液体硫属化物的组合物及其制备和使用方法.pdf

本发明提供新的稳定的液体组合物，包含硫属化物或其盐。这些组合物可以用于各种目的，包括治疗和预防缺血性或低氧性损伤，以及用于生物体的保存。

1.  一种组合物，包含在药学可接受的载体中的稳定的液体药物硫属化物或硫属化合物或其盐或前体，其中在储藏所述液体药物组合物后，所述硫属化物或硫属化合物或盐的浓度、pH和氧化产物保持在可接受标准的范围内。

2.  权利要求1的组合物，其中所述硫属化合物或硫属化物盐选自：H₂S，Na₂S，NaHS，K₂S，KHS，Rb₂S，CS₂S，(NH₄)₂S，(NH₄)HS，BeS，MgS，CaS，SrS和BaS。

3.  权利要求1的组合物，其中所述硫属化合物或硫属化物盐选自：H₂Se，Na₂Se，NaHSe，K₂Se，KHSe，Rb₂Se，CS₂Se，(NH₄)₂Se，(NH₄)HSe，BeSe，MgSe，CaSe，SrSe，PoSe和BaSe。

4.  权利要求2的组合物，其中所述硫属化合物或硫属化物盐是硫化物并且浓度范围是95mM至150mM。

5.  权利要求2的组合物，其中所述硫属化合物或硫属化物盐是硫化物，所述硫化物的量的范围是约80％至约100％w/v。

6.  权利要求2的组合物，其中所述硫属化合物或硫属化物盐是硫化物，所述硫化物的量的范围是约90％至约100％w/v。

7.  权利要求2的组合物，其中所述硫属化合物或硫属化物盐是硫化物，所述硫化物的量的范围是约95％至约100％w/v。

8.  权利要求2的组合物，其中所述液体是氢氧化钠。

9.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物的pH范围是6.5至8.5。

10.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物的氧含量小于或等于5μM。

11.  权利要求1的组合物，还包含一种或多种选自多硫化物，亚硫酸盐，硫酸盐和硫代硫酸盐的氧化产物。

12.  权利要求11的组合物，其中所述氧化产物是范围为0％-1.0％的硫酸盐，范围为0％-1.0％的亚硫酸盐，范围为0％-1％的多硫化物或范围为0％-1.0％的硫代硫酸盐。

13.  权利要求1的组合物，其中所述储藏期是在23□-27□的范围内约3个月。

14.  权利要求1的组合物，其中所述储藏期是在23□-27□的范围内约6个月。

15.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物的同渗浓度的范围是250-330mOsmol/L。

16.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物是近似等渗的。

17.  权利要求1的组合物，其中所述组合物储藏在不渗透的容器中。

18.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物还包含螯合剂。

19.  权利要求18的组合物，其中所述螯合剂选自：二乙三胺五乙酸(DTPA)或去铁胺.

20.  权利要求19的组合物，其中DTPA的量的范围是0.1mM至1.0mM。

21.  权利要求19的组合物，其中去铁胺的量的范围是0.1mM至1mM。

22.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物还包含pH调节剂。

23.  权利要求22的组合物，其中所述pH调节剂选自：二氧化碳，氢氧化钠，盐酸或硫化氢.

24.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物还包含还原剂。

25.  权利要求24的组合物，其中所述还原剂选自：二硫苏糖醇(DTT)或谷胱甘肽。

26.  权利要求25的还原剂，其中二硫苏糖醇(DTT)的量的范围是0.1mM至1M。

27.  权利要求25的还原剂，其中谷胱甘肽的量的范围是0.1mM至1M。

28.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物还包含自由基清除剂。

29.  权利要求28的组合物，其中所述自由基清除剂选自(6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸)(Trolox)或盐酸三(2-羧乙基)膦(TCEP)。

30.  权利要求4或5的组合物，其中所述自由基清除剂是自旋捕获剂。

31.  权利要求30的组合物，其中所述自由基清除剂选自：N-叔丁基-苯基硝酮(PBN)，2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧基(TEMPO)，4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPOL)。

32.  权利要求的31组合物，其中所述自旋捕获剂的范围是0mg/kg至100mg/kg。

33.  权利要求4或5的组合物，其中所述组合物还包含防腐剂。

34.  权利要求33的组合物，其中所述防腐剂选自苯甲醇，苯酚，尼泊金甲酯，尼泊金乙酯，尼泊金丙酯，尼泊金丁酯或苯扎氯铵。

35.  权利要求34的组合物，其中所述防腐剂的范围是苯甲醇0％-2.0％)(w/v，苯酚0％-0.5％w/v，尼泊金甲酯0％-0.25％w/v，尼泊金乙酯0％～0.25％w/v，尼泊金丙酯0％～0.25％w/v，尼泊金丁酯0％-0.4％w/v，苯扎氯铵0％-0.02％w/v。

36.  权利要求21的组合物，其中1当量的硫化氢气体溶入1当量的氢氧化钠溶液中，并且其中所述组合物的pH范围是6.5至8.5，并且其中所述组合物的同渗浓度的范围是250-330mOsmol/L并且其中所述组合物的氧含量小于或等于5μM，并且在储藏3个月后，其中所述组合物所包含的氧化产物的范围是0％-3.0％w/v。

37.  权利要求2的组合物，其中1当量的硫化氢气体溶入1当量的氢氧化钠溶液中，并且其中所述组合物的pH范围是6.5至8.5，并且其中所述组合物的同渗浓度的范围是250-330mOsmol/L并且其中所述组合物的氧含量小于或等于5μM，并且在储藏5个月后，其中所述组合物所包含的氧化产物的范围是0％-2.0％w/v。

38.  权利要求2的组合物，其中1当量的硫化氢气体溶入1当量的氢氧化钠溶液并且其中所述组合物的pH范围是7.5至8.5，并且其中所述组合物的同渗浓度的范围是250-330mOsmol/L，并且其中所述组合物的氧含量小于或等于5μM，并且在储藏5个月后，其中所述组合物所包含的氧化产物的范围是1％-2.0％(w/v)。

39.  一种制备适合施用于动物的硫化物的组合物的方法，包括：
a.将1当量的硫化氢气体溶入1当量的液体中，由此产生了硫化物的组合物；和
b.将由步骤(a)得到的组合物的pH调节至pH范围为6.5至8.5，其中所述组合物由此产生了适合施用于动物的硫化物的液体组合物。

40.  权利要求39的方法，其中所述液体是氢氧化钠。

41.  权利要求39的方法，其中pH是通过加入氯化氢，二氧化碳，氢氧化钠和硫化氢中的一种或多种来调节的。

42.  权利要求39的方法，其中pH是通过将氮，二氧化碳和/或硫化氢溶入由步骤(a)得到的组合物中来调节的。

43.  权利要求39的方法，其中pH是通过将氮气和二氧化碳的组合或氮气和硫化氢的组合溶入由步骤(a)得到的组合物中来调节的。

44.  权利要求39的方法，其中pH是通过将硫化氢溶入由步骤(a)得到的组合物中来调节的。

45.  权利要求39的方法，还包括将由步骤(b)得到的组合物的同渗浓度调节至同渗浓度的范围是250-350mOsmol/L。

46.  权利要求39的方法，还包括：在惰性大气或稀有气体下将步骤(b)得到的组合物装入避光的小瓶中。

47.  权利要求39的方法，还包括将赋形剂加入到步骤(b)得到的组合物中。

48.  权利要求47的方法，其中所述赋形剂选自：螯合剂，pH调节剂，还原剂，自由基清除剂和防腐剂。

49.  权利要求46的方法，其中在约6个月里氧含量小于或等于5μM。

50.  一种试剂盒，包含一个或多个包含硫属化物或硫属化物盐的组合物的容器，其中所述组合物的pH范围是6.5至8.5.。

51.  权利要求50的试剂盒，其中所述硫属化物或硫属化物盐选自：H₂S，Na₂S，NaHS，K₂S，KHS，Rb₂S，CS₂S，(NH₄)₂S，(NH₄)HS，BeS，MgS，CaS，SrS和BaS。

52.  权利要求50的试剂盒，其中所述硫属化物或硫属化物盐选自：H₂Se，Na₂Se，NaHSe，K₂Se，KHSe，Rb₂Se，CS₂Se，(NH₄)₂Se，(NH₄)HSe，BeSe，MgSe，CaSe，SrSe，PoSe和BaSe。

53.  权利要求50的试剂盒，其中所述组合物是等渗的。

54.  权利要求50的试剂盒，其中所述容器是避光的。

55.  权利要求50的试剂盒，其中所述容器是琥珀色小瓶。

56.  权利要求50的试剂盒，其中所述容器是气体不可渗透的。

57.  权利要求50的试剂盒，其中在惰性大气或稀有气体下所述组合物储藏于所述容器中。

58.  权利要求50的试剂盒，其中所述惰性或稀有气体选自氦(He)，氖(Ne)，氩(Ar)，氪(Kr)，氙(Xe)和氡(Rn)。

59.  一种治疗暴露于缺血性或低氧性情况的人疾病或生物体的损伤的方法，包括将该生物体与有效量的硫属化物或硫属化物盐的组合物接触。

60.  权利要求59的方法，其中所述接触包括静脉内，真皮内，动脉内，腹膜内，体内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，瘤内，肌内，腹膜内，眼内，皮下，结膜下，intravesicularlly，粘膜，心包内，脐带内，眼内，口服，局部，通过注射，通过输注，通过连续输注，通过吸收，通过吸附，通过浸入，通过局部灌注，经导管或经灌洗。

61.  权利要求59的方法，其中所述硫属化物或硫属化物盐选自：H₂S，Na₂S，NaHS，K₂S，KHS，Rb₂S，CS₂S，(NH₄)₂S，(NH₄)HS，BeS，MgS，CaS，SrS和BaS。

62.  权利要求59的方法，其中所述硫属化物或硫属化物盐选自：H₂Se，Na₂Se，NaHSe，K₂Se，KHSe，Rb₂Se，CS₂Se，(NH₄)₂Se，(NH₄)HSe，BeSe，MgSe，CaSe，SrSe和BaSe。

63.  权利要求59的方法，其中缺血性或低氧性情况是由于对该物体的损伤，不利地影响该物体的疾病的发生或发展或者该物体的出血导致的。

64.  权利要求59的方法，其中损伤，疾病发生或发展前或者该物体出血前，该物体与该组合物接触。

65.  权利要求59的方法，其中损伤，疾病发生或发展或者该物体出血后，该物体与该组合物接触。

66.  权利要求59的方法，其中损伤是外部物理来源的。

67.  权利要求59的方法，其中损伤是手术。

68.  权利要求59的方法，其中该物体与一定量的该组合物接触一段时间，保护该物体免于由损伤，疾病发生或发展或者该物体出血而导致的损害或死亡。

69.  权利要求59的方法，其中该物体选自：细胞，组织，器官，有机体和动物。

70.  权利要求69的方法，其中该物体是动物。

71.  权利要求70的方法，其中动物是哺乳动物。

72.  权利要求71的方法，其中哺乳动物是人。

73.  权利要求59的方法，其中该生物体包含血小板。

74.  权利要求59的方法，其中该生物体是要植入的。

75.  权利要求59的方法，其中该生物体具有再灌注损伤的危险。

76.  权利要求59的方法，其中该生物体具有出血性休克的危险。

液体硫属化物的组合物及其制备和使用方法
与相关申请的交叉参考
本申请要求2007年3月23日提交的美国临时申请60/896,727和2006年10月5日提交的美国临时申请60/849,900的提交日的权利，将其整体内容通过参考引入本文。
背景技术
技术领域
本发明一般涉及液体硫属化物的组合物，更具体地是包含硫属化物的稳定的液体药物组合物。本发明还涉及这些组合物在保护细胞和动物免于损伤，疾病和早产儿死亡中的应用。
相关技术的描述
包含硫属元素，即在周期表的第6组中的那些元素，但是氧除外的化合物一般称作“硫属化物”或“硫属化合物”。这些元素是硫(S)，硒(Se)，碲(Te)和钋(Po)。常见的硫属化物，除了其他元素外，包含一个或多个S，Se和Te。
近来显示，用硫属化物治疗会诱导生物体停滞并保护生物体免于低氧性和缺血性损伤。在这些研究中，证明了硫化氢(H₂S)气体作为氧消耗的潜在抑制剂可以减少代谢并保护小鼠和大鼠免于低氧性损伤(PCT公开号WO2005/041655)。
尽管一般不认为硫化氢气体是一种医疗气体，但是这种出人意料的结果表明存在令人兴奋的可能性：其可以用于治疗或预防很多的动物和人的疾病，特别是与低氧和缺血有关的疾病和损伤。
某些硫属化合物(例如，硫化氢和硒化氢)在氧气存在下是不稳定的，因为它们能与氧发生化学反应，导致它们发生氧化并化学变化。例如，硫化物的化学变化限制了它作为药物的用途，这是因为它稳定性有限，储藏期有限以及在制造，储藏或使用期间有产生氧化产物的可能性。硫化物可能的氧化剂包括氧，二氧化碳和固有的金属杂质，它们可以产生氧化产物(例如亚硫酸盐，硫酸盐，硫代硫酸盐，多硫化物，连二硫酸盐，连多硫酸盐和硫元素)的混合物。因此，在储藏期间硫化物的快速氧化限制了其作为药剂的用途。
为了给需要用硫属化物治疗的细胞或患者带来药学方面的益处，需要所得到的剂型是稳定的，易于制造和重复生产，并设计用于标准的给药途径。很明显，本领域需要稳定的硫属化物的液体药物组合物，包括包含硫化物的那些药物组合物。硫化物定义为硫处于-2价状态，是例如H₂S或其盐(例如，NaHS，Na₂S等等)，其可以在可控的医疗环境下方便地施用于患者，例如用于治疗疾病，在急救期间在该领域作为治疗剂，或在对灾难性损伤或危及生命的医疗事件中使用。本发明通过提供硫属化物的新的稳定的液体药物组合物而满足了这种需要，本文证明了其可以保护动物免于由低氧性和/或缺血性病症以及其他损伤和疾病情况导致的损伤或死亡。
发明简述
本发明提供硫属化物的液体组合物，及其制备和使用方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，包含在药学可接受的载体中的稳定的液体药物硫属化物或硫属化合物或其盐或前体，其中在储藏所述液体药物组合物后，所述硫属化物或硫属化合物或盐的浓度，pH和氧化产物保持在可接受标准的范围内。
在各个实施方案中，硫属化合物或硫属化物盐选自：H₂S，Na₂S，NaHS，K₂S，KHS，Rb₂S，CS₂S，(NH₄)₂S，(NH₄)HS，BeS，MgS，CaS，SrS和BaS。
在其他实施方案中，硫属化合物或硫属化物盐选自：H₂Se，Na₂Se，NaHSe，K₂Se，KHSe，Rb₂Se，CS₂Se，(NH₄)₂Se，(NH₄)HSe，BeSe，MgSe，CaSe，SrSe，PoSe和BaSe。
在具体的实施方案中，硫属化合物或硫属化物盐是硫化物并且浓度范围是95mM至150mM。
在具体的实施方案中，其中所述硫属化合物或硫属化物盐是硫化物，所述硫化物的量的范围是约80％至约100％，约90％至100％，或约95％至100％w/v。
在具体的实施方案中，液体是氢氧化钠。
在某些实施方案中，该组合物的pH范围是6.5至8.5。
在一个实施方案中，该组合物的氧含量小于或等于5μM。
在一个实施方案中，该组合物还包含一种或多种选自多硫化物，亚硫酸盐，硫酸盐和硫代硫酸盐的氧化产物。所述氧化产物可以是范围为(0％-1.0％)的硫酸盐，范围为(0％-1.0％)的亚硫酸盐，范围为(0％-1％)的多硫化物或范围为(0％-1.0％)的硫代硫酸盐。
储藏期可以是在(23□-27□)的范围内约3个月或在(23□-27□)的范围内6个月。
在一个实施方案中，该组合物的同渗浓度的范围是250-330mOsmol/L。其可以是等渗的或近似等渗的。
在某些实施方案中，该组合物储藏在不可渗透的容器中。
在其他实施方案中，该组合物还包含螯合剂。螯合剂可以是二乙三胺五乙酸(DTPA)或去铁胺。DTPA的范围可以是0.1mM至1.0mM。去铁胺的范围是0.1mM至1mM。
在一个实施方案中，该组合物还包含pH调节剂。pH调节剂可以选自：二氧化碳，氢氧化钠，盐酸或硫化氢。
在另一个实施方案中，该组合物还包含还原剂。还原剂可以选自：二硫苏糖醇(DTT)或谷胱甘肽。二硫苏糖醇(DTT)的量的范围可以是0.1mM至1M。谷胱甘肽的量的范围可以是0.1mM至1M。
在一个进一步的实施方案中，该组合物还包含自由基清除剂。自由基清除剂可以选自(6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸)(Trolox)或盐酸三(2-羧乙基)膦(TCEP)。自由基清除剂可以是自旋捕获剂。自由基清除剂可以选自：N-叔丁基-苯基硝酮(PBN)，2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧基(TEMPO)，4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPOL)。
在另一个实施方案中，该组合物还包含防腐剂。防腐剂可以选自苯甲醇，苯酚，尼泊金甲酯，尼泊金乙酯，尼泊金丙酯，尼泊金丁酯，或苯扎氯铵。防腐剂的范围可以是苯甲醇(0％-2.0％)(w/v)，苯酚(0％-0.5％)(w/v)，尼泊金甲酯(0％-0.25％)(w/v)，尼泊金乙酯(0％-0.25％)(w/v)，尼泊金丙酯(0％-0.25％)(w/v)，尼泊金丁酯(0％～0.4％)(w/v)，苯扎氯铵(0％-0.02％)(w/v)。
在一个实施方案中，1当量的硫化氢气体溶入1当量的氢氧化钠溶液，其中所得到组合物的pH范围是6.5至8.5，同渗浓度的范围是250-330mOsmol/L，氧含量小于或等于5μM并且在储藏3个月后所包含的氧化产物的范围是0％-3.0％(w/v)。
在一个相关的实施方案中，1当量的硫化氢气体溶入1当量的氢氧化钠溶液，其中所得到的组合物的pH范围是6.5至8.5，“同渗浓度”的范围是250-330mOsmol/L，氧含量小于或等于5μM并且在储藏5个月后，所包含的氧化产物的范围是0％-2.0％(w/v)。
在另一个相关的实施方案中，1当量的硫化氢气体溶入1当量的氢氧化钠溶液，其中所得到的组合物的pH范围是7.5至8.5，“同渗浓度”的范围是250-330mOsmol/L，氧含量小于或等于5μM并且在储藏5个月后，所包含的氧化产物的范围是1％-2.0％(w/v)。
本发明进一步提供制备适合施用于动物的硫化物的液体组合物的方法，包括：
a.将1当量的硫化氢气体溶入1当量的液体中，由此产生了硫化物的组合物；和
b.将步骤(a)得到的组合物的pH调节至pH范围为6.5至8.5，其中所述组合物由此产生了适合施用于动物的的硫化物的液体组合物。
在某些实施方案中，pH是通过加入氯化氢，二氧化碳，氢氧化钠和硫化氢中的一种或多种来调节的。在其他实施方案中，pH是通过将氮，二氧化碳和/或硫化氢溶入步骤(a)得到的组合物中来调节的。pH也可以通过将氮气和二氧化碳的组合或氮气和硫化氢的组合溶入步骤(a)得到的组合物中来调节。此外，pH可以通过将硫化氢溶入步骤(a)得到的组合物中来调节。
该方法还可以包括将步骤(b)得到的组合物的“同渗浓度”调节至同渗浓度的范围是250-350mOsmol/L。
该方法还包含在惰性大气或稀有气体下将步骤(b)得到的组合物装入到避光的小瓶中。
该方法还包括将赋形剂加入到步骤(b)得到的组合物中。
在该方法的一个具体的实施方案中，约6个月后氧含量小于或等于5μM。
在另一个实施方案中，本发明包括一种试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个包含硫属化物或硫属化物盐的组合物的容器，其中所述组合物的pH范围是6.5至8.5。
在一个实施方案中，容器是避光的，例如琥珀色小瓶。在另一个实施方案中，容器是气体不可渗透的。
在一些试剂盒中，在惰性大气或稀有气体下所述组合物储藏于所述容器中。
在具体的实施方案中，惰性或稀有气体可以是氦(He)，氖(Ne)，氩(Ar)，氪(Kr)，氙(Xe)和氡(Rn)。
在另一个相关的实施方案中，本发明提供一种治疗暴露于缺血性或低氧性病症的人疾病或生物体的损伤的方法，包括将该生物体与有效量的硫属化物或硫属化物盐的组合物接触。
在各个实施方案中，接触是静脉内，真皮内，动脉内，腹膜内，体内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部(topically)，瘤内，肌内，腹膜内，眼内，皮下，结膜下，intravesicularlly，粘膜，心包内，脐带内，眼内，口服，局部(locally)，通过注射，通过输注，通过连续输注，通过吸收，通过吸附，通过浸入，通过局部灌流，经导管或经灌洗。
在具体的实施方案中，所述硫属化物或硫属化物盐选自：H₂S，Na₂S，NaHS，K₂S，KHS，Rb₂S，CS₂S，(NH₄)₂S，(NH₄)HS，BeS，MgS，CaS，SrS和BaS。
在具体的实施方案中，所述硫属化物或硫属化物盐选自：H₂Se，Na₂Se，NaHSe，K₂Se，KHSe，Rb₂Se，CS₂Se，(NH₄)₂Se，(NH₄)HSe，BeSe，MgSe，CaSe，SrSe和BaSe。
在一个实施方案中，缺血性或低氧性病症是由于对该物体的损伤，疾病不利地影响该物体的发生或发展或者该物体的出血导致的。
在另一个实施方案中，损伤前，疾病发生或发展前或者该物体出血前，该物体与该组合物接触。
在一个不同的实施方案中，损伤，疾病发生或发展或者该物体出血后，该物体与该组合物接触。
在一个实施方案中，损伤是外部物理来源的。
在一个具体的实施方案中，损伤是手术。
在某些实施方案中，该物体与一定量的该组合物接触一段时间，保护该物体免于由损伤，疾病发生或发展或者该物体出血而导致的损害或死亡。
在相关的实施方案中，该物体选自：细胞，组织，器官，有机体和动物。在具体的实施方案中，该物体是动物，在更具体的实施方案中，动物是哺乳动物或人。
在一个实施方案中，该生物体包含血小板。
在另一个实施方案中，该生物体是要植入的。
在另一个实施方案中，该生物体具有再灌注损伤的危险。
在一个具体的实施方案中，该生物体具有出血性休克的危险。
几个附图的简述
附图1的图，显示了当硫化物的浓度大于氧分子的浓度([硫化物]>[O₂])时，在7.0-9.0的pH范围内检测到的硫化物氧化物质。
附图2的图，显示了在7.0-9.0的pH范围内在硫化物水溶液中检测到的氧化产物。
附图3的图，描述了H₂S的液体组合物(液体药物组合物IV)的三种不同的制剂随着时间的硫化物水平。
附图4的图比较了用或不用合成型螯合剂二乙三胺五乙酸(DTPA)制备的H₂S的液体组合物(液体药物组合物IV)在129天中硫化物稳定性。
附图5A和5B的图，描述了在无氧环境中，在DTPA存在(5B)或不存在(5A)下制备的H₂S的液体组合物(液体药物组合物IV)中，129天中所测定的氧化产物(即，亚硫酸盐，多硫化物，硫代硫酸盐，硫酸盐和在37分钟鉴定的未知氧化产物)的水平。
附图6是在129天的时间里，以特定间隔测定的硫化物，97mM H₂S的液体组合物(液体药物组合物IV)的pH水平。
附图7A的图，显示了快速注射液体药物组合物IV后尿中硫代硫酸盐的排泄。该图描述了在施用后指定时间点时，在大鼠尿中测定的硫代硫酸盐的量。
附图7B的图，显示了快速注射液体药物组合物IV后尿中硫酸盐的排泄。该图描述了在施用后指定时间点时，在大鼠尿中测定的硫酸盐的量。
附图8A的图，显示在快速注射液体药物组合物IV(1mg/kg)后，在大鼠中240分钟内测定的血液硫代硫酸盐水平。在该研究中，血液抽取自颈动脉，用PFBBr衍生物制备样品并通过GC-MS分析。
附图8B的图，显示在快速注射液体药物组合物IV(1mg/kg)后，在大鼠中240分钟内测定的血液硫化物水平。在该研究中，血液抽取自颈动脉，用PFBBr衍生物制备样品并通过GC-MS分析。
附图9的图，显示的是用Na₂S(液体药物组合物I)灌注并暴露于低氧条件(4％ O₂)下的小鼠随着时间的中心体温(MJVC07)。灌注开始和结束的时间，暴露于低氧条件时开始和结束的时间如所示。
附图10是Kaplan Meier图，比较了用载体灌注或用灌注的Na₂S(液体药物组合物I)治疗的C57BL/6小鼠暴露于低氧(4％ O₂)随着时间测定的存活率。
附图11的图，描述了用所示量的液体药物组合物IV治疗的小鼠的血清AST和ALT水平。在最高受试浓度(3.0mg/kg)下，所达到的AST水平统计学显著地降低。与载体组相比，三个治疗组(0.3mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg)中ALT水平的水平都降低。统计学显著的p-值0.05(*)和p<0.01(**)如所示。
附图12的图，描述了用所示量的硫化物的液体药物组合物治疗的小鼠中LV或AAR的百分比。统计学显著的p-值0.05(*)和p<0.01(**)如所示。
附图13A和13B的图，描述了在液体药物组合物IV存在或不存在下，用冰的Ringer′s治疗的猪的中心体温。附图13A和13B显示了由具有所提供的p-值的两种实验获得的结果。
附图14的图，描述了在对照载体或液体药物组合物IV存在下缺血并再灌注的猪的梗塞面积。
附图15的图，描述了在对照载体或液体药物组合物IV存在下对缺血应答的狗的前负荷补充搏功(PRSW)。
附图16的图，描述了用载体或液体药物组合物IV预治疗的动物中AAR或LV的百分比。
附图17表示的是在对照载体或硫化氢存在下在心肺分流术之前或之后动物的左心室功能。附图17A的图，显示了在对照载体或胃肠外施用的硫化氢存在下在心肺分流术之前或之后动物的左心室dP/dT。附图17B的图，显示了在对照载体或胃肠外施用的硫化氢存在下在心肺分流术之前或之后动物的PRSW。
附图18的图表示的是体内内皮细胞的功能，其描述了在对照载体或硫化氢存在下在心肺分流术之前或之后动物的DCBF[％]。
附图19显示了在对照载体或硫化氢存在下的体外内皮功能。附图19A的图，描述了在对照载体或硫化氢存在下进行或未进行心肺分流术时对乙酰胆碱应答的血管舒张。附图19B的图，描述了在对照载体或硫化氢存在下进行或未进行心肺分流术时对SNP应答的血管舒张。
发明详述
提供了包含硫属化物的组合物和用于制备它们的方法和用途。该组合物是硫属化物或硫属化合物或其盐或前体的稳定的液体组合物，而在以液体制备或储藏期间所述硫属化物或硫属化合物或其盐或前体作为治疗剂的有效性通常会受到产生氧化产物的氧化反应的影响。本发明的液体组合物具有较长的储藏期限，易于制造和重复生产，并设计用于标准给药途径，在治疗和预防先前认为可使用液体或气体硫属化物的组合物的疾病和病症中是有利的。本发明关注的是它们在诱导生物体停滞或预停滞的方法、以及保护生物体免于疾病或损伤，特别是缺血性或低氧性损伤的方法中的应用。
A.稳定的液体的硫属化物的药物组合物
本发明涉及包含硫属化物的稳定的液体组合物和用于制备它们的方法。就本发明的目的而言，涉及药物组合物时的术语“液体”意欲包括属于“含水的”。
在一个方面，本发明涉及包含硫属化物或硫属化合物或其盐或前体的稳定的液体药物组合物，其中在储藏所述液体药物组合物预定的时间后，所述硫属化物的浓度，pH和氧化产物保持在可接受标准(所述试验的数量界限，范围或其他标准)的范围内。
本文使用的“稳定的”涉及活性硫属化物的组合物的浓度，硫属化物的组合物的pH和/或硫属化物的氧化产物保持在可接受标准的范围内。
“可接受标准”是指标准的设定，在该标准内，药物或药物产品应当证明对其所欲用途是可接受的。本文使用时，可接受标准是一系列的试验，涉及分析方法和适当的测定，其限定为用于将在哺乳动物中使用的药物产品。例如，硫属化物的稳定的液体药物组合物的可接受标准是指一系列的药物预定范围，pH和氧化产物的水平，基于稳定性试验，其对于特定药物组合物的药学用途是可接受的。对于不同的制剂，包括局部和化妆用的那些而言，可接受标准可以是不同的。各个工业一般都有自己定义的可接受标准。
各种可接受标准包括满足美国食品和药品管理局公布的药品生产质量管理规范的本文所述的任意值或范围。在某些实施方案中，可接受标准是在4℃，25℃或40℃下，在0，1，2，3，或4个月的储存时间点时，pH范围是7.4-9.0，6.5至8.5，或6.5至9.0。在某些实施方案中，可接受标准是在4℃，25℃或40℃下，在0，1，2，3，或4个月的储存时间点时，重量同渗浓度的范围是250-350mOsm/kg或同渗浓度的范围是250-330mOsm/L。在某些实施方案中，可接受标准是在4℃，25℃或40℃下，在0，1，2，3，或4个月的储存时间点时，硫化物浓度是5.0-6.0mg/ml。在另一个实施方案中，可接受标准是在4℃，25℃或40℃下，在0，1，2，3，或4个月的储存时间点时，硫属化物的浓度在0.1-100mg/ml，1-10mg/ml或95-150mM的范围内。在其他实施方案中，可接受标准是在4℃，25℃或40℃下，在0，1，2，3，或4个月的储存时间点时，硫化物占硫化物及其氧化产物的总量至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％重量/体积。在相关的实施方案中，在4℃，25℃或40℃下，在0，1，2，3，或4个月的储存时间点时，氧化产物占硫化物及其氧化产物的总量小于10％，小于5％，小于4％，小于3％，小于2％，小于1％，0.5％或更少。
短语“药学-可接受的”或“药理学-可接受的”是指当以医学或兽医学环境下施用于人或动物时不会产生变应性或类似的不希望的反应的分子体和组合物。
“硫属化物”或“硫属化合物”是指包含硫属元素，即在元素周期表第6组的那些，但不包括氧的化合物。这些元素是硫(S)，硒(Se)，碲(Te)和钋(Po)。具体的硫属化物及其盐包括但不限于：H₂S，Na₂S，NaHS，K₂S，KHS，Rb₂S，CS₂S，(NH₄)₂S，(NH₄)HS，BeS，MgS，CaS，SrS，BaS，H₂Se，Na₂Se，NaHSe，K₂Se，KHSe，Rb₂Se，CS₂Se，(NH₄)₂Se，(NH₄)HSe，BeSe，MgSe，CaSe，SrSe，PoSe和BaSe。
“硫属化物前体”是指在某些条件下例如暴露于生物体时或其后可以得到硫属化物，例如，硫化氢(H₂S)的化合物和试剂。这些前体经一个或多个酶或化学反应得到H₂S或其他的硫属化物。在某些实施方案中，该硫属化物前体是二甲亚砜(DMSO)，二甲硫醚(DMS)，甲硫醇(CH₃SH)，巯基乙醇，硫氰酸盐，氢氰酸，甲硫醇(MeSH)或二硫化碳(CS₂)。在某些实施方案中，该硫属化物前体是CS₂，MeSH，或DMS。
在一个实施方案中，根据下列反应式，在水性溶液中由H₂S供体硫氢化钠(NaHS)的自发性分解来产生H₂S：
NaHS→Na⁺+HS^-


在某些实施方案中，硫属化合物包含硫，而其他则包含硒，碲和钋。在某些实施方案中，硫属化合物包含一个或多个暴露的硫醚基(sulfide group)。在具体的实施方案中，关注的是，该硫属化合物包含1，2，3，4，5，6或更多个或其可推导出的任意范围的暴露的硫醚基。在具体的实施方案中，这种包含硫化物的化合物是CS₂(二硫化碳)。在某些实施方案中，该硫属化物是盐，优选其中硫属元素处于-2氧化态的盐。本发明的实施方案包括的硫化物盐包括但不限于，硫化钠(Na₂S)，硫氢化钠(NaHS)，硫化钾(K₂S)，硫氢化钾(KHS)，硫化锂(Li₂S)，硫化铷(Rb₂S)，硫化铯(Cs₂S)，硫化铵((NH₄)₂S)，硫氢化铵((NH₄)HS)，硫化铍(BeS)，硫化镁(MgS)，硫化钙(CaS)，硫化锶(SrS)，硫化钡(BaS)等等。
本领域公知，硫化物是不稳定的化合物，已经做了很多努力了稳定这类化合物。特别地，硫化物氧化产生了可测定的氧化产物。因此，可以用本文所述并且本领域公知的标准测定方法，通过测定氧化产物随着时间的水平来容易地确定硫化物在液体组合物中储藏期间产生的氧化产物的范围。
本文使用的“氧化产物”是指由硫化物的化学转化产生的产物，包括例如亚硫酸盐，硫酸盐，硫代硫酸盐，多硫化物，连二硫酸盐，连多硫酸盐和元素硫。硫化物氧化的这些产物通常是在处理，制造或储藏期间产生的(例如，通过氧化)。
“储藏期间”是指制备好液体硫属化物的组合物后，并且施用于患者或生物体前的这段时间。当制备好以后，本发明的液体药物组合物可以不立即施用于患者。相反，在制备好以后，将其包装成液体形式，半固体形式，凝胶形式，固体形式或其他适合施用于患者的形式储藏。在某些实施方案中，储藏的范围是1个月至12个月，1个月至6个月，或2个月至5个月。
本发明组合物可以通过本领域一般所知的方法，与赋形剂一起制备(Remington′s Pharmaceutical Sciences(2005)；21^st Edition，Troy，David B.Ed.Lippincott，Williams和Wilkins)，以用于药学施用。
本发明的液体药物组合物可以包括任意所需浓度的硫属化物或硫属化合物或其盐或前体。可以容易地调节浓度，例如，根据所要治疗的生物体的类型和给药途径，以便以合适的方式和以适当的时帧递送有效量。在一些实施方案中，硫属化物或硫属化合物或其盐或前体的浓度是0.001mM至5,000mM的范围，1mM至1000mM的范围，50至500mM的范围，75至250mM的范围，或95mM至150mM的范围。
本发明的液体药物组合物还包含由硫化物组成的硫属化物，其中硫化物的浓度范围是1mM-250mM。在另一个实施方案中，硫化物的浓度范围是10mM-200mM。
在某些实施方案中，在本发明的液体硫属化物的组合物中，该硫属化物或其盐或前体的浓度是约，至少约，或至多约0.001，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0mM或M或更大或其可推导出的任意范围(在标准温度和压力(STP)下)。在一些实施方案中，当具有硫化氢气体时，例如，浓度可以是约0.01至约0.5M(在STP下)。
可以容易地将摩尔浓度转化为重量/体积。因此，上述任意的摩尔浓度可以称为例如，mg/ml。因此，在某些实施方案中，在本发明的液体硫属化物的组合物中，该硫属化物或其盐或前体的浓度的范围是0.01-1000mg/ml，0.1-100mg/ml，或1-10mg/ml。在其他实施方案中，浓度是约或是1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，7mg/ml，8mg/ml，9mg/ml，或10mg/ml。
在本发明的一个方面，液体药物组合物包含溶解于液体中的硫属化物或硫属化合物或其盐或前体。在一个实施方案中，液体是水(H₂O)，而在其他实施方案中，是其他生理学相容的溶液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Ringer′s溶液。在其他实施方案，液体是氢氧化钠的水溶液，或氢氧化钾的水溶液。
关注的是，在一些实施方案中，液体药物组合物是硫属化物或硫属化合物或其盐或前体的饱和溶液。
当不与限定词(例如w/v，v/v，或w/w)使用时，本文使用的术语“％”是对于固体的液体溶液是％重量体积比(w/v)，对于气体的液体溶液是％重量体积比(w/v)，对于液体的液体溶液是％体积体积比(v/v)，对于固体和半固体的混合物是重量比(w/w){Remington′sPharmaceutical Sciences(2005)；21^st Edition，Troy，David B.Ed.Lippincott，Williams和Wilkins)。
在一个实施方案中，本发明的液体药物组合物包含经测定为80％-100％(w/v)的硫化物。在一个实施方案中，本发明的液体药物组合物包含经测定为90％-100％(w/v)的硫化物。在一个实施方案中，本发明的液体药物组合物包含经测定为95％-100％(w/v)的硫化物。在一个实施方案中，本发明的液体药物组合物包含经测定为98％-100％(w/v)的硫化物。
在一个实施方案中，本发明的液体的硫属化物的药物组合物的pH的范围是(3.0-12.0)，而在其他实施方案中，pH范围是(5.0-9.0)。可以将该液体药物组合物的pH调节至生理学相容的范围。例如，在一个实施方案中，该液体药物组合物的pH的范围是6.5-8.5。在其他实施方案中，本发明的液体药物组合物的pH范围是7.5-8.5或7.4-9.0。
在一个实施方案中，在该药物组合物中，所测定的氧的范围是0μM-5μM。在一个实施方案中，在该药物组合物中，所测定的氧的范围是0μM-3μM。在一个实施方案中，在该药物组合物中，所测定的氧的范围是0.01μM-1μM。在一个实施方案中，在该药物组合物中，所测定的氧的范围是0.001μM-1μM。
本发明的药物组合物还可以包含氧化产物。本发明的氧化产物包括但不限于，亚硫酸盐，硫酸盐，硫代硫酸盐，多硫化物，连二硫酸盐，连多硫酸盐和元素硫。在各个实施方案中，这些氧化产物的一种或多种的存在量小于10％，小于6.0％，小于3.0％，小于1.0％，小于0.5％，小于0.2％，小于0.1％，小于0.05％，或小于0.01％。
在一个实施方案中，氧化产物，亚硫酸盐的范围是0％-10％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，亚硫酸盐的范围是3.0％-6.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，亚硫酸盐，的范围是1.0％-3.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，亚硫酸盐的范围是0％-1.0％(w/v)。
在一个实施方案中，氧化产物，硫酸盐的范围是0％-10.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，硫酸盐的范围是3.0％-6.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，硫酸盐的范围是1％至3.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，硫酸盐的范围是0％-1.0％(w/v)。
在一个实施方案中，氧化产物，硫代硫酸盐的范围是0％-10％(w/v)。在另一个实施方案中，氧化产物，硫代硫酸盐的范围是3.0％-6.0％(w/v)。在另一个实施方案中，氧化产物，硫代硫酸盐的范围是1.0％-3.0％(w/v)。在另一个实施方案中，氧化产物，硫代硫酸盐的范围是0％-1.0％(w/v)。
在一个实施方案中，氧化产物包括范围为(0％-10％(w/v)的多硫化物。在一个实施方案中，氧化产物，多硫化物的范围是3.0％-6.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，多硫化物的范围是1.0％-3.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，多硫化物的范围是0％-1.0％(w/v)。
在一个实施方案中，氧化产物，连二硫酸盐的范围是0％-10％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，连二硫酸盐的范围是3.0％-6.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，连二硫酸盐的范围是1.0％-3.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，连二硫酸盐的范围是0％-1.0％(w/v)。
在一个实施方案中，氧化产物，连多硫酸盐的范围是0％-10％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，连多硫酸盐的范围是3.0％-6.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，连多硫酸盐的范围是1.0％-3.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，连多硫酸盐的范围是0％-1.0％(w/v)。
在一个实施方案中，氧化产物，元素硫的范围是0％-10％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，元素硫的范围是3.0％-6.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，元素硫的范围是1.0％-3.0％(w/v)。在一个实施方案中，氧化产物，元素硫的范围是0％-1.0％(w/v)。
本领域技术人员将会意识到，在施用于哺乳动物前的储藏期间优选液体药物组合物(药品)保持稳定。在一个实施方案中，液体药物组合物的储藏期是约3个月，并且储藏温度的范围是18℃-27℃。在另一个实施方案中，液体药物组合物的储藏期是约6个月并且储藏温度的范围是18℃-27℃。在另一个实施方案中，液体药物组合物的储藏期是约12个月，并且储藏温度的范围是18℃-27℃。
在一个实施方案中，液体药物组合物的储藏期是约3个月，并且储藏温度的范围是4℃-23℃。在另一个实施方案中，液体药物组合物的储藏期是约6个月，并且储藏温度的范围是4℃-23℃。在另一个实施方案中，液体药物组合物的储藏期是约12个月，并且储藏温度的范围是4℃-23℃。
在一个实施方案中，本发明的制备液体药物组合物的方法还包括调节该液体药物组合物的“同渗浓度”至同渗浓度的范围是200-400mOsmol/L。在一个实施方案中，该液体药物组合物的同渗浓度的范围是240-360mOsmol/L或等渗范围。在具体的实施方案中，该液体药物组合物的同渗浓度的范围是250-330mOsmol/L或该液体药物组合物的同渗浓度的范围是250-350mOsm/kg。可以用NaCl作为赋形剂来调节重量同渗浓度。
在某些实施方案中，需要液体药物组合物具有等渗性，因为施用时它会减小疼痛并使与高渗性或低渗性组合物有关的潜在溶血效果最小。因此，与使用用包含酸和该酸的盐的其他常规缓冲系统的制剂相比，本发明的稳定化组合物不仅储藏稳定性更高，而且在施用时具有额外的显著减小疼痛的益处。
在一个实施方案中，该稳定的液体药物组合物包装在不可渗透的容器中。“不可渗透的容器”是指为气体分子的通过提供持久屏障的容器。不可渗透的容器是本领域技术人员已知的，包括但不限于，包含气体不可渗透的构筑材料的“i.v.袋”或密封的玻璃瓶。该液体药物组合物可以在惰性大气或稀有气体下包装在不可渗透的容器中。稀有气体是指氦(He)，氖Neon(Ne)，氩(Ar)，氪(Kr)，氙(Xe)和氡(Rn)。惰性气体是指氮气(N₂)。术语“惰性大气”是指容器中的氮气或氩气大气。该液体药物组合物可以包装在避光小瓶或容器中，例如琥珀色小瓶中。在一个实施方案中，该组合物可以密封和储藏在玻璃安瓿中。
在一些实施方案中，本发明的液体药物组合物包含一种或多种赋形剂，以防止硫属化物在储藏期间氧化，其中储藏期的范围是1至12个月或更长。在一些实施方案中，储藏期的范围是1至6个月。在一些实施方案中，储藏期的范围是3至6个月。在一些实施方案中，储藏期的范围是4至5个月。本发明的实施方案可以使用一种赋形剂或赋形剂的组合。有许多适当的赋形剂。例子包括螯合剂，pH调节剂，还原剂，抗氧化剂，自旋捕获剂和防腐剂。
在一个实施方案中，本发明的液体药物组合物可以任选包含螯合剂。螯合物是金属离子和络合剂的水溶性复合物。它通常在溶液中不易分解，而是形成惰性复合物。但是，在易变络合物中，金属离子可以容易地被交换。过渡元素的金属络合物是公知的，但是在范围很广的元素内都会发生螯合。得到可溶性金属络合物的螯合剂也称作掩蔽剂。螯合剂典型地具有至少两个给金属一对电子的官能团，例如-0，-NH₂或-COO^-。此外，限制这些基团，以使与金属成环。自然形成的螯合剂的例子包括烃，包括多糖，具有一个以上的配位基的有机酸，脂类，甾类，氨基酸及相关化合物，肽，磷酸盐(酯)，核苷酸，四吡咯，高铁氧胺，离子载体例如短杆菌肽，莫能星，真菌霉素和酚类化合物。合成的螯合剂的例子包括但不限于，二乙三胺五乙酸(DTPA)，二乙三胺五乙酸五钠盐(DTPA5)，CaDTPAH，二巯丙醇(BAL)，去铁胺，去铁灵，2，2′-二吡啶基二巯丙醇乙二胺四乙酸，乙二氧基-二乙烯-二氮川-四乙酸(EDTA)，CaNa₂乙二胺四乙酸，乙烯乙二醇-二-(2-氨乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)，离子载体，次氮基三乙酸(NTA)，邻二氮杂菲，水杨酸，二巯丁二酸(中-2，3-二巯基丁二酸(DMSA)，三乙醇胺(TEA)，N-(2-羟基乙基)乙二胺-N，N′，N′-三乙酸三钠盐(HEDTA)，氮川三乙酸(NTA)。
在一个实施方案中，合成型螯合剂是DTPA。在某些实施方案中，DTPA的浓度是约，至少约，或至多约0，0.001，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mM或M或其可推导出的任意范围。在一个实施方案中，DTPA的范围是0.1mM至50mM。在一个实施方案中，合成型螯合剂由DTPA5组成。在某些实施方案中，DTPA5的浓度范围是(0.0001％-0.1％)(w/v)。在另一个实施方案中，DTPA5的范围是(0％-1.0％)(w/v)。在一个实施方案中，DTPA5的范围是(0％至0.01％)(w/v)。
在一个实施方案中，合成型螯合剂是CaDTPA。在某些实施方案中，CaDTPA的浓度范围是(0.0001％-0.1％)(w/v)。在一个实施方案中，CaDTPA的范围是(0％至0.01％)(w/v)。在另一个实施方案中，CaDTPA的范围是(0％-1.0％)(w/v)。
在一个实施方案中，合成型螯合剂是去铁胺。在某些实施方案中，去铁胺的浓度是约，至少约，或至多约0，0.001，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mM或M，或其可推导出的任意范围。在一个实施方案中，去铁胺的范围是0.1mM至10mM。
在一个实施方案中，合成型螯合剂是EDTA。在某些实施方案中，EDTA的浓度是约，至少约，或至多约0，0.001，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mM或M，或其可推导出的任意范围。在某些实施方案中，EDTA的范围是0％-1％(w/v)。在另一个实施方案中，EDTA的范围是0.0001％-0.1％(w/v)。在另一个实施方案中，EDTA的范围是0％-1.0％(w/v)。在一个实施方案中，EDTA的范围是0％至0.01％(w/v)。
本发明的液体药物组合物还可以包含一种或多种pH调节剂。pH调节剂包括但不限于，无机盐，例如碳酸锌，碳酸镁，碳酸钙，氢氧化钙，磷酸氢钙，乙酸钙，氢氧化钙，乳酸钙，马来酸钙，油酸钙，草酸钙，磷酸钙，乙酸镁，磷酸氢镁，磷酸镁，乳酸镁，马来酸镁，油酸镁，草酸镁，氯化钠，碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钾，磷酸钾，碳酸氢钠，巯基乙酸，乙酸锌，磷酸氢锌，磷酸锌，乳酸锌，马来酸锌，油酸锌，草酸锌或其组合。其他pH调节剂包括，例如，乙酸，延胡索酸，苹果酸，硝酸，磷酸，丙酸，硫酸，酒石酸，二氧化碳，碳酸，N-甲基-D-葡萄糖胺，4-(2-羟乙基)-吗啉，氨丁三醇，乳清酸和盐酸。在一个实施方案中，pH调节剂是氢氧化钠。
本领域技术人员容易理解的是，当加入到已呈酸性或碱性的溶液中时，pH调节剂可以用作缓冲剂，然后其调节并维持在新的pH下(参见：The United States Pharmacopeia-National Formulary 29^thEdition，(2006)Rockville，MD；Stahl，P.Wermuth，C.ed.Handbookof Pharmaceutical Salts Properties，Selection and Use.Wiley(2002))。在一个具体的实施方案中，pH调节剂用作缓冲剂，由二氧化碳或硫化氢构成。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包括一种或多种赋形剂，其是还原剂，例如，例如，谷胱甘肽(参见：US 6,586,404)，盐酸三(2-羧乙基)膦(TSEP)，1-半胱氨酸，半胱氨酸或蛋氨酸。在一个实施方案中，还原剂是谷胱甘肽(参见：Vincent等人，EndocrineReviews(2004)25：612-628)，二硫苏糖醇(DTT)(Weir等人，Respir和Physiol Biol；(2002)132：121-30)或二硫赤藓糖醇(DTE)。在某些实施方案中，谷胱甘肽的浓度是约，至少约，或至多约0，0.001，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mM或M或更大或其可推导出的任意范围。在某些实施方案中，所存在的二硫苏糖醇(DTT)的浓度是约，至少约，或至多约0，0.001，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mM或M，或其可推导出的任意范围。在某些实施方案中，还原剂是二硫赤藓糖醇(DTE)，浓度是约，至少约，或至多约0，0.001，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mM或M，或其可推导出的任意范围。
本发明的液体药物组合物可以任选包含自由基清除剂或抗氧化剂。自由基清除剂或抗氧化剂的例子包括但不限于，抗坏血酸(维生素C)，乙酸D-α生育酚，DL-α-生育酚(维生素E)，褪黑激素，亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，偏重亚硫酸钠，Trolox(6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸)，盐酸三(2-羧乙基)膦(TCEP)，褪黑激素，二亚硫酸盐，焦亚硫酸盐，半胱氨酸，亚硫酸氢钾，巯基乙酸钠，硫乙二醇，L-苏抗坏血酸，乙酰水杨酸，水杨酸，卵磷脂，抗坏血酸基棕榈酸盐，butylated hydroxanidole，抗坏血酸，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟基醌，丁基化羟基苯甲醚，羟基香豆素，丁基化羟基甲苯，cephalm，榈酸乙酯，没食子酸丙酯，没食子酸辛酯，没食子酸十二酯，苯甲酸羟丙酯，三羟基丁酰苯，二甲酚，卵磷脂，乙醇胺，葡甲胺及其组合(参见US 2005/0106214)。在一个实施方案中，抗氧化剂，例如，亚硫酸钠的范围是0％-2％(w/v)。
在一个实施方案中，抗氧化剂，例如，亚硫酸钠的范围是0％-1％(w/v)。在一个实施方案中，抗氧化剂，例如，亚硫酸钠的范围是0％-0.2％(w/v)。(参见：Swadesh等人，Anal Biochem(1984)，141：397)。
在一个实施方案中，抗氧化剂是自旋捕获剂。自旋捕获剂的例子包括但不限于，N-叔丁基-苯基硝酮(PBN)(参见：Kotake，Y.，AntioxidRedox Signal(1999)481)，4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPOL)(Gariboldi，M.B.，等人(2000)，Free Radic.Biol.Med.29：633；Miura，Y.，等人J.Radiat Res.(Tokyo)(2000)41：103；Mota-Filipe，H.，等人(1999)，Shock 12：255R：22-41；S：39-26)；2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧基(TEMPO)(参见：Lapchak，等人，Stroke(2001)32：147-53)；(二钠-[(叔丁基亚胺基)甲基]苯-1，3-二磺酸N-氧化物(NXY-059)(参见：Lapchak等人，CNS DrugRev(2003)9：253-62)。
在一些实施方案中，自旋捕获剂是TEMPO，其范围是0mg/kg-1，000mg/kg。在一些实施方案中，自旋捕获剂是TEMPO，其范围是100mg/kg-1,000mg/kg。在另一个实施方案中，自旋捕获剂是TEMPO，其范围是0mg/kg-100mg/kg。
本发明的硫属化物的组合物任选可以包含防腐剂。本文使用的术语“防腐剂”是指用于防止微生物生长的化合物。这些化合物的例子包括但不限于，苯扎氯铵，苄索氯胺，苯甲酸，苯甲醇，丁基化羟基茴香醚(BHA)，西曲溴铵，西吡氯铵，三氯叔丁醇，氯甲酚，甲酚，尼泊金甲酯钠，苯酚，苯氧乙醇，苯乙醇，乙酸苯汞，硝酸苯汞，乙酸苯汞，硫柳汞，间甲酚，肉豆蔻γ甲代吡啶氯，苯甲酸钾，山梨酸钾，苯甲酸钠，丙酸钠，山梨酸，硫代甘油，硫柳汞，麝香香酚和尼泊金甲酯，乙酯，丙酯或丁酯以及本领域普通技术人员已知的其他物质。这些防腐剂可以根据可接受的药学实践，例如如(参见：The UnitedStates Pharmacopeia-National Formulary 29^th Edition，(2006)Rockville，MD；Remington′s Pharmaceutical Sciences(2005)21^stEdition，Troy，DB，Ed.Lippincott，Williams和Wilkins)所述，以典型的浓度用于液体硫属组合物。在某一实施方案中，防腐剂是苯甲醇，并且范围是0％-1.0％(w/v)。在一个实施方案中，防腐剂是苯甲醇，并且范围是0％-0.5％(w/v)。在一个实施方案中，防腐剂是范围为0％-0.5％(w/v)的酚。在某一实施方案中，防腐剂是范围为(0.0％-0.25％(w/v)的尼泊金甲酯。在某一实施方案中，防腐剂是范围为0％-0.25％(w/v)的尼泊金乙酯。在某一实施方案中，防腐剂是范围为0％-0.25％(w/v)的尼泊金丙酯。在某一实施方案中，防腐剂是范围为0％-0.4％(w/v)的尼泊金丁酯。在某一实施方案中，防腐剂是范围为0％-0.02％(w/v)的苯扎氯铵。
在一个实施方案中，赋形剂的组合减少了多硫化物的形成。在一个实施方案中，减少多硫化物形成的赋形剂的组合包含范围为0％-0.1％(w/v)的亚硫酸钠和范围为0％-0.01％(w/v)的EDTA。在一个实施方案中，减少多硫化物形成的赋形剂的组合是亚硫酸钠和DTPA5。在一个实施方案中，减少多硫化物形成的赋形剂的组合是亚硫酸钠，DTPA5和苯甲醇。
在具体的实施方案中，本发明的制剂包含小于或等于0.01mg/ml的铁，小于或等于10，5，2.7，2.5，或1EU/ml的内毒素，小于10，5，或1ppm的羰基硫和小于5，2.5，或1ppm的二硫化碳。
上述中的某些是优选的，因为这些物质作为食品添加剂和操作助剂被广泛接受，并且已经达到美国食品和药品管理局在这些用途方面的“一般认可安全级”(或“GRAS”)状态。
本发明此外还包括包含本发明的液体药物组合物的试剂盒。在某些实施方案中，这些试剂盒包含储藏本发明的液体药物组合物的一个或多个容器。在一个实施方案中，该组合物在惰性或稀有气体下储藏在容器中，该容器是密封的，并且不可渗透的避光容器(例如，琥珀色小瓶)。
B.制备液体药物组合物的方法
根据本发明的方法的各种实施方案，生物体被提供本发明的液体药物组合物，例如通过静脉内，真皮内，动脉内，腹膜内，体内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，瘤内，肌内，腹膜内，眼内，皮下，结膜下，intravesicularlly，粘膜，心包内，脐带内，眼内，口服，局部，通过注射，通过输注，通过连续输注，通过吸收，通过吸附，通过浸入，通过局部灌注，经导管或经灌洗
关注的是包含溶于液体的已知和期望浓度的硫属化物或其盐或前体的组合物或用于胃肠外施用的组合物。“胃肠外”是指除了通过消化道以外的物质的任意给药途径。一般地，液体硫属化物的组合物可以如下制备，包括，例如将硫属化物气体(例如，H₂S)与该组合物接触(例如溶解或浸入)来使气体分子溶于包含适当pH调节剂的液体。在一个实施方案中，该硫属化物气体是缓冲剂，并溶于包含药学可接受的载体的液体。在一个进一步的实施方案中，液体药物组合物包含如上制备并加入一种赋形剂或赋形剂的组合的硫属化物气体溶液。
本领域技术人员将会意识到，溶于该组合物的气体的量将取决于很多的变量，包括但不限于，气体在液体或溶液中的溶解度，液体或溶液的化学组成，它的温度，它的压力，它的pH，其组合中化学物质的pKA，它的离子强度，以及气体的浓度和气体接触进入溶液的程度(例如，溶解或浸入的速率或持续时间)。胃肠外施用的液体或溶液中，硫属化物或其盐或前体的浓度可以用本领域技术人员已知的方法来确定。通过在制备或制造该液体硫属化物的组合物后不同的时间间隔后测定其浓度来确定硫属化物或其盐或前体的稳定性，其中与起始浓度相比，硫属化物或其盐或前体的浓度降低表明该硫属化物或其盐或前体损失或发生了化学转变。
可替代地，通过包括在可控储藏条件(例如，温度，湿度，光暴露)下，能够确定液体硫属化物药物组合物的稳定性，测定最大量的硫属化合物(或其盐或前体)的化学转变(例如，氧化)产生的化学物质随着时间的变化。
在一些实施方案中，制备液体硫属化物的组合物，是将该硫属化物的盐形式溶于无菌水或盐水(0.9％氯化钠)中，以得到药物可接受的胃肠外施用的制剂(例如，静脉内，动脉内，皮下，肌内，脑池内，腹膜内和真皮内)剂型。在另一个实施方案中，液体药物组合物配制成口服，鼻内(吸入剂或喷雾剂)，含服或局部施用的剂型。可以将胃肠外施用的液体剂型缓冲至一定pH以增强硫属化合物的溶解性或影响硫属化合物的离子状态。在硫化氢或硒化氢的情况中，本领域技术人员已知的很多任意的盐形式都是满足要求的，包括但不限于，钠，钙，钡，锂或钾。在一个实施方案中，将硫化钠或硒化钠溶于无菌磷酸盐缓冲盐水中，并用盐酸将pH调节至7.5-8.5的范围，以得到可以施用于患者的已知浓度的溶液。
在各个实施方案中，在液体或溶液中制备液体硫属化物的组合物，其中在液体或溶液与该硫属化合物接触前已经降低了氧。在一个实施方案中，制备本发明的液体药物组合物的方法还包括在制备和储藏该药物组合物的各个方面限制氧含量。在一个实施方案中，在药物组合物中，所测定的氧的范围是0μM-5μM。在一个实施方案中，在药物组合物中，所测定的氧的范围是0μM-3μM。在一个实施方案中，在药物组合物中，所测定的氧的范围是0.001μM-0.1μM。在一个实施方案中，在药物组合物中，所测定的氧的范围是0.1μM-1μM。
由于某些硫属化合物(例如，硫化氢，硒化氢)由于能够与氧化学反应，所以在氧存在下它们是不稳定的，会导致它们发生氧化和化学变化。因此，可以用本领域的已知方法从液体或溶液中除去氧，包括但不限于，对液体或溶液使用负压(真空除气)，或用导致氧结合或“螯合”的化学试剂与该溶液或液体接触，以有效地从溶液中除去氧。
在一个实施方案中，该液体硫属化物的组合物储藏在不可渗透的容器中。当先前已经从溶液中除去氧以限制或防止该硫属化物或其盐或前体氧化时，这是特别需要的。此外，在不可渗透的容器中储藏将会抑制该液体或溶液中硫属化物气体的氧化产物，使得可以维持溶解的硫属化物的恒定浓度。不可渗透的容器是本领域技术人员已知的，包括但不限于，包含气体不可渗透的构筑材料的“i.v.袋”或密封的玻璃小瓶。为了防止在不漏气的储藏容器中暴露于空气，可以在密封前向该容器中引入惰性或稀有气体，例如氮气或氩气。
在其他相关的实施方案中，将液体药物组合物储藏在耐光或避光的容器或小瓶例如琥珀色小瓶中。优选该组合物包装在小瓶中。优选在惰性大气，例如氮气中填充至小余压，以防止/减缓该组合物的氧化分解，并以一定形式包装以防止光进入，因此防止了该组合物的光化学降解。可以用琥珀色小瓶来最有效地实现这一点。允许溶液储藏在不含氧的环境中的容器系统是公知的，因为很多静脉用溶液都是对氧敏感的。例如，可以使用在填充和密封过程中清除氧的玻璃容器。在另一个实施方案中，可以使用柔软的塑料容器，它们可以附上外包装，以密封防氧。基本上，可以使用任何防止氧与液体药物组合物相互作用的容器(参见：US 6,458,758)。在一个实施方案中，容器包括一种或多种氧清除剂。例如，清除氧的组合物可以在产品的内表面用作涂层或内层，作为支撑或保护工具，发挥屏障的功能来防止氧渗透(参见：US 5,492,742)。
在一个实施方案中，本发明包括一种制备包含溶解于液体溶液中的硫属化物盐的药物组合物的方法。在一个实施方案中，该硫属化物盐是硫化钠。在另一个实施方案中，该硫属化物和盐包括但不限于H₂S，Na₂S，NaHS，K₂S，KHS，Rb₂S，CS₂S，(NH₄)₂S，(NH₄)HS，BeS，MgS，CaS，SrS和BaS。在一个实施方案中，液体是水或磷酸盐缓冲盐水。在一个实施方案中，液体是氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液。
在另一个实施方案中，本发明包括一种制备包含注入到液体中的气体形式的硫属化物、例如、H₂S(硫化氢)的药物组合物的方法。在一个实施方案中，液体是氢氧化钾溶液或a氢氧化钠溶液.
在各个实施方案中，制备本发明的包含硫属化物的液体药物组合物的方法还包括调节该组合物的pH的步骤。在某些实施方案中，pH是通过加入氯化氢，二氧化碳，氮或硫化氢中的一种或多种来调节的。在另一个实施方案中，pH是通过将氮，二氧化碳和/或硫化氢溶入该组合物或其任意组合中来调节的。在一个实施方案中，pH是通过将氮气和二氧化碳的组合或氮气和硫化氢的组合溶入该组合物中来调节的。在某些实施方案中，溶液的pH是通过将硫化氢溶入氢氧化钠或氢氧化钾来调节的。在一个实施方案中，将1当量的硫化氢溶液溶入1当量的氢氧化钠溶液。
此外，本文所述的方法可以还包括加入一种或多种金属螯合剂，自由基清除剂和/或还原剂。在本发明的特别的方法中，在密封容器中制造该液体硫属化物的组合物，该密封容器包含一个管以使该液体硫属化物的组合物有测定pH，加入气体和不与外界大气接触即可分配的进口。在一个实施方案中，该管是具有毛玻璃配件的三颈烧瓶。在一个实施方案中，用氮气或氩气冲洗该管，以使氧含量减小至0.00μM-3μM的范围。在某一实施方案中，经测定管中的氧含量是0.01μM-0.03μM。通过NaOH的起始浓度来确定该液体硫属化物的组合物中硫化物的最终浓度。例如，将NaOH溶液置于含有任意需要的添加剂的三颈烧瓶中，其中所述添加剂是为增强稳定性(DTPA)或平衡同渗浓度(NaCl)。搅拌下，在5psi下用氩气溶解15分钟来给溶液除氧。搅拌下，将硫化氢气体(H₂S)溶于溶液，直至溶液的pH范围是7.6至7.8。在一个实施方案中，可接受的pH范围是7.5至8.0。在正氩气气压下，通过用氩气填充顶部空间至最大以防止氧气进入该溶液来将溶液从烧瓶中转入小瓶或瓶子中。将装入组合物的小瓶或瓶子置于手套箱中，该手套箱用恒定气流的氩气冲洗以使氧的范围减小为0.00μM-0.5μM并且在装入组合物前用氩气冲洗各瓶子或小瓶。所述小瓶和瓶子是由琥珀色玻璃制成的以增强稳定性，并用具有特氟龙/硅垫圈的塑料盖或具有中心特氟龙并夹有硅隔断的塑料盖密封以提供气密密封。在一个实施方案中，小瓶和瓶子是由硼硅玻璃制成的。在一个实施方案中，小瓶和瓶子是由二氧化硅制成的。
C.使用液体药物组合物的方法
本发明的液体药物组合物可以用于治疗或预防各种疾病和障碍，包括已经用气体形式的硫属化物(参见；WO 2005/041655)或液体硫属化物的组合物治疗的任何疾病或障碍。例如，已经在动物模型中用硫化钠治疗来作为心肌梗塞，脓毒症(参见：Hui，等人J Infect(2003)：47：155)，肝硬化中的血管异常(参见：Fiorucci S，等人，Hepatology.(2005)42：539)的潜在治疗方法，作为心脏保护剂(参见：(参见；Geng，等人，Biochem和Biophy Res Com(2004)313：362)，在心肌缺血再灌注损伤中(参见：Johansen等人，Basic ResCardiol(2006)101：53)作为神经保护剂(参见：Qu K.等人，Stroke.(2006)889)，用于减轻血管钙化(参见：Wu等人，ActaPharmacol Sin.(2006)27：299)，用于减轻药物治疗引起的胃损伤(参见：Fiorucci，S.等人，Gastroenterology(2005)129：1210)，用于减少嗜中性粒细胞粘着和调节白细胞介导的炎症(参见：Zanardo等人，FASEB J.(2006)20：2118-2120)，用于治疗勃起机能障碍(参见：Srilatha B.等人，Eur J Pharmacol.(2006)535：280)，应激性肠综合征(Distrutti E.，等人，JPET(2006)319：447)和在炎症后超敏反应中的抗伤害性疼痛作用。治疗性用途的其他例子和相关信息综述于表1中。此外，该组合物可以用于在各种生物体中诱导停滞或前期停滞，也可以用于治疗或预防由缺血或低氧导致的损伤。
术语“生物体”是指任何活的生物体，包括细胞，组织，器官和/或有机体及其任意组合。关注的是，本发明的方法可以在有机体的一部分上实施(例如，在细胞，在组织和/或在一个或多个器官中)，而不论该部分是否保持在有机体内还是从有机体移出，或者本发明的方法可以在整个有机体上实施。此外，在涉及细胞和组织的上下文中关注的是，同质和异质细胞群都可以是本发明的实施方案的受者。术语“体内生物体”是指体内，即仍然在有机体内或与之相连的生物体。此外，术语“生物体”应当理解为与术语“生物体”是同义的。在某些实施方案中，关注的是从有机体分离的一个或多个细胞，组织或器官。术语“分离的”可以用于描述这种生物体。关注的是，本发明的方法可以在体内和/或分离的生物体上实施。
根据本发明的方法治疗的细胞可以是真核的或原核的。在某些实施方案中，细胞是真核。最特别地，在一些实施方案中，细胞是哺乳动物的细胞。哺乳动物的细胞包括但不限于来自人，猴子，小鼠，大鼠，兔，仓鼠，山羊，猪，狗，猫，雪貂，牛，羊或马的那些。此外，本发明的细胞可以是二倍体，但是在一些情况中，细胞是单倍体(性细胞)。此外，细胞可以是多倍体，非整倍体或无核的。细胞可以来自特定的组织或器官，例如心脏，肺，肾，肝，骨髓，胰腺，皮肤，骨，静脉，动脉，角膜，血液，小肠，大肠，脑，脊髓，平滑肌，骨骼肌，卵巢，睾丸，子宫和脐带。在某些实施方案中，细胞可以是特征在于是下列细胞类型之一：血小板，髓细胞，红细胞，淋巴细胞，脂肪细胞，成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，平滑肌细胞，骨骼肌细胞，内分泌细胞，神经胶质细胞，神经元，分泌细胞，屏障功能细胞，收缩细胞，吸收细胞，粘膜细胞，边缘细胞(来自角质层)，茎细胞(全能型，多向型或多能型)，未受精的或受精的卵母细胞，或精子。
术语“组织”和“器官”是根据它们的通常和清楚含义使用的。尽管组织是由细胞组成的，但是应当理解的是，术语“组织”是指形成确定种类的结构物的相似细胞的聚集体。此外，器官是特定类型的组织。在某些实施方案中，组织或器官是“分离的”，是指它不在有机体内。
术语“低氧”和“低氧的”是指氧水平在正常之下的环境。当不把正常生理学水平的氧用于细胞，组织或器官时就会发生低氧。“常氧”是指对于所讨论的特定细胞类型，细胞状态或组织而言氧处于正常的生理学水平。“缺氧”是指没有氧。“低氧条件”是指导致细胞，器官或有机体低氧的那些条件。这些条件取决于细胞类型和组织或器官内细胞的特定组织或位置，以及细胞的代谢情况。对于本发明的目的，低氧条件包括其中氧浓度为或小于正常大气条件，即小于20.8，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1，0.5，0％的条件。可替代地，这些数值可以代表在1个大气压(101.3kPa)的大气百分比。“缺氧”是没有氧。氧浓度为百分之零则定义为缺氧条件。因此，低氧条件包括缺氧条件，尽管在一些实施方案中，使用的是不小于0.5％的低氧条件。本文使用时，“常氧条件”是指氧浓度为约20.8％或更高。
在标准温度和压力(STP)下，暴露于空气的水包含280μM的溶解氧。在某些实施方案中，当用本文所述以及本领域技术人员已知的方法在水中并且水中的氧水平降至低氧条件、即水中的氧降低至280μM以下配制该液体的硫属化物的药物组合物时就产生了“低氧制剂”。
在另一个实施方案中，低氧制剂包括其中氧浓度为在或小于正常大气条件、即小于20.8，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1，0.5，0％的条件；可替代地，这些数值可以代表在1个大气压(101.3kPa)的大气百分比。
达到低氧或缺氧的标准方法是已确定的，包括使用依赖化学催化剂从室中除去氧的环境室。这些室是商业上购自，例如BD DiagnosticSystems(Sparks，MD)as GAS PAK Disposable Hydrogen+CarbonDioxide Envelopes或BIO-BAG环境室。可替代地，可以用非氧的气体例如氮气交换室中的气体来除去氧气。可以例如用FYRITE氧分析器(Bacharach，Pittsburgh PA)测定氧浓度。
在一个实施方案中，术语“有效量”是指可以达到可测定结果的量。在一个实施方案中，“有效量”是指，例如当在可控的2期或3期临床试验中施用于需要医学治疗的人类患者时对预定的临床终点(例如死亡率)产生统计学显著的益处时的量。有效量增强了生物体对疾病或损伤应答的生存性，或者是在生物体内诱导停滞或或前期停滞(pre-stasis)的量。
应当理解的是，当在组织或器官中诱导停滞或前期停滞时，有效量是通过组织或器官的细胞呼吸的集合量确定的组织或器官中诱导停滞或前期停滞的量。因此，例如，如果在暴露于特定量的本发明的液体硫属化物的组合物后心脏(心脏细胞共同)的耗氧水平降低至少约2倍(即50％)，那么应当理解，这个特定量就是在心脏中诱导停滞的有效量。类似地，在有机体中诱导停滞或前期停滞的有效量是提高了停滞或前期停滞的特定参数的共同或集合水平的量。同时应当理解的是，当在有机体中诱导停滞或前期停滞时，有效量是在整个有机体中诱导停滞或前期停滞的量，除非靶向于有机体的特定部分。此外，应当理解的是，有效量是足以诱导停滞或前期停滞的量，或者可以是足以与其他试剂或刺激物例如其他化合物，损伤或疾病状态组合诱导停滞或前期停滞的量。
在某些实施方案中，本发明的的方法和组合物在要治疗的生物体内诱导停滞或前期停滞。本文使用时，“停滞”是指代谢减退的状态，其中生物体是活的，但是特征在于下列中的一种或多种：该生物体的二氧化碳产生速率或量降低至少50％(即2倍)；该生物体的耗氧速率或量降低至少50％；和活动或运动力降低至少10％(仅用于活动的细胞或组织，例如精子或心脏或四肢，或者当在整个有机体内诱导停滞时)(统称为“细胞呼吸指示标志”)。
在本发明的某些实施方案中，关注的是生物体的耗氧速率降低约，至少，至少约，或至多约2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-，9-，10-，15-，20-，25-，30-，35-，40-，45-，50-，60-，70-，80-，90-，100-，150-，200-，250-，300-，350-，400-，450-，500-，600-，700-，800-，900-，1000-，2000-，3000-，4000-，5000-，或10000-倍或更多，或由其可推导出的任意范围。可替代地，关注的是本发明的实施方案可以在生物体的耗氧速率的降低约，至少，至少约，或至多约50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％或更多，或由其可推导出的任意范围。
可以使用任何测定方法来测定耗氧，典型的测定方法包括使用封闭的环境并测定置于该环境中的氧和在该环境中一段时间后的氧之间的差值。此外，关注的是可以测定二氧化碳产生来确定生物体的耗氧量。因此，二氧化碳产生的减少对应的是耗氧量的减少。
本文使用时，“前期停滞”是指在生物体必须转变为达到停滞过程中的代谢减退状态。前期停滞的特征在于生物体内代谢的数值降低，但这种降低小于停滞的定义。为了用有效的化合物达到停滞，必要时生物体必须通过其中生物体中耗氧和CO₂产生减少小于50％的渐进的代谢减退状态来转变。这种其中代谢或细胞呼吸降低程度小于50％的连续区域即称为“前期停滞”的状态。
此外，在各个实施方案中，前期停滞的特征在于与正常的生理条件相比，代谢活动的一个或多个指示标志降低程度小于或等于1％，2％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，或50％。在其他实施方案中，前期停滞是的特征在于其增强或促进对其他刺激物的应答而进入停滞的能力，或者其增强生物体受损伤、疾病的发生或发展、或出血，特别是可以导致不可逆的组织损害、出血性休克或致死的出血而导致的损害的存活力或保护其免于上述损害。尽管在本文中示例性明确举出的本发明的方法是指诱导“停滞”，应当理解的是，这些方法也很容易适合诱导“前期停滞”，诱导前期停滞的这些方法也是本发明所关注的。此外，通过将它们以比诱导停滞更低的剂量和/或更短的时间来提供给生物体，这些与用于诱导停滞相同的方法和组合物也可以用于诱导前期停滞。
一般地，根据本发明的方法，停滞或前期停滞是暂时性的和/或可逆的，这就是说生物体在一段时间以后会不再显示停滞的特点，这种治疗对于生物体是没有毒性的，不会使它死亡或分解。
根据本发明的方法的各种实施方案，诱导停滞(stasis)或前期停滞，包括用直接诱导生物体本身停滞的一定量的本发明的液体硫属化物的组合物来治疗该生物体；或者可替代地，用一定量的本发明的液体硫属化物的组合物来治疗生物体，所述量不会诱导其本身停滞或前期停滞，但是会促进或增强生物体对其他刺激物，例如但不限于，损伤、疾病、低氧、过度出血的应答而达到停滞的能力，或者减少生物体产生所述应答所需的时间；或者用一种或多种如本文所述的有效化合物来治疗。
在某些实施方案中，本发明的液体药物组合物是用于治疗或预防对面临缺血性或低氧性情况的生物体的损伤。在一个实施方案中，这些方法用于治疗已经经受，正经受损伤、创伤或危重护理治疗的患者，或对损伤、创伤或危重护理治疗易感的患者。损伤可以是由外部损伤，例如烧伤，伤口，切断术，枪弹伤或手术创伤，腹部手术，前列腺手术导致的，或者可以是由内部创伤例如感染性休克，中风或心跳停止，导致循环急剧减少的心脏病发作，或由于非侵入性应激例如暴露于寒冷或辐射而导致的循环减少导致的。在细胞水平上，损伤经常导致细胞，组织和/或器官面临低氧，因此会诱导程序性细胞死亡，或“细胞凋亡”。
因此，本发明关注的是用有效量的本发明的液体硫属化物的组合物与组织，器官，四肢或甚至整个有机体接触，作为保护它们免于损伤的有害作用的方法，在一个具体的方案中，当难以得到医学关注时，这可以为患者“买来时间”，直到它们接受适当的医学关注。本发明也关注通过预防/延迟可以导致伤口愈合和组织再生延迟的生物学过程来诱导组织再生和伤口痊愈的方法。在本文中，在其中四肢或有机体有很大的伤口的方案中，将该生物体与液体硫属化物的组合物接触有助于通过作用于抑制愈合和再生的生物学过程来促进伤口愈合和组织再生过程。除了伤口愈合，本发明的方法可以用于预防或治疗创伤，例如心跳停止或中风以及出血性休克。本发明的重要性在于防止急救手术操作例如胸廓切开术，剖腹术和脾脏处理或心脏手术，动脉瘤，外科手术，脑手术等等中的创伤危险。
在某些实施方案中，本发明的方法可以用于增强由心跳停止或中风导致的缺血性损伤的存活性并对其进行预防。因此，在一个实施方案中，本发明包括在患或有心跳停止或中风危险的患者中增强存活性或减轻缺血性损伤的方法，包括在心肌梗塞，心跳停止或中风之前，之后或者之前和之后给予该患者有效量的液体硫属化物的组合物。
本文使用的术语“疾病的治疗”是指对已经患有疾病、病症或障碍的患者的治疗和护理。治疗的目的是减小疾病、病症或障碍的有害作用。治疗包括施用有效的化合物以消除或控制疾病、病症或障碍，以及缓解与疾病、病症或障碍有关的症状或并发症。
在某些实施方案中，本发明的方法包括在缺血性或低氧性损伤或疾病损伤前预治疗生物体例如，患者。当事先计划或选择会发生或者事先预计可能发生导致缺血或低氧损伤或疾病时，可以使用这些方法。例子包括但不限于，与失血可以同时发生的大手术或是操作结果，其中危害血氧产生或其中血液的血管递送减少(如在冠状动脉旁路移植(CABG)手术的背景下)的心肺分流术，或在移出供体器官以用于需要器官移植的受者前处理器官供体中。例子包括但不限于，其中损伤或疾病发展是固有的医疗条件(例如，在不稳定心绞痛，血管成形术后，出血性动脉瘤，出血性中风，较大的创伤或失血后的背景下)，或其中使用医学诊断试验可以诊断出危险的医疗条件。
此外，本发明的其他实施方案关注的是增强存活性和预防失血或其他缺少氧产生例如缺少适当的供血而对细胞或组织的不可逆的组织损害。这可以是例如，急性失血，或者可以是由于导致向细胞或组织中的血流阻断的病症或疾病，降低局部或有机体整体的血压的病症或疾病，减少血中载氧量的病症或疾病，或者减少血中载氧细胞数的病症或疾病。所涉及的病症或疾病包括但不限于，血凝块和栓塞，囊肿，生长，肿瘤，贫血(包括镰状细胞性贫血)，血友病，其他凝血性疾病(例如，von Willebrand，或ITP)和动脉粥样硬化。这些病症或疾病也包括由于损伤，疾病或病症而对有机体的细胞或组织产生严重的低氧或缺氧条件的那些。
在一个实施方案中，本发明提供增强患出血性休克的生物体的存活性并预防所述生物体的损伤或损害的方法，包括将有出血性休克危险或处于出血性休克状态的生物体与有效量的液体硫属化物的组合物在损害的一小时内尽快就实际上并理想地接触。该方法允许要移植的患者处于可控的环境(例如，手术)，其中可以寻找损伤的最初原因，然后以可控方式使患者恢复正常功能。对于这种适应症，损伤后的第一小时，也称作“黄金一小时”对于得到成功的结果是决定性的。
在各种其他的实施方案中，本发明的方法可以用于治疗与缺血或低氧有关的神经变性疾病，治疗体温过低，治疗增殖过度性障碍和治疗免疫障碍。在各种其他的实施方案中，生物学病症是下列的任意一种或组合：神经学疾病，心血管疾病，代谢性疾病，感染性疾病，肺病，遗传性疾病，自身免疫性疾病和免疫相关性疾病。
在某些实施方案中，本发明的方法可以用于增强发生低氧或缺血性病症的离体生物体包括例如分离的细胞，组织和器官的存活性。这些离体生物体的具体例子包括血小板和其他血液制品，以及要移植的组织和器官。
在一个实施方案中，本发明方法可以在实验室或研究的背景下用于增强生物体的存活性，，例如当细胞株或实验室有机体被有目的地用于低氧或缺血条件，例如在深低温保藏和储藏期间。例如可以在本发明的液体硫属化物的组合物存在下储藏或运输细胞，组织或器官。本发明的方法可以用于增强供体组织和器官的存活性，因此在供体组织必须移植到受者和恢复血流前延长了时间。这些方法可以与现有的保存方法联合，所述保存方法包括使用其他保存剂和氧灌注。本发明提供增强血小板的存活性的方法，包括，在具体的实施方案中，将血小板储藏在缺氧环境中，包括在储藏期间将血小板与有效量的液体硫属化物的组合物接触。
本发明提供保存非存活生物体以及保存或延长非生物体的储藏期限的方法和组合物。这些方法包括将非存活生物体或非生物体与液体硫属化物的组合物接触。
在某些实施方案中，提供给生物体的量或有效的化合物可以是约，至少，至少约，或至多约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，441，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670，680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860，870，880，890，900，910，920，930，940，950，960，970，980，990，1000mg，mg/kg，或mg/m²，或其可推导出的任意范围。
可替代地，量可以表述为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，441，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670，680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860，870，880，890，900，910，920，930，940，950，960，970，980，990，1000mM或M，或其可推导出的任意范围。
在本发明的各种实施方案中，生物体暴露于本发明的液体药物组合物约，至少，至少约，或至多约30秒，1，2，3，4，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55分钟，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24小时，1，2，3，4，5，6，7天或更长，以及其任意范围或组合。
此外，当静脉施用时，关注的是可以使用下列参数。流速是约，至少约，或至多约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100gtts/分钟或μgtts/分钟，或其可推导出的任意范围。在一些实施方案中，溶液的量是按体积计的，这取决于液体硫属化物的组合物的浓度。量的时间可以是约，至少约，或至多约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60分钟，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24小时，1，2，3，4，5，6，7天，1，2，3，4，5周和/或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12个月，或其可推导出的任意范围。
可以总共或在一个时间施用的体积为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，441，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670，680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860，870，880，890，900，910，920，930，940，950，960，970，980，990，1000mls或升，或其任意范围。
将所有上述的美国专利，美国专利申请公开，美国专利申请，外国专利，外国专利申请和在本说明书中提及和/或在申请数据表中所列的非专利文献都以其整体通过参考引入本文。
实施例1
液体药物组合物I-IV的方法和制备
如下所述制备四种液体的硫属化物的药物组合物。
用去氧的水制备母液。通过真空除去气体并用压缩氮气(99.99％)溶解30分钟来给水去氧。由用无氧蒸馏的去离子水冲洗的Na₂S*9H₂O晶体(Fisher #5425)来制备2.5M Na₂S的饱和母液。该母液密封储藏并避光。通过稀释浓酸(Fisher # A144-212)并通过用压缩氮气溶解去氧来制备HCl的220mM母液。
在充满氮气而得到无氧环境的基础手套箱的通风橱中制备液体药物组合物。手套箱中是具有pH计，起泡器和搅拌器的反应器。用灵敏度水平为0.03μM的测氧计(Mettler-Toledo)来检测手套箱中的氧水平。制备本发明的液体药物组合物的方法包括在该药物组合物的制备和储藏的各个方面限制氧含量，其中在该药物组合物中所测定的氧的范围是0μM-5μM。
在每个开口配备有毛玻璃配件的三颈烧瓶(Wilmad Labs)中制备液体药物组合物，具有下列特征：
a)具有塑料盖的通用接头(adapter)，该塑料盖具有中心孔和O型环。该接头配有pH探针并用O型环密封。
b)具有软管连接器和塑料盖的通用接头，该塑料盖具有中心孔和O型环。该接头配有具有玻璃料的气体分散管。该分散管与压缩气体筒相连，用于通过用压缩氮气溶解来给溶液去氧，并用H₂S和氮气的混合物中和pH。软管连接器配有塑料管，以使压力释放。这两个连接反转则能在正氮气压下分配烧瓶中的内容物。
c)用毛玻璃塞密封第三个颈，用于向烧瓶中加入Na₂S溶液或水。
1.液体药物组合物I-九水合Na₂S
用下列步骤制备液体药物组合物I：
a)向三颈烧瓶中加入无氧蒸馏的去离子水，并通过搅拌下用氮气溶解30分钟来去氧。
b)加入2.5M Na₂S母液以得到200mM Na₂S溶液。
c)搅拌下，用压缩氮气使该200mM Na₂S溶液起泡15分钟。
d)在用压缩氮气溶解和搅拌的同时，加入220mM HCl直至最终pH为7.8-8.0。
e)加入去氧去离子水，得到最终浓度为100mM的Na₂S。
2.液体药物组合物II-九水合Na₂S
用下列步骤制备液体药物组合物II：
a)向三颈烧瓶中加入无氧的去离子水，并通过搅拌下用氮气溶解30分钟来去氧。
b)加入2.5M Na₂S母液以得到100mM Na₂S溶液。
c)搅拌下，用压缩氮气使该100mM Na₂S溶液起泡15分钟。
d)用压缩氮气和CO₂(99.9％)的50/50混合物使该溶液起泡，直至达到pH7.8。
3.液体药物组合物III-含有H₂S和氮气的Na₂S
用下列步骤制备液体药物组合物III：
a)向三颈烧瓶中加入无氧的去离子水，并通过搅拌下用氮气溶解30分钟来去氧。
b)加入2.5M Na₂S母液以得到100mM Na₂S溶液。
c)搅拌下，用压缩氮气使该100mM Na₂S溶液起泡15分钟。
d)用压缩氮气和H₂S的50/50混合物使该溶液起泡，直至达到pH8.2。这产生了最终浓度为90mM的硫化物。
4.液体药物组合物IV-H2S
通过NaOH的初始浓度来确定液体药物组合物IV中硫化物的最终浓度。用下列步骤制备液体药物组合物IV：
a)向含有添加剂(DTPA，抗氧化剂)的三颈烧瓶中加入范围为5mM至500mM的NaOH溶液(附图1)。
b)搅拌下，在5psi下，通过用氩气起泡15分钟来给溶液去氧。
c)搅拌下，H₂S起泡通过该溶液直至pH降低至7.7(或范围为7.6至7.8)。
d)用氩气冲洗该烧瓶的顶部空间。
e)将琥珀色投药瓶或小瓶置于用恒定氩气流冲洗的手套箱中，用氩气冲洗各个瓶或小瓶。
f)在氩气维持无氧的环境下，分配该制剂。
通过测定硫化物的浓度，pH和吸收光谱(多硫化物形成)来监测溶液的稳定性。进行其他分析以监测包括亚硫酸盐，硫酸盐，硫代硫酸盐和元素硫的氧化产物。
在正氮气压下，液体药物组合物由三颈烧瓶分配于密封的手套箱内。在惰性大气氩气或氮气下，将琥珀色小瓶或琥珀色玻璃瓶填充至小余压以防止/减缓液体药物组合物的氧化分解，并使用锯齿状盖卷边器(Aldrich Z112976)，用具有特氟龙/硅垫圈的塑料盖或具有中心特氟龙并夹有硅隔断的塑料盖密封以提供气密密封。
实施例2
在无氧环境中制备的液体的硫属化物的药物组合物，含有稳定的硫化物和较少的硫化物的氧化产物
硫化物氧化，产生了各种的氧化产物，包括如附图1和2所述的那些。(参见：Chen等人，Environ.Sci.Technol.(1972)，p.529-537；Kotronarou等人，Environ.Sci.Technol.(1992)，p.2420-2428；Beaucham等人，Critical Reviews in Toxicology(1984)；p.25-97)。
在充满氮气以得到无氧环境的基础手套箱的通风橱中制备液体药物组合物IV的三种制剂，测定这些制剂的稳定性。在该研究中，用灵敏度水平为0.03μM的测氧计(Mettler-Toledo)来监测手套箱中的氧水平。如实施例1所述制备该液体药物组合物。
制备液体药物组合物IV的三种制剂，包括：(1)97mM，pH7.62，273mOsm；(2)98mM，pH7.71，291mOsm；和(3)98mM，pH7.75，276mOsm。测定组合物以确定在无氧环境中制备是否会增强硫化物的稳定性并减少可检测的氧化产物。在用氮气冲洗以使箱中的氧含量最低(0.02μM)的密封手套箱中的反应器装置中制备液体药物组合物。在129天的时间里测定胃肠外施用的液体药物组合物的硫化物水平和氧化产物(多硫化物，亚硫酸盐，硫代硫酸盐，硫酸盐和未知的峰)。
通过离子选择电化学(ISE)来测定硫化物。离子选择电化学(ISE)是一种测定离子种类的技术。电极包含对离子种类具有特异性的膜，在此处离子与膜的表面结合。与膜结合的离子的量确定了潜在的差异，这种差异取决于溶液中离子的浓度。在测定时间里，硫化物的水平保持在对照物的100％水平(附图3)。
用离子色谱法(IC)分析亚硫酸盐，硫代硫酸盐和硫酸盐，并在第0，8，22，30，37，51，72，100和129天测定。离子色谱法(IC)用于分析离子种类和测定双相系统中样品组分的差速迁移。与固定相相互作用较小的样品组分在柱中花费的时间较小。离子从注入到检测为止在柱中花费的时间称作保留时间，是组分同一性的检定，而峰高或面积是组分浓度的测定。在该测定中硫酸盐的检测上限<0.08％，认为可能的硫酸盐值的范围为0％-<0.08％。相对于蒸馏水，在370nM下在Spectramax中测定多硫化物(参见：Weiss，J.和Weiss T.Handbook of Ion Chromatography；Wiley，Third Edition(2005)；O′Brien D.J.等人，Environ.Sci.Technol.1977，p.1114-1120；Hoffmann M.R.，等人，Environ.Sci.Technol.1979，p.1406-1414；Tossell，J.A，Chemical Geology.1997，p.93-103；Chen，K.Environ.Sci.Technol.1972，p.529-537；Kotronarou A.等人，Environ.Sci.Technol.1992，p.2420-2428)。所检测的氧化产物的量如附图5A所述。
实施例3
通过在DTPA存在或不存在下多硫化物的形成来测定液体药物组合物IV的稳定性
检验合成型螯合剂增强硫化物的液体药物组合物的稳定性的能力。在充满氮气以得到无氧环境的基础手套箱的通风橱中制备两种液体药物组合物(液体药物组合物IV)。在包含三颈烧瓶的密封容器中制备该液体硫属化物的组合物，其中所述三颈烧瓶具有毛玻璃配件(管)以便为液体硫属化物的组合物的pH测定、加入气体提供进口和可以不接触外界大气即可分配的口。用氮气或氩气冲洗该管，以使氧含量最低。在这些药物组合物中，通过NaOH的初始浓度确定硫化物的最终浓度。
将NaOH溶液置于不含任何添加剂或含有DTPA以增强稳定性的三颈烧瓶中。这两种制剂都包含NaCl以平衡同渗浓度，搅拌下通过在5psi下用氩气溶解15分钟来给溶液去氧。用灵敏度水平为0.03μM的测氧计(Mettler-Toledo)来检测手套箱中的氧水平。用或不用合成型螯合剂，二乙三胺五乙酸(DTPA)(1mM)来制备硫化物H₂S 97mM的受试液体药物组合物(液体药物组合物IV)。在第0，8，22，30，37，51，72，100和129天用分光光度计(Spectromax)在峰吸收度370nm处测定硫化物和多硫化物水平。如附图4所示，第129天时1mM DTPA的存在增强了制剂中硫化物的稳定性。
在第129天时，测定氧化产物亚硫酸盐(uM)，硫酸盐(uM)，硫代硫酸盐(uM)和在37min(U)处测到的未知产物。如附图5A和5B所示，1mM DTPA的存在导致在第129天时氧化产物的水平降低。在129天结束时，测定到所形成的多硫化物小于硫化物总浓度的0.03％。
实施例4
在硫化物的液体药物组合物中pH是稳定的
硫化氢是弱的二元酸，在溶液中以三种形式存在(H₂S，HS-和S₂-)。在溶液中为硫的比例取决于pH。在pH7时，HS-是主要的种类。在pH小于7时，则H₂S是主要的种类(参见：O′Brien D.J.等人，Environ.Sci.Technol.1977，p.1114-1120)。
为了测定液体药物组合物IV中硫化物的药学稳定性，在129天内的特定时间点测定pH。在用氮气冲洗以降低箱中氧含量(在小于0.02μM下测定)的密封手套箱的反应装置中制备硫化物100mM H₂S的液体药物组合物(液体药物组合物IV)。用pH计(Thermo Electron Corp.)在第0，8，22，30，37，51，72，100和129天测定pH。在129天的时间里pH都是稳定的，平均值为7.68±0.04(平均值±标准差)(附图6)。
制备硫化钠的液体药物组合物，在各种商业可接受的温度和持续时间下储藏后，其在包括浓度，pH和同渗浓度的方面都满足优质生产规范(GMP)的可接受标准。
实施例5
在施用液体药物组合物IV后，检测大鼠尿中的硫化物和氧化产物
在啮齿类动物中测定尿中硫化物的氧化产物的代谢性质。在IV快速推注液体药物组合物IV(98mM的硫化物，pH7.65，293m/Osmol)后，在大鼠尿中测定氧化产物硫代硫酸盐和硫酸盐的水平。
将200-250克重的10-11周大的雌性Sprague Dawley大鼠(Taconic，Prunedale，CA)麻醉(100mg/kg氯胺酮和10mg/kg噻拉嗪)，植入两个颈静脉导管(JVC)和尿道插管。在实验期间维持麻醉。通过颈静脉导管注射快速推注剂量的液体药物组合物IV(0.5mg/kg)。在实验期间，用输注泵(Harvard Apparatus)以3mL/小时的速率输注磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在注射前(时间＝0)和在施用后在长达60分钟的时间里以15分钟的间隔收集尿样，并在4℃下储藏以用于分析。
通过离子色谱法(Metrohm AG 861 IC，具有Metrosep A supp 5column)测定尿中硫代硫酸盐和硫酸盐的水平。在IC洗脱液(3.2mM碳酸钠/1.0mM碳酸氢钠)中以1:20稀释尿样。在60分钟结束时，所排泄出的硫代硫酸盐水平升高至300μM(附图7A)。在60分钟里，排泄的硫酸盐的水平平均是22±3mM(附图7B)。这些数据表明，硫化物的氧化产物硫代硫酸盐和硫酸盐在尿中排泄，并可以通过离子色谱法检测。
实施例6
在施用液体药物组合物IV后大鼠血液中硫化物和和硫代硫酸盐的检测
在IV快速推注液体药物组合物IV后，用衍生物化法和GC-MS分析来测定大鼠血液中硫化物和硫代硫酸盐的水平。
使用三只(326-350)克重的10-11周大的雄性Sprague Dawley大鼠(Taconic，Prunedale，CA)，其具有颈静脉导管(JVC)和颈动脉插管(CAC)。在开始实验操作前，将动物在温度和湿度可控的环境中恢复和适应5-6天。随意提供食物和水。
通过颈动脉插管将各只大鼠的基线血样(～0.3ml)收集到配有23g路厄(Luer)短管接头的涂有肝素的1ml注射器中。在取样后，通过颈动脉插管将相应体积的盐水缓慢注射到动物中，然后注射100μ1的肝素溶液(肝素化的右旋糖50IU/ml)。通过颈静脉导管注射快速推注剂量的液体药物组合物IV(1mg/kg i.v.)(98mM sulfide，pH7.65，293mOsm)。在给药后，立即用配有23g Luer短管接头的涂有肝素的1ml注射器通过颈动脉插管收集血液(～0.3ml)。如所述立即处理血样。在取样后，通过颈动脉插管将相应体积的盐水缓慢注射到动物中。在注射后10分钟，30分钟，60分钟，2小时和4小时重复取血样。
用注射器抽取0.2ml的大鼠血液，立即加至9ml的琥珀色小瓶中，该瓶包含：5％ NaCI溶液，200mM抗坏血酸溶液(新鲜制备的)，20mM五氟苄溴(PFBBr)的丙酮溶液。用螺丝帽(具有夹有PTFE的间隔)密封该制剂，并起漩涡1分钟。然后将该混合物培养15分钟，然后向各管中加入用四硼酸钠饱和的5mM四癸基二甲基苄铵氯的无氧水溶液，25mM碘的乙酸乙酯溶液，50mM五氟苄溴的乙酸乙酯溶液。将制剂起漩涡30分钟，然后培养5分钟。然后加入100mg磷酸二氢钾，然后溶液起漩涡30秒。然后将该溶液培养1小时以完成反应，然后以2500rpm离心分离15分钟。除去上清液(有机相)并干燥，以用于GC/MS分析(Kage，等人，Journal of Forensic Science(1988)33：217；Kage等人，Journal of Analytical Toxicology(1991)15：148)。
这些结果表明，当使用PFB-Br的衍生化方法时，可以从i.v.注射的快速推注剂量的液体药物组合物IV的大鼠的血液中可以同时检测到硫化物和硫代硫酸盐(附图8A和8B)。在240分钟的研究时间里，血液中的硫化物水平恢复，C_max出现在第10分钟(附图8B)。
实施例7
液体药物组合物增强低氧条件下的存活力
用气体H₂S治疗已经显示出可以增强动物在低氧条件下的存活能力。但是，在某些情况下，例如当在远距离的位置发生会立即致命的损伤时，用液体的硫属化物的药物组合物治疗患者是特别有利的。如实施例I所述制备液体的硫化物的组合物，并测定它们在低氧环境下增强动物存活力的能力。
在实验开始时，在插入颈静脉导管(JVC)的雄性C57BL/6的5-6周大的小鼠(Taconic)中测定三种不同的液体药物组合物，包括用1mL或5mL Luer-Lok注射器(Becton Dickison)给动物输注液体的硫化物的药物组合物。使用来自Bio Medic Data Systems(BMDS)的IPTT-300脉冲转发器来监测体温。在实验前至少24小时将脉冲转发器皮下注入(S.C.)到动物的背部。BMDS的DAS-6008数据采集模块通过该转发器来记录体温，并将数据输入到电脑表格程序中，相对于时间绘图。
使用输注泵(Harvard Apparatus)，通过留置导管将液体药物组合物给药于各只小鼠。给小鼠输注，直至皮肤中植入的温度片记录的体温为33℃。如果小鼠在体温降至33℃前显示出痛苦的迹象，则停止输注10分钟，并以低于先前速率的速率重新开始。当动物的温度降至33℃或更低时，停止输注并将小鼠转移至低氧大气(4.0％ O₂)。
在第一个实验中，用液体Na₂S溶液，pH7.75(液体药物组合物I)给小鼠(ID：MJVC07)输注。在该实施例中，制备液体药物组合物I，包括在去离子去氧的水中将Na₂S的饱和母液稀释至浓度为43M，在三颈烧瓶中，在搅拌30分钟下用100％ N₂溶解来给溶液去氧，该烧瓶具有毛玻璃配件以允许进行pH检测和与空气接触最小的条件下加入气体。在用N₂溶解和搅拌的同时，用220mM HCl将溶液的pH调节至7.75。氩气下，用最小的顶部空间将最终的溶液(液体药物组合物I)分配到琥珀色小瓶中，并用作用特氟龙/硅衬垫或间隔的帽密封。制备用于制备液体药物组合物I的Na₂S的饱和母液包括用每1毫升的去离子去氧的水溶解约1.0g的洗涤过的Na₂S晶体，将该母液密封避光储藏。
在60分钟的时间里，以6.4μL/分钟的输注速率将有效剂量的0.8mM/kg H₂S的液体药物组合物I输注于小鼠，直至皮肤中植入的温度片记录的体温为33℃(附图9)。然后停止输注并在1分钟内将小鼠置于低氧大气(4.0％ O₂)中。在1小时结束时，从低氧室中移出小鼠，置于笼中并检测。小鼠对于预治疗没有显示出痛苦的迹象。相反，用对照载体治疗的小鼠却死亡了(附图10)。
在第二个实验中，用Na₂S，pH8.2(液体药物组合物II)给小鼠(ID：MCAT08)输注。制备液体药物组合物II，包括在去离子去氧的水中将Na₂S的饱和母液稀释至浓度为41mM，在具有毛玻璃配件的三颈烧瓶中，在搅拌30分钟下用100％ N₂溶解来给溶液去氧。加入NaCl以将溶液的最终同渗浓度调节至300mOsmol/L。通过将N₂和CO₂的50/50混合物溶解来调节pH。用最小的顶部空间将最终的溶液(液体药物组合物II)以暴露于空气最少分配到琥珀色小瓶中，并用使用特氟龙/硅衬垫或间隔的帽密封。
在62分钟的时间里，以8μL/分钟的初始输注速率给小鼠输注。在输注30分钟后，由于观测到痛苦的迹象，将输注减小至4μL/分钟。在以4μL/分钟输注12分钟后，将输注速率提升至6μL/分钟，直至体温降至33℃。然后停止输注并在5分钟内将小鼠置于低氧大气(4.0％O₂)中。在60分钟内，小鼠在低氧大气中存活下来。
在第三个实验中，用Na₂S(用H₂S和氮气缓冲)，液体药物组合物III，pH8.35给小鼠(ID：MJVC03)输注。在该实施例中，制备液体药物组合物III，包括将Na₂S的饱和母液稀释至浓度为65mM，在具有毛玻璃配件的三颈烧瓶中，搅拌30分钟下用100％ N₂溶解来给稀释的溶液去氧，通过用N₂和H₂S的50/50混合物溶解来调节pH。用最小的顶部空间将最终的溶液(液体药物组合物III)以暴露于空气最少分配到琥珀色小瓶中，并用使用特氟龙/硅衬垫或间隔的帽密封。
在60分钟的时间里，以4.3μL/分钟的输注速率给小鼠输注Na₂S(用H₂S和氮气缓冲)，液体药物组合物III。当体温降至33℃时，停止输注并在1分钟内将小鼠置于低氧大气(4.0％ O₂)中。小鼠在4.0％的低氧下存活了53分钟。
与用液体H₂S治疗小鼠时获得的结果相对，用载体输注(10μL/分钟)的对照(首次试验的)雄性C57BL/6小鼠(平均重22g)在4.0％ O₂下仅平均存活了7分钟，平均体温下降仅0.06±0.38℃。
在另一个实验中，在对于任何实验化合物都是首次使用的插入导管的雄性Sprague Dawley大鼠(RJVC40)(310克，Taconic)中，测定了液体药物组合物(50mM H₂S)(液体药物组合物IV)，pH7.9的保护作用。动物通过手术植入了内部血管导管，并在任意操作前检查应激和疾病的迹象。在操作前给动物称重，在笼子的卡片上标出重量。使用来自Bio Medic Data Systems(BMDS)的IPTT-300脉冲转发器来监测体温。在实验前至少24小时将脉冲转发器皮下注入(S.C.)到动物的背部。BMDS的DAS-6008数据采集模块通过该转发器来记录体温，并将数据输入到电脑表格程序中，相对于时间绘图。
使用输注泵(Harvard Apparatus)，通过留置导管将50mM H₂S(液体药物组合物IV)，pH7.9，283分钟的时间里输注于大鼠，同时监测痛苦的迹象并通过皮下植入的IPTT-300转发器测定体温的降低。起始输注速率是6.5μL/分钟，每15分钟将速率提高6.5μL/分钟，直至皮肤中植入的温度片记录的体温为33℃。当小鼠显示出痛苦的迹象时，则停止输注10分钟，并以比先前速率低的13.0μL/分钟的速率重新开始。当动物的温度降至33℃时，停止输注并在8分钟内将小鼠转移至低氧大气(3.5％ O₂)中。动物存活了32分钟。在低氧室中测定，检测的体温降低了2.5℃。
对照组的4只(首次用于实验的)雄性SD大鼠(平均体重342克；Harlan)在3.5％ O₂下平均存活了15±4分钟，体温平均降低了1.6±0.2℃。
这些实验证实了硫化氢的液体药物组合物对于动物具有保护作用，增强了他们在低氧条件下存活的能力。该结果还证实了，施用H₂S的液体药物组合物对于患或有患例如损伤或疾病诱导的低氧或缺血性病症的危险的患者是有益的，为生物体提供了一种免于和防止低氧或缺血性损伤的方法。
实施例8
在鼠肝缺血-再灌注损伤模型中，硫化物的液体药物组合物为肝损伤提供了细胞保护益处
在小鼠的肝缺血-再灌注(I/R)损伤模型中，测定硫化物的液体药物组合物提供细胞保护益处的能力。在该研究中，证明了在肝缺血后和5小时再灌注之前立即腹膜内快速推注的液体药物组合物IV(硫化物，95mM，pH7.92)降低了血清中所测定的肝转氨酶天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)，改善了组织病理学得分。相反，用载体治疗不会在肝I/R损伤中提供益处。
在这些研究中使用的小鼠是8-10周大的C57-BL6/J小鼠(JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine)。随意提供食物和水。在开始实验操作前，让受试动物在温度和湿度可控的环境中适应。
用氯胺酮和噻拉嗪麻醉小鼠，并在手术操作以诱导肝缺血-再灌注(I/R)损伤期间维持温暖。具体地，进行中间切口以暴露肝，注射肝素以防止血凝。用小动脉瘤夹夹紧肝动脉和门静脉以得到缺血肝的左侧叶和中叶。缺血持续45分钟，将肝维持在其原位的腹膜腔中，并用0.9％正常盐水浸湿的纱布保持湿润。对照小鼠接受假手术，尽管用小动脉瘤夹不会减少肝血流。在45分钟结束时，移除小动脉瘤夹。在肝再灌注5小时后，用分光光度法和商业可用的试剂(Sigma-Aldrich)测定肝血清转氨酶水平(AST或ALT)。
将鼠肝缺血-再灌注损伤的受试动物随机分为4组。第1组：载体治疗的；第2组：用0.3mg/kg的液体药物组合物IV治疗；第3组：用1.0mg/kg的液体药物组合物IV治疗和第4组：用3.0mg/kg的液体药物组合物IV治疗。如附图11所示，在最高受试浓度(3.0mg/kg)下AST水平达到了统计学显著地降低。与载体相比，在三个治疗组(0.3mg/kg，1.0mg/kg和3.0mg/kg)中ALT水平降低。
实施例9
在鼠心肌缺血再灌注模型中硫化物的液体药物组合物提供了心脏保护益处
在心肌缺血再灌注(I/R)损伤模型中，测定硫化物的液体药物组合物提供心脏保护益处的能力。在该研究中，证明了在缺血后和24小时再灌注前5分钟向左心室腔内快速推注液体药物组合物IV(95mM，pH7.65)减轻了心肌缺血并减小了心肌梗塞面积占危险区的百分比。在相关的研究中，在开始研究前24小时施用预处理的快速推注剂量的液体药物组合物IV显著减小了心肌梗塞面积(占危险区的百分比)(心肌梗塞)(附图16)。相反，用载体治疗不会在心肌I/R损伤中提供任何保护益处。
在这些研究中使用的小鼠是8-10周大的C57-BL6/J小鼠(JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine)。随意提供食物和水。在开始实验操作前，让受试动物在温度和湿度可控的环境中适应。
用氯胺酮和戊巴比妥钠麻醉小鼠，并在手术操作以诱导心肌缺血-再灌注(I/R)损伤期间维持温暖。将小鼠置于手术板前侧，口腔插管并与Model 683啮齿动物通风机(潮气量：2.2mLs，呼吸率：每分钟呼吸122次，经通风机侧口补充100％氧。)(Harvard Apparatus)相连。打开胸腔，暴露邻近的冠状动脉左总干并结扎。维持心肌和冠状动脉闭塞30分钟，然后除去缝线并再灌注24小时。
在再灌注24小时后，缺血后，麻醉小鼠，插管并与啮齿动物通风机相连。将依文思蓝染料注入到穿入总颈动脉的导管中。进行正中胸骨切开术，并在前述的相同位置再结扎冠状动脉左总干。用依文思蓝使从非缺血区分离的缺血区显像，快速切除心脏，并沿短轴连续切片成5个1mm的切片，将其在37℃下在1.0％氯化2，3，5-三苯基四唑(Sigma-Aldrich)培养5分钟以分离危险区内的存活和不存活的心肌。将5个心肌切片(1-mm)分别称重，用计算机辅助的面积法评价梗塞面积，危险区(AAR)和未缺血的左心室，观察者不知道样品的同一性。所有左心室危险区(AAR)和梗塞面积确定的操作(参见：Jones，S.P.等人Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.(2004))。286：H276-H282)。
用StatView软件5.0版(SAS Institute)，通过使用post-hocBonferroni测定的双向ANOVA来分析数据。数据表示为平均值±SEM。p值小于0.05则认为是显著的。
将10-13只动物的鼠心肌缺血-再灌注损伤的受试动物组随机分为4个治疗组。第1组：载体治疗的；第2组：用50μg/kg的液体药物组合物IV治疗；第3组：用100μg/kg的液体药物组合物IV治疗和第4组：用500μg/kg的液体药物组合物IV治疗。在该研究中，在施用剂量为50μg/kg和100μg/kg的治疗组中，在缺血30分钟和24小时再灌注前5分钟向左心室腔内快速推注液体药物组合物IV(97mM，pH7.65)减小了心肌梗塞面积占危险区的百分比(附图12)。在最高受试浓度下(500μg/kg)，4只动物在治疗后存活。载体不会在心肌I/R损伤中提供任何保护益处。
在第二个实验中，在手术和缺血前24小时，用快速推注剂量的液体药物组合物IV预治疗(预处理剂量)动物。由于所测定的梗塞面积显著减小，用液体药物组合物预治疗为心肌坏死提供了保护(100μg/kg)(附图16)。
实施例10
液体药物组合物IV在大型哺乳动物中诱导轻度低温的方法和应用
先前已经证明了液体药物组合物I，II，III和IV抑制啮齿动物的中心体温(实施例7)。由于可以在心脏手术期间对患者全心缺血的保护作用和减小再灌注损伤，已经在心跳停止中诱导轻度低温(参见：Nolan等人，Circulation.(2003)，108：118-1210)。在本研究中，证明了液体药物组合物IV在轻度低温模型中降低大型动物体温的假说。在60分钟的时间里将液体药物组合物IV施用于两组母猪中，测定体温随着时间的改变速率。
如实验动物的护理和使用指导所述，将母猪(20-25kgs)在适当护理下圈养。设置环境控制以维持温度为61至81°F，相对湿度为30至70％。使用12小时亮/暗循环，并使该室的10次换新鲜气体/小时最小。
用氯胺酮(20mg/kg)和噻拉嗪(2.0mg/kg)的组合经肌内(IM)施用麻醉动物。然后立即给各动物插管，并维持在吸入剂异氟烷(0.5-2.5％)麻醉下。通过体积可调的呼吸器或重复呼吸装置递送吸入式麻醉剂。将静脉内导管置于颈静脉中以施用乳酸Ringer′s溶液(10ml/kg/小时)和任何必要的急救药物(药物，剂量，给药途径和位点如外科文件所列)，每15分钟手动记录异氟烷浓度，氧率，SaO₂％，脉搏率，呼吸率和毛细管再充盈时间。在整个实验期间监测血压和EKG。通过使用食管温度传感器来检测中心体温，所述传感器插入到动物的食管中以探测中心体温。
如上所述麻醉2组的5-6只动物。测定EKG，动脉血压和中心(腹部)温度。在麻醉下将动物维持30分钟的基线时间。在30分钟的基线时间后，用Ringer′s溶液给受试猪输注(2.5mg/kg/小时)60分钟，通过单独的静脉内线，施用载体或Ringer′s溶液，并通过单独的静脉内线施用液体药物组合物IV。在60分钟的输注时间里观测动物。以1秒的间隔测定中心温度。在60分钟结束时，在从麻醉中恢复前观测动物30分钟。
由位于腹部，紧贴在肝下的温度传感器来记录中心温度。用PowerLab数据采集器和软件将数据直接传送到计算机中。将冰冷Ringer′s乳酸盐输注1小时期间记录的数据点输出到GraphPad Prism软件中进行回归分析。
计算总的温度改变和改变速率(回归线斜率)的组平均值，并通过Student′s T-检验进行比较。
这些实验证明，在猪(20-25kg)中，液体药物组合物IV增强了低体温-诱导治疗所诱导的低体温的程度。与载体相比，施用液体药物组合物IV在中心体温方面产生了统计学显著的改变(附图13A和13B)。数据表明，液体药物组合物IV可以有效地在大型动物中诱导低温。
实施例11
在猪的心肌缺血模型中液体药物组合物IV减轻了局部缺血
在猪中测定了硫化物的液体药物组合物在心肌缺血-再灌注(I/R)损伤模型中提供心脏保护益处的能力。在该研究中，证明了在缺血后(在120分钟的再灌注期前开始5分钟)向左心室腔内快速推注，然后输注60分钟的液体药物组合物IV(100mM，pH7.80，292mOsm)减轻了心肌缺血并减小了心肌梗塞面积占危险区的百分比。相反，用载体治疗不会在心肌I/R损伤中提供任何保护益处。
分别圈养动物。随意提供食物和水。所有实验根据美国国立卫生研究院指导规则来调整实验动物的护理和使用。
用盐酸氯胺酮(20mg/kg)肌内镇静不同性别的猪(35至45kg)，用戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉内麻醉。在整个实验中维持由异氟烷产生的全身麻醉。用容量转换呼吸器经气管插管术提供通风(氧，40％；潮气量，1000mL；通风率，12次呼吸/分钟；正内-呼吸压，3cm H₂O；吸气与呼气时间的比，1/2)。向右股静脉中插管以检测静脉和IV注射，向右总或股浅动脉中插管以进行动脉血取样和动脉血压监测。在胸廓切开术前施用肝素钠和1％利多卡因。每30分钟施用肝素，直至实验结束。通过正中胸骨切开术暴露心包，并打开以形成心包篮。通过尖部将具有导管尖的压力计引入到左心室(LV)中记录LV压。在冠状动脉左前降支的远端三分之一周围或在暴露适当的血管后在其大对角线分支穿上血管环。通过紧固血管环来闭合冠状动脉，然后用蚊式止血钳夹紧固定。通过心肌表面的局部青紫来从视觉上确认心肌缺血。
将猪随机分为几组，并进行45分钟的局部缺血(闭合)，然后进行120分钟的再灌注。在整个实验(PO-NE-MAH数字资料采集系统，Gould，Valley View，OH)期间用Acquire Plus数据采集板，左心室压分析软件和Gould ECG/Biotach来连续检测动脉压(收缩压，舒张压，平均血压)，心率，节缩短百分比(LV dP/dt)和心肌组织流。在开始移除冠状动脉夹前5分钟开始施用液体药物组合物IV或载体(快速推注(100mcg/kg)和1mg/kg/小时输注)，并在再灌注期间连续输注60分钟。
使用植入到缺血区内约10mm远的心内膜下层中的超声探针(2.0mm)，通过声纳微测量法(Sonometrics Corp.，London，ON，Canada)来评价局部心肌功能，两对置于平行于心脏短轴的位置，并用聚丙烯缝线(Ethicon，Inc.，Somerville，NJ)固定心内膜。将探针留在该位置直至实验结束。用后处理软件(SonoView，Sonometrics Corp.，London，ON，Canada)检查数字数据以校正舒张末期和收缩末期点的同一性。在正常窦性心律下，测定至少3个心搏周期，然后平均。在数据采集期间停止通风机以消除呼吸的效应。在正LV dP/dt开始时测定舒张末期节段长度(EDL)，在负dP/dt峰值时测定收缩末期节段长度(ESL)。通过节段缩短术(SS)来评价局部收缩性。壁运动异常用收缩期突起(SB)来评价，收缩期突起的定义是在舒张结束后心肌的突起。收缩后缩短(PSS)是收缩喷射结束后的缩短。由4-5个独特的水平和/或纵向距离的平均值±SEM来计算％SS的时程改变，并表示为基线的百分比，以减小各个动物间的差异。SS的时程改变表示为平衡值的百分比，以减小各个动物间的差异。
用Corning 238pH/血液气体分析器和Corning 270 CO-血氧定量计，每10-15分钟检测血液中的气体和红细胞比容。血液气体和酸-碱参数维持在PO₂>100mmHg；pH-7.3±0.3；和温度-37℃。
在实验结束后，通过在结扎相关的动脉后注射到动脉中的单星蓝色素来表示有危险的缺血面积。通过氯化三苯四唑氯染色(SigmaChemical Co.)来确定梗塞面积，并表示为危险区的百分比。通过电脑求积法来测定危险区和梗塞区的面积(Scion Image，Scion Corp.，Frederick，MD)。
在每次实验结束时取出的来自左心室的危险区(缺血区)和非缺血区中的缺血组织样本(约0.5g)由心外膜，心肌和心内膜组织组成，并将它们分为两组样本。通过单星蓝色素注射来确认缺血和非缺血区的样本。将样本根据需要快速冷冻或包埋。
收集血样，离心和/或储藏在冰上。用SAS(SAS Institute，Inc.，Cary，NC)进行统计分析。平均值±SEM用于表示所有变量。通过重复测定的方差分析(ANOVA)来确定统计学显著性，组是“个体间”因子，时间是“个体内”因子。使用Bonferroni校正调节试验的多样性，一次来进行各组之间平均效果和各个时间点的后-hoc比较。通过ANOVA来评价各组间梗塞面积的显著性差异。进行线性回归分析来确定各组的节段缩短，梗塞面积和局部缺血时间。用普通线性模型来比较各组的回归线的差异。普通线性模型也用于测定显著的非线性(例如，二次方)效果。统计学显著时要求p<0.05。
在该研究中，在45分钟的缺血和120分钟的再灌注期之前5分钟快速推注液体药物组合物IV，然后输注60分钟减小了心肌梗塞面积占危险区的百分比(附图14)。载体不会在心肌I/R损伤中提供任何保护益处。
实施例12
在狗中，在心肺分流术后液体药物组合物IV保护心脏功能
迄今为止，用阻止心跳的体外循环来进行常规心外科的主要部分。尽管心脏功能障碍在临床中并不明显，如压力-体积相互关系的人的研究所述，会发生心肌收缩的减弱。此外，冠状内皮和外周血管功能障碍会进一步使术后过程复杂化。也已知体外循环可以诱导释放自由基的全身性炎症反应，导致续发性器官损害。
有新证据表明，硫化氢可以在培养的肌细胞中，在灌注的心脏中和在心肌梗塞的啮齿浓度模型中显示心脏保护作用(参见，例如，Pan，T.T.等人，J.Mol.Cell.Cardiol.40：119-30(2006)；Bian，J.S.等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.316：670-8(2006)；Johansen，D.等人，Basic Res.Cardiol.101：53-60(2006)；和Zhu，Y.Z.等人，J.Appl.Physiol.102：261-8(2007))。硫化物保护的机制包括转变细胞能量，向下调节炎症途径，由于抗氧化效果的细胞保护作用。在该研究中，在心肺分流术的狗模型中测定H₂S的液体药物组合物的潜在的心脏保护作用，以确定该化合物是否在分流手术的临床相关模型中影响心血管功能。此外，确定硫化氢对于血管功能和心肌活动状态的作用。
用确定的心跳停止模型，在两组狗中测定硫化物的液体药物组合物在心肺分流术期间提供心脏保护益处的能力(缺血；Szabo，G.等人，Eur.J.Cardiothorac.Surg.25：825-32(2004))。在该研究中，各只动物经受了90分钟的心肺分流术(CBP)(30分钟CBP，然后心跳停止60分钟)和60分钟由动脉流恢复导致的再灌注。如前负荷补充搏功(PRSW)所测定的那样，在心跳停止和再灌注期间输注液体药物组合物IV保护了心脏功能。相反，用载体治疗不会在心跳停止(缺血)模型中提供任何心脏保护益处。
狗随机分为2组，并根据the National Society for MedicalResearch和National Institutes of Health的指导接受人道护理。先给狗施用丙酰丙嗪，用戊巴比妥麻醉，用泮库溴铵和气管插管保持。通风包含室内气体和O₂的混合物，频率为12-15/分钟，以15ml/kg/分钟开始的潮气量。动脉的部分二氧化碳压水平维持在35-40mmHg。向股动脉和静脉中插管以记录主动脉压(AoP)并取血样以进行生化分析。用Ringer′s溶液(1ml/分钟/kg)进行基本静脉注射体积置换。根据钾，碳酸氢根和碱过量的值，置换包括施用氯化钾和碳酸氢钠(8.4％)。不施用儿茶酚胺和其他激素或加压物质。
在60分钟的心跳停止和60分钟的再灌注(1mg/kg/小时，输注)期间输注包含液体药物组合物IV(100mM，pH7.71，292mOsm)或载体的受试物质。
在左前外侧开胸术后切开大血管。向左锁骨下动脉中插管以进行动脉灌注，并施用肝素以维持抗凝。将静脉插管置于右心房中。体外回路(分流)包含心脏交换器，静脉贮血器，滚压泵以及用含肝素和碳酸氢钠的Ringer′s乳酸溶液预处理的膜式充氧器。在心肺分流术(CPB)开始后，将动物体温冷却至28℃。横跨夹紧主动脉，并用25ml/kg HTK溶液(单位mmol：15 NaCl，9 KCl，4 MgCl₂ 6 H₂O，18一水合盐酸组氨酸，180组氨酸，2色氨酸，30甘露醇，0.015 CaCl₂，12-氧代戊二酸氢钾，H₂O)使心跳停止。
在心跳停止/灌注期间，调节泵流量以维持灌注压在35-40mmHg以上。在夹紧后40分钟和心跳停止60分钟后开始恢复温度，松开动脉，在分流回路中用血液再灌注心脏。如果必要，用40J的DC心脏复率来抵消心室颤动。
在该研究后，用100％的氧气重新开始通风。在动脉横跨夹松开后20分钟，所有动物脱离CPB而没有收缩性支持。在CBP前和再灌注后60分钟进行功能测定并记录。此外，在实验结束时，收集心肌探针来进行高能磷酸盐分析。
分别经肺动脉通过压力传导管的组合来测定左心室收缩末期(LVESP)和舒张末期压(LVEDP)和容量。计算心搏量(SV)。通过将1ml的高张生理盐水快速注射到肺动脉或上腔静脉中来评价平行的传导。进行大静脉闭合以获得一系列的压力-容量环。用左和右心室收缩末期压-容量的相互关系与前负荷补充搏功(PRSW)的斜率和截距计算心肌收缩力的负荷-独立性指数。
用血管周围的产生流探针在左前降支动脉上测定冠状动脉血流。在冠状动脉内单独快速推注乙酰胆碱(ACH，10^-7M)后评价冠状内皮-依赖性血管舒张，在快速推注硝普酸钠(SNP，10^-4M)后评价内皮-独立性血管舒张。血管应答表示为冠状血管阻力基线的百分比改变。
通过再灌注后的压力-容量环的分析来测定心收缩功能。在CBP后30分钟开始用载体或液体药物组合物IV输注，并继续进行，直至实验结束(总共输注2小时，剂量为1mg/kg/小时，i.v.)。所有动物经受60分钟的心跳停止(缺血)，总的心肺分流术时间是90分钟。在对缺血应答的载体治疗组中，前负荷补充搏功(PRSW)降低。如所测定的前负荷补充搏功(PRSW)改变，与基线相比，在心跳停止和再灌注期间输注液体药物组合物IV具有心脏保护作用(附图15)。
使用酶动力学分析，用标准的光度测定来评价三磷酸腺苷(ATP)，二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量。除此之外，在分离的冠状环中研究内皮-依赖性和-独立性舒张。在体内实验结束后，切除心脏，分离冠状动脉并置于冷的(+4℃)Krebs-Henseleit溶液(118mM NaCl，4，7mM KCl，1，2mM KH₂PO₄，1，2mM MgSO₄，1，77mM CaCl₂，25mM NaHCO₃，11.4mM葡萄糖；pH＝7，4)。制备冠状动脉并洗去外膜周围的脂肪和周围的结缔组织，用手术显微镜横切成4-mm宽的环。在37℃下，在包含的25ml的Krebs-Henseleit溶液的独立的器官浴槽(Radnoti Glass Technology，Monrovia，CA，USA)中将分离的主动脉环包埋在不锈钢假手上并用95％ O₂和5％ CO₂充气。在制备期间要特别注意，以避免损坏内皮。用等长的力传感器(Radnoti GlassTechnology，Monrovia，CA，USA)记录等长收缩，数字化，储藏并用IOX软件系统(EMKA Technologies，Paris，France)系统。将环放置在2g的静止张力下，并平衡60分钟。用U46619(5 x 10^-7M)预收缩环直至达到稳定的平顶，通过加入蓄积浓度的内皮-依赖性舒张剂乙酰胆碱(ACh，10^-9-10^-4M)和内皮-独立性舒张剂硝普酸钠(SNP，10^-10-10^-5M)来检验松弛反应。舒张表示为U46619诱导的收缩的百分比。
心率(HR)，MAP，CO和CBF如表2所示。基线心率在治疗组中稍高；此外，没有记载差异。在CPB后，所有3组中MAP都显示了降低的趋势，其在两个治疗组中是显著的(p<0.05)。各组和各时间之间CO没有显示较大差异。在所有3个组中CBF与基线相当。在CPB后，其在对照组中显著降低，而在2个治疗组中则保持不变。各组和各时间之间的血液动力学变量没有差异。
各组之间与左心室功能有关的基线值没有差异。在CPB后，对照组的左心室dP/dt和PRSW显著降低，其部分被H₂S逆转(附图15和17)。
在CPB之前，在体内内皮功能中没有观察到差异。在CPB之后，对照组中对乙酰胆碱的应答显著降低，其部分被H₂S所消除(附图19)。在各组和各时间，对SNP的应答没有差异。
当与对照环(没有CPB的动物，历史性对照)时，乙酰胆碱(ACh)的预收缩冠状动脉环的内皮-依赖性血管舒张显著受损，而在H₂S治疗组则完全防止了这一点(附图19)。各组SNP后的内皮依赖性血管舒张没有差异。
与对照载体相比，在硫化氢存在下，实验结束时所测定的心肌ATP显著增加。但是，ADP和AMP水平是相当的(表3)。
这些数据表明，在大型动物模型的心肺分流术的背景下，在心跳停止后用H₂S的液体制剂治疗改善了心肌缺血后和内皮功能。这些有益效果是由于H₂S的抗氧化，抗炎，血液动力学和细胞保护作用或其组合。
实施例13
硫化氢减轻主动脉-闭合-诱导的缺血-再灌注损伤引起的DNA损害
检验了在猪的胸主动脉闭合-诱导的缺血/再灌注(I/R)损伤的临床相关性模型中输注H₂S-供体NaHS的细胞保护作用。
在随机分为NaHS(n＝6；2mg/kgx小时，在主动脉闭合前2小时开始并持续，直至8小时的灌注)或载体(n＝6)组后，用置于锁骨下游区和主动脉叉上游区的膨胀气球将麻醉，通风和经工具处理的猪经受30分钟主动脉闭合。在主动脉闭合期间，用i.v.艾司洛尔，硝化甘油和ATP将平均动脉压(MAP)保持在闭合前的80-120％水平。在再灌注前期，连续滴注i.v.去甲肾上腺素以使MAP保持在基线水平的80％。用单细胞凝胶电泳(碱性comet测定来评价全血中的DNA损害。表4中的数据室各组的中位数(范围)，用Friedman ANOVA on ranks检验组内差异，用不配对秩和检验检验组间差异。
NaHS的输注导致心率和心输出量显著降低。但是，血压和搏出量未受影响。NaHS降低了实现血液动力学目的而所需的去甲肾上腺素的需求量，减少了葡萄糖循环并完全防止了I/R-诱导的DNA损害(在comet测定中的末尾阶段，#p<0.05vs输注前，§p<0.05vs.载体)。
这些数据表明，在主动脉闭合-诱导的I/R损伤期间，输注H₂S-供体NaHS是有益的，并确认了用液体硫化物制剂治疗可以预防缺血性损伤。这种有益效果是由于该化合物的代谢调节和细胞保护作用的组合。



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