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1、10申请公布号CN104262457A43申请公布日20150107CN104262457A21申请号201410417885522申请日20140822C07K7/06200601A61K38/08200601A61P35/00200601A61P37/0020060171申请人亚飞（上海）生物医药科技有限公司地址201203上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路780号4楼N座72发明人刘辰刘源74专利代理机构上海信好专利代理事务所普通合伙31249代理人张静洁贾慧琴54发明名称一种水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物及用途57摘要本发明公开了一种水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物及用途，该。
2、多烯紫杉醇的抗肿瘤药物的结构式为其中，R1为ALA，THR，VAL或ILE中的任意一种氨基酸；R2为ALA，THR，VAL或ASN中的任意一种氨基酸，N1150中的任意整数。本发明提供的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物具有水溶解性好,肿瘤特异靶向性,以及促进免疫治疗的特性,与多烯紫杉醇相比,其抑制肿瘤生长和转移的药效具有很大的提高，且药物的毒性大大降低，其抗肿瘤作用更高效、安全，具有非常好的应用前景。51INTCL权利要求书2页说明书23页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书23页10申请公布号CN104262457ACN104262457A1/2页21一种。
3、水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，其特征在于，该多烯紫杉醇衍生物的结构式为其中，R1为ALA，THR，VAL或ILE中的任意一种氨基酸；R2为ALA，THR，VAL或ASN中的任意一种氨基酸；N1150中的任意整数。2如权利要求1所述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，其特征在于，该多烯紫杉醇衍生物为化合物S1，其中，N1，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸，该S1的结构式为3如权利要求1所述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，其特征在于，该多烯紫杉醇衍生物为化合物S2，其中，N5，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸，该S2的结构式为4如权利要求1所述的水溶性肿瘤靶向激活的。
4、多烯紫杉醇衍生物，其特征在于，该多权利要求书CN104262457A2/2页3烯紫杉醇衍生物为化合物S3，其中，N11，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸，该S3的结构式为5如权利要求1所述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，其特征在于，该多烯紫杉醇衍生物为化合物S4，其中，N150，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸，该S4的结构式为6如权利要求1所述的水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物，其特征在于，水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物为S10S24中的任意一种。7一种采用权利要求16中任意一项所述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其特征在于，该抗肿瘤药物。
5、能用于不同癌症类型疾病的治疗，所述的不同癌症类型包括膀胱癌、脑癌、乳房/乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌和血癌。8如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物用于制备放射性治疗中辅助使用的抗肿瘤药物。9如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物用于制备免疫治疗和免疫治疗中的协同治疗药物。10如权利要求7的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物是由所述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物与药用辅料组成的药物组合物。权利要求书CN104262457A。
6、1/23页4一种水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物及用途技术领域0001本发明涉及一种抗肿瘤药物化合物，具体地，涉及一种水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物的抗肿瘤药物制备方法和用途。背景技术0002多烯紫杉醇DOCETAXEL是一种目前广泛使用的有效的抗肿瘤剂，00030004主要用于各种实体肿瘤如卵巢癌和乳腺癌的治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。然而，临床上应用这一化合物因为具有严重的毒副作用如骨髓抑制和致敏反应，而被限制其使用剂量。多烯紫杉醇具有骨髓毒性,造成中性粒细胞减少,具有神经毒性和心血管毒性，并能够引发过敏反应，溢出血管外可引起局部的炎症、脱发、。
7、乏力甚至带来肝脏毒性。因此，需要提供一种能降低多烯紫杉醇毒性，并可提高药物使用剂量和具有高度药效的靶向性激活药物作为抗肿瘤剂。本发明提供的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇与多烯紫杉醇相比,具有抗肿瘤靶向性,特异的激活特性和免疫促进的特性，抑制肿瘤生长和转移的药效具有很大的提高，且药物的制剂改变，并且毒性大大降低，具有非常好的应用前景。发明内容0005本发明目的是提供一种水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，该多烯紫杉醇衍生物中，由于多烯紫杉醇结合了恰当的基团而减弱了毒性,同时由于连接基团在肿瘤部位聚集和特异性激活而释放多烯紫杉醇,成为更低毒和有效的抗肿瘤药物。0006为了达到上述目的，本发明提供了一。
8、种水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇的抗肿瘤药物，该化合物的结构式为0007说明书CN104262457A2/23页50008其中，R1为ALA丙氨酸，THR苏氨酸，VAL缬氨酸或ILE异亮氨酸中的任意一种氨基酸；R2为ALA，THR，VAL或ASN天冬氨酸中的任意一种氨基酸，N1150中的任意整数。0009上述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇的抗肿瘤药物，其中，当N取1，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸时，该多烯紫杉醇衍生物为S1，该S1的结构式为00100011上述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇的抗肿瘤药物，其中，当N取5，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸时，该多烯紫杉醇衍生物为。
9、S2，该S2的结构式为00120013上述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇的抗肿瘤药物，其中，当N取11，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸时，该多烯紫杉醇衍生物为S3，该S3的结构式为0014说明书CN104262457A3/23页60015上述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇的抗肿瘤药物，其中，当N取150，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸时，该多烯紫杉醇衍生物为S4，该S4的结构式为00160017本发明水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，其中，所述的紫杉醇衍生物包括本发明提供的化合物S10S24为实施例1024制得，其N为5,R1和R2结构分别为下列化合物见表10018表1。
10、化合物S10S240019编号R1R2NS10丙氨酸苏氨酸5S11丙氨酸缬氨酸5S12丙氨酸天门冬酰胺5S13苏氨酸丙氨酸5S14苏氨酸苏氨酸5S15苏氨酸缬氨酸5S16苏氨酸天门冬酰胺5S17缬氨酸丙氨酸5说明书CN104262457A4/23页7S18缬氨酸苏氨酸5S19缬氨酸缬氨酸5S20缬氨酸天门冬酰胺5S21异亮氨酸丙氨酸5S22异亮氨酸苏氨酸5S22异亮氨酸缬氨酸5S24异亮氨酸天门冬酰胺50020本发明还提供了上述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物制备抗肿瘤药物的用途。该抗肿瘤药物能用于不同癌症类型疾病的治疗，所述的不同癌症类型包括膀胱癌、脑癌、乳房/乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠。
11、癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌和血癌等。0021上述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物制备抗肿瘤药物的用途，其中，该抗肿瘤药物还能用于免疫治疗。0022上述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物制备抗肿瘤药物的用途，其中，该抗肿瘤药物还能用于肿瘤手术后防止和治疗肿瘤转移。0023上述的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物制备抗肿瘤药物的用途，其中，该抗肿瘤药物能用于放射性治疗中的辅助抗癌药物使用。0024本发明提供的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，实验设计思路来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过。
12、连接复杂化合物到多烯紫杉醇上的2位或7位即分别将复杂化合物连接到多烯紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上，再通过肿瘤组织或天冬酰胺肽链内切酶LEGUMAIN存在时激活效率的大小进行多烯紫杉醇效率筛选，并依次筛选所得化合物在R1、R2，以及N取不同值时对肿瘤的抑制作用，最终得到毒性降低、释放效率高的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物。其中水溶性靶向激活的多烯紫杉醇的结构为我们首次合成和报道。该化合物不同部分的结构对水溶性靶向激活的多烯紫杉醇的靶向、激活、稳定、毒性和药效等功能产生巨大影响。水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物能够通过复杂的化学连接封闭多烯紫杉醇的毒性，而使其在肿瘤组织中的肿瘤细胞或肿。
13、瘤相关巨噬细胞中才能够被天冬酰胺肽链内切酶有效激活，从而靶向的释放毒性，达到治疗肿瘤的效果。取得肿瘤靶向性，封闭毒性和高效激活是与整个化合物整体的构效关系相关的。通过R1、R2，以及N的筛选研究发现R1、R2，以及N的选择也具有一定的构效关系，但从实验可以看出N优选的取值范围为1150时获得的治疗效果几乎相同。水溶性靶向激活的多烯紫杉醇能够有效降低多烯紫杉醇的毒性,却增加了治疗肿瘤的效果,形成了强烈的构效关系。0025本发明提供的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物还基于如下发现00261水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物在肿瘤部位具有聚集，滞留和激活效应,具有靶向肿瘤微环境的特性；说明书CN1。
14、04262457A5/23页800272水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物能够被肿瘤组织特异性的激活或断裂,生成多烯紫杉醇；00283在体外体内代谢实验中水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物在血液中并不激活,具有长期的血液稳定性和对正常组织器官低毒的特性；00294水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物的毒性相比多烯紫杉醇大大降低；00305化合物短肽的两边基团,以及多烯紫杉醇的偶连位置直接决定了药物的激活释放,以及药物的溶解性,稳定性和有效性都密切相关；如果药物无法激活,药物是一个无细胞毒性的药物，将不会具有疗效；00316水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物在多种肿瘤激活，加上溶解性的改变,直接能够改变多。
15、烯紫杉醇肿瘤适应症限制的情况，直接成为广谱性药物；00327水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物的长度也具有不同的影响，即N不同长度的药物对整体药物的激活有影响,随着N值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔计量的药物质量数增大，但是因为N值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效并没有降低。经实验发现，在N选自1150的范围内，多烯紫杉醇衍生物能取得的治疗效果没有明显变化。00338理论上由于肿瘤细胞转移时，该多烯紫杉醇衍生物对应的天冬氨酸等蛋白酶水解活性升高,所以其对肿瘤转移治疗具有特殊的疗效。0034肿瘤相关巨噬细胞M2型区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞M1型确认标记就是天冬酰胺肽链内切酶的表达。。
16、肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞,肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制和直接帮助肿瘤细胞浸润和转移。我们的研究中发现肿瘤微环境释放性多烯紫杉醇具有杀伤肿瘤相关巨噬细胞,减弱微环境中免疫抑制的细胞因子和促进毒性CD8细胞的免疫增强现象。其中，更重要的是，肿瘤微环境释放性多烯紫杉醇只在肿瘤局部激活,不同于传统化疗药物会损伤整体免疫系统,在我们的实验中肿瘤微环境释放性多烯紫杉醇和PD1程序性死亡分子1，PROGRAMMEDDEATH1抑制抗体PDL1抗体，市售，是目前认为具有免疫治疗效果的候选药物具有强烈协同治疗作用,能够解决免疫治疗很难与化疗药物结合使用的弊端。0035本。
17、发明所述水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述药物为由水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物与药用辅料组成的药物组合物。0036综上所述，本发明提供的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物具有抗肿瘤靶向性，特异的激活活性和免疫促进的特性，相对于多烯紫杉醇，其抑制肿瘤生长和转移的药效具有很大的提高，且药物的毒性大大降低，具有非常好的应用前景。迄今为止，尚未有专利和文献报道与我们相同的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇，更没有与我们相似的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇药物用于治疗人体肿瘤的有效方法。具体实施方式0037本发明提供的水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，该多烯紫杉醇衍生物的结构式为003。
18、8说明书CN104262457A6/23页90039其中，R1为ALA丙氨酸，THR苏氨酸，VAL缬氨酸或ILE异亮氨酸中的任意一种氨基酸；R2为ALA，THR，VAL或ASN天冬氨酸中的任意一种氨基酸，N1150中的任意整数。0040当N取1，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸时，该多烯紫杉醇衍生物为S1，该S1的结构式为00410042当N取5，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸时，该多烯紫杉醇衍生物为S2，该S2的结构式为00430044当N取11，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸时，该多烯紫杉醇衍生物为S3，该S3的结构式为0045说明书CN104262457A7/23页。
19、100046当N取150，R1取ALA氨基酸，R2取ALA氨基酸时，该多烯紫杉醇衍生物为S4，该S4的结构式为00470048下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步地说明。0049实施例1水溶性靶向激活的多烯紫杉醇S1的合成00501二2甲氧基乙氧基乙酰基L赖氨酸乙酯I的合成0051将22甲氧基乙氧基乙酸161MG,12MMOL溶于N,N二甲基甲酰胺10ML中，冰浴冷却后，搅拌下加入27偶氮苯并三氮唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸酯462MG,12MMOL、N,N二异丙基乙基胺313MG,24MMOL和L赖氨酸乙酯二盐酸盐100MG,04MMOL，加毕，室温搅拌过夜，减压蒸除溶剂，粗品经反相。
20、制备柱纯化得I128MG，收率778。00522二2甲氧基乙氧基乙酰基L赖氨酸II的合成0053将二2甲氧基乙氧基乙酰基L赖氨酸乙酯I122MG,03MMOL溶于四氢呋喃15ML中，冷却至0下滴加氢氧化锂39MG,09MMOL水溶液5ML，室温搅拌反应2小时。冰浴冷却下以浓盐酸调PH至2，蒸除四氢呋喃后冻干，得粗品II112MG，收率99，未经纯化直接用于下一步。00543二2甲氧基乙氧基乙酰基LLYSLALALALALASNTRT对氨基苄醇III的合成0055将二2甲氧基乙氧基乙酰基L赖氨酸112MG,03MMOL溶于N,N二甲基甲酰胺10ML中,冷却至0下滴加3二乙氧基邻酰氧基1,2,3苯。
21、并三嗪4酮109MG,036MMOL、LALALALALASNTRT对氨基苄醇188MG,03MMOL和N,N二异丙基乙基胺117MG,09MMOL，加毕，室温下搅拌过夜。减压蒸除溶剂，粗品经反相制备柱纯化得III159MG，收率540。说明书CN104262457A108/23页1100564二2甲氧基乙氧基乙酰基LLYSLALALALALASNTRT对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯IV的合成0057于三口瓶加入二2甲氧基乙氧基乙酰基LLYSLALALALALASNTRT对氨基苄醇167MG,017MMOL溶于四氢呋喃10ML中，冷却至0下滴加氯甲酸对硝基苯酯73MG,036MMOL和吡啶39MG。
22、，050MMOL。室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，粗品经反相制备柱纯化得IV153MG，收率785。00585二2甲氧基乙氧基乙酰基LLYSLALALALALASN对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯V的合成0059将二2甲氧基乙氧基乙酰基LLYSLALALALALASNTRT对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯IV100MG,0087MMOL溶于三氟乙酸1ML中，滴入两滴水，立即用油泵抽干，得粗品V80MG，未经纯化直接用于下一步。00606二2甲氧基乙氧基乙酰基LALALALALASN对氨基苄基多烯紫杉醇S1的合成0061将二2甲氧基乙氧基乙酰基LLYSLALALALALASN对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯1176。
23、MG，13MMOL和多烯紫杉醇1293MG,16MMOL用干燥的N,N二甲基甲酰胺20ML溶解，冷却至0下加入DMAP318MG,26MMOL，室温搅拌过夜。将反应液倒入二氯甲烷中，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，粗品经反相制备柱纯化得目标产物S1511MG,收率25。质谱MS检测结果S1的对应质荷比分别为1573与结构计算获得分子量157369相对应0062S2,S3,S4的合成参照S1的合成，区别仅在于第1步的合成使用的烷氧基取代乙酸的分子量的不同。S2的合成是以3,6,9,12,15,18六氧杂十九酸替代22甲氧基乙氧基乙酸；S3的合成是以3,6,9,12,15,18。
24、,21,24,27,30,33,36十二氧杂三十七酸替代22甲氧基乙氧基乙酸；S4的合成是以多氧杂脂肪酸替代22甲氧基乙氧基乙酸；质谱MS检测结果S2,S3的对应质荷比分别为1926,2454,与结构计算获得分子量192611和245474相对应。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱MALDITOFMS检测S4分子量约为14964,与结构计算获得分子量1496456相对应，如表2所示。0063表2化合物S1S4的性状、质谱及荧光测试结果0064说明书CN104262457A119/23页120065实施例10240066合成方法与实施例S1相近,只是氨基酸连接时原料不同如下表3所示。将对应的R1。
25、氨基酸和R2氨基酸溶于N,N二甲基甲酰胺中,分别加入缩合剂如1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐反应，于025反应052H，再加入天门冬酰胺；，于025反应224H。反应液经后用纯化处理,得到3肽,将三肽按实施例1中的方法替代ALAALAASN为合成中间替制备S10S24化合物。质谱MS检测结果确认S10S24化合物分子量依次如下表,与结构计算预测的分子量相符合。0067表3化合物S10S24的性状、质谱及荧光测试结果00680069说明书CN104262457A1210/23页130070实施例2水溶性靶向激活的多烯紫杉醇中化合物不同基团对药物的制剂方案的巨大影响0071合成的S1,S2,。
26、S3和S4和各种对照化合物分别经过真空干燥，通过气体灭菌无菌处理，在无菌室进行分装。在动物实验前，S1,S2,S3和S4在无菌室中用溶剂1注射用水或溶剂230酒精,70注射用水溶解,再用注射用水稀释到所需浓度；而对比化合物C1,C2,C3,C4,C5,C6不满足药物的制剂要求,如下表4所示。多烯紫杉醇不溶于水，改造后的多烯紫杉醇溶解特性发生巨大变化，在水中的溶解度增加,溶解特性的变化对药物的制剂方案有巨大影响。与传统的不溶于水的多烯紫杉醇药物相比,S1,S2,S3和S4可产生可溶性的药物制剂,能提高注射剂量和疗效,避免如多烯紫杉醇使用过敏性辅料蓖麻油,是药物可开发使用的巨大进步,表明了水溶性靶。
27、向激活的多烯紫杉醇具有非常好的创新性和应用前景。0072表4采用筛选药物溶解性试验，对照化合物中近似不同成分的缺失或多烯紫杉醇7位或2位连接即，分别将基团2链接到多烯紫杉醇的2位或7位的OH上对药物制剂溶解性影响。0073说明书CN104262457A1311/23页14化合物溶剂1溶剂2C1AAN基团2注2多烯紫杉醇2位连接不溶不溶C2基团1注1AANL多烯紫杉醇2位连接不溶不溶C3AAN多烯紫杉醇2位连接不溶不溶C4基团1注1AAN基团2注2多烯紫杉醇7位连接不溶不溶C5基团1注1AANL基团2注2多烯紫杉醇2位连接不溶可溶C6基团1注1AANK基团2注2多烯紫杉醇2位连接不溶不溶S1不溶。
28、可溶S2可溶可溶S3可溶可溶S4可溶可溶0074注1基团1的结构为0075注2基团2的结构为下文中涉及的基团1与基团2与此相同；0076其中，表1中的AAN、AANL、AANK分别代表化合物中小肽氨基酸的连接符号，A代表ALA、N代表ASN、L代表LEU、K代表LYS。0077本发明提供的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，实验设计思路来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到多烯紫杉醇上的2位或7位即分别将复杂化合物连接到多烯紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上，再通过肿瘤组织或天冬酰胺肽链内切酶存在时激活效率的大小进行多烯紫杉醇效率筛选，并依次筛选。
29、所得化合物在R1、R2，以及N取不同值时对肿瘤的抑制作用肿瘤组织特异性的激活位点是AAN与基团2之间的连接处，激活断裂后，基团2能够自释放，而进一步释放出多烯紫杉醇。因为天冬酰胺肽链内切酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部,切割位点需要接近酶活中心,这时复杂化合物对切割位点是否有空间位阻变为非常重要。0078通过筛选实验的结果,我们推测基团2的连接，可以有效避免直接连接多烯紫杉醇带来的空间位阻，而不影响天冬酰胺肽链内切酶的接近。而基团1的构效关系能够增加切割位点的极性,使更水溶性的蛋白酶更容易接近酶切位点,而增加切割效率。连接到多说明书CN104262457A1412/23页15烯紫杉醇第2位也显。
30、然减少了多烯紫杉醇对蛋白酶的空间位阻和暴露的更多的整体亲水极性基团,增加切割效率和水溶性。0079实施例3S1,S2,S3和S4含量测定的方法及含量范围。0080S1,S2,S3和S4使用分析型HPLC安捷伦1220AGILENT1220SERIES，C8柱5M,46MMID250MM,流动相为095乙腈ACN，纯度在9599。0081实施例4水溶性靶向激活的多烯紫杉醇中化合物不同基团的连接与多烯紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。0082多烯紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。在我们的实验中,在37温度下100微克酸化的肿瘤组织匀浆中的蛋白酶加入1。
31、毫克/毫升的化合物,肿瘤组织匀浆能够促使释放多烯紫杉醇。通过HPLC能够检测化合物的减小和多烯紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率,通过筛选发现目前的化合物连接在筛选的化合物中具有最高的激活效率,同时在不同肿瘤类型中的激活也说明了药物治疗的广谱性见表5。同时比较化合物筛选过程中产生的特定化合物,分析在同一组织中的计划激活效率,通过筛选发现本发明的化合物S1,S2,S3,S4连接在筛选的化合物中具有最高的激活效率。见表6。0083表5S1,S2,S3,S4的激活测定，不同肿瘤组织匀浆中的S1,S2,S3,S4的化合物激活比例0084说明书CN104262457A1513/23页160085。
32、表6筛选对比化合物中近似不同成分的变化或多烯紫杉醇7位或2位连接对MDAMB231肿瘤激活药物的影响0086化合物激活效率C1AAN基团2紫杉醇2位连接175C2基团1AAN紫杉醇2位连接466C3AAN紫杉醇2位连接385C4基团1AAN基团2紫杉醇7位连接163说明书CN104262457A1614/23页17C5基团1AANL基团2紫杉醇2位连接674C6基团1AANK基团2紫杉醇2位连接566S1基团1AANL基团2紫杉醇2位连接934S2916S3906S48850087由表6可看出，多烯紫杉醇2位连接的激活效率远远高于7位连接。0088上述结果说明本发明水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物。
33、不同基团的连接与紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。S1,S2,S3,S4在不同肿瘤类型中10种不同肿瘤的激活说明了药物激活的广谱性表5。同时比较化合物筛选过程中产生的特定化合物,分析在同一人乳腺癌MDAMB435肿瘤组织中的激活效率,实验证明S1,S2,S3,S4化合物的各基团选择是相对更高激活效率表6。0089实施例5受试药静脉用药最大耐受剂量MTD的测定0090试验目的通过测定小鼠静脉用药MTD实验，了解本新药制剂的急性毒性。0091治疗药物S1,S2,S3和S4注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。009。
34、2动物一级巴比赛BALB/C小鼠，体重1921G,全为雌性。0093方法和结果受试BALB/C小鼠210只，体重1921G，按体重随机分为21组，每组10只。如表7所示，按0MG/KG,125MG/KG,150MG/KG，175MG/KG,200MG/KG一次性静脉注射S1,S2,S3和S4注射液，并且，进行生理盐水组、多烯紫杉醇组注射的对照试验，给药体积02ML。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。0094表7受试小。
35、鼠分别接受不同剂量的S1、S2、S3和S4注射液与生理盐水、多烯紫杉醇注射液的死亡率结果对照0095说明书CN104262457A1715/23页180096说明书CN104262457A1816/23页190097结果与讨论注射S1,S2,S3和S4注射液的小鼠组，在175MG/KG剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表7所示S1和S2注射液的MTD值约为150MG/KG，远大于多烯紫杉醇的MTD值25MG/KG，受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明靶向激活释放的多烯紫杉醇的毒性比多烯紫杉醇显著降低。0098实施例6S1,S2,。
36、S3和S4注射液在裸鼠NUDEMICE中的药效研究0099试验目的通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1,S2,S3和S4药物的抗肿瘤药效。0100治疗药物S1,S2,S3和S4注射液和多烯紫杉醇注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。0101方法和结果01021动物裸鼠，68周龄，全为雌性。01032产生肿瘤模型01041人前列腺癌PC3CELLS细胞从美国模式培养物集存库AMERICANTYPECULTURECOLLECTION，ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10胎牛血清达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基简称，DMEM培养液在37，5的二氧化碳条件下培养。每3天传。
37、代一次，细胞使用在15代以内。01052肿瘤产生，将5106PANC1细胞皮下注射到裸鼠NUDEMICE小鼠背部，待肿瘤长至少达100MM3左右时随机分组，开始治疗,以开始治疗当天为第一天。01063治疗过程0107根据S1,S2,S3和S4临床用药使用静脉注射即IV注射，S1,S2,S3和S4都使用小于1/6MTD的计量25毫克/公斤剂量，多烯紫杉醇药物治疗组使用1/3MTD的计量83说明书CN104262457A1917/23页20毫克/公斤剂量,对照组使用生理盐水,每周一次给药，共4周。01084分组与结果测量如下表8所示0109表8S1,S2,S3和S4药物、多烯紫杉醇及对照组对裸鼠治。
38、疗肿瘤的效果011001115结果与讨论由表8可知，与等摩尔浓度的多烯紫杉醇药物治疗组对照组比较，在S1,S2,S3和S4治疗组的肿瘤生长抑制效果被大大提高。0112实施例7S1,S2,S3和S4药物在D121肿瘤免疫模型的药效研究0113试验目的通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解S1,S2,S3和S4药物的抗肿瘤药效。0114动物C57小鼠,68周龄，全为雌性。0115产生肿瘤模型01161D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10胎牛血清DMEM培养液在37，5的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。01172肿瘤免疫,小鼠腹腔注射51。
39、05经过照射死亡的D121肺癌细胞购自美国模式培养物保藏所,免疫注射3次,每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞,然后再给药,每周一次给药，共4周。01183肿瘤产生在第32天,将106活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0304CM左右时开始治疗。说明书CN104262457A2018/23页2101194肿瘤CD8T细胞分析。肿瘤组织经过匀浆,过滤分离出肿瘤中单个细胞,用缓冲液洗两次,白细胞共同抗原CD45PE和T淋巴细胞抗原CD8FITC标记的抗体在室温1小时结合,细胞用包含1胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次,然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原CD45阳性细。
40、胞中T淋巴细胞抗原CD8阳性细胞的比例，该比例升高则显示T淋巴免疫细胞增多，表明了动物体内的针对肿瘤的免疫力提高。01205分组与结果测量如表9所示。0121表9S1,S2,S3和S4药物、多烯紫杉醇治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果01220123说明书CN104262457A2119/23页2201246结果与讨论由表9可知，与免疫对照组和其他治疗对照组相比较,S1,S2,S3和S4在C57小鼠的治疗效果大大提高，S1与PDL1抗体具有良好的协同促进免疫和协同治疗效果作用，能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。0125实施例8S1,S2,S3和S4药物在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效。
41、研究0126试验目的通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解S1,S2和S3药物的抗肿瘤药效。0127治疗药物S1,S2,S3和S4注射液和多烯紫杉醇注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。01281动物BALB/C小鼠,68周龄，全为雌性。01292产生肿瘤模型013014T1CELLS从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10胎牛血清DMEM培养液在37，5的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。01312肿瘤转移的产生，将106T1CELLS细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至15CM左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开。
42、始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液BOUINSSOLUTION中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。说明书CN104262457A2220/23页2301323治疗过程根据S1,S2,S3和S4临床用药使用IV注射，S1,S2,S3和S4和都使用1/6MTD的计量,176微摩/公斤剂量，多烯紫杉醇药物治疗组使用1/6MTD的计量3微摩/公斤剂量,对照组使用生理盐水,每三天一次给药，共4次。01334分组与结果测量如表10所示0134表10S1,S2,S3和S4药物、多烯紫杉醇治疗组及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果013501365结果与讨论如表10所。
43、示，与多烯紫杉醇治疗组对照组比较，在S1,S2,S3和S4组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。0137实施例9S1注射液在多肿瘤模型的药效研究0138试验目的通过小鼠的多肿瘤模型，了解S1的抗肿瘤药物的广谱性。0139治疗药物S1注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。0140方法和结果01411动物裸鼠，68周龄，全为雌性。01422产生肿瘤模型01431对应的细胞从美国模式培养物集存库AMERICANTYPECULTURECOLLECTION，ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10胎牛血清达尔。
44、伯克氏改良伊格尔氏培养基简称，DMEM培养液在37，5的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。01442肿瘤产生，将5106对应细胞皮下注射到裸鼠NUDEMICE小鼠背部，待肿瘤长至少达100MM3左右时随机分组，开始治疗,以开始治疗当天为第一天。01453治疗过程0146根据S1临床用药使用IV注射，S1都使用1/6MTD的计量176微摩/公斤剂量，说明书CN104262457A2321/23页24对照组使用生理盐水,每周一次给药，共3周。01474分组与结果测量如下表11所示0148表11S1在多肿瘤模型的治疗效果0149015001515结果与讨论如表11所示，S1在。
45、多种肿瘤模型中具有良好的药效,说明药物已经成为一个广谱性的肿瘤治疗药物。0152本发明的一些实施例实施例1024，合成方法与实施例S1相近中，对于不同氨基酸结构的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇的激活特性、抑瘤率及抑制转移率分别进行了测试，测试方法与上述实施例4,6,8相同，测试结果如表12所示0153表12实施例1024的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇的激活特性、抑瘤率及抑制转移率结果0154说明书CN104262457A2422/23页2501550156结果与讨论如表12所示，实施例1024的化合物具有一定激活活性和肿瘤生长和转移抑制效果，说明我们筛选个的过程具有优化激活和疗效的实际意义，通过上述。
46、优选化合物的实施例，应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的R1和R2位的氨基酸替换和改变都将是显而易见的。0157在本发明的一些实施例中，还合成了其他的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇化合物，其中，N1150中的任意整数，R1为ALA，THR，VAL或ILE中的任意一种氨基酸；R2为ALA，THR，VAL或ASN中的任意一种氨基酸；并做了上述的制剂方法同实施例2、MTD测说明书CN104262457A2523/23页26试方法同实施例5、对肿瘤的疗效研究方法同实施例6、7、转移疗效方法同实施例8及多肿瘤疗效方法同实施例8的实验，并取得了与S1S。
47、4相似的实验结果。经实验证明，N1150范围内，随着N增大，抑瘤率轻微下降。随着N值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔计量的药物质量数增大，但是因为N值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效只是轻微下降，在N选自1150的范围内，均能到达本发明实施例S1S4相近的技术效果。0158综上所述，本发明合成了水溶性靶向激活的多烯紫杉醇的抗肿瘤药物，并通过毒性和药效试验证明化合物比多烯紫杉醇具有更低的毒性的，更好的制剂方法，同时药物,免疫治疗和直接治疗都药效大大提高,并具有治疗适应症扩大和对肿瘤转移有特效的显著特征,具有良好的实际治疗应用价值。0159尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。说明书CN104262457A26。