可缩放的细胞培养生物反应器和细胞培养方法 【技术领域】
本发明涉及可缩放的毛细管 ( 空心纤维 ) 膜生物反应器及其用途， 其用于培养和 维持细胞和 / 或微生物， 以利用这些细胞的代谢， 用于以提高的方法灵活性生产生物产物 或生物转化。 【背景技术】
毛细管膜或空心纤维反应器 (HFRs) 已被广泛用于上游和下游过滤和纯化方法 ； 在废水处理中作为固定了微生物或酶的生物反应器 ； 和作为细胞或组织培养系统。
大多数细胞培养 HFR 设计使用轴流， 其中分开的流体流通过膜两侧的膜表面 (Chresand et al， 1987)。通过增加包括在圆柱状歧管内的空心纤维束中的膜数来增加这 些模块， 由此增加活跃的膜表面积。物质或营养物经膜表面通过扩散从一侧流体流向另一 侧流体流交换。 此导致跨纤维束的轴向和辅向营养物梯度， 其会产生不均一性， 不利地影响 细胞生长， 生物过程稳定性和产力。这些不均一性随着 HFR 尺寸增大而增加。 已将细胞培养 HFR 中的交叉流 ( 正切 ) 和死端 ( 流通 ) 过滤用于改善 2 个分开的 流体流之间的物质交换， 其中物质通过对流而非扩散运输穿过膜表面。这 2 种流体传送手 段已被分别用于灌流 (US4,804,628) 和固定的 (WO2007004170A2) 细胞培养系统。各情况 中观察到增强的营养物递送到细胞和从细胞培养空间移出代谢废物和 / 或生物目的产物。 然而， 仍观察到空心纤维束内的轴向梯度和不均一性， 及限制 HFR 设计的规模。
起初开发横向流模块用于过滤， 渗透物蒸发和废水处理过程， 以限制轴向梯度和 不均一性， 允许沿膜表面良好限定的流体动力学进料流和渗流， 由此控制浓度极化和优化 基于浓度的跨膜推进力 (Futselaar， 1993)。这些模块中， 毛细管膜的位置与进料流方向垂 直。膜的规则设置防止了流错误分配， 而横向定向显著增加了质量转移系数 (Futselaar， 1993)。此膜的均匀的 2-D 分布允许了改善的可缩放性， 且已有几种设计的描述 (Zhang et
al 2003， Smart et al 1998，1999)。各情况中固定了通过膜的流道， 以相同方向取向的全部膜被歧入单个流体入口和出口通道 ( 图 1A ～ C)。
US 5,516,691 描述了改良的横向流模块， 其中膜以 3-D 设置分布 ( 图 1D)， 其被用 作用于培养和维持细胞及使用它们的代谢 ( 代谢产物 ) 的细胞培养设备。此生物反应器设 计涵盖以下原理 ： 通过交叉流和 / 或死端过滤改善质量转移， 和通过其 3-D 纤维网络改善底 物和代谢物交换和可控性， 由此促进贯穿细胞培养空间的连贯的流体传送和导致改善的代 谢和细胞活力。此 3-D 设置还促进至少 3 个独立的膜系统， 各包括多个膜。第一膜系统用 于培养基流入， 第二膜系统用于供给 O2 或移出 CO2， 第三膜系统用于培养基流出。将膜系统 和外部歧管之间的内部空间用作细胞培养空间。 此设计首次将多维纤维设置应用于细胞培 养， 且给出概念， 组织培养作为合成的器官或肝辅助装置， 其中未考虑可缩放性。 此外， 以相 同方向取向的各膜层被歧入单个流体入口和出口通道 ( 图 1D)。
【发明概述】
本发明第一方面提供了可缩放的生物反应器， 其包括 ：●至少 1 个包括歧管和空心纤维膜装置的盒体 ；
●上顶板 ； 和
●下顶板，
其中盒体是模块化部件， 其适于彼此配合及与顶板配合， 以限定内部毛细管外培 养空间 (ECS)， 且其中空心纤维膜装置包括分离的入口和出口。
优选入口和出口经空心纤维膜成流体连通。盒体优选包括入口和出口储液池， 所 述入口和出口储液池与 ( 各 ) 歧管成流体连通。歧管优选位于膜的各端， 且各储液池与相 应入口或出口成流体连通。
各盒体优选仅包括分离的入口和出口， 所述分离的入口和出口与储液池成流体连 通， 即未通过盒体与 ECS 成流体连通。
空心纤维膜可设置在基本上平行的膜排中。各盒体优选包括 1 个或多个所述排。
当各盒体包括多于 1 个所述层 ( 排 ) 时， 空心纤维膜各层优选在水平或竖直方向 上与其上和 / 或其下层垂直设置。空心纤维膜各层更优选相对于其上和 / 或其下的膜层偏 移。
生物反应器优选包括 2 个或多个盒体。各盒体可针对每个功能包括 1 个空心纤维 膜层 ( 排 )。
顶板优选包括向 ECS 的开口 ( 孔 )， 从而流体可导入， 排出和 / 或使通过 ECS 自由 流动。顶板可适于包括至少 1 个配件或孔， 其使探头或传感器插入到 ECS 隔间， 从而可监控 和 / 或控制 ECS 内的流体组成。各开口 ( 孔 ) 优选是可闭合的。与 ECS 成流体连通的此类 孔优选仅位于顶板中 / 上， 且非盒体中。
本发明第二方面提供了盒体， 所述盒体包括适于接收空心纤维膜装置的歧管， 所 述盒体还包括各空心纤维膜装置的分离的入口和出口， 且其中所述盒体适于与另一盒体接 合和 / 或与上和下顶板接合， 以限定内部 ECS。
本发明第三方面提供了用于生物反应器的成套工具， 其包括 ：
●歧管， 其适于接收空心纤维膜装置 ； 和
●上和下顶板。
成套工具优选包括适于接收或包括歧管的盒体， 所述盒体适于与另一盒体配合和 / 或与上和下顶板配合。 成套工具还可包括至少 1 个空心纤维膜， 所述空心纤维膜任选安装 在歧管内。
空心纤维膜优选为轴向延伸的空心管， 形状如同饮水吸管。空心纤维膜优选选择 性可渗透， 且可为陶瓷膜。
歧管可包括在框架中， 所述框架包括 2 个 ( 或多个 ) 相对的歧管， 所述歧管适于接 收空心纤维膜， 歧管彼此连接以形成框架。各歧管可包括适于接收空心纤维膜的孔。各盒 体优选包括 ( 入口或出口 ) 储液池， 其与歧管 ( 孔 ) 和入口或出口成流体连通， 还与储液池 成流体连通。
储液池可通过框架与端板配合形成。
盒体， 框架， 歧管， 端板和顶板可由不锈钢或任何适宜形式的聚合物 / 塑料构成。
本说明书中， 对生物反应器的各部件 ( 例如， 盒体， 歧管， 框架和 / 或空心纤维膜 ) 的描述适用于本发明的全部方面。本发明第四方面提供了利用细胞和 / 或微生物代谢的方法， 所述方法包括利用本 发明的生物反应器的步骤。
所述方法可包括 ： 将细胞和 / 或微生物接种到上述生物反应器的 ECS 中。优选地， 细胞和 / 或微生物被固定于空心纤维膜外表面， 和 / 或细胞和 / 或微生物被悬浮于 ECS 中。 本领域技术人员会理解， ECS 可含气体和 / 或液体。
细胞可选自哺乳动物和昆虫细胞系， 微生物可选自 ： 细菌， 酵母和真菌。哺乳动物 和昆虫细胞系优选， 但不限于， 贴壁依赖型细胞系， 和微生物优选非丝状微生物。
贴壁依赖性细胞系一般选自正常二倍体细胞系， 例如人胚胎肺细胞系， 人包皮细 胞系， 人胚胎肾细胞系， 鸡、 兔、 小鼠和大鼠的胚胎成纤维细胞系， 黑猩猩肝成纤维细胞系， 大鼠神经胶质细胞系， 猫肺成纤维细胞系和次代猴肾细胞系 ； 原代细胞系， 例如猴、 狗和兔 肾细胞系， 小鼠巨噬细胞系， 大鼠胰腺细胞系， 大鼠肝细胞系， 鸡胚胎成纤维细胞系， 大鼠垂 体细胞系和羊水细胞系 ； 建立的和转化的细胞系， 例如小鼠成纤维细胞系， 正常大鼠肾细胞 系， 中国仓鼠卵巢和肺细胞系， 幼仓鼠肾细胞系， 黑猩猩胚胎肺细胞系， 非洲绿猴肾细胞系， 小鼠 L 细胞系， HeLa 细胞系， 小鼠巨噬细胞细胞系， 转化的狗肾细胞系， 肉瘤病毒转化的大 鼠肾和小鼠成纤维细胞系， 人神经胶质瘤细胞系， 人骨肉瘤细胞系， 小猎犬肾细胞系， KB 细 胞系， 恒河猴肾细胞系， McCoy 细胞系， 人甲状腺癌细胞系， 人横纹肌肉瘤细胞系， 大鼠肌肉 衍生的成纤维细胞系和兔角膜细胞系。 微生物一般选自正常的或转化的枯草杆菌， 念珠菌属， 大肠杆菌， 汉森酵母属， 乳 酸克鲁维酵母， 乳球菌属， 乳杆菌属， 葡萄球菌属， 毕赤酵母属。酿酒酵母， 粟酒裂殖酵母和 解脂耶氏酵母。
所述方法可包括由标准交叉流操作或由死端操作通过空心纤维膜装置的入口系 统的流体流。
所述方法可包括控制器， 所述控制器用于调节通过空心纤维膜的流体传送。控制 器优选为特定集成的控制器， 其可为压力控制器。
所述方法优选包括供给和 / 或移出物质， 所述物质包括营养物， 气体， 例如氧和二 氧化碳， 缓冲剂 ( 酸性或碱性溶液 )， 激素， 调控生长或改变代谢的化合物， 耗竭的培养基， 代谢废物， 目的产物， 和热交换物质。所述物质可经盒体的入口或出口系统 ( 即通过空心纤 维膜 ) 和 / 或通过上和下顶板中的开口 ( 孔 ) 被供给到细胞和 / 或微生物。
所述方法可包括通过 ECS 的流体流， 且所述流体流还可再循环， 或可通过死端模 式再循环。通过 ECS 的流体流可在压力下操作。本领域技术人员会理解， 通过 ECS 的流体 流优选由自下顶板到上顶板或从上顶板到下顶板的横向流实现。
本文通过引用包括下列参考文献 ：
1.Chresand J.J.， Gillier R.J.and Dale B.E.(1987)Optimisation fibre spacing in a hollow fibre bioreactor.Biotechnol.Bioeng.32 ： 983-982.
2.Cracauer， R.F.， Walker R.D.， and Gruenberg M.(1998)Hollow fiber cell culture device and method of operation.US 4,804,628.
3.Fraser， S.J.， Edwards， W.and Leukes， W.D.(2007)Production of secondary metabolites and recombinant proteins.Synexa Life Sciences(PTY.)LTD. WO2007004170A2
4.Futselaar H.(1993)The transverse-flow module construction ， performance and application.PHD Thesis.University of Trente， Netherlands.
5.Gerlach J.(1996)Module for culturing and using metabolisms and/or for maintaining microorganisms.US 5,516,691
6.Smart J.， Starov V.M.， Schucker R.C.and Lloyd D.R.(1998)Pervaporative extraction of volatile organic compounds from aqueous systems with use of a tubular transverse flow module.J Membr Sci143 ： 159-179.
7.Vladisavljevic G.T.and Mitrovic M.V.(1999)Pressure drops and hydraulic resistances in a three-phase hollow fiber membrane contactor with frame elements.Chem Eng Processing 40 ： 3-11
8.Zhang S.， van Houten R.， Eikelboom D.H.， Doddema H.， Jiang Z.， Fan Y.and Wang J.(2003)Bioresource Technol 185-192. 【附图说明】
以下将参照非限制性附图详述本发明， 所述详述仅旨在举例。 图 1 显示各种现有技术装置。
图 2 显示本发明的完整的可缩放的生物反应器的 (A) 断面图， (B) 俯视图或仰视 图和 (C， D) 透视图。
图 3 显示本发明的可缩放的生物反应器的立体图。
图 4 显示方法例的示意图。
图 5 显示实施例 1 中使用的生物反应器装置。
图 6 显示实施例 1 的 CHO-K1 方法数据。
【发明详述】
本设计中， 模块增加和处理灵活性原理被编入毛细管网络膜的 2-D 和 3-D 设计。 可缩放的膜生物反应器设备 ( 图 2 和 3) 包括 2 个顶板 (1) 和固定在 2 个顶板之间的至少 1 个盒体 (5)， 有效限定毛细管外空间 (ECS)， 及将其从位于空心纤维膜内的毛细管内空间 (ICS) 区分开。图 2 显示完整的细胞培养模块， 显示 2 个顶板 (1) 固定了例如 7 个独立的盒 体 (5)。上和 / 或下顶板可包括中央透明观察板 (2)， 其可使在操作期间观察模块内情况。 各顶板还可包括至少 1 个 ECS 孔 (3， 4)， 其发挥到 ECS 的入口 / 出口的作用 ； 和至少 1 个配 件或孔， 其允许通过例如 pH 配件 (29) 或 DO 探头 (30) 将探头或传感器插入到 ECS 隔间。 使 用 O 型环， 垫圈或通过其他手段 (8) 将各盒体 (5) 与相邻盒体 (5) 和 / 或顶板 (1) 密封。盒 体和顶板封件通过例如位于层叠的设备 4 个角的 4 个杆或钉 (6) 挤压在一起， 及固定。更 大的生物反应器可需要更多钉， 以辅助挤压。
各盒体 ( 图 3) 包括内框架 (7)， 其中使用树脂， 环氧树脂或通过其他手段固定至少 4 层毛细管膜 (9)。在优选实施方式中， 毛细管膜是陶瓷， 给框架提供刚性， 及提供对用聚合 物膜时常观察到的结构变形的耐力。但是， 应注意， 此设计不限于任何特定尺寸， 化学性质 或技术特征的毛细管。 在优选实施方式中， 各层包括类似类型的膜， 但不同层可包括具有不 同化学或技术性质的膜， 包括， 但不限于， 制造材料， 孔尺寸和分布， 涂层， 选择性和 / 或导 电性。
2-D 膜阵列 (9) 确保通过膜在反应器内的所有位置均匀供给和移出物质， 由此最 小化生物反应器内的轴向梯度和不均一性。通过在压力下操作模块， 细胞培养流体中可达 到更高浓度的溶解的营养物或气体。自 1 个膜系统 ( 层或排 ) 到 ECS( 细胞培养空间 )、 并 通过第二膜系统出的营养物死端流可用于在膜表面浓缩和固定细胞， 及确保营养物改善的 质量转移和均匀递送到生物膜内全部固定的细胞。已将细胞浓度和生物膜形成与细胞 - 细 胞通信， 细胞 - 活力和增强的产力相关联。
歧管中的孔 (10， 11， 12， 13) 排内接收膜的各连续层， 各层与其上和其下膜层以垂 直取向。而且， 相同取向的各连续膜层可偏移， 从而当从上观察时， 膜交错形成连续的双轴 膜网络 (9)， 通过沟流限制流体错误分配和 ECS 内细胞的重力下沉淀。
通过包括在框架 (7) 上的流体分配歧管将各膜层与其他膜层有效间隔。膜层内的 各毛细管膜的开放端开向且被独立的流体分配室 ( 储液池 )(14， 15) 包括。 单个盒体 (5) 内 的不同膜层和流体分配室 (14， 15) 通过 O 型环， 垫圈或通过其他手段 (19) 彼此密封。4 个 独立的端板 (18) 均与框架 (7) 对齐和密封， 且通过至少 2 个螺丝或钉 (20) 固定， 以限定流 体分配室 ( 储液池 )。各膜层在各相对的流体分配室中有 ICS 入口 (21， 23， 25， 27) 或 ICS 出口 (22， 24， 26， 28)， 它们能使分开的和内含的流体流通过各膜层。 在优选实施方式中， 使用至少 1 个膜层将营养物溶液供给到 ECS 内的细胞， 而使用 至少 1 个层移出含目的产物和 / 或代谢废物的耗竭的培养基。可使用更多层 ：
●以使用气体可渗透膜给培养空间充氧 ；
●以通过调节 CO2 浓度， 导入酸性或碱性溶液来缓冲培养空间， 或使用选择性可渗 透膜从培养空间清除有机酸 ；
●用于受控的供给调控生长或改变代谢的化合物， 用于增强的处理稳定性和控 制。包括， 但不限于， 特定的营养料， 生长期抑制剂或诱导物分子 ； 或
●作为热交换器维持反应器在恒定温度。
细胞培养空间可通过位于顶板的入口或出口用营养物溶液排放， 清除或再循环。
模块组件提供自相同设计的规模的增加的灵活性， 其中只要用包括至少 1 个膜插 入件的生物反应器优化所述方法， 可根据需要， 将更多膜插入件叠在另一膜插入件上部， 从 而有效线性增加膜表面积和反应器体积。就给定方法而言， 自不同膜插入件的膜层可一起 歧化， 以辅助流体传送和 / 或到 / 从模块内全部膜插入件的移出的均匀分配。
在优选实施方式中， 生物反应器设备竖直取向， 膜网络水平取向 ( 图 2， 截面 A-A)。 此例中， 位于基部顶板 (1) 的 ECS 孔 (4) 用于将细胞接种物和 / 或流体导入 ECS， 而使气体 或耗竭的培养基通过位于顶部顶板的 ECS 孔 (3) 出。用此方法， 整个 ECS 可被装填流体， 防 止气塞。这对于用于监控 ECS 内的处理情况的任何探头 ( 包括， 但不限于 pH 探头 (29) 或 DO 探头 (30)) 的有效操作是必要的。 横向通过膜网络的流体流可使用标准交叉流操作条件 通过 ECS 再循环 ( 见图 1， 现有技术 )， 或 ECS 出口 (3) 可闭合， 且流体流以死端模式操作。 可使用任意流模式将细胞固定在包括在盒体 (5) 内的膜层中的至少 1 个空心纤维外表面。 通过对 ECS 内的流体施加压力来辅助， 从而使液体通过选择性可渗透毛细管膜 (9) 壁渗透 到 ICS 中， 且通过至少 1 个 ICS 出孔 (22， 24， 26， 28) 出， 而接种物保持在 ECS 侧的膜表面。
长时间操作过程中， 可使用位于基部顶板的 ECS 孔 (4) 从 ECS 清除可蓄积在 ECS 内的和在重力作用下沉淀的细胞碎片或物质。
接种后， 将 ECS 孔 (3， 4) 两端密封， 在 ECS 内有效包括细胞培养空间。例如 ( 图 2， 3 和 4)， 营养物溶液通过第一膜层或系统 (A) 的 ICS， 从膜层 ICS 入口 (21) 进入， 填充入口 流体分配室 ( 入口储液池 )， 膜层中的全部毛细管腔， 出口 (14) 处的流体分配室 ( 出口储 液池 )， 并通过相同膜层的 ICS 出口 (22) 出。操作期间此膜层的 ICS 出口 (22) 闭锁， 培养 基递送以死端模式操作。从此第一膜层 (a) 中的全部毛细管 ICS 过滤新鲜的营养物溶液， 穿过膜壁进入生物反应器 ECS， 在那里新鲜的营养物可被细胞代谢。在压力下， 耗竭的培养 基 / 渗透物通过滤过毛细管壁进入第二膜层的 ICS 而出 ECS， 及通过第二膜层的 ICS 出口 (28) 出膜层 ICS。在渗透物收集管中收集耗竭的培养基 / 渗透物。用此方法， 将新鲜的营 养物连续供给到固定的细胞 / 生物膜， 同时从细胞培养空间连续移出可不利地影响细胞生 长的代谢废物。 此外， 依赖于目的产物的分子特征和第二膜层内毛细管膜的物理特征， 分泌 的产物可连续产生和随着渗透物从生物反应器移出， 由此保持生物质和防止细胞生长被毒 性代谢物抑制， 产物形成的负反馈控制和 / 或不稳定的产物的酶解。
连续操作下， 细胞培养方法可需要其他营养物， 例如用于高密度细胞生长的增加 的溶解氧 (DO)。第二膜层腔可充气 (B)， 在那里， 从第二膜层的 ICS 入口 (27) 供给湿润的 气体， 从入口 ( 入口储液池 ) 进入流体分配室， 流过膜层中全部毛细管的 ICS， 从出口 ( 出口 储液池 ) 进入流体分配室， 随着渗透物从相同膜层的 ICS 出口 (28) 出。溶解的氧可从 ICS 穿过膜壁向 ECS(b) 扩散， 在那里， 其可被固定的细胞 / 生物膜代谢。可通过集成的处理控 制器， 使用 DO 探头调节充氧速度， 例如通过调节湿润的气体流中的 O2 水平。
第三膜层 (C) 可用于通过酸性或碱性溶液， 二氧化碳 (CO2) 或碳酸氢盐的控制的 供给来调节细胞培养流体 pH。这些溶质或溶解的代谢物可从第三膜层的 ICS 入口 (23) 供 给， 从 ICS 入口进入流体分配室 ( 入口储液池 )， 通过膜层中的全部毛细管腔， 从出口 ( 出口 储液池 ) 进入流体分配室， 从相同膜层的 ICS 出口 (24) 出。可从 ICS 穿过膜壁 (c) 将缓冲 化合物供给到 ECS。缓冲化合物穿过膜壁从 ICS 到 ECS 内的细胞培养流体的递送速度可通 过集成的处理控制器， 使用 pH 探头控制。例如用于调节流体穿过膜壁递送到 ECS 的集成的 压力控制器。
可使用第四膜层供给特定生长调控因子或影响细胞代谢和 / 或目的化合物生产 的其他化合物 (D)。这些化合物可昂贵或不稳定。可将所述化合物在压力下通过第四膜层 的 ICS 入口 (25) 供给 (D) 到细胞培养空间， 进入入口流体传送室 ( 入口储液池 )， 通过第 四膜层中的毛细管腔， 从出口 ( 出口储液池 ) 进入流体传送室， 通过相同膜系统的 ICS 出口 (26) 出。特定代谢物 (d) 穿过膜壁， 从 ICS 到 ECS 内的细胞培养流体的递送速度可使用处 理特定集成的控制策略控制。例如用于调节流体穿过膜壁递送到 ECS 的集成的压力控制 器。
应注意， 膜系统 ( 层 ) 数， 递送到细胞培养空间的物质的组成和顺序可不同， 但改 善的质量转移， 独立的流体传送和集成的处理控制器的原理保持相同。 从不同膜系统的 ICS 递送到 ECS 的全部化合物通过对流在 ECS 内和通过固定的细胞层 / 生物膜运输。随着这些 物质通过固定的细胞层 / 生物膜， 它们被细胞代谢， 导致自我调控穿过生物膜建立的梯度。 在集成的处理中完全控制这些梯度的性质， 及允许可用于在连续的处理中调节形态分化和 生长期相关代谢的连贯的处理条件， 其规模由所用膜插入件的数量和尺寸限定。【实施例】
【固定在有单个盒体的可缩放的细胞培养生物反应器的 ECS 内的中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞的培养】
CHO 细胞常规用于生物和医学研究， 包括毒性筛选， 营养和基因表达。CHO 细胞是 用于重组蛋白治疗剂生产的最常用的哺乳动物宿主。
CHO-K1 是贴壁依赖性细胞系， 其在适宜细胞培养表面一般生长为单层， 且在我们 5 2 的实验室， 在细胞培养瓶中常规生长至细胞密度约 1×10 细胞 /cm 表面积。
【染色和培养条件】
在 T-75 瓶中， 使用 30ml 补充了 5％ (v/v) 胎牛血清 (FBS) 和 1％ (v/v) 青霉素 / 链霉素的含 2mM 谷氨酰胺的 DMEM-F12 生长培养基常规培养贴壁的 CHO-K1 细胞。细胞每 3 ～ 4 天传代。使用含 80ml 生长培养基的 T-150 瓶进行培养物扩展。全部培养在 CO2- 温 育器中于 37℃进行。
说道接种， 将细胞悬浮于 15 ～ 20ml 生长培养基中。此例中， 将约 2.5×107 细胞 用作接种物。
【反应器装置】 使用包括被顶板固定的单个盒体的一次性的生物反应器模块进行 CHO-K1 培养。 生物反应器设计提供了在 119cm3 的工作体积 (ECS 体积 ) 中， 用于贴壁的细胞生长的 519cm2 的总毛细管表面积。生物反应器和辅助装置示意于图 5， 且其包括集成于顶板之一的 pH 探 头和溶解氧探头， 以监控 ECS 内的处理情况。此例中， 盒体内的 4 个陶瓷膜层均包括相同化 学组成、 但不同孔尺寸的膜， 从而各膜层在操作过程中辅助不同功能， 如下所述。
层1： 1400nm 陶瓷毛细管 - 通过腔用充气移出耗竭的营养物
层2： 40nm 陶瓷毛细管 - 通过腔供给 100％氧
层3： 1400nm 陶瓷毛细管 - 通过腔供给营养物溶液
层4： 40nm 陶瓷毛细管 - 通过腔供给 100％氧
使用 5％二氧化碳 / 压缩气体气动供给生长培养基， 从而自培养基供给管的营养 物流通过位于层 3 的全部膜的腔 (ICS)。操作之前， 通过从培养基供给管填充培养基， 通过 层 3ICS 并进入填充收集管来从网和膜腔置换气体。操作期间夹闭层 3 的 ICS 出口， 且以死 端模式操作培养基供给， 从而使营养物从 ICS 通过毛细管膜壁及进入 ECS 或细胞生长隔间。 从 ECS 置换耗竭的培养基， 及经膜层 1 移出。
类似的， 通过位于层 2 和 4 的毛细管膜 ICS 供给 100％氧。以大于或等于培养基供 给压力的压力供给氧， 依赖于细胞生长隔间内细胞生长的氧摄取要求。无气泡充氧主要是 扩散性的， 且被通过 ICS 表面的气流促进。通过还用于维持比流速的流控制阀维持反压。
终层具有两个功能 ： 第一， 自增湿管的压缩气流通过层 1 的 ICS 进入收集管， 然后 其通过流控制阀释放。流控制阀维持气流于比流速， 且还提供操作要求的反压 ； 第二， 操作 期间从 ECS 移出耗竭的培养基， 穿过毛细管壁及以等于培养基供给速度的速度进入层 1 的 ICS。将进入层 1 膜腔的渗透物随着通过此层的气流排入收集管。渗透物可采样或经采样 孔从收集管移出。
【灭菌】
将有网和无菌连接件的一次性的生物反应器模块用 γ- 照射。将培养基供给管，
填充管， 增湿管， 渗透物收集管和接种管 ( 各有网和无菌连接件 ) 在接种之前， 经独立地高 压灭菌， 并无菌连接到经 γ- 照射的生物反应器模块。
【接种】
接种之前， 将无菌生物反应器装置和生长培养基于 37℃预温育。将生长培养基用 5％二氧化碳 / 气体喷射和平衡至 pH7.2。
将 2.5×107CHO-K1 细胞直接接种到生物反应器 ECS 内。通过用补充了 10％ (v/ v) 胎牛血清 (FBS) 和 1％ (v/v) 青霉素 / 链霉素的含 2mM 谷氨酰胺的 DMEM-F12 生长培养 基填充 ECS 来将细胞固定于毛细管膜外表面。在穿过膜壁压力下将进入 ECS 的自接种管的 培养基流导入毛细管腔 (ICS)， 导向填充管， 然后在操作前再循环到培养基供给管内。
【操作】
使用补充了 10％ (v/v) 胎牛血清 (FBS) 和 1％ (v/v) 青霉素 / 链霉素的含 2mM 谷 氨酰胺的 DMEM-F12 生长培养基 ( 用 5％二氧化碳 / 气体平衡至 pH7.2) 于 37℃培养细胞。
接种后， 用通过膜层 1 的 ICS 的恒定空气流量和压力 (40kPa) 及用通过膜层 2 和 4 的恒定 100％氧流量和压力 (50 ～ 70kPa) 操作生物反应器。每隔一段时间调节氧压力， 以支持增加的氧递送和维持 ECS 内的 DO 浓度 (10 ～ 30％ )， 用于增强的细胞生长和活力。 氧压力不得低于施加到培养基供给管的压力， 防止耗竭的培养基流进入这些膜层。 随着 CHO 细胞生长， 营养物耗竭、 且由于通过细胞代谢产生废物产物而 ECS 内的培 养基 pH( 细胞生长环境 ) 改变。从 ECS 移出耗竭的培养基， 及将新鲜的培养基置换进膜层 1 的 ICS 中， 所述新鲜的培养基从膜层 3 的 ICS 被供给到 ECS。将耗竭的培养基从膜层 1 的 ICS 置换， 并随着流过膜层 1 的 ICS 的气体转移到收集管。通过施加到培养基供给管的气 动压力 ( ＞ 40kPa) 和施加到膜层 1 的 ICS 的恒定压力 ( ＝ 40kPa) 之间的压力差调节供给 新鲜的培养基和从 ECS 移出耗竭的培养基的速度。调节流速至超过生长细胞的营养物需要 (1 ～ 10ml/ 小时 )。
操作期间， 监控 ECS 内的 pH， 且当培养基供给速度不能缓冲细胞生长环境时， 每隔 一段时间向培养基供给掺入小体积碳酸氢盐， 以补偿以高细胞密度增加的废物蓄积。用此 方法， 将 ECS 的 pH 维持在 pH6.8 以上。
连续操作生物反应器， 且细胞维持 11 天的时间， 然后拆开膜模块， 及使用台盼蓝 对 CHO-K1 计数。每天从收集管采样耗竭的培养基， 用于底物分析。
【结果与讨论】
连续操作 CHO-K1 细胞培养 11 天。 如图 6 的底物分析显示， 培养期间， 在全部时间， 营养物供给超过需求。接种后， 细胞的葡萄糖摄取速度低， 表明生长有 1 ～ 2 天的延迟期。 第 2 天后， 观察到葡萄糖摄取速度从 0.1mg/ 小时增加， 在第 4 天达到最大值 12mg/ 小时， 之 后葡萄糖摄取速度下降并稳定在培养残余的约 8mg/ 小时。表明在第 4 天得到最大细胞产 率。
乳酸盐生产遵循与葡萄糖摄取速度类似的趋势， 细胞将葡萄糖代谢为乳酸盐的水 平保持低于摄取速度， 直到第 9 天， 在该时间点， 细胞应激于低培养基 pH， 其降至 pH6.8 以 下。当细胞代谢明显不再适于生长实验时停止， 及测定总细胞产率。 8
得到 1.5×10 细胞的总细胞产率。这些细胞中， 1.5×107 细胞松散粘连或悬浮于 ECS， 而胰蛋白酶消化后收获 1.3×108 贴壁的细胞。
此实验中， 得到 2.5×105 细胞 /cm2 的贴壁的细胞密度， 良好比肩于 Syzmanski 等 5 2 5 人报道的 T175 瓶 (1.7×10 细胞 /cm ) 和 HYPER 瓶 (2.2×10 细胞 /cm2) 培养中的最大 CHO 细胞密度 (2008)。
【参考文献】
1.Szymanski， S.L， Huff， K.W， Patel， A.D.， Murray， J.R， Feasby， J.， Sharma， B.V.， Denise Young， D.K.， Strulovici， B.， Peltier， R.R.， Johnson， E.N.and Rush， A.(2008) Automated application of a novel high yield， high performance tissue culture flask.JALA vol.13(3) ： 136-144.