AXL/c-Met抑制剂在制备逆转肾癌舒尼替尼耐药的药物中的应用技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种AXL/c-Met抑制剂在制备逆转
肾癌舒尼替尼耐药的药物中的应用。
背景技术
肾癌(renalcellcarcinoma，RCC)是中国发病率第二的泌尿系统肿瘤。
约20-30％的肾癌患者在诊断时已经处于晚期，而约30％的原位肾癌患者在术
后会出现复发、转移。目前，以舒尼替尼为代表的受体型酪氨酸激酶(RTK)
抑制剂是晚期肾癌的主要治疗手段。舒尼替尼是一种口服、多靶点的酪氨酸
激酶抑制剂，其主要靶点包括血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板源性
生长因子受体(PDGFR)、干细胞生长因子受体(KIT)、FMS样酪氨酸激酶3
(FLT3)，具有抑制血管生成和抑制肿瘤细胞生长的双重作用。尽管舒尼替尼
能显著缩减肿瘤体积，但大部分患者在治疗6-15月后会出现耐药，导致肿瘤
进展复发，使舒尼替尼不能有效延长晚期肾癌患者的生存期。因此阐明肾癌
舒尼替尼耐药的分子机制将有助于逆转肿瘤耐药，改善患者预后。
大量研究表明，酪氨酸激酶代偿性扩增、活化是耐药产生的常见机制之
一。AXL(GENBANK号NM_001699.5)和c-Met(GENBANK号
NM_001127500.1)均属于受体型酪氨酸激酶，两者具有相似的激酶结构域，
能够活化相似的信号通路。据报道，代偿性扩增的AXL、c-Met参与了非小
细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤对表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂产生的耐药(参
见文献ZhangZ,,etal.ActivationoftheAXLkinasecausesresistanceto
EGFR-targetedtherapyinlungcancer[J].NatureGenetics,2012,44(8),852-860；
MeyerAS,etal.ThereceptorAXLdiversifiesEGFRsignalingandlimitsthe
responsetoEGFR-targetedinhibitorsintriple-negativebreastcancercells[J].
Sciencesignaling,2013,6(287):1-14.)。BMS777607，AXL和c-Met的双重抑
制剂，目前已处于多项临床试验中，用于实体肿瘤的单药治疗。(参见文献
SchroederGM,etal.Discoveryof
N-(4-(2-amino-3-chloropyridin-4-yloxy)-3-fluorophenyl)-4-ethoxy-1-(4-fluorophe
nyl)-2-oxo-1,2-dihydropyridine-3-carboxamide(BMS-777607),aselectiveand
orallyefficaciousinhibitoroftheMetkinasesuperfamily[J].Journalofmedicinal
chemistry,2009,52(5):1251-1254.)
目前AXL和c-Met在肾癌耐药中的研究较少，AXL/c-Met抑制剂用于逆
转肾癌舒尼替尼耐药也尚未见文献报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供AXL/c-Met抑制剂新的医药用途。
本发明的另一个目的是提供AXL/c-Met抑制剂在制备逆转肾癌舒尼替尼
耐药的药物中的应用。
本发明提供了一种预防肾癌舒尼替尼耐药的方法。
本发明前期建立了舒尼替尼耐药的肾癌细胞株7SuR、ACSuR并保藏于
中国典型培养物保藏中心(典藏号：CCTCCC2014217，CCTCCC2014238)。
通过检测多个受体型酪氨酸激酶的表达情况，我们发现耐药细胞7SuR、
ACSuR中AXL和c-Met显著活化，并且干扰AXL和c-Met表达或使用
AXL/c-Met抑制剂BMS777607能够使耐药细胞恢复对舒尼替尼的反应性，但
干扰AXL或c-Met中的某一个并不能逆转耐药，提示AXL和c-Met共同参与
了肾癌细胞对舒尼替尼的耐药。
此外，我们还发现，用舒尼替尼联合AXL/c-Met抑制剂处理荷有普通肾
癌细胞的裸鼠，其移植瘤生长被持续抑制，未对舒尼替尼产生耐药性。
以上结果提示，AXL/c-Met抑制剂可用于逆转肾癌舒尼替尼耐药，以及其
与舒尼替尼联用可防止舒尼替尼耐药的产生。
本发明的第一方面，提供了AXL/c-Met抑制剂在制备肿瘤联合治疗药物
中的应用。
所述的AXL/c-Met抑制剂为BMS777607或NPS-1034；
或根据AXL(GENBANK号NM_001699.5)和c-Met(GENBANK号
NM_001127500.1)的序列，通过本领域常规技术，设计相关的siRNA或shRNA。
所述的联合治疗药物为舒尼替尼。
所述的肿瘤优选为肾癌，特别是舒尼替尼耐药的肾癌。
本发明的第二方面，提供了AXL/c-Met抑制剂在制备逆转肾癌舒尼替尼
耐药的药物中的应用。
所述的药物为AXL/c-Met抑制剂与舒尼替尼联用药物。
所述的AXL/c-Met抑制剂是抑制或降低AXL/c-Met基因转录(翻译)的
物质，或能抑制AXL/c-Met正常生物学功能的物质。例如通过siRNA或shRNA
等方法降低AXL/c-Met表达；使用AXL/c-Met双重抑制剂BMS777607抑制
AXL/c-Met正常生物学功能等。
本发明的第三方面，提供了AXL/c-Met抑制剂在制备预防肾癌舒尼替尼
耐药发生的药物中的应用。
所述的AXL/c-Met抑制剂为BMS777607或NPS-1034。
所述的预防药物为AXL/c-Met抑制剂与舒尼替尼联用药物。
本发明的第四方面，提供了一种联合用药物，具体的是一种治疗肾癌的
联合用药物，所述的联合用药物其活性成分为AXL/c-Met抑制剂和舒尼替尼。
所述的联合用药物，还可以包含一种或多种药用载体。
所述的AXL/c-Met抑制剂，是能同时抑制AXL和c-Met的物质，包括
但不限于：BMS777607、其他针对AXL和c-Met的干扰序列；
本发明所述的联用、联合用药物，包括同时或顺序的施用有效量的
AXL/c-Met抑制剂和有效量的舒尼替尼。所述的顺序可以是先用AXL/c-Met
抑制剂，再用舒尼替尼；也可以是先用舒尼替尼，再用AXL/c-Met抑制剂。
本发明所述的药用载体，即药学上可接受的载体，是指药学领域中常用
的除活性成分以外添加物，例如稀释剂(淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐
类)、赋形剂等，填充剂如淀粉蔗糖、粘合剂如水、乙醇、纤维素衍生物、明
胶和聚乙烯吡咯烷酮，崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠，增溶剂如聚山梨酯
类和聚氧乙烯脂肪酸酯类等，吸收促进剂、表面活性剂如吐温、司盘，吸附
载体、润滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶等。另外，还可以在组合物中加入其它
辅料如香味剂、甜味剂等。
本发明所述的联合用药物，可以药物组合物的形式通过口服、鼻吸入、
直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，
可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微
丸、固体分散体、包合物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、熔胶剂、糖
浆剂、合剂、溶液剂等，用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水
或油性混悬剂、乳剂、脂质体、微囊、微球、毫微粒等，也可将其制成各种
缓释、控释制剂。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、栓剂和注射
剂，特别优先特定部位靶向释放的制剂。
本发明的主要技术方案为：将AXL/c-Met抑制剂与舒尼替尼同时对患者
进行给药。
在本发明的优选实施例，所述的AXL/c-Met抑制剂为口服制剂、针剂或
者缓释制剂等。
在本发明的优选实施例，以AXL/c-Met抑制剂与舒尼替尼作为活性成份
的药物的给药方式包括口服、静脉注射和局部给药等。
在本发明的优选实施例，AXL/c-Met抑制剂与舒尼替尼可以联合给药，
或分开给药。
有益效果
本发明有助于开发针对AXL/c-Met的抑制剂或药物，以用于肿瘤联合治
疗，特别是逆转耐药肾癌病人对舒尼替尼治疗的反应性，增加治愈率，具有
良好的转化医学前景。
附图说明
图1为舒尼替尼耐药细胞与亲本细胞中AXL、c-Met的蛋白表达水平；
图2为舒尼替尼耐药细胞7SuR(A)和ACSuR(B)在BMS777607作用下的药物浓
度-抑制率曲线；
图3为舒尼替尼耐药细胞在BMS777607、舒尼替尼及两者联合作用下的克隆形
成数目；
图4为舒尼替尼耐药细胞在BMS777607、舒尼替尼及两者联合作用下的体内生
长曲线；
图5为肾癌细胞在舒尼替尼联合BMS777607作用下的体内生长曲线；
图6为舒尼替尼耐药细胞在单独抑制AXL或c-MET及两者联合抑制下的克隆
形成数目。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于
此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。除非另外说明，
否则百分比和份数按重量计算。
舒尼替尼：购自辉瑞公司，规格为12.5mg/粒。
BMS777607：AXL/c-Met双重抑制剂，购自Selleck公司，货号S1561。
肾癌细胞系：786-O、ACHN购自中科院细胞所。
实验动物：正常健康裸鼠(6-8周龄)，雄性，购于第二军医大学实验动
物中心。
实施例1：肾癌舒尼替尼耐药细胞中RTK的表达情况
我们前期构建了舒尼替尼耐药的肾癌细胞株7SuR、ACSuR并保藏于中
国典型培养物保藏中心(CCTCCC2014217，CCTCCC2014238)，并已申请
了中国发明专利CN201510304372.8，发明名称为“肾癌舒尼替尼耐药细胞系
及其构建方法”。
为了研究舒尼替尼耐药的分子机制，我们利用westernblot检测了多个
RTK的表达情况，结果发现AXL、c-Met在耐药细胞移植瘤中表达明显高于
亲本细胞移植瘤(图1)，而其它RTK未见明显差异，提示AXL、c-Met可能
参与了肾癌细胞舒尼替尼耐药。
实施例2：AXL/c-Met抑制剂BMS777607对耐药细胞半数致死量的影响
将耐药细胞7SuR、ACSuR分别接种于96孔板，每孔5000个细胞，每种
细胞分DMSO+舒尼替尼组和BMS777607+舒尼替尼组，BMS777607终浓度
为1μM，舒尼替尼终浓度依次为0、1、2、5、10、20μM，每种药物浓度设3
个复孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h后弃培养基，每孔加100μLCCK8
工作液，在培养箱中孵育1小时后，放入酶标仪检测每孔450nm波长的OD
值，计算复孔平均值，以药物浓度为横坐标、某浓度组OD平均值与0μM浓
度组的OD平均值的比值为纵坐标，绘制药物浓度-抑制率曲线。
结果表明BMS777607组耐药细胞的半数致死量明显低于DMSO组(图2)，
说明AXL/c-Met抑制剂能恢复耐药细胞对舒尼替尼的敏感性。
实施例3：AXL/c-Met抑制剂BMS777607对耐药细胞克隆形成能力的影响
将耐药细胞7SuR、ACSuR消化、计数，分为DMSO组、BMS777607
组、舒尼替尼组、BMS777607+舒尼替尼组，BMS777607终浓度1μM，舒尼
替尼终浓度2μM。取5000个细胞分别加入四组500μL2×DMEM中，然后与
500μL0.8％低熔点琼脂糖混匀，接种至预铺的12孔板中，置于37℃、5％
CO2的细胞培养箱中培养。培养2-4周后，当琼脂中出现肉眼可见的克隆时，
终止培养，用适量中性红染色液染45分钟，弃去染色液后拍照、计数。
结果如图3所示，单独BMS777607或舒尼替尼处理均未抑制耐药细胞
的克隆形成能力，只有BMS777607联合舒尼替尼处理才能够抑制耐药细胞
的克隆形成能力，再次说明AXL/c-Met抑制剂能恢复耐药细胞对舒尼替尼的
敏感性。
实施例4：AXL/c-Met抑制剂BMS777607对耐药细胞体内生长的影响
将耐药细胞7SuR接种于裸鼠两侧肩胛部皮下，5×106/点，待裸鼠移植
瘤体积达200mm3时，将裸鼠随机分为DMSO组、BMS777607组、舒尼替尼
组、BMS777607+舒尼替尼组，每组4只，BMS777607每天灌胃10mg/kg，
舒尼替尼每天灌胃40mg/kg，持续4周。在指定的时间点用游标卡尺测量移
植瘤的长短径，计算肿瘤体积。
结果如图4所示，单独BMS777607或舒尼替尼处理均未抑制耐药细胞
体内生长，而BMS777607与舒尼替尼联合治疗抑制了耐药细胞的体内生长，
而且在联合治疗停止后4个月仍未见肿瘤进展，进一步在体内证明了
AXL/c-Met抑制剂能恢复耐药细胞对舒尼替尼的反应性，逆转耐药。
实施例5：AXL/c-Met抑制剂BMS777607对普通肾癌细胞体内生长的影响
将普通肾癌细胞系786-O接种于裸鼠两侧肩胛部皮下，5×106/点，待裸
鼠移植瘤体积达200mm3后，将裸鼠随机分为2组，每组4只，对照组每天
灌胃溶剂+40mg/kg舒尼替尼，实验组每天灌胃10mg/kgBMS777607+
40mg/kg舒尼替尼，持续12周。在指定时间点用游标卡尺测量移植瘤的长短
径，计算肿瘤体积。
结果如图5所示，单纯舒尼替尼治疗组在治疗7周后开始出现耐药，而
舒尼替尼联合BMS777607治疗组则能够持续抑制肾癌细胞的体内生长，治疗
期间未出现舒尼替尼耐药现象，提示AXL/c-Met抑制剂与舒尼替尼联用能防
止肾癌细胞对舒尼替尼产生耐药。
实施例6：单独抑制AXL或c-Met对耐药细胞克隆形成能力的影响
将耐药细胞7SuR-shGFP、7SuR-shAXL、7SuR-shc-MET、7SuR-shA+shM
消化、计数，取5000个细胞分别加入四组500μL含舒尼替尼的2×DMEM中
(终浓度2μM)，然后与500μL0.8％低熔点琼脂糖混匀，接种至预铺的12
孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。培养2-4周后，当琼脂中
出现肉眼可见的克隆时，终止培养，用适量中性红染色液染45分钟，弃去染
色液后拍照、计数。
结果如图6所示，舒尼替尼联合单独抑制AXL或c-MET均不能抑制耐
药细胞的克隆形成能力，而只有将AXL和c-MET都抑制才能恢复耐药细胞
对舒尼替尼的敏感性，实现对耐药细胞生长的抑制，提示AXL/c-Met双重抑
制才能恢复耐药细胞对舒尼替尼的反应性。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不
限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下
还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请
权利要求所限定的范围内。