蜜二糖浓度的升高，300mM浓度时的抑制率达到了80％以上，这说明了阳性克隆很可能就结合在蜜二糖与抗B型血单克隆抗体结合的位点。结果参见图1。
以上实例说明了17肽有机化合物与抗B单克隆抗体的特异结合位点(α型Gal)是特异性的，正好起到封闭抗B单克隆抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
实施例3：小肽抑制A型人血清与猪红细胞的凝集反应
试验方法：先把制备好的新鲜2％猪红细胞悬浮在PH＝7.4的磷酸缓冲液中备用。在V型血凝板的孔里，40ul小肽用磷酸缓冲液依次逐孔倍比稀释后，每孔分别加入40ul适当稀释的A型血人血清和40ul 2％的猪红细胞。然后把此120ul混合液在室温下先用震荡器震荡1分钟，再静置1小时后观察凝集结果。如果红细胞沉淀到孔的底部，呈一边缘光滑的圆点，则此为没有凝集。如果红细胞并不下沉到孔底，而呈边缘粗糙的网络，此为出现凝集。试验必须设空白、阳性对照。
试验结果：此小肽预先能与A型人血清中的抗Gal-α-1，3-Gal抗体结合，使它失活。这样此抗体就不能再与猪红细胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原结合，从而使猪红细胞凝集起来。结果参见图2。1，2，3孔为空白对照，4，5，6孔为阳性对照(1，2，3孔不凝集，4，5，6孔出现凝集)；加入蜜二糖后的试验结果(从600mM-15mM的蜜二糖都能抑制红细胞的凝集)；加入小肽后的试验结果(前三孔能抑制红细胞的凝集，后三孔由于浓度稀释对红细胞的凝集抑制作用不完全)；加入阴性克隆后的试验结果(不能抑制A型血人血清对猪红细胞的凝集)。
图2中：A1-A3为空白对照，即用40ul猪红细胞和磷酸缓冲液混匀后静置1小时的结果。此结果为未出现凝集。(红细胞沉于底部，聚集于一点)。
A4-A6为阳性对照，即用40ul磷酸缓冲液稀释60倍的A型人血清和40ul猪红细胞混匀后静置1小时的结果。此结果为出现凝集。(红细胞形成一网络，并不下沉到孔底)。
B，C两条均为蜜二糖抑制猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释蜜二糖，使蜜二糖的浓度形成600mM，300mM，150mM，75.5mM，37.75mM，18.875mM的梯度，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释60倍的A型人血清和40ul猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(低达18.875mM浓度的蜜二糖就能够抑制猪红细胞凝集)。
D，E两条均为阳性阳性克隆抑制猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释一定浓度的阳性克隆(方法同上面的蜜二糖试验)，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释60倍的A型人血清和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(前三孔能抑制红细胞的凝集，后三孔由于浓度稀释对红细胞的凝集抑制作用不完全)。
F，G两条均为阴性阳性克隆不能抑制猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释一定浓度的此阴性阳性克隆(方法同上面的蜜二糖试验)，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释60倍的A型人血清和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(阴性阳性克隆不能抑制A型血人血清对猪红细胞的凝集)。
以上实例用形象而直接的方式说明了17肽有机化合物除了能与抗B单克隆抗体结合外，还能与人体内预存的抗猪抗原的抗体特异性结合，从而封闭它的作用，起到了抑制猪异种移植超急性排斥反应的发生。
实施例4：17肽有机化合物抑制BS-I-B4与猪红细胞的凝集反应
试验方法：操作上同前一试验，唯一不同处是前试验加入的人血清替换成本试验2ug/ml的BS-I-B4。
试验结果：此小肽预先能与BS-I-B4特异性地结合，从而使BS-I-B4失活而不能使猪红细胞凝集起来。参见图3。1，2孔为空白对照，3，4孔为阳性对照(1，2，孔不凝集，3，4，孔出现凝集)，加入蜜二糖后的试验结果(从600mM-15mM的蜜二糖都能抑制红细胞的凝集)，加入小肽后的试验结果(前三孔能抑制红细胞的凝集，后三孔由于浓度稀释对红细胞的凝集抑制作用不完全)加入阴性克隆后的试验结果不能抑制BS-I-B4对猪红细胞的凝集)。
图3中：A1，A2为空白对照，即用40ul 2％猪红细胞和磷酸缓冲液混匀后静置1小时的结果。此结果为未出现凝集。(红细胞沉于底部，聚集于一点)。
A3，A4为阳性对照，即用40ul磷酸缓冲液稀释的2ug/mg的BS-I-B4和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。此结果为出现凝集。(红细胞形成一网络，并不下沉到孔底呈一边缘光滑的圆点)。
B，C两条均为蜜二糖抑制BS-I-B4使猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释蜜二糖，使蜜二糖的浓度形成600mM，300mM，150mM，75.5mM，37.75mM，18.875mM的梯度，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释的2ug/mg的BS-I-B4和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(低达18.875mM浓度的蜜二糖就能够抑制猪红细胞凝集)。
D，E两条均为阳性阳性克隆抑制BS-I-B4使猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释一定浓度的此阳性克隆(方法同上面的蜜二糖试验)，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释的浓度为2ug/mg的BS-I-B4和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(前三孔能抑制红细胞的凝集，后三孔由于浓度稀释对红细胞的凝集抑制作用不完全)
F，G二条均为阴性阳性克隆不能抑制BS-I-B4猪红细胞凝集的试验结果，即1-6孔分别用磷酸缓冲液倍比稀释一定浓度的此阴性阳性克隆(方法同上面的蜜二糖试验)，然后每孔分别各加入40ul磷酸缓冲液稀释的浓度为2ug/mg的BS-I-B4和40ul 2％猪红细胞混匀后静置1小时的结果。(阴性阳性克隆不能抑制BS-I-B4对猪红细胞的凝集)。
此实施例说明了17肽有机化合物与人体内预存的天然抗体的结合位点(α型Gal)是特异性的，正好起到封闭抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。