一种检测鸡腹脂性状的单核苷酸多态性分析方法 【技术领域】
本发明涉及一种检测动物数量性状的方法，特别是涉及一种用分子生物学技术检测鸡腹脂性状的方法。背景技术
脂肪是机体的主要成分，对于动物维持正常生理功能及代谢起着重要作用，适当的脂肪储备是生命活动所必须的。当摄入能量超过正常需要时，多余的能量就会转化为脂肪沉积下来。肝脏是禽类合成甘油三酯的主要场所。肝脏中合成的甘油三酯主要以极低密度脂蛋白(VLDL)形式经门脉系统运输到脂肪或其它组织中去，在脂蛋白酶的作用下VLDL中的甘油三酯被贮存在脂肪组织中或用作代谢所需地能量。鸡的脂肪性状是一种数量性状，鸡体内脂肪蓄积的主要部位是脂肪组织，一定量的皮下脂肪使胴体外形美观，但腹部，嗉囔周围等部位的脂肪基本上不会被人们利用，而是直接抛弃，造成很大的浪费，降低饲料转化率。腹脂占肉仔鸡活重的2-3％，控制多余脂肪沉积，降低腹脂重，建立起低脂系的肉鸡品系，既有利于改善鸡肉品质，又可以降低肉仔鸡生产成本，将给养禽业及消费者带来巨大的经济效益。
1972年Ockner等从肠细胞液组分中分离出一种脂肪酸结合蛋白(fatty acid bindingprotein，FABP)，发现它的一种功能是将脂肪酸从刷状缘膜向光滑内质网移位，另一功能是防止细胞内堆积游离脂肪酸。FABP优先地结合长链脂肪酸并有效地促进酯化反应，有利于甘油三酯的重新合成。目前发现FABP家族的8个成员都参与脂肪酸从细胞膜到细胞内的利用过程(Veerkamp，Maatman 1991)。此外，FABP可能还参与诸如基因转录、细胞信号、生长及分化等过程。FABP家族迄今为止发现有四种：小肠、肝脏、心脏及脂肪组织脂肪酸结合蛋白。在哺乳动物中有两种脂肪酸结合蛋白被作为肌间脂肪(IMF)的候选基因，一种是心脏脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid binding protein，H-FABP)，另一种是脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocytefatty acid-bindin gprotein，A-FABP)。H-FABP基因主要在心脏和骨骼肌细胞表达，对肌肉内脂肪酸含量影响显著。A-FABP基因主要在脂肪细胞中表达，在猪A-FABP基因的第一个内含子检测到了一个微卫星序列，对六个猪种的测试发现具有多态性。在杜洛克群体中，A-FABP的遗传变异和IMF含量有关。在禽类中，相应的脂肪酸结合蛋白已经在肝脏、肌肉、小肠、视网膜和脂肪组织中被分离出来。然而到目前为止这些脂肪酸结合蛋白基因序列还没有报道过，只是在氨基酸序列上进行分析和比较，其中肌肉脂肪酸结合蛋白(muscular fatty acidbinding protein)与人的心脏脂肪酸结合蛋白在氨基酸水平上有80％的同源性。在鸡胚中分离出了细胞外脂肪酸结合蛋白(extracellular fatty acid bind ing protein，EX-FABPs)，主要在外周组织中表达，在细胞外的体液和血清中优先结合长链不饱和脂肪酸，对于甘油三脂的合成和脂肪酸的代谢起着很重要的作用，即腹脂的性状与细胞外脂肪酸结合蛋白有关。Giannoni，P.Dozin，等人(1999)已经成功地克隆并测序了鸡的EX-FABP基因，其序列全长为5148bp(GeneBank，AF121346)，包括6个外显子，共编码178个氨基酸。发明内容
本发明的目的是提供一种用分子生物学技术，即单核苷酸多态性(SNPs)，来检测鸡腹脂性状的方法。
一种检测鸡腹脂性状的单核苷酸多态性分析方法，是用下述两对引物中的至少一对引物对鸡的总DNA进行PCR扩增，然后用单链构象多态(SSCP)方法进行单核苷酸多态检测。
第一对引物，正向：5′-TGCGTGACAGGGCATTCTT-3′
反向：5′-CCAGCATGAAGTGGTGTTGA-3′
第二对引物，正向：5′-CCGTCTGTCCATCCATCCTG-3′
反向：5′-CAGCCCTGACAACAAAAGCA-3′
利用第一对引物扩增后，用单链构象多态(SSCP)方法进行单核苷酸多态(SNPs)检测，可以检测出细胞外脂肪酸结合蛋白基因的第3698位碱基是C还是T，利用第二对引物扩增后，用单链构象方法进行单核苷酸多态检测，可以检测出细胞外脂肪酸结合蛋白基因的第1669位碱基是否插入C。
当细胞外脂肪酸结合蛋白基因的3698位碱基是C时，其纯合体鸡的基因型为GG，3698位碱基是T时，其纯合体鸡的基因型为HH，它们的杂合体基因型为GH，其中具有HH基因型鸡的腹脂重、腹脂率显著低于具有GG，GH基因型鸡的腹脂重和腹脂率，HH基因型鸡的腹脂重比具有GG、GH基因型鸡的腹脂重分别低10.99克和5.31克，腹脂率分别低0.64％和0.30％，差异达到极显著水平(P＜0.01)，而其它屠体性状(屠体重、胸肌重、腿肌重、肝重)在这些基因型间没有显著的差异(P＞0.05)，因此，用该片段作为标记对鸡腹脂进行选择时不会影响其它屠体性状。当1669位碱基处插入C时，其纯合体鸡的基因型为BB，1669位碱基处未插入C时，其纯合体鸡的基因型为AA，它们的杂合体基因型为AB，其中具有BB基因型鸡的腹脂重、腹脂率显著高于具有AA，AB基因型鸡的腹脂重和腹脂率，BB基因型鸡的腹脂重比具有AA、AB基因型鸡的腹脂重分别高17.86克和18.41克，腹脂率分别高1.22％和1.25％，差异达到极显著水平(P＜0.01)，但其它屠体性状(屠体重、胸肌重、腿肌重、肝重)在这些基因型间没有显著的差异(P＞0.05)，因此，用该片段作为标记对鸡腹脂进行选择时不会影响其它屠体性状。通过计算机软件BSDM(Binding site distribution matrix)分析蛋白和DNA结合位点关系，表明第1对引物扩增的片段中的两处碱基突变没有结合位点的改变，而第2对引物扩增的片段中的C碱基的插入导致此处多了一个转录启始cap信号位点。同时可以推测，细胞外脂肪酸结合蛋白基因是影响腹脂性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的基因。
本发明巧妙地采用PCR-SSCP法检测SNPs。由于BB基因型的鸡具有较高的腹脂重和腹脂率，比群体均值高30.19％和30.65％，而HH基因型的鸡有较低的腹脂重和腹脂率，比群体均值低16.42％和14.55％，因此可以利用细胞外脂肪酸结合蛋白基因3698及1669这两个位点，以其单独或合并基因型对腹脂性状进行选择，为鸡的育种工作中标记辅助选择或标记辅助渗入的工作提供了一个更为有效、简便易行、多态信息含量更高的分子遗传标记，为鸡的腹脂性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加快育种的速度与进程。本发明操作简单，费用低，精确度高，可自动化进行检测。使用本发明中的BBGG基因型对鸡腹脂进行选择时，可以使鸡腹脂量提高40.55％；使用本发明中的AAHH基因型对鸡腹脂进行选择时，可以使鸡腹脂量降低14.55％，将会取得很大的经济效益。具体实施方式
一、实验材料
1、菌株和克隆载体
所用菌株如表1所示。
表1：所用菌株菌株名称 表型及基因型 DH5α supE44 ΔLac169(Φ80 LacZ ΔM15)hsdR17 RecA endAl gyrA98 thi-1 recAl JM109 recAl supE44 endAl hsdr17 gryA96 relAl thiΔ(lac-proAB)F′〔traD36 proAB+laIq LacZ ΔM15〕
所用的克隆载体为：
pGEM 3zf(+/-)vectors
pGEM 7zf(+/-)vectors
PGEM-T Vectors
上述载体均来自Promega公司
2、实验动物组织样与血样
以明星肉鸡、丝毛乌骨鸡以及明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F2代为实验素材，其中肉鸡做父本为正交系，乌骨鸡做父本为反交系，正反交各三个家系共557只鸡。12周龄时翅静脉采血，草酸盐抗凝，酚仿抽提之后，TE溶解-20℃保存。之后屠宰，分割称量屠体重(g)、胸肌重(g)、腿肌重(g)、肝重(g)和腹脂重(g)并计算出相应的产率。
3、酶与试剂
各种限制性内切酶和修饰酶分别购自华美生物工程公司、Biolab公司和Promega公司；试剂购自化学试剂商店。
4、DNA分析软件
同源性分析软件：GENETYX-MAX8.5，
PCR引物设计软件：OLIGO4.0，
数据分析软件：SAS(6.12版本).
二、实验方法
1、缓冲液、试剂的配制
TE缓冲液：10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高压灭菌。高压灭菌条件为1.034×105Pa，20min。
STE缓冲液：0.1M NaCl，10mM Tris·Cl，1mMEDTA pH8.0，高压灭菌。
50X TAE缓冲液：Tris碱242g，冰乙酸57.1ml，0.5MEDTA(pH8.0)100ml，加水至1L。
5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA(pH8.0)20ml，加水至1L。
质粒DNA提取溶液I：50mM葡萄糖，2.5mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，高压灭菌10磅15min，贮存于4℃。
质粒DNA提取溶液II：0.2M NaOH，1％SDS，现配现用。
质粒DNA提取溶液III：5M乙酸钾溶液60ml，冰乙酸11.5ml，灭菌水28.5ml。
IPTG溶液：IPTG 1g溶解于50ml双蒸水中，过滤除菌，分装贮存于-20℃。
1M Tris·Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
0.5M EDTA：EDTA 186.1g溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
3M NaAc(pH7.0)：NaAc·3H2O 408.1g溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌。
3M NaAc(pH5.2)：NaAc·3H2O 408.1g溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至5.2，定容至1000ml，高压灭菌。
1M CaCl2：CaCl2·6H2O 27g加水至100ml，过滤灭菌，贮存于-20℃。
10％SDS：SDS 100g溶于900ml双蒸水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH值至7.2，定容至1000ml。
RNaseA溶液：100mg/ml溶于10mM Tris·Cl(pH7.5)，15mM NaCl中100℃煮沸10min，室温冷却后，贮存于-20℃。
禽血裂解液：120g尿素，10g SDS，100ml Tris.cl(1M，PH＝8.0)，200ml EDTA(0.5M，PH＝8.0)，蒸馏水定容至1升。
血液DNA提取液：10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，20μg/ml胰RNA酶，0.5％SDS。
组织DNA提取液： 母液浓度 工作浓度 RNA酶 10mg/ml 20ug/ml 蛋白酶K 10mg/ml 100-200ug/ml DNA提取液 1M Tris Cl(pH8.0) 50mM 0.5M EDTA(pH8.0) 100mM 2MNaCl 100mM 10％SDS 1％
2、感受态细胞的制备(CaCl2法)
挑取DH5α或JM109大肠杆菌原种，在LB琼脂板上划线培养
↓挑取刚培养好的新鲜单菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃培养至OD600达到0.4-0.5。将菌转移至一预冷的灭菌100ml离心管中，冰浴10-15min
↓
4000rpm，4℃离心10min，以回收细菌沉淀
↓
加入20ml冰预冷的0.1M CaCl2悬浮细菌沉淀，然后冰浴10-15min
↓
4000rpm，4℃离心10min，回收细菌沉淀
↓
加入4ml 0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，这时的细胞可直接用于转化实验。
↓
加甘油至终浓度为15％-20％，混匀，分装成200μl一小份，冻存于-70℃
3、质粒DNA的小规模提取——碱裂解法
(1)接种一单菌落于3ml含70ug/ml Amp的LB液体培养基中，220rpm，37℃振荡培养过夜(8-10hr)。
(2)10,000rpm，4℃离心5min(无4℃条件常温亦可)，收集菌体。
(3)适量STE重悬细菌沉淀，3ml培养物沉淀在一个1.5ml离心管中，4℃离心5min，收集菌体。
(4)倒尽STE液体，加入200ul溶液I，振荡充分悬浮细胞于溶液I中。
(5)加入新配制的溶液II 200ul，将管迅速颠倒混匀10次，室温静置5min。
(6)加入溶液III 200ul，将管倒置振荡1min，冰浴5min。
(7)1,2000rpm离心8min，小心取上清于离心管中。
(8)用与上清等体积的Tris饱和酚、酚/氯仿、氯仿顺次抽提一次，保留水相。
(9)加入1/10体积的pH5.2的3M NaAc，再加2体积的无水乙醇，-70℃冰箱内沉淀15min。
(10)离心弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀。
(11)离心弃上清，真空抽干，去除痕量乙醇。
(12)加入50ul TE同时加1ul RNase放入37℃中2小时。
(13)电泳检查含量。
4、质粒DNA的大量制备
接种大肠杆菌单菌落于100ml LB液体培养基中，37℃培养过夜
↓
4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，弃上清
↓
将细菌沉淀用20ml冰预冷的STE溶液重悬，按上述方法重新离心，去上清，倒
置，吸干残留液，加入冰预冷的质粒提取溶液I 2ml，将细菌沉淀重悬
↓
加入200μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml溶于10mM Tris·Cl，pH8.0)，混匀
↓
加入4ml新配制的质粒提取溶液II，盖紧离心管盖，缓慢颠倒数次，
充分混匀内容物，于室温放置5-10min
↓
加2ml用冰预冷的质粒提取溶液III，将离心管颠倒数次，
冰浴15min，可看见有白色絮状沉淀产生
↓
12,000rpm，4℃离心20min
↓
将上清转移至另一离心管中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，于室温放置10min
↓
10000rpm，室温离心15min，回收质粒沉淀
↓
去除上清，用70％乙醇洗沉淀一次，稍抽干，溶于1ml TE中
↓
加入5μl RNaseA(5mg/ml)，37℃消化1hr
↓
转移至小离心管，用等体积的苯酚，苯酚∶氯仿，氯仿，各抽提一次
↓
加入1/5体积的l0M NH4AC，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置30min
↓
12,000rpm，室温离心10min
↓
弃上清，用70％乙醇洗沉淀两次，真空抽干，溶于适量TE中，储存于-20℃.
5、重组质粒大小的快速鉴定——Cracking法
挑取转化后在x-gal平板培养的白色菌落，在另一块含有Amp的
LB板上划线培养12-16hr，同时挑一蓝斑做对照
↓
用牙签挑取少量菌体，涂于含有20μl灭菌水的离心管内
↓
振荡，充分悬浮菌体后，加入等体积20μl的2×Cracking buffer，剧烈振荡2min
↓
12,000rpm离心5min后，取上清10-20μl上样电泳，以蓝斑的裂解物作对照，检测质粒是否有插入及其大致大小。
6、自鸡血中提取总DNA
取20μl新鲜血液，加ACD抗凝，加入600μl禽裂解液，加入蛋白酶k至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化6-10hr，直至溶液中不再有粘稠的团块
↓
将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，反复颠倒离心管，
直至两相混合形成乳浊液，12,000rpm，室温离心10min
↓
取上清，再用等体积酚∶氯仿，氯仿各抽提1次
↓
取上清加1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀DNA
↓
将DNA挑出放到一1.5ml离心管中，用70％乙醇洗两次
↓
将DNA干燥后溶于适量TE或灭菌双蒸水中。7、目的片段的制备(冻融法)(1)取10μg质粒DNA，200μl体系，10u内切酶37℃酶切3hr。(2)加入25.8μl 1M Tris·Cl(pH7.5)，10u内切酶，加ddH2O至300μl 37℃酶切2hr。(3)取少量酶切产物检查酶切效果。(4)0.8％琼脂糖，胶上电泳分离目的片段。(5)切下含目的片段凝胶，切碎，置于1.5ml离心管。(6)加入等体积苯酚混匀。(7)液氮中放置3-5min，室温解冻，重复二次。(8)8000g，离心8min。(9)取上清加等体积酚仿，氯仿各抽一遍。(10)加2倍体积无水乙醇1/10倍体积3M NaAc(pH5.2)，于-20℃放20min。(11)1,2000rpm离心10min。(12)70％乙醇洗一遍，抽干溶于20μl TE(pH8.0)。(13)测OD值，电泳检查。8、将PCR产物连到T载体上连接体系：
10×T4 DNA连接酶缓冲液 1μl
T4 DNA连接酶(3u/μl) 1μl
T载体(30ng/μl) 1μl
PCR产物 60ng
加dd H2O至 10μl
16℃水浴过夜9、转化(1)从-70℃取出保存的感受态细胞，冰浴助融。(2)200μl感受态细胞加入5μl连接产物，冰浴30min。(3)42℃水浴热激90秒，冰浴2min。(4)加800μl LB，37℃水浴复活50min。(5)铺200μl于含X-gal，IPTG，Amp的LB平板。(6)37℃培养9-16hr。10、筛选重组子(1)挑取白斑划线于涂有X-gal，IPTG，Amp的平板。(2)接划线菌于2ml LB中，过夜培养。(3)碱变性提取重组质粒。(4)内切酶消化0.5μg DNA。(5)电泳检查。11、制备模板(1)碱变性制备模板。(2)调浓度至0.1-0.2μg/μl。12、Dye Primer对阳性克隆作部分测序(1)碱裂解法准备模板，稀释至0.1-0.2μg/μl(2)PCR测序反应体系：碱基A C G T模板(μl)1 1 2 2Premix(μl)4 4 8 8总体积(μl)5 5 10 10(3)PE9600 PCR反应a、95℃，30秒；55℃，30秒；70℃，1min；15个循环。B、95℃，30秒；70℃，1min，15个循环。(4)沉淀PCR产物
a.将反应物加入到含100μl 95％乙醇，1.5ml离心管中。
b.冰上放置15min。
c.12,000rpm，离心15min。
d.250μl 70％的乙醇洗一遍。
e.抽干，-20℃保存，准备测序上样。
13、利用玻璃奶洗脱法回收PCR产物
(1)从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5ml Eppendorff管中捣碎。
(2)加入3倍体积的溶胶液，室温下放置5min(或50℃保温3min)。
(3)加入10μl玻璃奶，颠倒混匀，冰浴下放置10min，间隔2-3min混匀一次。
(4)12,000rpm离心30秒，吸弃上清。
(5)加250μl漂洗液，用加样器吸漂洗液将玻璃奶冲散均匀，离心弃上清。
(6)重复第5步一次。吸取完漂洗液后，再离心10秒钟，用Tip头将最后一点儿漂洗液吸干净。然后，放置于37℃温箱干燥20min。
(7)加适量无菌蒸馏水或TE(10-30μl)，混匀。60℃水浴5min。
(8)12,000rpm离心1min，回收上清备用，重复第7-8步1-2次。
14、PCR扩增
(1)25μl PCR反应体系：2.5μl 10×Taq DNA聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明胶)，2μl dNTPs(2.5mmol/L for each)，引物终浓度0.5μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng，终体积25μl。
PCR反应条件：
94℃4min，然后94℃30S，58℃30S，70℃30S，30个循环，最后72℃7min，4℃长时间保存。
用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
(2)10μl PCR反应体系：1μl 10×Taq DNA聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明胶)，0.8μl dNTPs(2.5mmol/L foreach)，引物终浓度0.5μmol/L，0.5U Taq DNA聚合酶，模板DNA 25-50ng，终体积10μl。
PCR反应条件：
94℃4min，然后94℃30S，58℃30S，70℃30S，30个循环，最后72℃ 7min，4℃长时间保存。
用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，
15、SSCP分析
12％非变性聚丙烯酰胺凝胶(25ml体积，0.1cm胶条)制作、电泳及染色过程如下：
(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用0.8％o琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。
(2)在100ml烧杯内加入30％丙烯酰胺10.0ml，2.5ml的50％甘油，5xTBE 5ml，10％过硫酸铵0.175ml，TEMED8ul，加入纯水7.325ml，混合后迅速灌胶。
(3)当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚和半小时，多余的丙烯酰胺4℃保存。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。
(4)凝胶聚合好后，向电泳槽加入1xTBE，用注射器冲洗加样孔。
(5)预电泳10分钟，同时准备点样。
(6)取Iul PCR产物置于PCR管中，加5ul变性Buffer，离心混匀，98℃变性10分钟。
(7)迅速冰浴10分钟，用微量注射器点样。
(8)打开电源，150伏，电泳14-16小时。
(9)电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70％乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10-15分钟。
(10)去离子(或蒸馏水)水洗胶2遍，每次2分钟，洗去乙醇。
(11)用200ml染色液染色30分钟。
(12)去离子水洗胶3遍，每次2分钟，洗去多余的染色液。
(13)用200ml显色液显色，约10-30分钟，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液。
(14)去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存。
实施例1、细胞外脂肪酸结合蛋白基因3698位碱基是C还是T与鸡腹脂的相关性
用本发明的第一对引物对实验鸡的全血DNA进行PCR扩增，然后进行SSCP分析，细胞外脂肪酸结合蛋白基因3698位碱基是C时，其纯合体鸡的基因型为GG，3698位碱基是T时，其纯合体鸡的基因型为HH，它们的杂合体基因型为GH，同时测量相应的腹脂重，并计算腹脂重最小二乘均值及腹脂率最小二乘均值，结果如表2所示。
表2基因型 个体数 基因型频率 腹脂重最小二乘均值 腹脂率最小二乘均值 GG 61 0.12 51.49a 0.0340a GH 110 0.21 45.81b 0.0306b HH 342 0.67 40.50c 0.0276c a -5.495 -0.0032 d -0.185 -0.0002 D 0.03 0.06
注：均值比较时同一列字母相同的差异不显著(P＞0.05)
D：显性度D＝d/a：a＝(HH-GG)/2；d＝GH-(GG+HH)/2表中的统计数据表明，用本发明的第一对引物扩增产生的HH型相对于GG、GH等其它基因型有较低的腹脂重和腹脂率，且差异极显著(P＜0.001)
实施例2、细胞外脂肪酸结合蛋白基因1669位碱基处是否插入C时与鸡腹脂的相关性
用本发明的第二对引物对实验鸡的全血DNA进行PCR扩增，然后进行SSCP分析，细胞外脂肪酸结合蛋白基因1669位碱基处插入C时，其纯合体鸡的基因型为BB，1669位碱基处未插入C时，其纯合体鸡的基因型为AA，它们的杂合体基因型为AB。同时测量相应的腹脂重，并计算腹脂重最小二乘均值及腹脂率最小二乘均值，结果如表3所示。
表3基因型 个体数 基因型频率 腹脂重最小二乘均值 腹脂率最小二乘均值 AA 255 0.49 45.23a) 0.0300a) AB 218 0.43 44.68a) 0.0297a) BB 39 0.08 63.09b) 0.0422b) a -8.93 -0.0061 d -9.48 -0.0064 D 1.06 1.05
注：均值比较时同一列字母相同的差异不显著
D：显性度D＝d/a；a＝(AA-BB)/2；d＝AB-(AA+BB)/2
表中的统计分析结果表明，本发明的第二对引物扩增区分出的BB型相对于AA和AB等基因型有较高的腹脂率，且差异极显著(P＜0.001)。
实施例3、鸡细胞外脂肪酸结合蛋白基因合并基因型对脂肪性状的影响
用本发明的两对引物对实验鸡的全血DNA进行PCR扩增，然后进行SSCP分析，细胞外脂肪酸结合蛋白基因3698位碱基是C时，其纯合体鸡的基因型为GG，3698位碱基是T时，其纯合体鸡的基因型为HH，它们的杂合体基因型为GH。细胞外脂肪酸结合蛋白基因1669位碱基处插入C时，其纯合体鸡的基因型为BB，1669位碱基处未插入C时，其纯合体鸡的基因型为AA，它们的杂合体基因型为AB。同时测量相应的腹脂重，并计算腹脂重最小二乘均值及腹脂率最小二乘均值。由于第2对引物的BB基因型对鸡腹脂有增高作用，而第1对引物(C-T)HH基因型对鸡腹脂有降低作用，因此将这两个位点的基因型合并起来对腹脂进行选择比单个标记选择的作用更大。由表4的数据可以看出，这两个基因型间互作效应不显著。由表5的数据可以看出，具有BBGG、BBGH基因型的个体腹脂重和腹脂率最高，具有AAHH、ABHH基因型的个体腹脂重和腹脂率最低。
表4：基因互作的最小二乘分析结果 腹脂重 腹脂率 df F值 P F值 P引物2 2 14.47 0.0001 16.32 0.0001引物9(C-T) 2 8.65 0.0002 6.54 0.0015基因互作 4 2.00 0.1125 1.68 0.1747
表5：两对引物合并基因型对腹脂重和腹脂率的影响基因型 个体数 基因型频率 腹脂重最小二乘均值 腹脂率最小二乘均值AAGG 61 0.12 55.68a 0.0357aAAGH 110 0.21 43.48b 0.0289bAAHH 84 0.17 40.42b 0.0277bABGG 82 0.16 45.34b 0.0302bABGH 115 0.22 44.84b 0.0299bABHH 21 0.04 40.59b 0.0263bBBGH 23 0.05 60.22ac 0.0405acBBGG 16 0.03 68.54c 0.0545c
注：均值比较时同一列字母相同的差异不显著(P＞0.05)
对于鸡细胞外脂肪酸结合蛋白基因第3698位及1669位碱基两个位点的分析均表明，在利用这两个位点选择时，可以改变鸡腹脂性状而不会影响到其它屠体性状，因此将这两个位点合为单倍型分析脂肪性状会产生更好的效果。在合并基因型中BBGG基因型的腹脂重(68.54g)要高于单位点BB基因型的腹脂重(63.09g)，而合并基因型中AAHH基因型的腹脂重(40.42g)略低于单位点HH基因型的腹脂重(40.50g)，因此用合并基因型对腹脂性状进行标记辅助选择会比用单位点基因型选择起到更好的效果。在合并基因型中，没有出现BBHH基因型的组合，这与单个位点的分析是一致的，因为BB基因型代表的是高腹脂基因型，而HH基因型代表的是低腹脂的基因型。