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1、10申请公布号CN104220055A43申请公布日20141217CN104220055A21申请号201380017890022申请日20130325CNCMI386520071115CNCMI39142008020512162361520120330EPA61K31/19200601A23L1/00200601A61K8/00200601C12R1/00200601A61P17/00200601A61K8/368200601A61Q19/0220060171申请人雀巢产品技术援助有限公司地址瑞士沃韦72发明人FJ阿尔塞维拉B布尔其T布特勒S杜布克斯F法塔M吉塔尔PA盖N帕日SAD莱兹74。
2、专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人宋卫霞黄革生54发明名称4氧代2戊烯酸和皮肤色素沉着57摘要本发明概括而言涉及改善皮肤外观的领域。本发明的一个方面旨在提供用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域的包含4氧代2戊烯酸的组合物。本发明还涉及用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域的包含4氧代2戊烯酸的组合物的化妆美容应用。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014092986PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0562572013032587PCT国际申请的公布数据WO2013/144079EN2013100383生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说。
3、明书9页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图3页10申请公布号CN104220055ACN104220055A1/1页21包含4氧代2戊烯酸的组合物，其用于减少或预防由选自以下的病症导致的具有较深的色素沉着的皮肤区域斑驳病、白斑、与损伤或炎症有关的皮肤状况、艾迪生病、库欣病、黑棘皮病和甲状腺疾病。2依据权利要求1的用于所述应用的组合物，其中4氧代2戊烯酸可从短双歧杆菌BIDOBACTERIUMBREVECNCMI3865或短双歧杆菌ATCC15700获得。3依据前述权利要求中的一项的用于所述应用的组合物，其包含至少1MG/KG组合物、优选至少10。
4、MG/KG组合物、例如50MG至50G/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸。4依据前述权利要求中的一项的用于所述应用的组合物，其以相当于2G至20MG的4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG的4氧代2戊烯酸/KG体重、例如40G至1MG的4氧代2戊烯酸/KG体重的日剂量被施用。5依据前述权利要求中的一项的用于所述应用的组合物，其中所述组合物选自食品组合物、药物组合物、食品添加剂、功能性食品、饮料、宠物食品组合物、粉末、霜剂、洗剂或凝胶剂。6用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域的包含4氧代2戊烯酸的组合物的化妆美容应用。7依据权利要求6的应用，其用于皮肤美白。8依据权利要求6或7中任意一。
5、项的应用，其中具有较深的色素沉着的皮肤区域选自痣、胎记、黑斑病、雀斑、老年斑或其组合。9依据权利要求6至8中任意一项的应用，其中4氧代2戊烯酸从天然来源获得。10依据权利要求6至9中任意一项的应用，其中4氧代2戊烯酸可从短双歧杆菌CNCMI3865或短双歧杆菌ATCC15700获得。11依据权利要求6至10中任意一项的应用，其中组合物包含至少1MG/KG组合物、优选至少10MG/KG组合物、例如50MG至50G/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸。12依据权利要求6至11中任意一项的应用，其中所述组合物以相当于2G至20MG的4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG的4氧代2戊烯酸/KG体重、。
6、例如40G至1MG的4氧代2戊烯酸/KG体重的的日剂量被施用。13依据权利要求6至12中任意一项的应用，其中局部施用所述组合物。14依据权利要求6至12中任意一项的应用，其中口服施用所述组合物。15依据权利要求6至12中任意一项的应用，其中组合物选自食品组合物、食品添加剂、饮料、宠物食品组合物、化妆品组合物、粉末、霜剂、洗剂或凝胶剂。权利要求书CN104220055A1/9页34氧代2戊烯酸和皮肤色素沉着0001描述0002本发明概括而言涉及改善皮肤外观的领域。本发明的一个方面旨在提供用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域的包含4氧代2戊烯酸的组合物。本发明还涉及用于减少或预防具有较深的色。
7、素沉着的皮肤区域的包含4氧代2戊烯酸的组合物的化妆美容应用。0003皮肤是人身体最大的器官，是我们防御环境的首道防线，保护身体免于遭受致病的微生物并防止过度的水分损失。由于其组织结构和多样性的组成细胞，皮肤确保了广泛范围的生物学功能，包括伤口愈合、免疫应答、体温调节和维生素D生成。皮肤还通过生成黑色素皮肤中的棕色色素的黑素细胞涉及防晒。0004皮肤颜色主要由黑色素的量和类型决定。黑色素的量越少皮肤越白，量越多皮肤颜色越深。皮肤中的色素沉着过度由皮肤中黑色素的过度表达或积累而引起。因此，黑色素产生所涉及的途径，已经成为许多抑制剂的靶点，从而降低黑色素产生水平。在黑色素途径中所涉及的主要的酶之一是。
8、酪氨酸酶，其通过氧化从酪氨酸催化黑色素的生成。0005黑色素的合成是一个受激素控制的过程，包括由前体阿黑皮素原产生的促黑素细胞激素和促肾上腺皮质激素肽。通过UVB照射经酪氨酸酶的转录调节也可刺激该过程。0006当今许多社会非常期望改变皮肤中色素含量表达，来促进均匀的皮肤色调或较浅的皮肤色调的能力。共同关注的问题涉及具有与周围皮肤不匹配的色素沉着例如痣、胎记、雀斑、老年斑AGESPOTS或白斑VITILIGO的皮肤区域。其他的人希望减少由于暴露于阳光导致的皮肤颜色变深。为满足这些需求，已进行了许多尝试以开发减少或预防皮肤色素沉着的组合物，但到目前为止已开发的组合物往往功效低、具有不期望的副作用或。
9、具有这两者。已出版了已知引起色素减退皮肤颜色损失的不同活性剂的综述FSOLANO等,PIGMENTCELLRESEARCH,19,5505712006。0007已知当氢醌应用于皮肤时减少色素沉着已经超过50年。氢醌通过抑制酪氨酸酶的作用等抑制黑色素的生成。不幸的是，氢醌可能具有缺点，原因是其细胞毒性和副作用、诸如皮肤刺激。在许多国家氢醌被禁止用于一般化妆品用途。0008其它的旨在减少皮肤色素沉着的外用制剂包括了曲酸、抗坏血酸、过氧化氢、胶体硫COLLOIDALSULPHUR和莫诺苯宗。莫诺苯宗是氢醌的单苄基醚。然而，这些活性剂由于可能的稳定性和/或安全性问题是不合需要的。曲酸像氢醌一样是酪氨酸。
10、酶抑制剂，但也可能具有不期望的副作用、诸如变态反应和皮肤刺激，且在化妆品制剂中经常不稳定。抗坏血酸，有时用于预防或减少色素沉着，可容易地被氧化，且在具有高含水量的组合物、诸如化妆品中经常不稳定。抗坏血酸还可引起副作用，因为当存在微量金属离子时其可以诱导自由基的大量增加。过氧化氢溶液可具有保存稳定性和安全性的问题。胶体硫具有独特的气味，且可能难以用作皮肤美白剂的成分。莫诺苯宗可引起黑素细胞的破坏和永久的色素脱失。不推荐单苄基用于除白斑外的皮肤状况。0009有人提出使用局部类视色素和局部皮质类固醇作为色素减轻剂，还有人提出了激光疗法和化学去皮法CHEMICALPEELS，但这些方法常常达不到所需的。
11、响应。说明书CN104220055A2/9页4WO2010/066639中已描述了具有乙酰胆碱酯酶抑制剂的皮肤美白组合物。0010几个世纪以来在亚洲和欧洲天然物质已经被尝试用于使皮肤变白或用于增强白皙皮肤的外观。这些尝试包括柠檬、橙、黄瓜、银杏、角豆、玫瑰果ROSEFRUIT、老鹳草GERANIUMHERB、肉桂、甜马郁兰SWEETMARJORAM和迷迭香的使用。0011为了对抗与异常色素沉着有关的病症或者为了使皮肤色调变浅，已提出使用多种当局部涂抹在皮肤上时降低酪氨酸酶活性的化合物。不幸的是，所述目前可以采用的处置方法不能完全令人满意，特别是在副作用方面，诸如使用某些局部活性剂可能发生的皮肤。
12、刺激。0012因此，非常合乎需要的是可获得的减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域而没有一些现有技术的缺点的另外的组合物，以拓宽可获得的治疗选项并因此增加选择和适合个人需要。特别是，希望发现有效的组合物，其活性成分获自天然来源。0013本发明的目的是改善现有技术水平、特别是提供用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域、克服至少一些上文描述的缺点的组合物。0014本发明人惊讶地发现本发明的目的能够通过独立权利要求的主题实现。从属权利要求进一步发展了本发明的构思。0015本发明人令人惊讶地发现4氧代2戊烯酸有效地抑制黑色素的生成。本发明人还发现4氧代2戊烯酸减少酪氨酸酶牵涉于黑色素合成的第一个步。
13、骤的酶的产生。0016本发明人还惊讶地发现4氧代2戊烯酸可从一些菌株获得。例如，当在90加热6小时时，短双歧杆菌BIDOBACTERIUMBREVECNCMI3865和短双歧杆菌ATCC15700TM的细菌制剂均产生4氧代2戊烯酸。在将热处理的细菌制剂离心并过滤后在溶解的级分中发现了4氧代2戊烯酸。0017短双歧杆菌CNCMI3865在2007年11月15日保藏于国立微生物保藏中心，巴斯德研究所，25，ROUX博士路，F75724巴黎15区，法国COLLECTIONNATIONALEDECULTURESDEMICROORGANISMESCNCM,INSTITUTPASTEUR,25RUEDUD。
14、OCTEURROUX,F75724PARISCEDEX15,FRANCE。0018短双歧杆菌ATCC15700TM可以例如以商品名ATCC15700购自例如美国模式培养物保藏所，马纳萨斯，弗吉尼亚，美国AMERICANTYPECULTURECOLLECTIONATCC,MANASSAS,VIRGINIA,USA。0019因此，本发明的一部分涉及包含4氧代2戊烯酸的组合物，其用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域。0020本发明还涉及4氧代2戊烯酸在制备用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域的组合物中的应用。0021具有深色素沉着的皮肤区域可由与损伤或炎症有关的皮肤状况、切口、烧伤或痤疮。
15、突破ACNEBREAKOUTS引起，因此减少深的皮肤色素沉着可被认为是治疗措施的一个恢复步骤。0022皮肤的深色素沉着通常是局部区域黑色素的累积被称为色素沉着过度的状况的结果。色素沉着过度与多种疾病相关，包括艾迪生病、库欣病、黑棘皮病、甲状腺疾病和黑斑病。因此预防色素沉着过度是本发明的一种预防性应用。说明书CN104220055A3/9页50023因此，本发明的组合物可用于治疗性应用。包含4氧代2戊烯酸的组合物可用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域，其由选自以下的病症引起斑驳病、白斑、与损伤或炎症有关的皮肤状况、艾迪生病、库欣病、黑棘皮病和甲状腺疾病。白斑是引起皮肤区段色素脱失的病症。在。
16、白斑的情况中，根据本发明的具有较深的色素沉着的皮肤区域可以是未受影响的区域。00244氧代2戊烯酸具有CAS编号4743822和以下结构式00250026应理解“减少具有较深的色素沉着的皮肤区域”意指具有较深的色素沉着的皮肤区域的总面积的减少和/或具有较深的色素沉着的皮肤区域的数量的减少和/或这些皮肤区域的色素沉着的暗度的减少。应理解“预防具有较深的色素沉着的皮肤区域”包括完全或部分预防具有较深的色素沉着的皮肤区域的形成。所述皮肤区域大小不受限制，可遍布整个体表。0027本发明还提供了包含4氧代2戊烯酸的组合物的非治疗性应用。本发明的一个实施方案可以是用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域。
17、的包含4氧代2戊烯酸的组合物的化妆美容应用。0028本发明可提供4氧代2戊烯酸在皮肤美白中的化妆美容应用。皮肤美白是减少皮肤区域中皮肤色素沉着的总体程度的行为。一些人可能认为皮肤美白是需要的，从而逆转日光照射的影响或追随某些文化中存在的较浅皮肤的潮流。0029本发明还可提供4氧代2戊烯酸在减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域中的化妆美容应用，其中所述具有较深的色素沉着的皮肤区域选自痣、胎记、黑斑病、雀斑、老年斑或其组合。这是有利的，因为许多人认为没有皮肤色素缺点的均匀的肤色是在审美上期望的。0030在本发明中4氧代2戊烯酸可以是可获得的、例如从天然来源获得。许多人关心从化学原料工业合成的物质。
18、的安全性、尤其是当这些物质要被摄入时，而偏爱从天然来源获得的物质。0031本发明人令人惊讶地发现一些细菌菌株提供了4氧代2戊烯酸的天然来源。特别是，本发明人发现4氧代2戊烯酸可以从短双歧杆菌CNCMI3865或短双歧杆菌ATCC15700TM短双歧杆菌的模式株获得。使用细菌作为4氧代2戊烯酸来源特别有利，因为进行4氧代2戊烯酸的大量生产是可行的，例如使用生物反应器。因此，在本发明中，4氧代2戊烯酸是可获得的，例如从短双歧杆菌CNCMI3865或短双歧杆菌ATCC15700TM获得。0032在工业生产过程中可在约60180、优选在约80160、例如在约110150对细菌热处理。本发明人发现在这些。
19、温度的热处理在可接受的时间内提供了4氧代2戊烯酸的良好的收率。不希望受理论所束缚应理解提高热处理温度增加4氧代2戊烯酸形成的速度，但还增加其分解的速度。因此这些温度提供了4氧代2戊烯酸的形成速度与其分解之间的良好的平衡。0033典型的包含4氧代2戊烯酸的组合物可以包含至少1MG/KG组合物的量的4氧说明书CN104220055A4/9页6代2戊烯酸。通常，如果组合物包含至少10MG/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸是优选的，例如50MG至50G/KG组合物。0034技术人员可以容易地确定待施用的4氧代2戊烯酸的最佳量。0035在治疗性应用中，组合物以足以至少部分地治愈或阻止障碍的症状及其并发症的。
20、剂量施用。足以实现这一目标的量被定义为“治疗有效剂量”。用于此目标的有效量取决于本领域技术人员已知的多种因素，诸如障碍的严重性和患者的体重和总体状态。0036在预防性应用中，根据本发明的组合物以足以至少部分地减少发展成障碍的风险的量施用给对特定障碍易感或除此之外有患特定障碍的风险的患者。这样的量被定义为“预防有效剂量”。而且，精确的量也取决于许多患者的具体因素，诸如患者的健康状态和体重。0037用于化妆美容应用时，将本发明的组合物以足以至少部分减少人的外表的可见的或有形的缺陷/缺点的量施用于人。该量被定义为“化妆美容有效剂量“。而且，精确量也取决于人的多个特定因素、诸如人的性别、种族、肤色、年。
21、龄或健康状况。0038通常，本发明的组合物可以以治疗有效剂量、预防有效剂量或化妆美容有效剂量施用。0039本发明的组合物可以以相当于2G至20MG的4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG的4氧代2戊烯酸/KG体重、例如40G至1MG的4氧代2戊烯酸/KG体重的日剂量被施用。0040靶向特定的皮肤区域以减少色素沉着、例如雀斑或老年斑是有利的，在所述区域的目标是匹配周围皮肤区域的颜色。组合物的局部应用能实现该靶向递送。因此，在本发明中，可局部施用所述组合物。0041本发明的组合物还可经口施用。这样的优点是组合物通过快速和相对非限制性的施用模式对全部的皮肤起全局作用。0042具有较深的色素沉着。
22、的皮肤区域可以影响动物以及人。因此有利的是提供施用于人、宠物或家畜的组合物。其可以改善主人对其宠物的满意度，原因是宠物在审美上令人喜爱，而且，皮肤色素沉着方面的缺点会限制动物在比赛性的展览中获胜以及降低它们的感官价值。本发明提供了可施用于人、宠物或家畜的组合物。0043本发明中描述的4氧代2戊烯酸和组合物可施用于成年个体和/或老年个体。0044如果个体属于相对成熟的年龄则认为他们是成年个体。通常当个体性成熟且能繁衍时，则认为他们是成年个体。0045如果个体已经超过他们出生国的平均预期寿命的三分之二、优选他们已经超过他们出生国的平均预期寿命的四分之三、更优选如果他们已经超过他们出生国的平均预期寿。
23、命的五分之四，则认为所述个体是“老年个体“。例如，根据英国国家统计司在2010年出生在UK的男性具有78岁的预期寿命，因此在超过52岁的年龄、优选超过58岁零6个月且更优选超过62岁零6个月的年龄时，他们会被认为是老年个体。对于宠物和家畜应当考虑物种和品种。例如YORKSHIRETERRIERDOG具有约12年的预期寿命EJTAYLOR等,PROCEEDINGSOFTHENUTRITIONSOCIETY,54,6456561995，所以在超过8岁的年龄、优选超过9岁、更优选超过9岁7个月的年龄会被认为是老年个体。0046具有较深的色素沉着的皮肤区域、诸如老年斑日光斑SOLARLENTIGINE。
24、S、日说明书CN104220055A5/9页7晒斑SUNSPOTS、肝斑LIVERSPOTS和黑斑病也称为黄褐斑的发生经常是由于长期曝露于日光或日光浴床SUNBEDS的紫外辐射下。活得越久的人更可能在紫外光下曝露得更久。本发明的组合物可施用于成年个体和/或老年个体。0047组合物的性质无特别限制。用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤区域的组合物可选自食品组合物、药物组合物、食品添加剂、功能性食品、饮料、宠物食品组合物、粉末、霜剂、洗剂或凝胶剂。功能性食品是提供健康益处的食物作为强化食品、口服补充剂或膳食补充剂。本发明的组合物可以是任何通常可用于所选择的施用方法的盖仑制剂形式。根据所考虑的组合。
25、物类型，载体可以具有不同的性质。0048用于化妆美容应用的组合物可选自食品组合物、食品添加剂、饮料、宠物食品组合物、化妆品组合物、粉末、霜剂、洗剂或凝胶剂。0049本发明的各食品组合物性质各异，例如乳、酸乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、谷物制品CEREALBASEDPRODUCTS或发酵的谷物制品、乳基粉末、冷冻或耐贮存的SHELFSTABLE饮料、糖果/糕饼、动物饲料、特别是用于家畜的饲料。0050食品组合物还可以进一步包含蛋白质源、碳水化合物源、脂质源、矿物质源和/或维生素源。蛋白质、碳水化合物、脂质、矿物质和/或维生素的存在可能有多个优点。这些化合物通常有助于最终产品的味道和。
26、口感，并为身体提供了有益的营养物质。它们还使本发明的组合物能够被配制成全营养配方产品，从而不再需要额外的营养物。0051可溶于水中的化合物具有可以以多种方式方便施用的优点，包括作为溶液剂用于口服，在胶囊或片剂中施用，通过吸入施用，以含水凝胶或霜剂用于局部应用，在沐浴浸泡品BATHSOAKS、沐浴凝胶或香波中施用，或作为滴眼剂、滴鼻剂或滴耳剂。包含4氧代2戊烯酸的组合物可以是基于水的、例如所述组合物可包含溶于水中的4氧代2戊烯酸。0052本领域的技术人员将理解他们能够自由组合本文公开的本发明的所有特征。特别是，为本发明不同实施方案所描述的特征可以进行组合。例如，为用于治疗性应用的组合物所描述的特。
27、征可以与为本发明的化妆美容应用所描述的特征组合，反之亦然。本发明的另外的优势和特征根据以下附图和非限制性性实施例是显而易见的。0053图1显示用4氧代2戊烯酸或曲酸预处理的B16鼠黑素细胞的黑色素生成，将其表示为相比于对照组未添加其他化合物的B16鼠黑素细胞培养物的生成的黑色素的百分比。0054图2显示用4氧代2戊烯酸或曲酸预处理的B16鼠黑素细胞的酪氨酸酶生成，将其表示为相比于对照组未添加其他化合物的B16鼠黑素细胞培养物的生成的酪氨酸酶的百分比。0055图3显示溶于水中的4氧代2戊烯酸标准品的典型的色谱图。较高的SRM与M/Z11369的转变反应相关，而较低的SRM对应于M/Z11341的。
28、转变反应。保留时间以分钟表示X轴。信号强度Y轴以每秒计数CPS表示。0056图4显示对在90通过圆圈表示、120通过三角形表示和140通过正方形表示加热2、15、30和60分钟的短双歧杆菌CNCMI3865的粗制备物OD40进行HPLCESIMS/MS而实现的4氧代2戊烯酸定量。0057实施例14氧代2戊烯酸对皮肤色素沉着的作用说明书CN104220055A6/9页80058为评价4氧代2戊烯酸对皮肤色素沉着的作用，本发明人使用鼠黑素细胞B16的培养物，并进行2项测试黑色素生成的评价和酪氨酸酶生成的评价。0059细胞培养条件0060在37和含5CO2的增湿室中将B16细胞在没有酚红的DMEM1。
29、G/L葡萄糖补充有10胎牛血清中培养。DMEM是达尔伯克改良伊格尔培养基。0061通过B16鼠黑素细胞系生成黑色素。0062将细胞与7M浓度的4氧代2戊烯酸或400G/ML曲酸测试参比已知的黑色素生成抑制剂一起孵育72小时。所述孵育在MSH的类似物NDPMSH黑素细胞刺激激素存在或不存在下进行。通过在NDPMSH存在或不存在下，相对于黑色素标准品，测量各样品在405NM的光密度来评价黑色素的总量细胞外和细胞内。对照条件对应于只用不添加其他化合物的培养基处理的B16鼠黑素细胞培养物。0063通过B16鼠黑素细胞系生成酪氨酸酶。0064将细胞与7M浓度的4氧代2戊烯酸或400G/ML曲酸测试参比一。
30、起孵育48小时。通过免疫标记评价酪氨酸酶的生成。对照条件对应于只用不添加其他化合物的培养基处理的B16鼠黑素细胞培养物。0065结果表示为相对于对照的百分比。曲酸如预期一样诱导黑色素生成减少至对照组产生量的48，而4氧代2戊烯酸将黑色素生成降低至0，参见图1。0066曲酸和4氧代2戊烯酸还均减少了酪氨酸酶的生成图2，表明黑色素的减少至少部分上是由于酪氨酸酶的抑制。尽管在抑制黑色素生成上4氧代2戊烯酸比曲酸更有效，但其在抑制酪氨酸酶生成上比曲酸功效小，这可能表明4氧代2戊烯酸还影响作用于该酶上游或下游的机制。0067呈现的数据使我们得出结论4氧代2戊烯酸可以用于减少或预防具有较深的色素沉着的皮肤。
31、区域。0068实施例2作为4氧代2戊烯酸来源的菌株0069使用三个菌株研究4氧代2戊烯酸是否可以从微生物获得短双歧杆菌CNCMI3865NCC2950,短双歧杆菌CNCMI3914NCC466和短双歧杆菌ATCC15700TMNCC2791。短双歧杆菌CNCMI3914在2008年2月5日保藏于国立微生物保藏中心，巴斯德研究所，25，ROUX博士路，F75724巴黎15区，法国COLLECTIONNATIONALEDECULTURESDEMICROORGANISMESCNCM,INSTITUTPASTEUR,25RUEDUDOCTEURROUX,F75724PARISCEDEX15,FRANC。
32、E。0070对于每个菌株，将10ML带有005半胱氨酸的MRS琼脂用20L甘油储备液GLYCEROLSTOCK接种，并在37在缺氧情况下孵育过夜，形成预培养物。然后通过用预培养物接种10ML带有005半胱氨酸的MRS制备进一步的培养物最终OD600调节在01。将培养物在37在缺氧情况下孵育16小时，形成P2培养物。将200ML带有005半胱氨酸的MRS用P2培养物接种最终OD600调节在01，并将瓶在37在缺氧情况下孵育16小时。0071测量OD600，将培养物以3300G离心10MIN，并将细菌小球用冷的1XPBS磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并用1XPBS标准化至OD50。0072以两种方式获得。
33、每个菌株的细菌级分；“粗制备物”和“纯制备物”。说明书CN104220055A7/9页90073细菌的“粗制备物“如下获得。将5ML所述OD50细菌制备物在加热块DRIBLOCKDB3加热块，来自TECHNE,STAFFORDSHIRE，联合王国中在90加热6小时。将加热的细菌制剂在4以3300G离心10MIN，使用022M针筒式过滤器将上清液过滤，并在4储存直至进一步分析。0074细菌的“纯制备物“如下获得。将5ML所述OD50细菌制备物在4以3300G离心10MIN，并将细菌小球再混悬于5ML水中。在冷室中将细菌细胞使用迷你组织珠磨器MBB装置破碎以最大速度进行6个90秒的周期，每个周期之。
34、间停止10分钟。将破碎的细胞在4以3300G离心1H，将小球再混悬于5ML1XPBS中，并在90在加热块中加热6小时。将加热的制备物在4以3300G离心10MIN。使用022M针筒式过滤器将上清液过滤，并在4储存直至进一步分析。0075实施例3通过HPLCMS/MS对4氧代2戊烯酸进行定量。0076为定量4氧代2戊烯酸，开发了高通量分析法，其涉及将高效液相色谱法与电喷雾串联质谱联用HPLCESIMS/MS。00774氧代2戊烯酸标准品购自ALFAAESARWARDHILL，美国。HPLC级水、甲醇和乙酸购自LICHROSOLVMERCK,DARMSTADT,德国。HPLC小瓶和2MM插件INS。
35、ERT购自AGILENTSANTACLARA,CA。发现4氧代2戊烯酸可溶于水中至至少20MG/ML。将4氧代2戊烯酸标准品化合物溶解于水中，最终储备溶液为10MG/ML，并进一步在水稀释以建立标定曲线。0078在与3200QTRAP质谱仪APPLIEDBIOSYSTEMS联用的涡流色谱TFC系统THERMOFISHER,WALTHAM,MA上进行HPLCESIMS/MS分析。使用的分析柱为HYPERSILGOLDAQ3X50MM,5M，购自THERMOFISHERWALTHAM,MA，在室温运行，流速恒定为600L/MIN。流动相由以下溶剂构成溶剂A含005乙酸的水和B含005乙酸的甲醇。梯。
36、度程序为0MIN0B，在0B保持40秒0067MIN，上升至50B，180秒067367MIN，从50升至90B，10秒367383MIN，在90B保持120秒583MIN，然后返回至0B，并再保持300秒5831083MIN。进样体积为5L。0079在电雾化电离模式进行MS数据采集。进行MS调谐通过以10L/MIN的流速注入4氧代2戊烯酸标准品的溶液在水中，5G/ML，其使用T连接器与溶剂A和B80/20，VV；06ML/MIN的HPLC流混合。氮气用于喷雾器和气帘气。激活界面加热器INTERFACEHEATER，并将源加热块温度保持在700，毛细管电压设置在45KV。氮气还用作中压选择的碰。
37、撞气。使用选择反应监测SRM采集模式实现MS/MS检测。通过扫描M/Z11369碰撞能量11EV和M/Z11341碰撞能量26EV选择了两个最强的碎片离子，使用恒定的50MS的采样时间总扫描时间110MS。将去簇电压设置在29V。使用最强SRM信号进行定量分析，而第二个转变用于分析物确认基于从标准品溶液计算的适合的面积比。使用ANALYST151软件APPLIEDBIOSYSTEMS进行数据处理。0080通过HPLCMS/MS检测PBS和水中的4氧代2戊烯酸0081将4氧代2戊烯酸溶解于1XPBS或水中，并如之前部分描述进行HPLCMS/MS检测。在125MIN的保留时间，与M/Z11369的。
38、转变反应有关的SRM比与M/Z11341的有关相关的SRM显示更强的信号。对两次转变观测到了相似的保留时间，确定了分析的有效性图3。在1XPBS数据未显示和水图3中均成功的检测到分子4氧代2戊说明书CN104220055A8/9页10烯酸。00824氧代2戊烯酸标准曲线的建立0083为精确定量化细菌级分中4氧代2戊烯酸的量，为在单一的基质如1XPBS或HPLC级水中的4氧代2戊烯酸建立标准曲线。以不同的剂量将商购的4氧代2戊烯酸混悬于1XPBS和水中。然后使用HPLCESIMS/MS方法定量4氧代2戊烯酸的估计剂量。1XPBS和HPLC级水中的4氧代2戊烯酸的量从01至25G/ML与作为结果的。
39、强度以每秒计数CPS表示之间均有良好的线性。0084细菌级分中4氧代2戊烯酸的定量0085对在上文描述的热处理的细菌制备物中的4氧代2戊烯酸定量。将所有的样品稀释于HPLC级水中3个稀释品/样品，随后进行HPLCESIMS/MS分析。结果在表A中总结。0086表A在90加热6小时的粗制的和纯的细菌的加热制备物OD50中的4氧代2戊烯酸G/ML的浓度。ND表示“不可检测“，低于方法的检出限。00870088实施例4加热温度和时间对由短双歧杆菌CNCMI3865生成4氧代2戊烯酸的影响0089为表征经热处理后从短双歧杆菌CNCMI3865产生4氧代2戊烯酸的，使用多个温度进行动力学试验。在生物反应。
40、器中、在37用MRS培养基在缺氧情况和PH控制条件下制备用于该实验的生物质BIOMASS的“主储备物MASTERSTOCK”。在生长培养16H后，将培养基除去，并用1XPBS将细胞洗涤两次，在带有10甘油的1XPBS中浓缩至OD13415E10CFU/ML，然后在80以50ML等分试样储存。0090然后如下从生物质主储备物制备短双歧杆菌CNCMI3865的“工作生物质WORKINGBIOMASS”将生物质用1XPBS洗涤两次，并在1XPBS中调节至OD40，其分别对应于1和05E10CFU/ML。0091使用加温装置THA研究不同的时间和温度的作用。该系统为生产环境中存在的典型装置的小规模版本。蒸气用于加热保温管，其中含有生物质的筒。应用90、120和140的样品温度达至多60分钟的时间。然后将5ML的每种热处理的生物质以5000G离心说明书CN104220055A109/9页1110MIN，过滤上清液02M，通过HPLCESIMS/MS定量4氧代2戊烯酸含量。产生的4氧代2戊烯酸的量在图4中显示。说明书CN104220055A111/3页12图1图2说明书附图CN104220055A122/3页13图3说明书附图CN104220055A133/3页14图4说明书附图CN104220055A14。