人源抗戊肝病毒基因工程抗体 本发明涉及预防和治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，尤其是特异性针对戊肝病毒保护性抗原ORF2蛋白的基因工程抗体。
自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来，单克隆抗体作为一类用于基础研究，实验室诊断，临床治疗和预防的新型产物，其运用价值和开发前景已获得普遍的肯定。分子生物学和分子免疫学的研究发展导致了基因工程抗体的产生和发展。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。目前美国FDA批准上市或待批的生物制品中，各种形式的单克隆抗体和基因工程抗体占到一定比例，目前以批准上市的67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体共有9种。正在待批中等抗体有54种。其中已批准上市并且产生巨大经济和社会效益的四种人源化基因工程抗体中，其中有一种即为抗病毒基因工程抗体，其商品名为“SynagisTM″，为人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗体。
至今为止，大多数病毒性疾病无特异性治疗药物。戊肝病毒的主要传播途径是粪-口传播，已报道的爆发流行中主要由饮用水污染造成。在流行地区，对戊肝的预防首要的是提供洁净的饮用水，而疫苗预防是最终控制发展中国家戊型肝炎流行地重要措施。美国、印度和中国已有关于戊型肝炎病毒重组蛋白疫苗的动物实验的报道，但结果并不一致，因此在戊型肝炎的预防和治疗方面，特别是爆发流行时，被动免疫的作用也是值得重视的。根据对疫区的研究报道，仅靠自然免疫产生的抗体起到的保护作用是不完全的。最近的研究表明，在爆发流行中对孕妇进行免疫球蛋白治疗可有效减少感染病毒的数量，但急性感染病例仍不能得到控制。另据报道，来自于黑猩猩的针对ORF2蛋白的单克隆抗体在对恒河猴的病毒攻击实验中起到了一定保护作用。因此，对人源抗戊型肝炎病毒抗体的研究不仅对疾病的预防和治疗有一定的作用，而且对进一步研究病毒在体内的致病机制提供了有利的工具。用纯鼠源单克隆抗体预防和治疗病毒性疾病在国际上尚无任何批准的先例，鼠源抗体人用最大的不利之处为异源蛋白，在人体内易引起遗传免疫排斥而使抗体失效并引起免疫性疾病。因此，特异性抗病毒人源抗体是病毒性疾病预防和治疗的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗体的研究除已成功的抗RSV抗体外，通过噬菌体表面呈现系统，基因工程抗体库技术和分子生物学手段的联合运用，这一领域的研究已取得重大进展。
本发明的目的是通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用，直接从人抗体基因库中筛选出抗戊肝病毒的基因工程单克隆抗体，获得其抗体基因，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行性的特异性抗体药物。
本发明陈述的人源抗戊肝病毒基因工程抗体包括：
1、人源抗戊肝病毒基因工程抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，包括Fab抗体基因、基因产物及其应用。其主要特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合戊肝病毒的功能性抗体。
2、人源抗戊肝病毒基因工程抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要特征在于：抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，是人源抗戊肝病毒基因工程抗体可变区核苷酸和氨基酸序列。
3、人源抗戊肝病毒基因工程抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要基因特征在于：特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗戊肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其轻链(VL)和重链(VH)各自相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。重链(VH)三个CDR区的氨基酸序列包括：HEV-Fab-216：CDR1为SSAMS；CDR2为TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3为VPFSGYDYVWGSYGYFDY。HEV-Fab-315：CDR1为SSAMS；CDR2为TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3为VPLVDMITLGGVWLFDY。HEV-Fab-319：CDR1为SSAMS；CDR2为TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3为VPFSGYDTLGGSYGY。HEV-Fab-328：CDR1为SSAMS；CDR2为TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3为VPFSGYDTFGGVWLFDY。HEV-Fab-404：CDR1为SSAMS；CDR2为TISGFGGSTYYTDSVKG；CDR3为VPFSGYDTFGGVWLFDY。
轻链(VL)三个CDR区的氨基酸序列包括：HEV-Fab-216：CDR1为TGGSSNIGSSYHVH；CDR2为ADTRRPS；CDR3为QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-315：CDR1为TGGSSNIGSSYHVH；CDR2为DTRRPS；CDR3为QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-319：CDR1为AGSSSNIGAAYDVH，CDR2为SNSNRPS；CDR3为QSYDRSLNGVV。HEV-Fab-328：CDR1为TGGSSNIGSSYHVH；CDR2为ADTRRPS；CDR3为QTYDSDLGGSV。HEV-Fab-404：CDR1为AGSSSNIGAAYDVH；CDR2为SNSNRPS；CDR3为QSYDRSLNGVV。
4、人源抗戊肝病毒基因工程抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404 Fab抗体，其特征在于：为一种在原核细胞中获得稳定有效表达的基因重组的人源抗戊肝病毒ORF2蛋白基因工程Fab抗体，由重链Fd和lamda链组成。
5、人源抗戊肝病毒基因工程抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，其主要功能特征在于：特异性识别戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白，应具有抗戊肝病毒感染的中和活性功能。
6、人源抗戊肝病毒基因工程抗体的用途，其特征在于：利用上述获得的抗体可变区，Fab或全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒系统中表达和生产此抗体基因或以此为基础改建后的含有此抗体基因任何其他基因，获得具有中和戊肝病毒感染的抗体产物，其基因表达产物可望在临床上用于预防和治疗由戊肝病毒引起的戊型肝炎。
7、人源抗戊肝病毒基因工程抗体基因的用途，其特征在于：根据抗戊肝病毒中和抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的可变区中的CDR区特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同的抗体轻重链CDR区的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得抗戊肝病毒ORF2的中和抗体或相关蛋白或多肽产物。
传统的利用杂交瘤细胞技术获得人源单克隆抗体相当困难，而且建立的细胞系通常不稳定，基因易丢失。本发明陈述的人源抗戊肝病毒基因工程抗体，是在获得抗体基因的基础上获得基因产物的表达，此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，并可根据不同需要任意改建抗体基因，从而获得一种可行性的临床治疗用抗体制剂。
以下的优先实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容
在这些实施例中，为说明本发明，采用噬菌体表达载体为pComb3(Barbas C.III et al，Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991，89：10164-10168)。所用主要菌株为商品化产品XLI-Blu(美国Strategene公司)。所用噬菌体为VCSM13(美国Invitrogene公司)。
实施例1-5为人源抗戊肝病毒基因工程抗体的筛选制备方法；实施例7为人源抗戊肝病毒基因工程抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的基因特征；实例7-8为人源抗戊肝病毒基因工程抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404的特异性蛋白结合及功能特征。
实例1，人源IgG Fab段基因的PCR扩增：用淋巴细胞分离液从免疫后经检测抗体滴度达到保护水平的人体外周抗凝血中分离淋巴细胞，用Tril-Zon(美国Gibco，BRL)提取总细胞RNA，用Olig-dT引物将提取的RNA通过逆转录酶(美国Gibco，BRL)逆转录成cDNA，用一组特异性IgGFabGamma链、Kampa链及Lamda链引物，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃1分钟，54℃1分钟、72℃2分钟，35个循环(PE 4800)，上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化试剂盒QIAquickTM kit(德国QIAGEN公司)纯化后，获得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd链PCR产物。
实例2，噬菌体抗体基因库的建立：将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合，将不同引物合成的Fd链混合，分别用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌体载体pComb3，将克隆入轻，重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水悬起，电转导入事先制备好的200ul电转菌XLI-Blu，(电转条件为：Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5K伏)，电转后加10mlSOC培养液，37℃1小时，加入10ml带有氨苄青霉素和四环素的SB培养液(3)，37℃1小时，加入80-100ml前述SB，37℃ 2小时后加入辅助噬菌体M13GCM1 X10 12，1小时后加入卡那霉素(70ug/ml)，37℃摇床培养过夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌体上清，经9000rpm，20分钟，4℃离心后，用2ml 0.02M PBS PH7.4重悬沉淀，建立噬菌体抗体库，分装保存于-20℃冰柜中。
实例3，用于抗体库富集筛选的戊肝病毒抗原的制备：所用抗原为原核表达并纯化的HEVORF2蛋白，由本所肝炎室毕胜利老师惠赠。浓度为2mg/ml。
实例4，噬菌体抗体库的特异性富集筛选：用0.1M NaHCO3(pH8.6)的溶液包被纯化的戊肝病毒抗原(0.5-1μg/ml)，每孔55μl，4℃过夜；次日用1×PBST洗去未吸附的抗原，用4％的脱脂奶37℃封闭1小时，弃封闭液；每孔加入50μl噬菌体抗体库，37℃孵育2小时，弃去孔中未结合的噬菌体，用1×TBST(50mMTris-HCl，150mM NaCl，0.5％Tween 20，pH7.5)洗液冲洗各孔，冲洗时，用带有吸头的移液器反复吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌体；最后用ddH20洗两遍，吸净孔中的液体；每孔加入50μl Gly-HCl(pH2.2)的洗脱液，室温孵育10分钟。加入适量的2M Tris，以中和洗脱下来的噬菌体；将洗脱的噬菌体立即加入2ml新鲜制备的XLI-Blu菌液中(OD600＝1)，室温孵育15-20分钟；然后转入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨苄青霉素：20μg/ml，四环素：10μg/ml)，立即取10μl涂氨苄青霉素平皿，以滴定噬菌体；三角瓶与37℃振荡培养1小时，加入100mlSB(氨苄青霉素：100μg/ml)，37℃1小时后，加入辅助噬菌体VCSM13 1ml，37℃振荡培养2小时，加入卡那霉素(终浓度70μg/ml)，37℃培养过夜。如此反复筛选4-5次。
实例5，人IgGFab抗体可溶性表达产物的制备：将带有阳性抗体轻重链基因插入的阳性克隆扩增后按常规方法提取质粒DNA，用SpeI和NheI切除载体中的gIII，变FdgIII融合蛋白为独立表达的蛋白，连接后转化XLl-Blu菌，从过夜生长的氨苄碟子中挑取单个菌落，接种SB或TB细菌培养液，当细菌长至OD600＝0.2-0.3，加入1m M IPTG，在30℃诱导表达10-12小时。收获细菌，离心后加入原培养液1/10体积的PBS(0.02 M pH7.4)重悬，反复冻融三次，4℃10000rpm离心10分钟，上清即为表达的Fab抗体。备用于进一步的检测和鉴定。阴性对照为载体pComb3转化菌按同样方法制备的细菌裂解液。
实例6人IgGFab抗体E216的可变区基因的核酸序列分析：用Qiagen Miniprep Kit(美国Qiagen)制备质粒DNA进行核酸序列分析。测序为自动测序。至少3个克隆被用于确定同一相同的序列。所获序列均用DNA Strider(美国微软公司)序列分析软件进行分析处理，并比较Internet网络上基因库中的IgG序列。证实人源抗戊肝病毒基因工程Fab抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404基因由人IgGγ链Fd和λ链组成，其基因特征由VH和VL结构域中的6个CDR区的特异性核甘酸序列和氨基酸构成，序列比较资料如图1，是人源抗戊肝病毒基因工程抗体可变区氨基酸序列及分析比较。
实例7，从戊肝病毒免疫供体血液中分离淋巴细胞，用PCR技术扩增了人源IgGFab抗体基因，建立了噬菌体抗体基因库，用噬菌体表面呈现技术筛选并从富集筛选后获得的Fab阳性克隆中，最后选出5株阳性克隆，Fab抗体HEV-Fab-216，HEV-Fab-315，HEV-Fab-319，HEV-Fab-328，HEV-Fab-404，来源于纯化抗原的筛选。将表达的菌体细胞裂解上清同时检测其对抗人Fab抗体的结合活性及对戊肝病毒纯化抗原的抗原结合活性。ELISA结果表明获得株单抗不仅被抗人IgGFab抗体所识别，同样也识别结合上述纯化戊肝病毒ORF2抗原，如说明书附图2所示，为ELISA检测抗原结合活性结果。
实例8，间接免疫荧光(IFA)试验检测：将用于表达ORF2蛋白的杆状病毒感染sf9细胞，27℃培养、96 hrs后，滴加至玻璃底片上，丙酮固定15min，加入Fab表达上清，37℃温育30min，Tween/PBS冲洗，晾干，加入FITC标记的抗人Fab抗体，37℃温育30min，冲洗，晾干，伊文氏蓝染色后荧光显微镜观察结果(阴性对照为阴性血清对照)。结果显示，感染96小时后的sf9细胞中观察到荧光，如说明书附图3A所示，阴性血清对照未观察到荧光，如说明书附图3B所示，说明Fab抗体对戊肝病毒中和抗原ORF2蛋白的结合具有很高的特异性。
实例9，HEV-Fab-216轻链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTATCTGGGGCCCTAGGGCAGAGGGTGACCATCCCCTGCACTGGGGGCAGC E L T Q P P S V S G A L G Q R V T I P C T G G STCCAACATCGGCTCAAGTTATCACGTCCATTGGTATCGCCAACTTCCGGGAACAGCCCCCAGACTGCTCATT S N I G S S Y H V H W Y R Q L P G T A P R L L I
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实例10，HEV-Fab-216重链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACC L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGT F S S S A M S W V R Q S P G K G L E W V S T I S
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实例12，HEV-Fab-315重链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGATACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACC L E S G G G S V Q P G G S L I L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGT F S S S A M S W V R Q S P G K G L E W V S T I S
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实例13，HEV-Fab-319轻链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGCGTCACCATCCCCTGCGCTGGGAGCAGC E L T Q P P S V S G A P G Q S V T I P C A G S STCCAATATCGGGGCAGCATATGATGTGCATTGGTACCAACAATTTCCAGGGACAGTCCCCAAACTCCTCATC S N I G A A Y D V H W Y Q Q F P G T V P K L L I
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实例14，HEV-Fab-319重链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGATACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACC L E S G G G L V Q P G G S L I L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGT F S S S A M S W V R Q S P G K G L E W V S T I S
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实例15，HEV-Fab-328轻链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTATCTGGGGCCCTAGGGCAGAGGGTGACCATCCCCTGCACTGGGGGCAGC E L T Q P P S V S G A L G Q R V T I P C T G G STCCAACATCGGCTCAAGTTATCACGTCCATTGGTATCGCCAACTTCCGGGAACAGCCCCCAGACTGCTCATT S N I G S S Y H V H W Y R Q L P G T A P R L L I
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CDR3GGCTCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAGAGTGACAGTCTTAGGT G S V F G G G T R V T V L G
实例16，HEV-Fab-328重链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACC L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGT F S S S A M S W V R Q S P G K G L E W V S T I S
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实例17，HEV-Fab-404轻链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列GAGCTCACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGCGTCACCATCCCCTGCGCTGGGAGCAGC E L T Q P P S V S G A P G Q S V T I P C A G S STCCAATATCGGGGCAGCATATGATGTGCATTGGTACCAACAATTTCCAGGGACAGTCCCCAAACTCCTCATC S N I G A A Y D V H W Y Q Q F P G T V P K L L I
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实例18，HEV-Fab-404重链可变区核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGATACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACC L E S G G G L V Q P G G S L I L S C A G S G F TTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGT F S S S A M S W V R Q S P G K G L E W V S T I S
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