一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用技术领域
本发明属于生物技术领域。具体涉及一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用。
背景技术
近年来从世界范围来看由于抗生素的过度使用，造成细菌性感染和疾病呈上升趋势负
面效应越来越大，耐药性菌株的不断出现也越来越引起人们忧虑，因此寻找、发现和生产
新的抗生素的替代品已列入人们的议事日程。跨入新世纪以来，抗菌肽(Antibacterlal
peptides)是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肤,存在于多种生物
体中,是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分。由于自身的优点已日益引起人们的关注，
并已成为研究的热点，其中牛乳铁蛋白肽(LactoferricinB)，不仅参与铁的转运，而且
具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等生物学功能，因此被认为是一种新型的抗
菌药物和极具开发潜力的婴幼儿食品﹑饲料添加剂。
最初，日本研究人员发现天然牛乳铁蛋白的降解后，其抗菌活性比牛乳铁蛋白强400
多倍，分离提取后发现活性物质为牛乳铁蛋白肽。然而从天然来源中分离牛乳铁蛋白肽产
量低、费时长、工艺复杂，成本昂贵。此后，商业上用的牛乳铁蛋白肽是从牛奶中分离提
取牛乳铁蛋白，再经过生物酶降解产物，产生牛乳铁蛋白肽。由于所原来降解牛乳铁蛋白
的生物酶价格昂贵，因此这种方法生产的牛乳铁蛋白肽成本仍然较高。而人工合成牛乳铁
蛋白肽及其衍生物费用更高，无法大规模生产。目前我国从新西兰进口的牛乳铁蛋白每吨
价格为35万美元。尽管如此，随着生物技术的发展，牛乳铁蛋白已在欧洲和日本被进行商
业化生产，用于制造母乳化婴儿配方奶粉或其它功能性食品。因此利用基因工程技术将牛
乳铁蛋白肽基因转入其它生物中表达，为解决牛乳铁蛋白肽来源不足提供了新的途径。
基因工程表达法将是大量生产抗菌肽的理想途径。基因工程生产抗菌肽的表达系统主
要是毕赤酵母和大肠杆菌,常选用表达宿主偏爱的密码子人工合成基因并进行克隆表达。原
核表达系统是最早采用的表达系统,也是目前应用的较为经典的表达系统。该系统主要是将
目的基因连接到载体上,再对其进行克隆,之后转化至细菌,通过诱导表达、纯化获得目的蛋
白。该表达系统的优点体现在短时间内能获得目的蛋白,而且成本较低。但是，抗菌肽的大
量分泌会对宿主产生有害作用，因此，目前主要通过重组蛋白技术将目的基因同谷胱甘肽
硫转移酶，硫氧还蛋白，绿色荧光蛋白，外壳蛋白，类弹性蛋白，酮类固醇异构酶，小分
子泛素样修饰蛋白等融合表达，降低了抗菌肽对宿主细胞的毒性。本研究选择谷胱甘肽巯
基转移酶(GlutathioneS-transferase，GST)作为融合标签，尝试利用大肠杆菌表达系
统制备牛乳铁蛋白肽(LfcinB)抗菌肽。
发明内容
本发明目的在于，提供一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用，该方法选取氨基酸编码
序列NO.1为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2，并在苷酸
编码序列NO.2设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物
的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，PCR扩增获得抗菌肽基因片段，分
别构建重组表达载体，转化大肠杆菌后诱导表达。超声裂解菌体，十二烷基硫酸钠—聚丙
烯酰胺凝胶电泳检测，融合蛋白GST-LfcinB成功表达。融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖亲和层
析纯化后，经羟胺剪切缓冲液切割融合蛋白，释放抗菌肽。通过琼脂扩散法抑菌实验检测
其对大肠杆菌和金色葡萄球菌都具有明显的抑菌活性。克服了牛乳铁蛋白肽分子量较小而
且容易被蛋白酶水解，往往造成产量低，难以产业化。本发明所述方法，大大提高了抗菌
肽的产量。
本发明所述的一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，按下列步骤进行：
a、抗菌肽LfcinB基因的合成：
根据牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，选取氨基酸编码序列NO.1：Ac-FKCRRWQWRM
KKLGAP-NH为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2：上游
5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游
5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’，再将
核苷酸编码序列NO.2，设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两
条引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，即得上游引物：5’-GATCCTTCA
AATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTCTAAC；下游引物：
5’-TCGAGTTAGAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCATTGAAG，
再将选取的氨基酸编码序列NO.1目标蛋白上游引入羟胺切割蛋白位点天冬酰胺—甘氨酸；
PCR扩增目的抗菌肽基因：
PCR反应体系：超纯水40μL，10×PCR含Mg2+缓冲液5μL，2.5mmol/LdNTPs1μL，
上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，Taq酶1μL，共计50μL；
反应程序为：温度94℃保持5分钟后，温度94℃反应30秒，温度55℃反应30秒，
温度72℃反应30秒，共进行30循环后，温度72℃保持10分钟；
PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后，温度-20℃保存备用；
b、抗菌肽LfcinB基因重组载体的构建：
将步骤a中PCR产物与表达载体pGEX-4T-1用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，
反应体系为载体pGEX-4T-142μL，EcoRI1.5μL，XhoI1.5μL，10×FastDigest
缓冲液5μL，Total50μL分别混匀，温度37℃水浴20min；
连接产物转化到BL21大肠杆菌中，在含有抗生素氨苄青霉素的LB固体平板上挑选转
化子，分别接种于含50μg/mL氨苄青霉素的4mLLB液体培养基中，温度37℃，220rpm振
荡培养8-10h，提取质粒后，PCR鉴定，并命名为pGEX-4T-1LfcinB；
c、重组抗菌肽LfcinB基因的诱导表达：
重组菌pGEX-4T-1LfcinB经终浓度为1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导后，经十二
烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，与阴性对照相比，重组菌有明显浓集的目的蛋白
表达条带，检测目的蛋白，即得牛乳铁蛋白肽。
所述方法获得的牛乳铁蛋白肽在制备抑制大肠杆菌和金色葡萄球菌中的应用。
本发明所述的一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，该方法获得的牛乳铁蛋白肽经谷光甘肽
琼酯糖凝胶—4B(GlutathioneSepharose4B)亲和层析凝胶纯化融合蛋白结果：
大量培养诱导重组表达菌pGEX-4T-1LfcinB，收集后高压破碎菌体，离心后分别取上
清液和沉淀样品，三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Tricine-SDS-PAGE)检测，结果显示上清液和沉淀都有表达，主要表达在上清液，上清
液经0.45μm滤膜过滤除杂后，经谷光甘肽琼酯糖凝胶—4B(GlutathioneSepharose4B)
凝胶亲和层析纯化，用20％Tricine-SDS-PAGE胶电泳检测到一条与预测分子量大小一致
的条带。
本发明所述的一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，该方法中氨基酸序列No1：Ac-FKCRR
WQWRMKKLGAP-NH2；牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，核苷酸编码序列NO.2：上游
5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游
5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’。其制
备方法，构建牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB氨基酸的核苷酸序列的表达载体，并将表达
载体转化到宿主细胞中，形成可以表达LfcinB抗菌肽的重组细胞；培养重组细胞，使其可
以表达LfcinB抗菌肽；分离细胞裂解后，用蛋白酶切除去标签，产物具有抗菌活性。
附图说明
图1为本发明LfcinB抗菌肽基因的PCR扩增结果图；
图2为本发明LfcinB抗菌肽基因重组质粒的PCR鉴定图；
图3为本发明LfcinB抗菌肽基因重组质粒的双酶切鉴定图；
图4为本发明重组LfcinB抗菌肽基因诱导表达图；
图5为本发明亲和层析凝胶纯化LfcinB抗菌肽融合蛋白图；
图6为本发明LfcinB抗菌肽融合蛋白对金色葡萄球菌的抑制效果图；
图7为本发明LfcinB抗菌肽融合蛋白对大肠杆菌的抑制效果图。
具体实施方式：
实施例
a、抗菌肽LfcinB基因的合成：
根据牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，选取氨基酸编码序列NO.1：Ac-FKCRRWQWRM
KKLGAP-NH为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2：上游
5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游
5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’，再将
核苷酸编码序列NO.2，设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两
条引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，即得上游引物：5’-GATCCTTCA
AATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTCTAAC；下游引物：
5’-TCGAGTTAGAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCATTGAAG，
再将选取的氨基酸编码序列NO.1目标蛋白上游引入羟胺切割蛋白位点天冬酰胺—甘氨酸；
PCR扩增目的抗菌肽基因：
PCR反应体系：超纯水40μL，10×PCR含Mg2+缓冲液5μL，2.5mmol/LdNTPs1μL，
上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，Taq酶1μL，共计50μL；
反应程序为：温度94℃保持5分钟后，温度94℃反应30秒，温度55℃反应30秒，
温度72℃反应30秒，共进行30循环后，温度72℃保持10分钟；
PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后，温度-20℃保存备用；
b、抗菌肽LfcinB基因重组载体的构建：
将步骤a中PCR产物与表达载体pGEX-4T-1用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，
反应体系为载体pGEX-4T-142μL，EcoRI1.5μL，XhoI1.5μL，10×FastDigest
缓冲液5μL，Total50μL分别混匀，温度37℃水浴20min；
连接产物转化到BL21大肠杆菌中，在含有抗生素氨苄青霉素的LB固体平板上挑选转
化子，分别接种于含50μg/mL氨苄青霉素的4mLLB液体培养基中，温度37℃，220rpm振
荡培养8-10h，提取质粒后，PCR鉴定，并命名为pGEX-4T-1LfcinB；
c、重组抗菌肽LfcinB基因的诱导表达：
重组菌pGEX-4T-1LfcinB经终浓度为1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，
经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶电泳检测，与阴性对照相比，重
组菌有明显浓集的目的蛋白表达条带，检测目的蛋白，即得牛乳铁蛋白肽。
谷光甘肽琼酯糖凝胶—4B(GlutathioneSepharose4B)亲和层析凝胶纯化融合蛋白结
果：
大量培养诱导重组表达菌pGEX-4T-1LfcinB，收集后高压破碎菌体，离心后分别取上
清液和沉淀样品，三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Tricine-SDS-PAGE)胶电泳检测，结果显示上清液和沉淀都有表达，主要表达在上清液，
上清液经0.45μm滤膜过滤除杂后，经谷光甘肽琼酯糖凝胶—4B(GlutathioneSepharose
4B)凝胶亲和层析纯化，用20％三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Tricine-SDS-PAGE)胶电泳检测到一条与预测分子量大小一致的条带。
抗菌肽的抗菌效果：
将纯化后的凝胶从胶上切下来，溶解在0.01％的醋酸缓冲液中，取上清液，采用琼脂
扩散法检测抑菌活性，结果表明：通过本发明所述方法获得的牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌和
金色葡萄球菌有明显的抑菌活性，图6，图7。
名称：一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用
申请人：中国科学院新疆理化技术研究所
牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，氨基酸编码序列NO.1：Ac-FKCRRWQWRMKKLGAP-NH2。
牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，核苷酸编码序列NO.2：上游5’-TCAAATGCTGGCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAGAAATTGGGTGCTCCTTTTC-3’下游5’-GAAAGCACGACGCACGCAAGTGATAGAAGGAGCACCCAATTTCTTCCA-3’。