作为抗微生物剂和消炎剂的萘基水杨酰苯胺类化合物 本申请要求提交于2000年10月2日的序列号为60/237,319的美国在先申请的优先权，在此将其并入以供参考。发明领域
本发明一般涉及抗微生物剂领域。更特别的，本发明提供了新的萘基水杨酰苯胺类化合物以及将这些化合物用作抗微生物剂和消炎剂的方法。相关领域的讨论
一些水杨酰苯胺类化合物已经被确定为潜在的抗微生物剂。以前，这些试剂中的一些已经显示出可有效抵抗与牙菌斑有关的微生物。
美国专利4,287,191揭示了5-酰基水杨酰苯胺，据说它可以作为抗多种微生物(尤其是细菌以及在牙菌斑中普遍存在的微生物)的有效的防腐剂。然而，没有发现这些化合物可有效抵抗有抗菌素抗性地细菌，如变异微球菌。这些化合物的通式可用以下结构式代表：
其中，Z是取代的苯环，R是取代或未取代的烷基或苯基，X是-CN、-F、NO2、-H、低级烷基或低级卤代烷基。
美国专利4,358,443揭示了有上述通式的5-烷基水杨酰苯胺，其中R是取代或未取代的-烷基或苯基基团。
美国专利4,939,132揭示了有上述通式的作为抗微生物剂的5-磺酰基烷基水杨酰苯胺，其中R是取代或未取代的烷基磺酰基团。
美国专利4,742,083和5,958,911揭示了水杨酰苯胺的消炎作用。
由于有抗生素抗性的细菌不断出现，我们需要可有效抵抗多种细菌的新的抗微生物剂。
发明概要
本发明提供了新的芳酰基水杨酰苯胺。特别地，本发明提供了新的5-萘基水杨酰苯胺并描述了这些化合物抗多种细菌的抗微生物作用。此外，本发明还提供了使用这些化合物以减轻与这些细菌有关的感染的方法。
因此，本发明的一个目的是提供新的萘基水杨酰苯胺类化合物。
本发明的另一个目的是提供使用萘基水杨酰苯胺类化合物作为抗微生物剂的方法。
本发明的还有一个目的是提供控制牙周疾病的方法。附图简述
图1代表了小鼠耳朵炎症测定中萘基水杨酰苯胺和TMF-12对耳朵重量的作用。
发明详述
定义
出于说明和要求权利的目的，这里使用的术语“分配系数”是指log10P，其中P是辛醇-水系统中组合物组分的摩尔浓度之比。分配系数是对化合物亲脂特性的量度。因此，分配系数为4意味着该组分在辛醇中组合物的浓度与它在水中的浓度比为104或10,000比1。
出于说明和要求权利的目的，这里使用的术语“高亲脂性”是指分配系数大于4。
出于说明和要求权利的目的，这里使用的术语“取代的”是指化合物中一个或多个氢原子被含有碳和/或氮的部分取代，如(但不限于)烷基、O-烷基、分支的烷基、环烷基(所有的烷基都含有1-6的碳原子)、CN、CF3、NO2、甲氧基、苯氧基、苯甲酰基、苯氧基甲基以及它们的组合。
本发明是以意外观察到的5-萘基水杨酰苯胺是比美国专利4,287,191和4,358,443所揭示的5-酰基或5-烷基水杨酰苯胺更有效的抗菌剂为基础的。本发明的化合物有以下结构式(这里称为结构式100)。
其中，W是取代或未取代的萘环。W上的取代包括用-OH、烷基、O-烷基、分支的烷基或环烷基(含有1-6个碳原子)，或是它们的组合，取代一个或多个-H。Y是取代或未取代的苯环或取代或未取代的萘环。Y上的取代包括用CN、CF3、NO2、甲氧基、苯甲酰基、苯氧基、苯氧基甲基或它们的结合取代一个或多个-H原子。
一个实施方案中，其中Y是取代或未取代的苯基基团，W是取代或未取代的萘基基团，本发明的化合物可以用以下结构式表示(结构式110)：
其中Z代表苯环上的取代。Z优选是吸电子基团且最好没有强亲水性或水溶性。一个实施方案中，Z是在各个位置相互独立的-H、CF3、-CN或NO2。当Z在各个位置都是H时，这种化合物在这里被称为NA1。当Z在间位是-CF3时，化合物有以下结构：
上述化合物在这里被称为NA1mF。这是一种α异构体(连接在萘的1-位上)。这种化合物的β异构体(连接在奈的2-位上)在这里被称为NA2mF。当Z在间位上是-CN基团时，这种化合物有以下结构。这种化合物在这里被称为NA1mC(α异构体；连接在萘的1-位上)或Na2mC(β异构体；连接在萘的2-位上)。当-CN基团出现在对位上时，这种化合物在这里被称为NA1pC(α异构体)或NA2pC(β异构体)。本发明其它化合物的类似的异构体也包括在本发明的范围内。
另一个实施例中，Z可以是甲氧基、苯氧基、苯甲酰基或苯氧基甲基基团。以下是当Z是苯氧基甲基基团时的一个例子。这种化合物在这里被称为NA1_3BnOPh。
另一个实施方案中，在两个间位上都发生了Z取代。以下是取代的化合物的一个例子，它在这里被称为NA1mF2。
另一个实施方案中，Y是取代或未取代的萘环。以下是当Y是取代的萘环时化合物的一个例子(称为NA1NpC)。
另一个实施方案中，结构式100的萘基水杨酰苯胺的萘基W可以被取代。这种取代的一个例子是用-OH取代-H。这种化合物在这里被称为NA10HmF。
本发明的化合物可以用两步骤方法合成，其中第一个步骤制备了供所有类似(如1-萘基)衍生物使用的带有相同芳酰基基团的酯。第二个步骤中通过使该酯与苯胺或苯胺衍生物反应制得了所需的酰苯胺。
本发明的化合物的一个优点是，它们有未曾料到的高出以前所描述的水杨酰苯胺(美国专利4,287,191；4,358,443和4,939,132)的功效。在本发明的化合物中，5-萘基基团通过羰基基团与水杨酰苯胺连接。
在5-位上引入萘基使它们具有了抗多种细菌的功效。因此，已经发现本发明的化合物可有效抵抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。这些革兰氏阳性菌包括但不限于，变异链球菌、血链球菌、藤黄微球菌、唾液链球菌、疮疱丙酸杆菌、粘放线菌、金黄色葡萄球菌、鼠李糖乳杆菌(casei)7469。革兰氏阴性菌包括但不限于，沙门氏菌、具核梭杆菌25586、伴放线放线杆菌(Aa)Y4、大肠杆菌、狗齿龈卟啉单胞菌、猪霍乱沙门氏菌(Sal.chsuis)、脆弱拟杆菌和柠檬酸杆菌属。
由于这些化合物是高亲脂性的，它们在水中不溶。然而，非常出乎意料的是，我们发现这些化合物在局部施用中通常使用的浓度下可以溶解在阴离子型和非离子型去污剂的水溶液中。这些化合物的这一特性使得它们可以作为局部抗微生物剂和消炎剂。
因此，本发明的化合物可以被掺杂在供局部施用的制剂中。此类施用包括但不限于，治疗口部、皮肤、头皮、耳、鼻、眼、阴道和直肠感染的局部制剂。可被这些化合物治疗的感染包括包括龈炎和痤疮在内的各种病症。
本发明的化合物还可被用作供兽医使用的局部抗微生物剂或消炎剂，以减轻包括龈炎、结膜炎和关节炎在内的各种症状的感染。这种制剂可被用于(但不限于)口腔、皮肤、头皮、耳、鼻、眼、阴道和直肠。
按照本发明，用来减轻感染或炎症的方法包括，使感染区域与含在药学上可接受的载体中的本发明的化合物接触，这种载体包括酒精、非离子型或离子型去污剂。此类载体基可以选自凡士林、羊毛脂、石蜡、链烷醇和它们的混合物。通过使用羊毛脂或凡士林之类的基料，可以获得可展开的制剂，通式，通过使用石蜡之类的基料可以获得供局部施用的条状物。此外，本发明的化合物还可以被装进含有乙醇、非离子型或离子型去污剂的液体载体中。因此，可以使用乙醇、非离子型去污剂(Tween 80TM)和阴离子型去污剂(十二烷基硫酸钠(SLS))。
通过局部施用含有本发明化合物的制剂，上述化合物在动物，尤其是人类中可被用作抗微生物剂或消炎剂。这些化合物可被用于(但不限于)牙膏、漱口水、肥皂、香波、皮肤膏、皮肤露、眼药膏、滴眼液、滴耳液或滴鼻液。
本发明的化合物除了有抗与牙菌斑有关的细菌的作用外，另一种未曾料到的作用是，这些化合物还可以有效抵抗处口腔细菌以外的细菌。因此，本发明的药物制剂可用来减轻全身感染。因此，这些化合物可以和适合输递亲脂性药物(例如，但不限于，脂质体制剂)的药物载体或气溶胶一起使用。
脂质体是磷脂载体，当其分散在水溶液中时，它可以形成封闭的充满液体的球体。磷脂分子是由一个朝向含水侧的亲水性头部和两条由脂肪酸链构成的疏水性尾巴构成的极性分子。浓度充分时，磷脂分子会形成极性头部朝向含水介质而脂肪酸链朝向胶束内部的胶束。美国专利5,958,449中描述了各种类型的制造脂质体的技术，在此将其并入以供参考。可以通过静脉内、皮下和局部途径输递脂质体。也可以结合使用特殊的寻靶试剂将脂质体导向靶区域，比如将特殊的识别分子装进脂质体中。
另一种输递本发明化合物的制剂(如脂质体制剂)的方法是通过气溶胶。满足任何特定的输递和施用模式的合适浓度将随着要治疗的病况而改变。精通此领域的技术人员知道该如何确定这种条件。
以下实施例阐述了本发明。
实施例1
这个实施例阐述了用两步骤方法合成这里称为NA1的2-羟基-5-(萘-1-羰基)-N-苯基-苯甲酰胺。
合成2-羟基-5-(萘-1-羰基)-苯甲酸苯酯
反应容器是500ml的三颈圆底硼硅酸玻璃烧瓶，其上装有250mL加料漏斗、温度计、回流冷凝器和搅拌器。在圆底烧瓶中装入氯化铝(7.98g，59.8mmole)和225mL氯仿，然后搅拌悬浮液并在外面用冰浴冷却至5℃。将水杨酸苯酯(5.83g，27.2mmole)和萘-1-羰基氯(4.91mL，6.21g，32.6mmole)与130mL氯仿合并在一起，并在1.5小时将其内逐滴加入搅拌的悬浮液。在滴加中观察到颜色由无色变为淡黄色然后是深绿色最后变为深棕色。在滴加过程中将温度保持在5-15℃。滴加完毕以后将化合物加热回流48小时然后在22℃下保持8小时。
将反应混合物缓慢加入搅拌的已经加入了125mL 12N HCl的50mL碎冰中。在1升的分液漏斗中分离有机层，并用蒸馏水洗涤5次。在TLC(硅胶板)上检测纯度，所用溶剂是1∶1的CH2Cl2和己烷。在TLC上观察到了三个点，苯酯的点在最上面，而产物的点在中间。
用上述同样的溶剂系统在硅胶上进行快速层析，由此可以进行纯化。得到了白色固体状的3.75g(31％)所需苯酯产物，mp 82-84℃。’HNMR(300MHz，CDCI)δ7.276(d，J＝9.0Hz，1H，ArH)，7.357(d，J＝8.1Hz，2H，ArH)，7.459(m，2H，ArH)，7.617(t，2H，ArH)，7.732(m，5H，ArH)，8.120(m，TH，ArH)，8.206(m，3H，ArH)，8.903(d，J＝2.1Hz，1H，ArH)，11.254(s，1H，OH，D2O可交换)IR(KBr)v1652.9、1566.1、1199.65cm-1。
合成2-羟基-5-(萘-1-羰基)-N-苯基-苯甲酰胺
在含有300mg苯胺的5mL异丙醚中缓慢鼓入氯化氢气体，直至溶液被氯化氢饱和。收集所得苯胺盐酸盐的白色沉淀并干燥。将0.0501g这种盐、1.50g(4.07mmole)上述苯酯和0.459mL(5.04mmole)苯胺一起放在装有和干燥氩气连接的蒸馏头的50mL圆底烧瓶中。首先用干燥的氩气吹扫反应混合物30分钟，然后用外部油浴将温度升高至90℃以将酯融化。最后，将温度升高至170℃并在170℃下保持12小时。这一过程中要检测几次TLC以确保反应完全。在加热过程中要用干燥氩气吹扫。
用TLC(硅胶板)检测纯度，使用10∶1的己烷和乙酸乙酯。在TLC上观察到了4个点，目标化合物是从底部起的第二个点，它比苯胺点仅仅高一点，颜色是淡黄色的。
用10∶1己烷和乙酸乙酯的溶剂系统在硅胶上进行快速层析，由此可以进行纯化。收集并干燥产物，从而得到了0.398g(27％)淡黄色固体，mp100-104℃。’H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ6.846(d，J＝7.5Hz，2H，ArH)，6.910(m，2H，ArH)，7.139(m，3H，ArH)，7.262(m，2H，ArH)，7.492(m，3H，ArH)，7.640(m，2H，ArH)，7.725(m，3H，ArH)，8.057(m，2H，ArH)，8.441(s，1H，ArH)，9.507(s，1H，OH，D2O可交换)，10.617(s，1H，NH，D2O可交换)，IR(KBr)v 3059.8、1642.2、1593.1cm-1。
实施例2
这一实施方案证明了本发明化合物抗革兰氏阳性菌的功效。用“Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests forBacteria that Grow Aerobically”(National Committee for ClinicalLaboratory Standards Approved Standards，1997，NCCLS文件M7-A4)中描述的改进的微量稀释试管稀释法确定了化合物的MIC’s。简而言之，由于需要复杂营养的口腔生物和需要厌氧条件的细菌独特的生长需要，我们将这一方法进行了改进。还可以参考“Methods for AntimicrobialSusceptibility of Anaerobic Bacteria”(National Committee forClinical Laboratory Standards Approved Standards，1997，NCCLS文件M11-A4)。
简单地说，方法如下。让培养物在合适的培养基中生长18-24小时(好氧菌)或48-72小时(厌氧菌)。对于好氧菌使用了全强度脑心浸液培养基(BHI，Difco)。对于厌氧菌使用了添加有酵母提取物(10g/L)、氯高铁血红素(0.29mL原液，每200mL dH2O中含有0.1g)和维生素K3(15mL原液，每30mL 95％的EtOH中含有0.15mL)的半强度BHI(18.5、L)。将最初的培养物稀释至约1×108CFU/mL以便用作接种物。每次测定用10μL接种物。从含在二甲基亚砜(DMSO)的原液中制备药物并将其稀释在培养基中。药物的最终浓度在50-0.05μg/测定。重复进行两次测定并根据氧需求按照需要培育24-48小时。厌氧培养所用的气体中含有5％CO2、10％H2以及平衡N2。没有可视生长的抗微生物剂的最低浓度被作为MIC。
上面已经描述了这一实施例中使用的本发明的化合物NA1mF、NA1mC、NA2mF、NA2mC、NA1pC、NA1、NA1NpC、NA1pBz、Na1OHmF、NA1_3BnOPh、NA1mOPh和NA1mF2。NA1pBz是有110结构的萘基水杨酰苯胺，其中Z在对位上是苯甲酰基。NA1mOPh有结构式110的结构，其中Z在间位上是苯氧基，NA1-2mOMe有结构式110的结构，其中Z在两个间位上都是-OCH3。美国专利6,117,859中描述了TMF-12的结构。BPAmF、BPAmC和BBAmF是美国专利4,287,191中描述的取代或未取代的的烷基水杨酰苯胺。它们的结构也提供在下面。BPAmF有以下结构：BPAmC有以下结构：BBAmF有以下结构：
在表1-5中，NE说明这种药物在浓度＞50mg/ml时不起作用，“-”说明没有测试这种药物。
表1-革兰氏阳性菌 药物代码 变异链球菌 血链球菌 唾液链球菌 疮疱丙酸杆 菌6922 疮疱丙酸杆 菌11828 NA1mF 0.8 0.8 3.1 0.2 0.4 NA1mC 3.1 6.3 50 6.3 6.3 NA2mF NE 0.8 50 0.4 0.4 NA2mC 6.3 6.3 50 6.3 12.5 NA2pC 1.6 6.3 50 6.3 6.3 BPAmF NE NE NE 0.2 0.4 BPAmC NE NE NE 0.2 12.5 BBAmF NE NE NE 0.2 0.8 NA1 50 NE NE 25 NE NA1NpC NE - - 0.4 - NA1pBz NE - - NE - NA1OHmF 6.3 - - 3.1 - NA1-2m0Me NE - - NE - NA1_3BnOP NE - - NE - NA1mOPh NE - - NE - NAmF2 1.6 - - 0.4 - TMF-12 NE 12.5 NE 0.4 0.2
表2-革兰氏阳性菌药物代码粘放线菌 金黄色葡萄球菌 鼠李糖乳杆菌 藤黄微球菌NA1mF＜0.1 1.6/3.1 0.4 0.8NA1mC3.2 6.3/12.5 3.1 3.1NA2mFNE NE 1.6 0.8NA2mC1.6 NE 12.5 3.1NA2pC1.6 6.3 6.3 3.1BPAmFNE NE 6.3 3.1BPAmCNE NE 12.5 3.1BBAmFNE NE 6.3 3.1NA13.1 50 - -NA1NpC0.8 NE - -NA1pBzNE NE - -NA1OHmF0.8 NE - -NA1-2m0MeNE NE - -NA1_3BnOP6.3 NE - -NA1mOPhNE NE - -NAmF20.8 NE - -TMF-121.6 NE 3.1 0.8
实施例3
这一实施方案证明了本发明化合物抗革兰氏阴性菌的功效。所用方法与实施例1中所描述的方法是一样的。
表3-革兰氏阴性菌药物代码 具核梭杆 菌25586 伴放线放 线杆菌Y4狗齿龈卟啉单胞菌381狗齿龈卟啉单胞菌53977 脆弱拟 杆菌NA1MF 3.1 3.1＜0.1＜0.1 3.1NA1mC 2.5 6.30.40.8 NENA2mF NE NE＜0.4＜0.4 NENA2mC NE NE0.80.8 3.1NA2pC 12.5 6.30.40.4 3.1BPAmF NE NE＜0.4＜0.4 50BPAmC NE NE＜0.4＜0.4 50BBAmF NE NE＜0.4＜0.4 NENA1 - -1.6- -NA1NpC - -0.2- -NA1pBz - -NE- -NA1OHmF - -0.8- - NA1-2mOMe - - NE - - NA1_3BnOP - - 3.1 - - NA1mOPh - - NE - - NAmF2 - - 0.2 - - TMF-12 INE NE 0.4 0.4 NE
表4-革兰氏阴性菌 药物代码 S.pyo 51339 S.pyo 49399 S.pyo 19615 Str.pn 6303 Str.pn 6301 Str.pn 6305 NA1mF 1.6 0.78 0.63 0.18 0.78 0.39 NA1mC 12.5 12.5 25 0.18 1.56 1.56 NA2mF 0.4 3.2 NE 0.18 0.78 1.56 NA2mC NE NE NE 6.78 1.56 0.39 NA2pC 3.2 3.2 NE 0.18 0.78 0.78 BPAmF 6.3 6.3 NE 0.18 1.56 0.78 BPAmC NE NE NE 0.18 0.78 0.78 BBAmF 6.3 6.3 NE 0.18 0.78 0.39 NA1 - 12.5 - - - - NA1NpC - 6.3 - - - - NA1pBz - NE - - - - NA1OHmF - 3.1 - - - - NA1-2m0Me - NE - - - - NA1_3BnOP - 50 - - - - NA1mOPh - NE - - - - NAmF2 - 1.6 - - - - TMF-12 0.32 0.8 0.32 0.78 0.39 0.78
即便浓度大于50mg/mL，也没有发现所测药物有抗沙门氏菌、大肠杆菌、Sal.chsuis和柠檬酸杆菌属的功效。NE说明在50mg/ml时没有可测效果。
实施例4
这一实施方案阐述了本发明的化合物抗链球菌菌株的功效。从位于布法罗的Children’s Hospital获得了一种菌株，Str.pn.R(菌株00-041-0614)。它是从支气管洗液中分离的并被发现呈β内酰胺酶阳性。已检测了这种菌株抗几种已知抗生素的敏感性。结果显示，它对氯林霉素、万古霉素、Trovoflox、利福平敏感，但可以抗青霉素和红霉素。表5显示了以MIC值测定的功效。
表5-链球菌的平均MIC值药物代码Str..pyo Str.pn Str.pn.R NA1mF1.0 0.45 0.78 NA1mC16.67 1.10 12.5 NA2mF- 0.84 0.78 NA2mCNE 0.91 6.25 NA2pC- 0.58 3.12 BPAmF- 0.84 NE BPAmC- 0.58 NE BBAmF- 0.45 NE TMF-120.47 0.65 0.78
实施例5
这一实施方案描述了各种链球菌菌株对本发明化合物的敏感性。链球菌R是来自布法罗的Children’s Hospital的00-045-1209菌株。它是从个体的腹膜腔(液体培养)中分离的。它是凝固酶阴性的。检测了这种菌株抗几种已知抗生素的敏感性。结果显示，它对万古霉素敏感，但可以抗阿莫西林、氯林霉素、红霉素、苯唑西林、阿齐红霉素(azithromycin)和头孢噻肟。然而，我们发现这种菌株对本发明的化合物敏感，且用NA1mF观察到了最强的效果(表5)。
金色链球菌R2菌株是从布法罗的Children’s Hospital获得的00-42-1066菌株。它是从个体的伤口中分离的。它是凝固酶阳性的。检测了这种菌株抗几种已知抗生素的敏感性。结果显示，它对万古霉素敏感，但可以抗阿莫西林、氯林霉素、红霉素、苯唑西林、阿齐红霉素和头孢噻肟。
表5药物代码金色链球菌链球菌R金色链球菌R2 NA1mF 3.1 1.6 1.6 NA1mC 12.5 25.0 6.3 NA2mF NE 25.0 25.0 NA2mC NE NE NE NA2pC 6.3 12.5 NE BPAmF NE NE NE BPAmC NE NE NE BBAmF NE NE NE TMF NE NE NE
实施例6
这一实施例阐述了本发明化合物抗炎症的功效与那些已知的消炎剂(如saliflor(TMF-12))是可比的。为了阐述，如美国专利5,958,911和6,117,859所述(在此将其并入以供参考)，以TPA小鼠的耳朵炎症测定作为急性炎症。为了将炎症定量，用TPA(阳性对照)处理并同时施用本发明的化合物(NA1mF、NA2mF)、TMF-12，或不使用TPA(阴性对照)，这样处理6小时后将耳朵活组织称重。实验结果显示在图1中。
这里已经列出了许多实施方案，这是出于阐述的目的而不是要限制。对这里所列实施方案的改进对于精通此领域的技术人员而言是显而易见的，并在本发明和权利要求的范围之内。