诱导植物病害抗性的组合物及其产生方法 【发明领域】
本发明涉及诱导植物病害抗性的组合物及产生该组合物的方法，其中所述组合物是以丝状真菌菌丝或子实体作为原料，也是环保的并且对使用者和消费者是安全的。
背景技术
农作物病害防除的主要常规方法包括使用化学农药的方法和使用微生物农药或生物的方法，其中所述化学农药如杀真菌剂或侵染抑制剂，微生物农药如拮抗微生物，生物方法如使用天敌生物。
在大部分化学农药中，通过直接作用于植物致病真菌而防除病害。除了化学农药外，还使用抗性诱导型农药，其中通过增强植物本身所拥有的病害抗性来防除农作物的病害。
多数情况下，农药对植物致病真菌表现出明显的作用。但持续使用这些农药在许多情况下会导致产生抗这些农药的突变体。另一方面，抗性诱导型农药通过诱导植物的抗性而不是通过直接作用于植物致病真菌来防除病害感染的。由于这种机制，到目前为止对于抗性诱导型农药还没有出现抗性突变体的报导。因此，可以认为抗性诱导型农药对包括其他生物在内的环境的影响相对较小。
在农业生产中，要求建立可持续的农业生产技术。为了满足这种要求，开发具有环境意识的农业材料是一项重要的任务。
此外，近几年来消费者对安全食品需求的不断增加导致了对有机农产品的日益增长的需求，这些有机农产品是通过利用农业的自然循环机能培育出来地。根据日本农林渔业部颁布的指导方针，在生产有机农产品中使用的材料限于天然存在的有用的矿物质、植物、动物和从上述物质中取出、提取或制备的天然物质。当期望将这些物质作为农药时，例如用于防除病害和害虫时，只有根据农用化学品管理法注册的农药能够被使用，并且抗生素是不能被使用的。
因此，用于有机农产品生产的防除物质是有限的。于是人们期待着来源于天然存在物质的高效病害防除剂作为常规化学农药的替代品。具有上述的抗性诱导型病害防除效果、也就是说能预防性地防除病害且来源于天然存在材料的农业材料的供给，能够使其实现成为对作为使用者的农业生产者和消费者是安全的、同时也能够降低环境负担的农药。
到目前为止，用于植物病害抗性诱导的农药局限于“Oryzemate”(通用名：烯丙异噻唑，明治制果株式会社生产)和“Bion”(通用名：苯并噻二唑(acibenzolar-S-methyl)，Novartis生产)，它们注册为稻瘟病防除剂。
已经报道的其它诱导病害抗性的物质是植物抗毒素诱导剂，如多糖分解产物(特开平5-331016号)和uasmonic acid(ジヤスモン酸)衍生物(特开平11-29412号)。
在上面以诱导病害抗性为目的农药中，针对多种作物病害的防除作用是通过诱导植物抗性实现的，而不是直接作用于植物致病真菌。因此，到目前为止，没有关于对这些农药出现抗性突变株的报道。然而，所有这些都是化学合成的农药，不符合指导方针。此外也应该注意到，尽管作为植物的一种病害抗性反应，上述的植物抗毒素诱导剂诱导产生植物抗毒素，但在上述公开中关于实际的病害防除效果没有清楚的描述。
同样地，已经作为植物抗毒素诱导剂被报道的脑苷脂在实际应用水平对水稻病害(イネ病)有防除效果(特许第2846610号和WO98/47364)。脑苷脂是一种鞘糖脂，并且是其中己糖通过糖苷键连到脑胺伯醇上的糖脂。鞘糖脂作为膜组分在各种生物体中广泛存在并且已经用来作为高度安全的化妆品成分。具有病害抗性诱导活性的鞘糖脂被认为是属于脑苷脂(KogaJ.等人(1998)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，48(27)，31985-31991)。已经知道脑苷脂B分布于绳状青霉(Penicillium funiculosum)(KawaiG.，Ikeda Y.，Tubaki K.(1985)农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)49(7)，2137-2146)、香菇(Lentinus edodes)(Kawai G.(1989)生物化学和生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)1001(2)185-190)、pachybasium sp.(Sitrin R.等人(1988)抗生素杂志(J.Antibiot.)41(4)，469-480)和丝核菌属(Rhizoctonia sp.)(Umemura K.等人，植物细胞生理学(Plant CellPhysiology)41(6)，676-683)。脑苷脂B含有由式(I)代表的结构：
在WO98/47364中，公开了脑苷脂B是一种水稻病害防除剂。在该专利中公开的防除剂是从植物致病真菌提取得到的。此外，还应该注意到，到目前为止，还没有关于脑苷脂B和其它脑苷脂针对除水稻外的农产品具有病害防除效果的报道。
关于担子菌中脑苷脂的分布，已经得知脑苷脂包含于生Shiitake香菇(香菇)子实体的乙醇提取液中(Kawai G(1989)化学和生物物理学报1001(2)185-190)，并且能够用丙酮从培养的裂褶菌(Schizophyllum commune)Fr.(スエヒロタケ)菌丝中提取到脑苷脂(特公昭63-52878号)。然而，上述公开中所描述物质的活性是子实体诱导活性，并且其中没有提到植物病害抗性的防除效果。
关于作物栽培中的担子菌提取液的利用，例如，特公昭56-44040号中描述的利用提取液来达到增加农作物的产量或促进生长的目的，以及特公昭57-48087号中描述的利用提取液来促进柑桔属植物色素形成和增加糖含量。然而，所有这些作用均为含水提取液显示的。
通常，已知病害抗性诱导物质的活性依不同的植物物种而不同。葡聚糖，是葡萄糖聚合物，是到目前为止报导的作为微生物来源的抗性诱导物质的代表实例。诱导大豆病害抗性的葡聚糖在水稻中不诱导任何抗性反应。另一方面，诱导水稻植物病害抗性的葡聚糖对大豆也没有任何抗性诱导能力(Sharp K.(1984)生物化学杂志259，11321-11336，和Yamaguchi T.(2000)植物细胞(Plant Cell)，12，817-826)，表明尽管这些物质都归类于葡聚糖但对作物不同的反应依赖于聚合的方法。此外，有报道称花生四烯酸可诱导马铃薯的抗性(Bostock M.(1981)科学(Science)212，349-360)。然而，没有关于在除马铃薯外的其它作物中诱导抗性的报道。因此，认为抗性诱导物质具有作物物种依赖的特异性活性。
发明概述
在这些情况下，本专利的发明者已经研究了诱导植物病害抗性组合物，所述组合物使用各种各样的丝状真菌包括食用真菌作为原材料，并且组合物包含丝状真菌中含有的鞘糖脂作为活性成分。结果，他们已经惊奇地发现丝状真菌来源的鞘糖脂具有针对水稻植物病害和多种除水稻外的作物的病害防除效果。
此外，本专利的发明者还发现与鞘糖脂一起从丝状真菌中提取到的脂溶性物质可有效地起到铺展剂的作用。当从丝状真菌中提取鞘糖脂并用作活性成分时，无需重新加入铺展剂，因为脂溶性物质也与鞘糖脂一起被提取。从提高工作效率和降低成本的观点看这是非常有利的。本专利的发明者还进一步发现含有从丝状真菌中提取到的脂溶性物质的组合物可高水平地使活性成分渗透转移进植物体。
而且，本专利的发明者已经发现用有机溶剂从含有鞘糖脂的丝状真菌提取得到的粗提物具有植物生长抑制活性。本专利的发明者已经发现用有机溶剂提取的丝状真菌粗提物中含有作为诱导抗性物质的杂质而存在的对植物具有生理性抑制活性的物质。本专利的发明者已经成功地在浓缩/分离步骤中有效地去除了这种生理性抑制物质。
因此，本发明的一个目的就是提供一种抗性诱导型病害防除组合物，这种组合物使用的原材料是经摄食或类似试验证明是安全的丝状真菌，对植物没有任何生理学上的抑制活性，对于多种作物物种具有广泛的防除谱，并且是环保的。
根据本发明的一个方面，提供了诱导植物病害抗性的组合物，所述组合物含有来源于丝状真菌的鞘糖脂。
根据本发明的另一个方面，提供了用于产生本发明组合物的方法，其包括如下步骤：搅拌浸于有机溶剂中的丝状真菌的菌丝或子实体以提取鞘糖脂或脂溶性物质到有机溶剂中(有机溶剂提取步骤)；以及对在提取步骤中由有机溶剂提取获得的提取液进行浓缩和然后的沉淀并去除提取液中含有的对植物具有生理性抑制活性的物质(浓缩/分离步骤)。
发明详述
在此处使用的术语“鞘糖脂”是指如式(I)所示的含有长链碱、脂肪酸和糖的化合物。在上下文中，糖的类型和糖的数量没有特殊的限制。
在此处使用的术语“脑苷脂”是指其中糖类部分是己糖的鞘糖脂。
丝状真菌来源的鞘糖脂的结构特征为长链碱部分第9位连接有甲基(Kawai G.，Ikeda Y.，Tubaki K.(1985)农业生物化学，49(7)，2137-2146和Kawai G(1989)生物化学和生物物理学报1001(2)185-190)。已知该结构参与水稻病害抗性诱导活性(Koga J.等人(1998)生物化学杂志，48(27)，31985-31991和Umemura K.等人(2000)植物细胞生理学，41(6)，676-683)。因此，在本发明中，术语“丝状真菌来源的鞘糖脂”是指长链碱部分第9位连接有甲基的鞘糖脂。而且，在本发明中，术语“丝状真菌来源的脑苷脂”是指长链碱部分第9位连接有甲基的脑苷脂。
丝状真菌来源的脑苷脂包括如下脑苷脂：
脑苷脂A：((4E，8E)-N-D-2’-羟基-(E)-3’-十六烷酰基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4，8-sphingadienine)；
脑苷脂B：((4E，8E)-N-D-2’-羟基棕榈酰基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4，8-sphingadienine)；
脑苷脂C：((4E，8E)-N-D-2’-羟基-(E)-3’-十八烷酰基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4，8-sphingadienine)；和
脑苷脂D：((4E，8E)-N-D-2’-羟基硬脂酰基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4，8-sphingadienine)。
本发明的组合物可以包含脑苷脂A、脑苷脂B、脑苷脂C和脑苷脂D中的任一种或两种以上的组合。
本发明的组合物中作为活性成分而包含的鞘糖脂可以从丝状真菌的菌丝或子实体中制备。
优选的丝状真菌包括属于担子菌的微生物和一些用于发酵生产如酶生产、抗生素生产和多醣生产的微生物。
担子菌包括食用担子菌和药用担子菌，食用担子菌如属于侧耳属(Pleurotus)、香菇属(Lentinus)、火菇属(Flammulina)、奇果菌属(Grifola)、蘑菇属(Agaricus)、木耳属(Auriculariales)、银耳属(Tremellales)、鳞伞属(Pholiota)和绣球菌属(Sparassidaceae)的微生物，药用担子菌如属于Wolfiporis属或灵芝属(Ganoderma)的微生物。用于发酵生产的微生物包括那些属于曲霉属(Aspergiilus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、小枝顶孢属(Acremonium)、毛霉属(Mucor)和根霉属(Rhizopus)的微生物。此处可用的优选担子菌实例包括香菇、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、Flammulina velutipes、Glifola frondosa、二孢蘑菇(Agaricus bisporus)、蘑菇(Agaricus campestris)和毛木耳(Auricularia polytricha)。用于发酵生产的优选微生物的实例包括黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和娄地青霉(Penicilliumroquefortii)。
丝状真菌的菌丝或子实体可以是诸如活细胞、细胞的培养液、培养液浓缩物、干燥细胞或它们的包括发酵残渣在内的加工产物等。优选的是子实体的干燥细胞。
当使用丝状真菌的干燥细胞时，用研磨机器如动力研磨机将干燥细胞研磨到溶剂能够轻易地浸透到干燥细胞内的程度时可以实现高效地提取。从实现更高效率提取的观点来看，精细研磨到颗粒可以通过2毫米孔径的筛子的程度是优选的。
在本发明优选的实施方案中，提供了一种产生诱导植物病害抗性的组合物的方法，包括如下步骤：搅拌浸于有机溶剂中的丝状真菌的菌丝或子实体，以将细胞中含有的成分提取到有机溶剂中(有机溶剂提取步骤)；以及浓缩提取步骤中通过有机溶剂提取得到的提取液和然后沉淀并去除提取液中含有的对植物具有生理性抑制活性的物质(浓缩/分离步骤)。由此得到的组合物包含作为活性成分的鞘糖脂和作为铺展剂成分的脂溶性物质。
在本发明中，术语“脂溶性物质”是指能溶于脂肪和油中的物质。用有机溶剂可提取到许多此类脂溶性物质。脂溶性物质的定量测定包括用正己烷进行的简单提取和测定法。来源于丝状真菌菌丝或子实体的脂溶性物质能与作为活性成分的鞘糖脂提取液一起从丝状真菌中提取出来。提取的脂溶性物质含有具有铺展活性的两亲性物质，在施用组合物后，提取的脂溶性物质能提高组合物在叶片上的铺展。因此，可以增强作为活性成分的鞘糖脂在植物体的铺展和渗透转移。在诱导植物病害抗性的本发明组合物中，当从丝状真菌提取活性成分时，提取液中也含有铺展剂成分。因此，在应用时无需添加任何额外的铺展剂。即便需要使用额外的铺展剂，也是仅添加少量的铺展剂便足以达到预期的结果。从提高工作效率和降低成本的角度来看是有利的，同时还能降低对环境的影响。
在提取步骤中，将有机溶剂加入到丝状真菌中，搅拌混合物，活性成分提取完成之后，进行固-液相分离以分离为有机溶剂提取液和用于提供有机溶剂提取液的残渣。在提取步骤中使用的有机溶剂包括乙醇、甲醇、己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、氯仿和丙酮。为获得高效提取，优选的溶剂是乙酸乙酯和氯仿。然而，当组合物作为病害防除剂用于培育有机农产品时优选使用乙醇。
根据所使用的有机溶剂和丝状真菌的情况选择适当的提取条件。提取时液体的温度优选地为15-80℃。而且，为了提高产量，残渣可以进行重提取以进一步获得活性成分。为了达到这个目的，可以采用这样的方法，其中在固—液相分离之后，再次使残渣浸入有机溶剂，并且将混合物进行固—液相分离以分离有机溶剂提取液。并将该提取液加到以前得到的有机溶剂提取液中。
在浓缩/分离步骤中，浓缩有机溶剂提取液以增加活性成分和铺展剂成分的含量，同时去除对植物具有生理性抑制活性的物质。
通过常规方法，如冷冻干燥、真空浓缩或加热蒸馏，可以实现浓缩。然而，由于在升高的温度下浓缩是不利的，所以优选地采用真空浓缩。在加热蒸馏时，浓缩可在80℃以下的温度下进行。
可以进行浓缩以使浓缩物中脑苷脂B的含量优选地为0.4-3.0mg/ml，更优选地为0.9-3.0mg/ml，作为正己烷提取物的脂溶性物质含量优选地为10-200mg/ml，更优选地为30-100mg/ml。当然，进行浓缩时也可以脑苷脂B以外的其他脑苷脂含量为指标。浓缩时，体积优选地降低到浓缩之前体积的五分之一到三十分之一，更优选地是1/10-1/20。
浓缩物中，作为正己烷提取物的脂溶性物质含量小于10mg/ml时，有时对植物有生理性抑制作用的成分不能作为沉淀物被去除。另一方面，当浓缩过度使得脂溶性物质的含量大于200mg/ml时，再稀释时有时会引起脂溶性物质的分离，这使得不可能得到均一的组分。
本发明诱导植物病害抗性的组合物制剂可以是在农药中所采用的任何一种制剂，它们的实例包括液体制剂、粉剂、颗粒剂、乳油、可湿性粉末、油溶液、气溶胶和飘浮剂(フロアブル)。施用的化学品形式、使用形式和施用方法都没有特别的限制。然而，施用时组合物的浓度要根据脑苷脂的含量而定，优选地为0.5-100μg/ml，更优选地为1-50μg/ml，特别优选地为5-20μg/ml。然而，施用浓度要依据植物种类、生长时期和施用方法而调整到适当的浓度。
本发明的诱导植物病害抗性的组合物可用于保护所有栽培植物，栽培植物的实例包括谷物类(例如水稻、大麦、小麦和玉米)、茄科植物(例如番茄、茄子和马铃薯)、葫芦科植物(例如黄瓜、甜瓜和南瓜)、豆科植物(例如豌豆和大豆)、十字花科植物(例如日本萝卜、大白菜和甘蓝)、蔷薇科植物(例如草莓、苹果和梨)、菊科植物(例如莴苣)、旋花科植物(例如甘薯)、伞形科植物(例如胡萝卜、欧芹和芹菜)和葡萄科植物(例如葡萄藤)。在植物中，一般的病害抗性反应被认为对致病真菌是非特异的。因此，所有的由丝状真菌引起的植物病害作为上述农作物的目标病害被提及，它们的实例包括稻瘟病真菌(Magnaporthe grisea)、稻褐斑病(イネごま葉枯病)真菌(宫部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus))、甘薯茎腐病(つる割れ病)真菌(尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum))、瓜类茎腐病真菌(尖孢镰刀菌f.sp.melonis)、莴苣根腐病真菌(尖孢镰刀菌f.sp.莴苣属)和番茄黄萎病(大丽花轮枝孢(Verticillum dahliae))。
在本发明一个优选的实施方案中提供了一种包含丝状真菌来源的鞘糖脂和脂溶性物质的诱导植物病害抗性的组合物，其中鞘糖脂包含脑苷脂B。
此外，在本发明一个优选的实施方案中还提供了一种包含丝状真菌来源的鞘糖脂和脂溶性物质的诱导植物病害抗性的组合物，其中鞘糖脂包含脑苷脂B，该脑苷脂B的含量是0.4-3.0mg/ml，作为正己烷提取物的脂溶性物质含量是10-200mg/ml。
在本发明的另一个实施方案中提供了一种在目的植物中诱导病害抗性的方法，包括用含有丝状真菌来源的鞘糖脂的组合物处理目的植物的步骤。
此外，在本发明的一个进一步实施方案中提供了一种防除植物病害的方法，包括用含有丝状真菌来源的鞘糖脂的组合物处理靶植物的步骤。
实施例
通过以下实施例进一步阐述本发明，但实施例不用于作为本发明的限制。
实施例1：诱导植物病害抗性的组合物的产生
(1)有机溶剂提取步骤
用动力研磨机(台式动力研磨机P-02，SHOWA GIKEN INDUSTRIAL有限公司制造)研磨干燥的shiitake香菇并用1.0mm孔径的筛子收集研磨物。向1kg干shiitake香菇研磨物中加入5L 99.5％的乙醇。将混合物保持在25℃，持续搅拌24小时进行提取，然后将固—液相分离成第一次乙醇提取液和残渣。然后，将残渣浸于5L 99.5％的乙醇中30分钟洗涤残渣，此后分离为第二次乙醇提取液和残渣。将第一次和第二次乙醇提取液混合在一起得到乙醇提取液。
(2)浓缩/分离步骤
将在有机溶剂提取步骤中得到的混合的乙醇提取液在大气压下、液体温度为80℃条件下进行浓缩，直到液体的体积变为起始体积的1/20。浓缩后，将浓缩物冷却至室温，通过离心去除液体中的最终沉淀，得到大约80ml乙醇提取浓缩液A。用正己烷法测定乙醇提取浓缩液A中的脂溶性物质的含量，并用HPLC法测定乙醇提取浓缩液A中脑苷脂B的含量。结果发现，脂溶性物质和脑苷脂B的含量分别为100mg/ml和2.2mg/ml。
(3)提取液的分析
上面得到的提取液用于如下的分析。
使用TSKgel ODS 120A柱(Tosoh公司制造；4.6mm×300mm)经HPLC分析提取液以测定脑苷脂B和脑苷脂D的含量。分析时，在柱温度为50℃、80％乙醇溶剂和1毫升/分钟流速的条件下，215nm紫外检测到的滞留时间为20.8分钟和24.6分钟的物质的含量分别为定量测定的脑苷脂B含量和脑苷脂D的含量。
脂溶性物质的含量是作为正己烷提取物来测定的(根据1985年日本环境机构第28号通告的附表)。具体而言，在100ml分液漏斗中加入50ml去离子水并向去离子水中加入1ml样品溶液。接着，加入10ml正己烷和0.5g NaCl，将混合物震荡，然后竖直放置。分离后，去除下层，再加入50ml水洗涤。用水洗涤重复两次，回收己烷层。将适量的无水硫酸钠加入到该己烷层中使其脱水。然后用2号滤纸(商标：ADVANTEC，Toyo RoshiKaisha有限公司制造)过滤混合物，滤纸用少量的己烷洗涤。将提取液转移到蒸发容器中在80℃热板上蒸发，然后在干燥器中干燥(80℃)。称重干燥的产物作为正己烷提取物重量。
实施例2：
为了比较不同有机溶剂之间的脑苷脂提取率，测定了从生shiitake香菇中提取到的脑苷脂B和脑苷脂D的含量。所比较的有机溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、正己烷和乙酸乙酯。在100g生shiitake香菇中加入其中一种溶剂(150ml)和30ml水，然后将其放在加水混合器(Ace HomogenizerAM-7，Nihon Seiki Seisakusho有限公司制造)中研磨。将研磨液转移到离心沉淀管中并在振荡器(旋转往复振动器R-30，TIETECH有限公司制造)上振荡12小时，以便将脑苷脂提取到有机溶剂层。用上述的HPLC方法测定溶剂提取的脑苷脂的量，并以每克生shiitake香菇中脑苷脂B和脑苷脂D的含量表示。结果示于表1。发现提取液中含有几种脑苷脂，而不是仅含有脑苷脂B和脑苷脂D(数据省略)。这些脑苷脂对应于Kawai等(生物化学和生物物理学报，1001，1989，185-190)给出的Len I-X。
表1 甲醇抽 提物 乙醇抽 提物 氯仿抽 提物 丙酮抽 提物 正己烷 提取液 乙酸乙酯 提取液脑苷脂B含量，μg/g 25.6 28.8 35.6 25.8 27.8 50.4脑苷脂D含量，μg/g 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.6
实施例3：脑苷脂B含量、脂类含量和浓缩率与防除稻瘟病的保护值之间的关系
对实施例1中乙醇提取浓缩液A制备过程中分别浓缩的浓缩物和进一步浓缩提取浓缩液A所得到的溶液进行脂溶性物质含量、脑苷脂B含量和对稻瘟病的防除效果的检测。对于每种浓缩液的浓缩，将完成提取步骤后的乙醇提取液作为一倍稀释液，并且完成提取后的液体量与浓缩/分离步骤中每一次浓缩操作后的液体量的比率作为浓缩率。这样，可得到1-、2-、5-、10-、20-、30-和50-倍浓缩液用于测试。以正己烷提取物表示脂溶性物质含量。此外，对于每种液体，还比较了所测试液体的铺展性、稀释后液体的状态以及以施用液体后叶片生理性紊乱水平表示的叶表面状态。
为了检测病害防除效果，用以下方法进行了评估测试。具体而言，每盆播种8粒强力萌芽稻种(品种：Akitakomachi)并在空调房间内进行培育，在真叶处于3-4叶龄期时将样品喷到植物上。在本例中，每组样品提供5盆，将具有不同浓缩率的溶液稀释到含10ppm脑苷脂B而制备的液体来处理植物。作为比较试验，将脑苷脂B的标准品稀释到10ppm脑苷脂B而制备的溶液来处理植物。将测试液(每盆2ml)施用于叶子上，并且使植物静置1小时直到叶子上的测试液变干，然后将植物重新置于空调房间内进行培育。脑苷脂B标准品(2mg/ml脑苷脂B溶液)(植物细胞生理学41(6)，676-683(2000))是用Umemura等人的方法分离和纯化到的标准样品。
样品处理3天后，用稻瘟病真菌(Magnaporthe grisea，种：007)分生孢子悬浮液喷雾接种来进行感染处理。喷雾接种后，将植物在黑暗和湿润的条件下静置36小时，使稻瘟病真菌感染植物。此后，将植物转移到空调房间中培养。接种5天后，计数每组样品中第三真叶上的病斑数用于计算保护值。按如下方程计算保护值：保护值＝(1-处理组每片叶子上病斑的平均数/对照组每片叶子上病斑的平均数)×100。对照组中，每盆喷雾2ml水。
结果归纳于表2。当使用低浓缩率样品时，叶子变色表明植物发病。另一方面，当使用高浓缩率样品时，其稀释液受到分离而降低保护值和可操作性。综合考虑叶子状态、铺展性、稀释后液体的状态和保护值，认为提取液优选地浓缩至脑苷脂B的浓度为0.4-3.0mg/ml和作为正己烷提取物的脂溶性物质含量为10-200mg/ml。
表2浓缩率 1(刚提 取后) 2 5 10 20(提取 液A) 30 50脑苷脂B标准品脑苷脂B含量，mg/ml 0.09 0.18 0.45 0.89 1.87 2.89 4.96 -脂溶性物质mg/ml 3 7 14 32 68 98 219 -保护值 80 85 88 91 92 93 70 90铺展性 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ×叶表面状态 × × △ ○ ○ ○ ○ ○稀释后液体状态 ○ ○ ○ ○ ○ △ × ○
铺展性：○正常，×排斥水的。
叶表面状态：○正常，×由于发病变黄或变色，△部分变色。
稀释后液体状态：○正常，×油分离，△部分分离。
实施例4：稻瘟病防除试验
(1)方法
用与实施例3中相同的方法评估防除效果。将实施例1中制备的乙醇提取浓缩液A用水稀释成300倍的稀释液(含10ppm脑苷脂B)，并且测试液处理组(A)的叶片用每盆2ml测试液进行处理。另一方面，在10ppm脑苷脂B溶液中加入0.1％的吐温20作为铺展剂得到测试液。测试液处理组(B)的叶片是用每盆2ml这种测试液进行处理。
(2)结果
结果示于表3。对于对照组，每片叶子的病斑平均数为18.6；对于脑苷脂B处理组(B)，每片叶子的病斑平均数为2.3；和对于乙醇提取浓缩液A处理组(A)，每片叶子的病斑平均数为1.8，表明在所有的组都观察到了显著的病害发生抑制效果。对于保护值，根据本发明的乙醇提取浓缩液A处理组(A)高于脑苷脂B(加入吐温20作为铺展剂)处理组(B)。
表3 实验组A 比较组B 对照组 病斑数 1.8 2.3 18.6 保护值 90.3 87.6 0
实施例5：稻褐斑病防除试验
(1)方法
用与实施例3中稻瘟病防除试验相同的方法(测试植物培育、样品处理方法和处理浓度、以及致病真菌感染方法)，检测了乙醇提取浓缩液A处理组(A)和脑苷脂B处理组(B)中的稻褐斑病防除效果。喷雾接种褐斑病真菌(宫部旋孢腔菌)分生孢子悬浮液2天后计数病斑数。
(2)结果
结果示于表4。对于对照组，每片叶子的病斑平均数为10.2；对于脑苷脂B处理组(B)，每片叶子的病斑平均数为1.3；和对于乙醇提取浓缩液A处理组(A)，每片叶子的病斑平均数为0.9，表明观察到了显著的病害发生抑制效果。对于抑制效果，乙醇提取浓缩液A处理组要好于脑苷脂B处理组。
表4 实验组A 比较组B 对照组病斑数 0.9 1.3 10.2保护值 91.1 87.3 0
实施例6：稻瘟病防除的田间试验
(1)方法
将稻瘟病经常发生地区的水稻种植田随机地分为测试组(每组24平方米)。在移栽水稻(品种：Koshihikari)秧苗第44天和第51天后，进行测试液施用处理。以120升/10公亩的量喷雾处理，每组3块地。各组中样品如下。用实施例1中制备的乙醇提取浓缩液A经水稀释150倍得到的液体(浓度：含20ppm脑苷脂B)处理试验组(E)。用含20ppm脑苷脂B和约0.02-0.03％作为铺展剂的Mylinow(Mairinou)(Nihon Nohyaku有限公司制造)的脑苷脂B溶液处理比较组(F)。用加入约0.02-0.03％的作为铺展剂的Mylinow(Nihon Nohyaku有限公司制造)到RabcideFlowable(Kureha化工有限公司制造)(活性成分：500ppm fthalide)1000倍稀释液中而制备得到的液体处理比较组(G)。
(2)结果
最初施用一个月后，观察植物叶瘟病发生，并且根据由病害发生百分数决定的保护值对各组进行比较。结果示于表5。对于乙醇提取浓缩液A处理组(E)，保护值是95、对脑苷脂B处理组(F)是93、和对比较组(G)是94，表明这些样品可有效防除稻瘟病。此外，乙醇提取浓缩液A处理组(E)的保护值是高于脑苷脂B处理组(F)。因此，证实在实际的种植田中，本发明的用于有机农产品培育的诱导植物病害抗性的组合物所能达到的效果等于或优于农用化学品所能达到的效果。
表5实验组E比较组F比较组G对照组保护值 95 93 94 0
实施例7：甘薯茎腐病防除试验
(1)方法
在植入农田之前，将用甘薯茎腐病真菌(尖孢镰刀菌)感染了的甘薯(品种：Benikomachi)幼苗根部浸于各种样品溶液30分钟。用下述样品溶液处理各组。用实施例1中制备的乙醇提取浓缩液A经稀释150倍得到的液体(浓度：含20ppm脑苷脂B)处理试验组(E)。用含20ppm脑苷脂B的液体处理比较组(H)。每组植株数为20，而每组由4块地组成，每块地之间间隔60cm。在这种情况下将植株植入农田。
(2)结果
植入26天后观察根部病害发生的百分数，并从根部病害发生的平均百分数计算保护值。结果示于表6。对于乙醇提取浓缩液A处理组(E)保护值是79，对脑苷脂B处理组(H)是70。因此，证实本发明诱导植物病害抗性的组合物对实体病害也有防除效果。由于对土壤病害有小的或没有有效的杀真菌剂，对土壤病害的防除可以说是困难的。由于这种原因，常常使用土壤熏蒸消毒剂。然而，由于它效果有限并从环境污染的角度来看，期待研发一种可替代技术。已经发现，本发明诱导植物病害抗性的组合物的使用可能是一种利用作物的抗性诱导作用的实体病害防除方法。
表6实验组E比较组H对照组保护值 79 70 0
实施例8：瓜类茎腐病防除试验
(1)方法
将瓜类植物(品种：Ams)(长出第三或第四叶(真叶))浸于各种测试溶液10小时。此后，培养于马铃薯葡萄糖培养基中的瓜类茎腐病真菌(尖孢镰刀菌f.sp.Melonis race 2)分生孢子进行浸液接种。用实施例1中制备的乙醇提取浓缩液A经稀释150倍得到的液体(浓度：含20ppm脑苷脂B)处理试验组(E)。用含20ppm脑苷脂B的液体处理比较组(H)。
(2)结果
接种21天后观察根部病害发生的百分数，并从根部病害发生的平均百分数计算保护值。结果示于表7。对于乙醇提取浓缩液A处理组(E)保护值是63，对脑苷脂B处理组(H)是52。因此，证实本发明诱导植物病害抗性的组合物对蔬菜病害防除是非常有效的。这种效果被认为应归功于这样一种事实，存在于正在申请的本发明病害抗性诱导组合物中的脂溶性物质的铺展作用促进了作为活性成分的脑苷脂的渗透转移进入植物体的过程。
然而，这里无意受下述理论的约束，尽管认为在水溶液中脑苷脂的结构是不稳定的，但是脑苷脂与存在于本发明的组合物中的脂溶性物质一起形成一种稳定的较高级的结构，这种结构在植物体内也相对稳定并且能逐渐地转移扩散进植物体。由于不易被雨水冲刷而从叶表面流失、不易被日光照射而光降解并且防除效果和所施用的化学液体的量之间没有明显的相关性，这种渗透导致预期更加稳定的防除效果和更长的残留效果。
表7实验组E比较组H对照组保护值 63 52 0
实施例9：
用乙酸乙酯作为溶剂提取Shiitake香菇、贝叶多孔菌(Glifolafrondosa)和侧耳(糙皮侧耳)的冷冻干燥子实体。将分别属于曲霉属(黑曲霉)、青霉属(娄地青霉)、毛霉属(普雷恩毛霉(Mucor prainii))和根霉属(Rhizopus delemar)的真菌培养于含有1％玉米淀粉、1％糖浆和1％玉米浆(加入氢氧化钠水溶液调至pH5.5)液体培养基中。将培养物6000×g离心20分钟，收集菌丝，然后用原料菌丝10倍量(w/v)的乙酸乙酯溶剂提取。将溶剂提取液进行如实施例1中的浓缩/分离步骤使提取液的体积降低至原体积的十分之一。因此，生理性抑制物质得到分离，并且诱导植物病害抗性的物质得到浓缩从而制备得到诱导植物病害抗性的组合物。
用上面的HPLC方法测定组合物中脑苷脂B的含量，以计算单位重量的原材料中脑苷脂B的含量。此外，所得到的每种溶剂提取液用水稀释至浓度为含100ppm脑苷脂B，并且稀释液施用于稻类植物的叶片。根据WO98/47364中所述的方法测定稀释液施用7天后的诱导活性，以叶结构中诱导的植物抗毒素的量作为指标。结果示于表8。植物抗毒素的量表示为phytocassaneA，B，C和D和momilactoneA和B的总量。
从结果看出，很明显特别是从担子菌中可高效提取脑苷脂B。此外，可以证实从不同的丝状真菌中提取制备的组合物具有植物抗毒素诱导能力。
表8 Shiitake 香菇 贝叶多 孔菌 侧耳 黑曲 霉 娄地 青霉 普雷 恩毛 霉 Rhizopus delemar组合物中脑苷脂B含量，mg/ml 2.75 2.48 2.38 0.48 0.49 0.52 0.51体积减少的产物中脑苷脂B含量，mg/g重 0.23 0.21 0.20 0.04 0.04 0.05 0.05诱导的植物抗毒素含量，mg/g原料叶 8.6 8.5 8.4 8.3 8.4 8.2 8.4脂溶性物质含量，mg/ml 100 98 95 28 30 33 32
实施例10：莴苣根腐病防除试验
(1)方法
接种前用化学法处理莴苣(品种：Patriot)植物(长出第三叶(真叶))12小时，然后将其植入被莴苣根腐病真菌(尖孢镰刀菌f.sp.Lactucae raceSB1-1)(用稀释板法测定细胞密度：3×104CFU/g)污染的土壤进行感染接种。实验组包括用实施例1中制备的乙醇提取浓缩液A稀释300倍(浓度：含10ppm脑苷脂B)后得到的溶液(E)进行浸没处理、施用处理和浇水处理的实验组和用20ppm脑苷脂B溶液(H)进行浸没处理的实验组。将通过这些处理得到的效果进行比较。
(2)结果
利用内部症状观察植入28天后病害发生情况。根据基于病害发生水平的指标判断病害发生的程度。根据以下标准评估病害发生水平。0：无植物维管束变色；1：少于三分之一的植物维管束变色；2：三分之一到三分之二的植物维管束变色；和3：不少于三分之二的植物维管束变色。按如下方程计算保护值：保护值＝(对照组病害发生的平均程度-实验组病害发生的平均程度)/(对照组病害发生的平均程度)×100。结果示于表9。对作为产品(农产品)的地上部分的重量也进行了测定。结果，在乙醇提取浓缩物处理(E)情况下，对于浸没处理组保护值是100，对于施用处理组是72，对于浇水处理组是86。对于原材料莴苣的地上部分，当将对照组重量设定为100时，浸没处理组重量是693，对于施用处理组是266，对于浇水处理组是559。因此证实本发明的病害抗性诱导组合物表现出不受处理方法限制的防除效果，尽管最适的处理条件以作物和目标病害的类型而不同。
表9浸没处理 (E)施用处理 (E)浇水处理 (E)浸没处理 (H) 对照组保护值 100 72 86 78 0地上部分原材料重量比 693 266 559 231 100
实施例11：蕃茄黄萎病防除试验
(1)方法
将蕃茄植物(品种：Hausumomotaro)(第二叶(真叶)伸展出)浸没在实施例1中制备的乙醇提取浓缩液A经稀释150倍得到的溶液(E)中。浸没处理后，将蕃茄植物植入被蕃茄黄萎病真菌(大丽花轮枝孢)(细胞密度：5×104CFU/g)污染的土壤进行感染接种。用稀释150倍的乙醇提取浓缩液A(浓度为含20ppm脑苷脂B)处理实验组(E)3、6、12和24小时。用20ppm脑苷脂B溶液处理实验组(H)12小时。对这些处理的防除效果进行了测定和比较。
(2)结果
植入后的第21天，根据基于外部症状的指标，通过观察病害发生检测了防除效果。根据以下标准评估了基于外部症状的病害发生程度。0：健康叶片；1：在最低或次最低位置上的叶片上观察到外部症状；2：在基本上半数叶片上观察到外部症状；3：在绝大部分叶片上观察到外部症状，并且也观察到脱落的叶片；和4：根部枯萎。按如下方程计算保护值：保护值＝(对照组病害发生的平均程度-实验组病害发生的平均程度)/(对照组病害发生的平均程度)×100。结果示于表10。从表10中明显的看到，在乙醇提取浓缩物处理(E)情况下，当处理时间为3小时时保护值为12，也就是说防除效果是不令人满意的。另一方面，当处理时间为6小时或更长时保护值大约为60，表明与比较组相比较显示出不同的病害防除活性。依赖于处理时间不同而效果不同的原因被认为是因为本发明病害防除组合物的防除效果是一种通过抗性诱导获得的效果，为了建立起植物方面的这种抗性，需要一定的时间阶段。此外，已经用20ppm脑苷脂B溶液处理12小时的实验组(H)保护值是60，这一事实表明，本发明的病害防除组合物中含有的脂溶性物质能够加强脑苷脂的病害防除活性，且不依赖于植物物种。
表10 3小时 (E) 6小时 (E) 12小时 (E) 24小时 (E) 12小时 (H)对照组保护值 12 56 68 64 60 0