通过修饰特定细胞色素P450基因改变烟草生物碱含量.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200880120735.0

申请日:

2008.11.12

公开号:

CN101939431A

公开日:

2011.01.05

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/53申请日:20081112|||公开

IPC分类号:

C12N15/53; C12N15/82; A01H5/12; C12Q1/68

主分类号:

C12N15/53

申请人:

北卡罗来纳州立大学; 肯塔基大学研究基金会

发明人:

R·E·德维; B·斯明茨基; S·W·鲍文; L·贾维拉诺

地址:

美国北卡罗来纳州

优先权:

2007.11.12 US 60/987,243

专利代理机构:

中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 11038

代理人:

罗菊华

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内容摘要

提供了用于降低烟草属植物和其植物部分中降烟碱和N′-亚硝基降烟碱(NNN)的水平的组合物和方法。组合物包含在此类植物中参与烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素P450的分离的多核苷酸和多肽。还提供了包含靶向公开的细胞色素P450多肽的表达或功能的抑制性序列的表达盒、载体、植物和其植物部分。还提供了使用此类新型序列抑制参与该代谢转化的细胞色素P450多肽的表达或功能的方法。该方法用于产生烟草制品,所述烟草制品具有降低水平的降烟碱和其致癌代谢产物NNN,从而对于消费此类烟草制品或暴露于源自此类制品的二手烟的个体具有降低的致癌潜能。

权利要求书

1: 包含选自 SEQ ID NOS : 1 和 3 的核苷酸序列的分离的多核苷酸。
2: 编码选自 SEQ ID NOS : 2, 5-12 和 14-24 的氨基酸序列的分离的多核苷酸。
3: 分离的多核苷酸, 其包含能够在植物细胞中发挥功能的启动子, 该启动子有效地连 接至核酸序列, 所述核酸序列包含从含有选自在位点 253、 353、 647、 733、 1050、 1397 和其组 合上的核酸的核酸的核酸序列获得的 SEQ ID NO : 1 的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷 酸的区域。
4: 包含编码绿叶烟碱脱甲基酶的核酸序列的分离的多核苷酸, 其中所述烟碱脱甲基酶 在选自残基 235, 449, 174, 410, 224, 72, 143 和 422 的位点中的氨基酸残基上具有置换, 其中 编号根据 SEQ ID NO : 2。
5: 分离的多核苷酸, 其包含能够在植物细胞中发挥功能的启动子, 所述启动子有效地 连接至包含 SEQ ID NO : 4 的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域的核酸序列。
6: 分离的多核苷酸, 其编码具有与其他 P450 多肽不同的残基至保守残基的突变的 SEQ ID NO : 2。
7: 分离的多核苷酸, 其编码在选自残基 85、 118、 216、 245 和 466 的位点上具有突变的 SEQ ID NO : 2, 其中 85 位上的残基不是异亮氨酸, 118 位上的残基不是天冬酰胺, 216 位上的 残基不是酪氨酸, 245 位上的残基不是酪氨酸且 466 位上的残基不是缬氨酸。
8: 权利要求 7 的分离的核酸分子, 其中所述突变选自 118 位上的残基和 466 位上的残 基。
9: 权利要求 7 的分离的核酸分子, 其中存在至少 3 个至保守残基的突变。
10: 包含编码 SEQ ID NO : 2 的多核苷酸的表达盒, 所述多核苷酸有效地连接至在植物 细胞中具有功能的启动子。
11: 权利要求 10 的表达盒, 其中将所述表达盒整合入载体。
12: 包含多核苷酸的表达盒, 所述多核苷酸包含与在植物细胞中具有功能的启动子有 效连接的 SEQ ID NO : 3 或其至少 25 个连续核苷酸的片段。
13: 权利要求 12 的表达盒, 其中所述启动子选自诱导型、 组成型、 病原体或创伤诱导 的、 受环境或发育调控的、 或细胞或组织特异性启动子。
14: 包含 SEQ ID NO : 3 的至少 25 个核苷酸的分离的多核苷酸。
15: 权利要求 14 的分离的多核苷酸, 其还包含 SEQ ID NO : 3 的至少 50 个核苷酸。
16: 包含选自 SEQ ID NO : 2, 5-12 和 14-24 的氨基酸序列的分离的多肽。
17: 包含与 SEQ ID NO : 299%同一的氨基酸序列的分离的多肽, 其中所述多肽能够在烟 草的绿叶中将烟碱转化成降烟碱。
18: 包含表达盒的烟草属植物或其植物部分, 所述表达盒编码 SEQID NO : 2、 其片段、 或 任一个的互补序列。
19: 与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因 烟草属植物, 所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源多核苷酸构建 体, 所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一序列形成双链 RNA 的第 二核酸序列的核酸序列, 所述第一核酸序列包含编码 SEQ ID NO : 2 的绿叶烟草烟碱脱甲基 酶序列的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域。
20: 权利要求 19 的转基因烟草属植物, 其中所述第一核酸序列包含所述绿叶烟草烟碱 2 脱甲基酶序列的大约 200 至大约 500 个核苷酸的区域。
21: 与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因 烟草属植物, 所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源多核苷酸构建 体, 所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链 RNA 的第二核酸序列的核酸序列, 所述第一核酸序列包含 SEQ ID NO : 3 的大约 100 个核苷酸至 大约 350 个核苷酸的区域。
22: 与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因 烟草属植物, 所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源多核苷酸构建 体, 所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链 RNA 的第二核酸序列的核酸序列, 所述第一核酸序列包含 SEQ ID NO : 4 的大约 100 个核苷酸至 大约 350 个核苷酸的区域。
23: 与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟 草属植物的种子, 所述植物包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子, 所述启动子有 效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一序列形成双链 RNA 的第二核酸序列的核 酸序列, 所述第一核酸序列包含具有 SEQ ID NO : 4 的氨基酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶 序列的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域。
24: 权利要求 23 的种子, 其中所述植物在绿叶中具有大约 1%的烟碱至降烟碱的转化。
25: 权利要求 23 的种子, 其中所述植物在绿叶中具有大约 0.5%的烟碱至降烟碱的转 化。
26: 可再生的烟草植物细胞的组织培养物, 其中所述烟草植物细胞包含具有 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 的片段的第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链 RNA 的第二核酸 序列。
27: 包含烟草植物材料的烟草制品, 所述烟草植物材料包含与非转基因植物相比在绿 叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物细胞, 所述植物细胞包含 能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子, 所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和 能够与所述第一核酸序列形成双链 RNA 的第二核酸序列的核酸序列, 所述第一核酸序列包 含 SEQ ID NO : 4 的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域。
28: 权利要求 27 的烟草制品, 其中所述烟草植物材料还包含与非转基因植物相比在衰 老叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物细胞, 所述植物细胞包 含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子, 所述启动子有效地连接至具有第三核酸序列 和能够与所述第三序列形成双链 RNA 的第二序列的核酸序列, 所述第三核酸序列包含编码 选自 SEQ ID NO : 12-24 的氨基酸的核酸序列的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区 域。
29: 权利要求 27 的烟草制品, 其中所述制品是无烟烟草制品例如鼻烟或嚼烟。 香烟、 烟斗烟、 小雪茄、 不透气或透
30: 权利要求 27 的烟草制品, 其中所述制品是雪茄、 气嵌入式过滤嘴香烟、 溶解性条、 树胶或片剂。
31: 具有经改变以抑制至少绿叶烟碱脱甲基酶的表达的基因组的烟草植物。
32: 具有经改变以抑制至少绿叶烟碱脱甲基酶的表达的基因组的烟草细胞, 其中所述 细胞对于编码绿叶烟碱脱甲基酶的基因中的突变是纯合的。 3
33: 权利要求 32 的烟草细胞, 其中所述基因组还包含编码选自 SEQID NOS : 13-24 的衰 老诱导的烟碱脱甲基酶的基因中的突变。
34: 包含含有绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列的转基因的烟草细胞, 所述核酸序列侧翼于 选择标记基因, 其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因, 从而产生其中内源绿叶烟碱 脱甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。
35: 包含含有绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列的转基因的烟草细胞, 所述核酸序列侧翼于 选择标记基因, 其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因, 从而产生其中内源绿叶烟碱 脱甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。
36: 用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法, 所述方法包括步 骤: a) 抑制烟碱脱甲基酶的表达, 其中所述烟碱脱甲基酶具有 SEQ IDNOs : 2 和 5-12 中所 示的氨基酸序列 ; 和 b) 降低来源于烟草属植物的植物部分中的降烟碱。
37: 权利要求 36 的方法, 其中所述抑制包括在所述植物中表达多核苷酸, 其中所述多 核苷酸抑制所述植物中所述绿叶烟碱脱甲基酶的表达。
38: 权利要求 36 的方法, 其中所述抑制性核酸序列能够转录为选自单链 RNA 多核苷酸、 双链 RNA 多核苷酸和其组合的抑制性多核苷酸。
39: 权利要求 36 的方法, 其中所述抑制包括在所述植物中表达多肽, 其中所述多肽抑 制所述植物中所述绿叶烟碱脱甲基酶的表达。
40: 权利要求 39 的方法, 其中所述多肽是识别具有 SEQ ID NO : 2 的氨基酸序列的多肽 的抗体。
41: 权利要求 36 的方法, 其中所述抑制包括在所述植物中消除基因, 其中所述基因编 码所述绿叶烟碱脱甲基酶。
42: 权利要求 36 的方法, 其中所述抑制包括将表达盒导入来自烟草属植物的植物细 胞, 其中所述表达盒包含 SEQ ID NOS : 1, 2 和 4 中所示的核酸序列的至少 25 个连续核苷酸 的核酸序列、 其互补序列或这些序列的混合物。
43: 权利要求 36 的方法, 其中所述抑制包括将表达盒导入来自烟草属植物的植物细 胞, 并且所述表达盒包含编码 SEQ ID NOS : 2, 5-12 中所示的序列的至少 25 个连续核苷酸的 核酸序列和其互补序列。
44: 权利要求 43 的方法, 其中所述抑制还包括将表达盒导入来自烟草属植物的植物细 胞, 并且所述表达盒包含编码选自 SEQ ID NOS : 13-24 的序列的至少 25 个连续核苷酸的核 酸序列, 和所述核酸序列的互补序列。
45: 权利要求 36 的方法, 其中所述抑制包括在所述植物中消除基因, 并且所述基因编 码所述烟碱脱甲基酶。
46: 权利要求 36 的方法, 其中所述烟碱脱甲基酶有效地连接至选自诱导型、 组成型、 病 原体或创伤诱导的、 受环境或发育调控的、 或细胞或组织偏爱型启动子的启动子。
47: 权利要求 46 的方法, 其中所述启动子是叶偏爱型启动子。
48: 权 利 要 求 36 的 方 法, 其 中 所 述 植 物 选 自 Nicotiana acuminatamultiflora、 大 花 烟 草 (Nicotiana alata grandiflora)、 Nicotianabigelovii quadrivalvis、 4 Nicotiana bigelovii wallacei、 Nicotiana obtusifolia obtusifolia、 Nicotiana obtusifoliaplameri、 Nicotiana quadrivalvis bigelovii、 Nicotianaquadrivalvis quadrivalvis 、 Nicotiana quadrivalvis wallacei 和 Nicotiana trigonophylla palmeri。
49: 用于减少烟草制品中的降烟碱的方法, 所述方法包括步骤 : a) 种植转基因烟草植物, 其中所述植物包含这样的植物部分, 其包含含有异源启动子 和烟碱脱甲基酶的表达盒, 其中所述烟碱脱甲基酶具有选自 SEQ ID NOS : 2 和 5-12 的氨基 酸序列 ; 和 b) 从所述烟草植物部分制备烟草制品。
50: 用于减少烟草制品中的降烟碱的方法, 所述方法包括步骤 : a) 种植转基因烟草植物, 其中所述植物包含这样的植物部分, 其包含特异性结合具有 选自 SEQ ID NOS : 2 和 5-12 的氨基酸序列的多肽的抗体 ; 和 b) 从所述烟草植物部分制备烟草制品。
51: 权利要求 50 的方法, 其中所述烟草制品选自嚼烟、 鼻烟、 香烟、 烟斗烟和雪茄。
52: 用于减少烟草制品中的降烟碱的方法, 所述方法包括步骤 : a) 种植转基因烟草植物, 其中所述植物包含这样的植物部分, 其包含有效地连接至异 源启动子的绿叶烟碱脱甲基酶的片段, 并且所述片段具有来自编码选自 SEQ ID NOS : 2和 5-12 的多肽的核酸序列的至少 25 个连续核苷酸 ; 和 b) 从所述烟草植物部分制备烟草制品。
53: 权利要求 52 的权利要求, 其中所述转基因植物部分还包含有效地连接至异源启动 子的衰老诱导的烟碱脱甲基酶的片段, 并且所述片段具有来自编码选自 SEQ ID NOS : 13-24 的多肽的核酸序列的至少 25 个连续核苷酸。
54: 用于减少来源于烟草属植物的植物部分中的降烟碱的方法, 所述方法包括步骤 : a) 修饰功能性 CYP82E5v2 等位基因以将等位基因变成无功能的 CYP82E5v2, 其中所述 无功能的 CYP82E5v2 的氨基酸序列在选自残基 235、 449、 174、 410、 224、 72、 143 和 422 的位 点中的氨基酸残基上具有置换, 其中编号根据 SEQ ID NO : 2; 和 b) 降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。
55: 权利要求 54 的方法, 其中所述修饰包括定点诱变。
56: 用于减少烟草制品的致癌潜能的方法, 所述方法包括通过下述制备所述烟草制品 的步骤 : a) 种植转基因烟草植物, 其中所述植物包含这样的植物部分, 其包含有效地连接至异 源启动子的绿叶烟碱脱甲基酶的片段, 并且所述片段包含来自编码选自 SEQ ID NOS : 2和 5-12 的多肽的核酸序列的至少 25 个连续核苷酸 ; 和 b) 从所述烟草植物部分制备烟草制品。
57: 权利要求 56 的方法, 其中所述片段包含至少 100 个核苷酸。
58: 权利要求 57 的方法, 其中所述转基因烟草植物还包含这样的植物部分, 其包含有 效地连接至异源启动子的烟碱脱甲基酶的片段, 并且所述片段具有来自编码选自 SEQ ID NOS : 13-24 的多肽的核酸序列的至少 25 个连续核苷酸。
59: 减少烟草属植物中烟碱至降烟碱的转化的方法, 其包括步骤 : 5 a) 用包含能够在植物细胞中发挥功能的启动子的核酸构建体转化烟草属植物, 所述启 动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链 RNA 的第二核 酸序列的核酸序列, 所述第一核酸序列包含 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 的 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域 ; 和 b) 再生转基因烟草属植物。
60: 权利要求 59 的方法, 其中所述 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域获自 SEQ ID NO : 1 的大约位点 100 和大约位点 500 之间的序列。
61: 权利要求 60 的方法, 其中所述转基因烟草属植物具有低于 2%的烟碱至降烟碱的 转化。
62: 权利要求 60 的方法, 其中所述转基因烟草属植物具有低于 1%的烟碱至降烟碱的 转化。
63: 权利要求 60 的方法, 其中所述第一核酸序列包含选自编码序列和内含子序列的烟 草烟碱脱甲基酶的区域。
64: 筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法, 其包括步骤 : a) 获得与 SEQ ID NO : 1 具有至少 200 个核苷酸的序列同一性的核酸序列 ; 和 b) 鉴定在所编码的多肽的位点 422 上编码终止密码子的密码子序列, 其中编号根据 SEQ ID NO : 2。
65: 权利要求 64 的方法, 其中在编码的蛋白质的位点 422 上的突变对酶的功能具有负 面效应。
66: 筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法, 其包括步骤 : a) 获得与 SEQ ID NO : 1 具有至少 200 个核苷酸的序列同一性的核酸序列 ; 和 b) 鉴定在编码的多肽的位点 449 上编码不是脯氨酸的密码子的密码子序列, 其中编号 根据 SEQ ID NO : 2。
67: 权利要求 66 的方法, 其中所述在编码的多肽的位点 449 上的密码子通过选自单核 苷酸多态性和 RT-PCR 的方法来鉴定。
68: 权利要求 66 的方法, 其中在编码的蛋白质的位点 499 上的突变对酶的功能具有负 面效应。
69: 用于鉴定具有低水平的降烟碱的烟草植物的方法, 所述方法包括步骤 : a) 从目的烟草植物获得 DNA 样品 ; 和 b) 就 SEQ ID NO : 1 中突变的存在筛选所述样品。
70: 权利要求 69 的方法, 其中所述烟草植物是非转换子。
71: 用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法, 所述方法包括步 骤: a) 抑制 CYP82E4v2 烟碱脱甲基酶和 CYP82E5v2 烟碱脱甲基酶的表达 ; 和 b) 降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。
72: 权利要求 71 的方法, 其中所述 CYP82E4v2 具有选自 SEQ IDNOS : 13-24 的氨基酸序 列, 并且所述 CYP82E5v2 具有选自 SEQ ID NOS : 2 和 5-12 的氨基酸序列。
73: 包含在选自残基 458、 364、 329 和其组合的位点上具有突变的氨基酸 SEQ ID NO : 13 的烟草植物材料。 6
74: 权利要求 73 的烟草植物材料, 其中位点 458 上的残基不是脯氨酸, 位点 364 上的残 基不是赖氨酸或位点 329 上的残基是终止密码子。
75: 包含在选自残基 458、 364、 329 和其组合的位点上具有突变的 CYP82E4v2 的烟草植 物材料, 其中编号相应于 SEQ ID NO : 13。
76: 包含在残基 376 上具有突变的 CYP82E4v2 的烟草植物材料, 其中所述残基不是缬氨 酸并且残基的编号相应于 SEQ ID NO : 13。

说明书


通过修饰特定细胞色素 P450 基因改变烟草生物碱含量

    发明领域 本发明涉及用于降低作为烟草属 (Nicotiana) 的成员的植物中降烟碱和其代谢 物 N′ - 亚硝基降烟碱 (NNN) 的水平的组合物和方法, 特别地用于抑制参与烟碱至降烟碱的 代谢转化的细胞色素 P450 多肽的表达或功能的组合物和方法。
     发明背景
     商业烟草品种中发现的主要生物碱是烟碱, 其通常占据总生物碱库的 90 %至 95 %。剩下的生物碱级分主要是 3 种另外的吡啶类生物碱 : 降烟碱、 新烟碱和新烟草碱。 降烟碱通过烟碱 N- 脱甲基酶直接从烟碱产生。降烟碱通常代表低于 5 %的总吡啶类生 物碱库。然而, 最初产生非常少量的降烟碱的烟草植物可产生将大百分比的叶的烟碱代 谢 “转化”成降烟碱的后代。该过程称为 “转换” 。在已进行遗传转换的烟草植物 ( 即, “转换子” ) 中, 大部分降烟碱的产生在成熟叶的衰老和加工过程中发生 (Wernsman & Matzinger(1968)Tob.Sci.12 : 226-228)。白肋烟 (burley tobaccos) 特别易于遗传转换, 在一些栽培品种中观察到高达每代 20%的比率。
     在烟草叶的处理和加工过程中, 一部分降烟碱代谢成 NNN( 被认定为在实验室 动物中致癌的烟草特异性亚硝胺 (TSNA))(Hecht &Hoffmann(1990)Cancer Surveys 8 : 273-294 ;和 Hoffmann 等 人 (1994)J.Toxicol.Environ.Health 41 : 1-52 ; Hecht(1998) Chem.Res.Toxicol.11 : 559-603)。 在 烤 烟 中, TSNA 主 要 通 过 生 物 碱 与 极 少 量 的 氮 氧 化物 ( 存在于用于常规烘烤室的直燃式加热系统中的燃烧气体中 ) 反应形成 (Peele & Gentry(1999)“Formation of tobacco-specificnitrosamines in flue-cured tobacco, ” CORESTA Meeting, Agro-Phyto Groups, Suzhou, China)。 然 而, 当用热交换 器 ( 其可消除燃烧气体与烘烤气体 (curing air) 的混合, 从而减少以该方式烘烤的烟中 的 TSNA) 改 进 烘 烤 室 时, 可 消 除 燃 烧 气 体 (Boyette &Hamm(2001)Rec.Adv.Tob.Sci.27 : 17-22.)。相反地, 在晾干的白肋烟中, TSNA 主要通过烟草生物碱与亚硝酸盐的反应 ( 由 叶 生 (leaf-borne) 微 生 物 催 化 的 过 程 ) 形 成 (Bush 等 人 (2001)Rec.Adv.Tob.Sci.27 : 23-46)。 迄今, 对于晾干的烟草, 通过改变处理条件同时保持可接受的质量标准来减少 TSNA 的努力仍未获得成功。
     在白肋烟植物中, 叶的降烟碱含量与经处理的叶中积累的 NNN 的量之间存在正 相 关 (Bush 等 人 (2001)Rec.Sdv.Tob.Sci, 27 : 23-46 ; 和 Shi 等 人 (2000)Tob.Chem.Res. Conf.54 : Abstract 27)。 然而, 由于转换的原因, 在白肋烟植物中将降烟碱水平保持在最低 水平是非常困难的。 植物育种者和种子生产者传统上负责使积累高水平降烟碱的白肋烟植 物的数量减少至最少。 尽管最终生长在田间的转换子的百分比通过在种子库 (seed stock) 繁殖过程中除去 (roguing) 转换子而减少。不幸地, 该方法花费高, 非常费时并且有缺陷。
     在植物转换后, 高降烟碱性状以单显性基因的形式遗传 (Griffith 等人 (1955) Science 121 : 343-344 ; Burke & Jeffrey(1958)Tob.Sci.2 : 139-141 ; 和 Man 等人 (1964) Crop Sci.4 : 349-353)。然而该基因的性质目前还不清楚。在最简单的场景中, 转换基因座 (conversionlocus) 可代表在转换子中可能通过动员突变诱导性转座元件重新获得其功能
     的无功能烟碱 N- 脱甲基酶基因。备选地, 转换子基因座可编码起始最终使得转换子能够将 烟碱代谢成降烟碱的级联事件的蛋白质, 这表明可能牵涉多个基因。
     无论存在一个还是许多个与转换相关的基因, 编码具有烟碱脱甲基酶活性的多 肽的基因在该过程中起着中枢作用。虽然不能从粗制提取物中纯化活性烟碱 N- 脱甲基 酶阻碍了该酶的分离和鉴定, 但存在一些证据证明单加氧酶的细胞色素 P450 超家族的 成员可能牵涉其中 (Hao & Yeoman(1996)Phytochem.41 : 477-482 ; Hao & Yeoman(1996) Phytochem.42 : 325-329 ; Chelvarajan 等人 (1993)J.Agric, FoodChem.41 : 858-862 ; 和 Hao & Yeoman(1998)J.Plant Physiol.152 : 420-426)。 不幸地, 这些研究不是结论性的, 因为经 典 P450 抑制剂例如一氧化碳和 tetcylasis 不能以与其他报导的 P450 介导的反应相当的 速率降低酶活性 (Chelvarajan 等人 (1993)J.Agric.FoodChem.41 : 858-862)。
     此 外, 细 胞 色 素 P450 是 独 特 的 跨 膜 蛋 白 质, 其参与代谢许多种化合物 ( 由 Schuler(1996)Crit.Rev.Plant Sci.15 : 235-284 ; 和 Schuler & Werck-Reichhart(2003) Annu.Rev.Plant Biol.54 : 629-667 综述 )。 由细胞色素 P450 介导的生物化学反应的实例包 括羟基化、 脱甲基化和环氧化。在植物中, 细胞色素 P450 基因家族非常大。例如, 总基因组 序列检查在拟南芥中发现 272 个预测的细胞色素 P450 基因和在稻中发现至少 455 个独特 的细胞色素 P450 基因 ( 参见, 例如, Nelson 等人 (2004)Plant Physiol.135(2) : 756-772)。 即使细胞色素 P450 牵涉烟碱至降烟碱的转化, 该蛋白质家族的至关重要的参与成员的鉴 定仍然是个挑战。
     除了用作 NNN 的前体外, 最近的研究表明烟草制品中发现的降烟碱具有不期望 的健康后果。例如, Dickerson & Janda 证明降烟碱在细胞内引起异常的蛋白质糖基化 (Dickerson & Janda(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99 : 15084-15088)。 同样, 降烟碱 - 修 饰蛋白的浓度在吸烟者的血浆中远比非吸烟者高。此外, 降烟碱可共价修饰经常开于处方 中的类固醇药物例如泼尼松, 这可以改变此类药物的功效和毒性。
     考虑到与转换相关的困难以及降烟碱积累的不期望的健康效应, 因而期望获得用 于减少烟草品种特别地白肋烟植物中的降烟碱含量的改进方法。 此类方法不仅帮助改善上 述的降烟碱本身的潜在负面健康后果, 而且还帮助降低 NNN 水平。
     发明概述
     提供了用于减少作为烟草属的成员的植物中降烟碱含量的组合物和方法。组合 物包括参与植物特别地烟草属物种中烟碱至降烟碱的转化的分离的细胞色素 P450 多核苷 酸和多肽。分离的多核苷酸包括包含 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 中所示的核酸序列、 编码 SEQ ID NO : 2, 5-12, 14-24 中所示的多肽的核酸序列的多核苷酸, 以及其片段和变体。本发明的分 离的多肽包括包含 SEQ ID NO : 2, 5-12 或 14-24 中所示的氨基酸序列、 由 SEQ ID NO : 1, 3或 4 中所示的核酸序列编码的氨基酸序列的多肽, 以及其片段和变体。
     在第一方面, 本发明概述为可在植物中抑制参与烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱 脱甲基酶 ( 包括本发明的烟碱脱甲基酶 ) 的表达的多核苷酸。本发明提供了具有能够在 植物细胞中发挥功能的有效连接至核酸序列的启动子的分离的多核苷酸, 所述核酸序列包 含 SEQ ID NO : 1 的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域, 所述区域从选自在位点 253、 353、 647、 733、 1050、 1397 和其组合上的核酸的序列获得。本发明还提供了包含编码绿 叶烟碱脱甲基酶的核酸序列的分离的多核苷酸, 其中编码的烟碱脱甲基酶的氨基酸序列在选自残基 235, 449, 174, 410, 224, 72, 143 和 422 的位点中的氨基酸残基上具有置换, 其中编 号根据 SEQ ID NO : 2。还提供的是分离的多核苷酸, 其包含能够在植物细胞中发挥功能的 启动子, 所述启动子与包含 SEQ ID NO : 4 的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域 的核酸序列有效连接。还提供的是编码 SEQ ID NO : 2 中所示的氨基酸序列 ( 其具有与其他 P450 多肽不同的残基至保守残基的突变 ) 的分离的多核苷酸。 备选地, 还提供的是编码 SEQ ID NO : 2 中所示的氨基酸序列 ( 其在选自残基 85、 118、 216、 245 和 466 的位点上具有突变, 其中 85 位上的残基不是异亮氨酸, 118 位上的残基不是天冬酰胺, 216 位上的残基不是酪氨 酸, 245 位上的残基不是酪氨酸以及 466 位上的残基不是缬氨酸 ) 的分离的多核苷酸。
     在第二方面, 本发明概述为包含编码 SEQ ID NO : 2 的氨基酸序列的多核苷酸的表 达盒, 所述多核苷酸有效连接至在植物细胞中具有功能的启动子。本发明提供了包含多核 苷酸的表达盒, 所述多核苷酸包含与在植物细胞中具有功能的启动子有效连接的 SEQ ID NO : 3 的核酸序列或其至少 25 个连续核苷酸的片段。还提供了包含 SEQ ID NO : 3 的核酸序 列的至少 25 个核苷酸的分离的多核苷酸。另外提供的是包含选自 SEQ ID NO : 2, 5-12 和 14-24 的氨基酸序列的分离的多肽。在第二方面的一个实施方案中, 分离的多肽包含与 SEQ ID NO : 2 99%同一的氨基酸序列, 从而其能够在烟草的绿叶中将烟碱转化成降烟碱。 在第三方面, 本发明概述为包含表达盒的烟草属植物或其植物部分, 所述表达盒 编码 SEQ ID NO : 2、 其片段或任一个的互补序列。还提供的是与非转基因植物相比较在绿 叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物, 所述植物包含含有能够 在植物细胞中发挥功能的启动子的外源核酸构建体, 所述启动子有效地连接至具有第一核 酸序列 ( 所述序列包含编码 SEQ ID NO : 2 的氨基酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大 约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域 ) 和能够与第一序列形成双链 RNA 的第二核酸 序列的多核苷酸。 还提供的是与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟 碱转化率的转基因烟草属植物, 所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的 外源核酸构建体, 所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列 ( 所述序列包含具有 SEQ ID NO : 3 的核酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸 的区域 ) 和能够与第一序列形成双链 RNA 的第二核酸序列的多核苷酸。还提供的是与非转 基因植物相比较, 在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱转化率的转基因烟草属植物, 所 述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源核酸构建体, 所述启动子有效 地连接至具有第一核酸序列 ( 所述序列包含具有 SEQ ID NO : 4 的核酸序列的绿叶烟草烟碱 脱甲基酶序列的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区域 ) 和能够与第一序列形成双 链 RNA 的第二核酸序列的多核苷酸。
     在第四方面, 本发明概述为与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱 至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物的种子, 所述植物包含能够在植物细胞中发挥功能 的异源启动子, 所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列 ( 所述序列包含具有 SEQ ID NO : 4 的氨基酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约 100 个核苷酸至大约 350 个核苷 酸的区域 ) 和能够与第一序列形成双链 RNA 的第二核酸序列的多核苷酸。还提供的是可 再生烟草细胞的组织培养物, 其包含含有第一多核苷酸 ( 所述多核苷酸具有 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 的核酸序列的片段 ) 和能够与第一多核苷酸形成双链 RNA 的第二多核苷酸的植物细 胞。
     在第五方面, 本发明概述为烟草制品, 所述烟草制品包含与非转基因植物相比较 在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物细胞, 所述植物细胞 包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子, 所述异源启动子有效地连接至具有第一核 酸序列 ( 所述序列包含具有 SEQ ID NO : 4 的核酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约 100 个核苷酸与大约 350 个核苷酸的区域 ) 和能够与第一核酸序列形成双链 RNA 的第二多 核苷酸的多核苷酸。 还提供的是具有经改变抑制至少绿叶烟碱脱甲基酶的表达的基因组的 烟草细胞, 其中所述细胞对于编码绿叶烟碱脱甲基酶的基因中的突变是纯合的。还提供的 是包含转基因的烟草细胞, 所述转基因包含侧翼连接选择标记基因的绿叶烟碱脱甲基酶核 酸序列, 其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因, 从而产生其中内源绿叶烟碱脱甲基 酶基因已被破坏的烟草细胞。 备选地, 提供的是包含转基因的烟草细胞, 所述转基因包含侧 翼连接选择标记基因的绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列, 其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基 酶基因, 从而产生其中内源绿叶烟碱脱甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。
     在第六方面, 本发明概述为用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱水平 的方法, 所述方法包括 a) 抑制烟碱脱甲基酶的表达, 其中烟碱脱甲基酶具有 SEQ ID NOs : 2 和 5-12 中所示的氨基酸序列 ; 和 b) 降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。 还 提供的是降低烟草制品中降烟碱的水平的方法, 所述方法包括 a) 种植转基因烟草植物, 其 中植物具有包含含有异源启动子和烟碱脱甲基酶的表达盒的植物部分, 其中烟碱脱甲基酶 具有选自 SEQ ID NOs : 2 和 5-12 的氨基酸序列 ; 和 b) 从烟草植物部分制备烟草制品。 还提 供的是用于降低烟草制品中降烟碱的水平的方法, 所述方法包括 a) 种植转基因烟草植物, 其中植物具有包含特异性结合具有选自 SEQ ID NOs : 2 和 5-12 的氨基酸序列的多肽的抗体 的植物部分 ; 和 b) 从烟草植物部分制备烟草制品。备选地, 提供的是降低烟草制品中降烟 碱的水平的方法, 所述方法包括 a) 种植转基因烟草植物, 其中植物具有包含与异源启动子 有效连接的绿叶烟碱脱甲基酶的片段的植物部分, 并且所述片段具有来自编码选自 SEQ ID NOs : 2 和 5-12 的多肽的多核苷酸的至少 25 个连续核苷酸 ; 和 b) 从烟草植物部分制备烟草 制品。还提供的是用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法, 所述方 法包括 a) 修饰功能性 CYP82E5v2 等位基因以将等位基因变成无功能的 CYP82E5v2, 其中无 功能的 CYP82E5v2 在选自残基 235, 449, 174, 410, 224, 72, 143 和 422 的位点的氨基酸残基 上具有置换, 其中编号根据 SEQ ID NO : 2; 和 b) 降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟 碱的水平。本发明还提供了用于减少烟草制品的致癌潜能的方法, 所述方法包括通过 a) 种 植转基因烟草植物, 其中植物包括包含与异源启动子有效连接的绿叶烟碱脱甲基酶的片段 的植物部分, 并且所述片段包含来自编码选自 SEQ ID NOs : 2 和 5-12 的多肽的多核苷酸的 至少 25 个连续核苷酸 ; 和 b) 从烟草植物部分制备烟草制品来制备烟草制品。此外, 本发明 提供了减少烟草属植物中烟碱至降烟碱的转化的方法, 所述方法包括 : a) 用包含能够在植 物中发挥功能的启动子的核酸构建体转化烟草属植物, 所述启动子有效地连接至具有第一 核酸序列 ( 所述序列包含 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 的 100 个核苷酸至大约 350 个核苷酸的区 域 ) 和能够与第一序列形成双链 RNA 的第二核酸序列的多核苷酸 ; 和 b) 再生转基因烟草属 植物。
     在第七方面, 本发明概述为筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法, 所述方法包括 a) 获得与 SEQ ID NO : 1 具有至少 200 个核苷酸的序列同一性的核酸序列 ; 和 b) 鉴定在编码的多肽的位点 422 上编码终止密码子的密码子序列, 其中编号根据 SEQ ID NO : 2。 还提供的是 筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法, 所述方法包括 a) 获得与 SEQ ID NO : 1 具有至少 200 个 核苷酸的序列同一性的核酸序列 ; 和 b) 鉴定在编码的多肽的位点 449 上编码不是脯氨酸的 密码子的密码子序列, 其中编号根据 SEQ ID NO : 2。 还提供的是用于鉴定具有低水平的降烟 碱的烟草植物的方法, 所述方法包括 a) 从目的烟草植物获得 DNA 样品 ; 和 b) 就 SEQ IDNO : 1 中的突变筛选样品。本发明还提供了用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的 水平的方法, 所述方法包括 a) 抑制 CYP82E4v2 烟碱脱甲基酶和 CYP82E5v2 烟碱脱甲基酶的 表达 ; 和 b) 降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。 还提供的是包含多肽的烟 草植物材料, 所述多肽具有在选自残基 458、 364、 329 和其组合的位点上具有突变的 SEQ ID NO : 13 的氨基酸序列。此外还包括的是包含在选自残基 458, 364, 329 和其组合的位点上具 有突变的 CYP82E4v2 的烟草植物材料, 其中编号根据 SEQ ID NO : 13。还包括的是包含在残 基 376 上具有突变的 CYP82E4v2 的烟草植物材料, 其中所述残基不是缬氨酸并且残基的编 号根据 SEQ ID NO : 13。
     附图概述
     图 1A-C 显示已在酵母和 / 或转基因植物中就烟碱脱甲基酶活性进行了测定的 CYP82E2 基因家族成员的氨基酸序列比对。以斜体字和下划线标示的序列对于烟碱脱甲基 酶活性是阳性的 (CYP82E4v2 和 CYP82E5v2) ; 以黑色开头的序列在测定中未显示活性。 在成 员之间不同的残基以灰色阴影标示。在图 1 中, CYP82E4v2 示于 SEQ ID NO : 13 ; CYP82E4v6 示于 SEQ ID NO : 26 ; CYP82E4v12 示于 SEQ ID NO : 27 ; 58-166 示于 SEQ ID NO : 28 ; CYP82E3 示 于 SEQ ID NO : 29 ; CYP82E2v1 示 于 SEQID NO : 30 ; CYP82E2v2 示 于 SEQ ID NO : 31 ; 和 CYP82E5v2 示于 SEQ IDNO : 2。
     核酸序列的描述
     SEQ ID NO : 1 显示 CYP82E5v2 的编码区的核酸序列。
     SEQ ID NO : 2 显示 CYP82E5v2 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 3 显示 CYP82E5v2 的内含子的核酸序列。
     SEQ ID NO : 4 显示基因组 CYP82E5v2 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 5 显示 CYP82E5v2 P235S 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 6 显示 CYP82E5v2 P449L 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 7 显示 CYP82E5v2 S174L 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 8 显示 CYP82E5v2 A410V 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 9 显示 CYP82E5v2 M224I 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 10 显示 CYP82E5v2 P72L 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 11 显示 CYP82E5v2 L143F 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 12 显示 CYP82E5v2 W422Stop 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 13 显示 CYP82E4v2 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 14 显示 CYP82E4v2 P458S 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 15 显示 CYP82E4v2 K364N 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 16 显示 CYP82E4v2 P38L 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 17 显示 CYP82E4v2 E201K 的氨基酸序列。SEQ ID NO : 18 显示 CYP82E4v2 R169Q 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 19 显示 CYP82E4v2 G459R 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 20 显示 CYP82E4v2 E296K 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 21 显示 CYP82E4v2 T427I 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 22 显示 CYP82E4v2 W329Stop 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 23 显示 CYP82E4v2 V376M 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 24 显示 CYP82E4v2 D171N 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 25 显示 CYP82E4 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 26 显示 CYP82E4v6 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 27 显示 CYP82E4v12 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 28 显示 58-166 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 29 显示 CYP82E3 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 30 显示 CYP82E2v1 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 31 显示 CYP82E2v2 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 32 显示用于 CYP82E4v2 的外显子 1 的正向引物的核酸序列。
     SEQ ID NO : 33 显示用于 CYP82E4v2 的外显子 1 的反向引物的核酸序列。
     SEQ ID NO : 34 显示用于 CYP82E4v2 的外显子 2 的正向引物的核酸序列。
     SEQ ID NO : 35 显示用于 CYP82E4v2 的外显子 2 的反向引物的核酸序列。
     SEQ ID NO : 36 显示用于 CYP82E5v2 的外显子 1 的正向引物的核酸序列。
     SEQ ID NO : 37 显示用于 CYP82E5v2 的外显子 1 的反向引物的核酸序列。
     SEQ ID NO : 38 显示用于 CYP82E5v2 的外显子 2 的正向引物的核酸序列。
     SEQ ID NO : 39 显示用于 CYP82E5v2 的外显子 2 的反向引物的核酸序列。
     SEQ ID NO : 40 显示引物 E5Gen_F1 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 41 显示引物 E5Gen_R1 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 42 显示引物 E5Gen_F2 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 43 显示引物 E5Gen_R2 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 44 显示引物 E4Rt_F 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 45 显示引物 E4Rt_R 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 46 显示引物 E5Rt_F 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 47 显示引物 E5Rt_R 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 48 显示引物 G3PDH_F 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 49 显示引物 G3PDH_R 的核酸序列。
     SEQ ID NO : 50 显示 CYP82E4v2 的编码区的核酸序列和编码的蛋白质 ( 即, SEQ ID NO : 13)。
     定义
     本发明包括用于抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达或功能的组合物和方法, 所述多肽 参与植物, 特别地烟草属植物 ( 包括各种商业品种的烟草植物 ) 中烟碱至降烟碱的代谢转 化。
     如本文中使用的, “抑制” 、 “阻抑” 和 “阻止” 被定义为本领域已知的或本文中描述的减少目的基因产物 ( 即, 靶基因产物 ) 的表达或功能的任何方法。
     “抑制” 可用于两种植物 ( 例如, 遗传改变的植物对野生型植物 ) 之间的比较的背 景中。比较可在植物之间进行, 其中一种植物缺乏能够减少试剂的 DNA 序列。靶基因产物 的表达或功能的抑制还可用于相同植物内的植物细胞、 细胞器、 器官、 组织或植物部分之间 或不同植物之间的比较的背景中, 包括相同植物或植物部分中发育阶段或时相阶段之间或 植物或植物部分之间的比较。
     “抑制” 可包括目的基因产物的功能或产量的任何相对减少, 直至和包括该基因 产物的功能或产生的完全消除。当比较试剂的水平时, 优选在具有相似遗传背景的生物之 间进行这样的比较。优选, 相似的遗传背景是其中待比较的生物共有 50%或更大, 更优选 75%或更大和更优选 90%或更大的核遗传物质的序列同一性的背景。 相似的遗传背景是其 中待比较的生物是植物并且除了最初使用植物转化技术导入的任何遗传物质或通过人干 预产生的突变外植物是同基因的背景。 试剂的水平或量的测量可通过任何合适的方法来进 行, 其非限定性实例包括但不限于 mRNA 转录物水平、 蛋白质或肽的水平、 和 / 或表型, 特别 是烟碱至降烟碱的转化的比较。如本文中所使用的, mRNA 转录物可包括加工的和未加工的 mRNA 转录物, 多肽或肽可包括具有或不具有任何翻译后修饰的多肽或肽。
     如本文中所使用的, “宿主细胞” 意指包含本发明的异源核酸序列的细胞。尽管 可将本发明的核酸序列和其片段及变体导入任何目的细胞, 但特别感兴趣的细胞是植物细 胞, 更特别地烟草属植物物种, 例如下面描述的烟草植物物种和变种的细胞。
     如本文中所使用的, “变体” 意指大体上相似的序列。变体可具有与目的野生型多 肽不同的功能或与其大体上相似的功能。对于烟碱脱甲基酶, 大体上相似的功能是在相同 条件下或在接近同基因的品系中至少 99%、 98%、 97%、 95%、 90%、 85%、 80%、 75%、 60%、 50%、 25%或 15%的野生型酶的将烟碱转化成降烟碱的功能。野生型 CYP82E5v2 是 SEQ ID NO : 2。野生型 CYP82E4v2 是 SEQ ID NO : 13。如本文中所使用的, “变异多核苷酸” 或 “变异 多肽” 意指不为野生型的核酸或氨基酸序列。
     变体可具有 1 个添加、 缺失或置换 ; 2 个或更少的添加、 缺失或置换 ; 3 个或更少的 添加、 缺失或置换 ; 4 个或更少的添加、 缺失或置换 ; 或 5 个或更少的添加、 缺失或置换。 突变 包括添加、 缺失和置换。此类缺失或添加可在 C 末端、 N 末端或 C 和 N 末端。融合多肽或带 有表位标签的多肽也包括在本发明中。 “沉默” 核苷酸突变不改变给定的位点上的编码的氨 基酸。氨基酸置换可以是保守的。保守置换是氨基酸的变化, 其中变化是至与原始氨基酸 相同的氨基酸家族内的氨基酸的变化。家族根据个体氨基酸的侧链来定义。氨基酸的家族 可具有碱性、 酸性、 不带电荷的极性或非极性侧链。参见, Alberts 等人, (1994)Molecular biology of the cell( 第 3 版, 第 56-57 页, GarlandPublishing Inc., New York, New York), 其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。可在相同位点对另一个 CYP82E 家族成员的氨基酸进行缺失、 置换或添加。参见, 图 1A-C。如本文中所使用的, “片段” 意指 多核苷酸的部分或多肽的部分, 以及由其编码的蛋白质。
     如本文中所使用的, “植物部分” 意指可从其再生完整植物的植物细胞、 植物原生 质体、 植物细胞组织培养物, 在植物中或植物的部分例如胚、 花粉、 花药、 胚珠、 种子、 叶、 花、 茎、 枝、 果实、 根、 根尖等中完整的植物愈伤组织、 植物团块 (plant clump) 和植物细胞。再 生植物的后代、 变体和突变体也包括在本发明的范围内, 只要它们包含导入的本发明的多核苷酸。如本文中所使用的, “烟草植物材料” 意指植物部分的任何部分或植物部分的任何 组合。
     如本文中所使用的, “有效连接的” 意指两个或多个元件之间的功能性连接。例如, 目的多核苷酸与调控序列 ( 即, 启动子 ) 之间的有效连接是允许目的多核苷酸表达的功能 性连接。有效连接的元件可以是连续或非连续的。当用于指两个蛋白质编码区的融合时, 有效连接意指编码区符合相同的阅读框架。
     如本文中所使用的, “异源” 意指源自外源物种的序列, 或, 如果来自相同物种, 基 本上在组成和 / 或基因组基因座上通过有意的人工干预从其天然形式修饰而来的序列。例 如, 与异源多核苷酸有效连接的启动子来自与所述多核苷酸所源自的物种不同的物种, 或 者, 如果来自相同 / 类似物种, 其一或两者基本上从它们的原始形式和 / 或基因组基因座修 饰而来, 或启动子对于有效连接的多核苷酸来说不是天然启动子。此外, 如本文中所使用 的, “嵌合基因” 意指与对于编码序列是异源的转录起始区有效连接的编码序列。
     发明详述
     烟碱脱甲基酶多核苷酸和多肽以及其变体和片段
     本发明的组合物包括细胞色素 P450 多肽。细胞色素 P450 多肽可具有烟碱脱甲基 酶活性。此类烟碱脱甲基酶多核苷酸和多肽参与植物 ( 包括烟草植物的商业品种 ) 中烟碱 至降烟碱的代谢转化。还包括的是此类烟碱脱甲基酶的变体。特别地, 本发明的组合物包 括包含 SEQ IDNOS : 2 和 5-24 中显示的氨基酸序列的分离的多肽、 包含 SEQ ID NOS : 1, 3和 4 中显示的核酸序列的分离的多核苷酸和编码包含 SEQ ID NOS : 2 和 5-24 的氨基酸序列的 多肽的分离的多核苷酸。 本发明的多核苷酸可用于抑制参与植物特别地烟草植物中烟碱至 降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶多肽或其变体的表达。 一些本发明的多核苷酸具有抑制 野生型烟碱脱甲基酶的烟碱脱甲基酶活性的突变。本发明的多肽的抑制在降低烟草品系 ( 其中遗传转换在少于 30%、 50%、 70%和 90%的群体中发生 ) 例如烤烟的降烟碱水平中 是有效的。本发明的多肽的抑制在降低烟草群体 ( 其中遗传转换在至少 90%、 80%、 70%、 60%和 50%的植物群体中发生 ) 的降烟碱水平中是有效的。 群体优选包含多于大约 25、 50、 100、 500、 1,000、 5,000 或 25,000 株植物, 其中更优选至少大约 10%、 25%、 50%、 75%、 95% 或 100%的植物包含本发明的多肽。
     本发明还提供表达盒, 所述表达盒包含具有 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 中所示的核酸序 列的多核苷酸的全部或部分, 和编码具有 SEQ ID NOS : 2 和 5-24 的氨基酸序列的多肽的分 离的多核苷酸, 其互补序列或片段, 或与 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 具有大体上的序列同一性的序 列, 或编码具有 SEQ ID NOS : 2 和 5-24 的氨基酸序列的多肽的多核苷酸, 或其互补序列或片 段, 与异源启动子有效连接, 所述启动子在用于表达干扰烟碱脱甲基酶多肽的表达 ( 即, 转 录和 / 或翻译 ) 的抑制性 RNA 转录物的植物细胞中是有功能的。在一些实施方案中, 表达 盒包含 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 中所示的核苷酸序列, 其互补序列或片段, 或与 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 具有大体上的序列同一性的序列, 或其互补序列或片段。将此类表达盒导入目的烟 草属植物 ( 特别是通常称为烤烟品种或浅色烟品种、 白肋烟品种、 深色烟品种和东方型 / 土 耳其烟品种的烟草植物品种 ), 导致具有减少的降烟碱和 NNN 的量的烟草植物的产生。来 自此类转基因植物的叶和茎材料可用于产生多种具有降低的降烟碱水平和相伴减少的 NNN 的烟草制品。本发明的烟碱脱甲基酶多核苷酸和编码的多肽包括称为 CYP82E5v2 烟碱脱甲基 酶基因的新的细胞色素 P450 基因, 其新近被鉴定为在烟草植物的烟碱至降烟碱的代谢转 化中具有作用。 转基因烟草植物中编码的多肽的表达的抑制导致此类转基因植物的绿叶中 降烟碱的积累显著减少。然而不受理论束缚, 此类多肽的代谢作用可以是直接作用, 即, 直 接催化 N- 脱甲基化反应, 或间接作用, 即产生导致叶的烟碱脱甲基酶活性的上调的产物。 无论什么机制, 借以在烟草属植物中靶向本发明的多肽的表达和 / 或功能以进行抑制或定 点诱变的任何方法在降低此类植物的叶和茎中的降烟碱的水平和 NNN 的水平中是有效的。
     本发明包括分离的或大体上纯化的本发明的多核苷酸或多肽组合物。 “分离的” 或 “纯化的” 多核苷酸或多肽或其生物学活性部分大体上或基本上不含通常伴随多核苷酸 或蛋白质或与其相互作用的组分, 如在其天然发生环境中发现的。 因此, 分离的或纯化的多 核苷酸或多肽基本上不含其他细胞材料或培养基 ( 当通过重组技术产生时 ) 或基本上不含 化学前体或其他化学药品 ( 当化学合成时 )。最佳地, “分离的” 多核苷酸不含在所述多核 苷酸所源自的生物的基因组 DNA 中天然侧翼于所述多核苷酸的序列 ( 最佳地蛋白质编码序 列 )( 即, 位于所述多核苷酸的 5′和 3′末端的序列 )。 例如, 在不同的实施方案中, 分离的 多核苷酸可包含小于大约 5kb、 4kb、 3kb、 2kb、 1kb、 0.5kb 或 0.1kb 的在所述多核苷酸所源自 的细胞的基因组 DNA 中天然侧翼于所述多核苷酸的核苷酸序列。基本上不含细胞材料的多 肽包括具有低于大约 30%, 20%, 10%, 5%或 1% ( 按干重计算 ) 的污染性蛋白质的制剂。 当重组产生本发明的多肽或其生物学活性部分时, 最佳地培养基代表低于大约 30%, 20%, 10%, 5%或 1% ( 按干重计算 ) 的化学前体或非目的蛋白化学药品。 公开的多核苷酸的片段和由其编码的多肽也包括在本发明中。 多核苷酸的片段可 编码保持天然多肽的生物学活性, 从而参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的多肽片段。 备选地, 用作杂交探针或 PCR 引物 ( 使用下述方法 ) 的多核苷酸的片段一般不编码保持生 物学活性的片段多肽。此外, 公开的多核苷酸的片段包括可在用于基因沉默 ( 使用本领域 内已知的任何方法 ) 的重组构建体内装配的那些, 所述方法包括但不限于有义抑制 / 共抑 制、 反义抑制、 双链 RNA(dsRNA) 干扰、 发夹 RNA 干扰和包含内含子的发夹 RNA 干扰、 扩增子 介导的干扰、 核酶和小干扰 RNA 或微 RNA, 如本领域中和下文中所描述的。 因此, 取决于期望 的结果, 多核苷酸的片段可在至少大约 20 个核苷酸、 大约 50 个核苷酸、 大约 70 个核苷酸、 大约 100 个核苷酸、 大约 150 个核苷酸、 大约 200 个核苷酸、 250 个核苷酸、 300 个核苷酸直 至编码本发明的多肽的全长多核苷酸的范围内。例如, 多核苷酸的片段的长度可以是 100 至大约 350 个核苷酸、 100 至大约 325 个核苷酸、 100 至大约 300 个核苷酸、 大约 125 至大约 300 个核苷酸、 大约 125 至大约 275 个核苷酸、 大约 200 至大约 320 个连续核苷酸、 大约 200 至大约 420 个连续核苷酸、 大约 250 至大约 450 个连续核苷酸。备选地, 片段的长度可以是 大约 300 至大约 450 个连续核苷酸。
     编码本发明的细胞色素 P450 多肽的生物学活性部分的本发明的烟碱脱甲基酶多 核苷酸的片段将编码至少 15、 25、 30、 50、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 250、 300、 350、 400、 450 或 500 个连续氨基酸, 或直至存在于本发明的全长烟碱脱甲基酶多肽中的总氨基酸数目 ( 例如, 对于 SEQ ID NOS : 2 和 5, 517 个氨基酸 ), 或将编码至少 15、 25、 30、 50、 75、 100、 125、 150 个氨基酸或直至存在于本发明的部分长度的细胞色素 P450 多肽中的总氨基酸数目 ( 例 如, 对于 SEQ IDNO : 12, 422 个氨基酸 )。优选, 片段包含直至所编码的多肽的氨基酸残基
     330。可通过下述来制备烟碱脱甲基酶多肽的生物学活性部分 : 分离本发明的一个细胞色 素 P450 多核苷酸的部分, 表达所编码的细胞色素 P450 多肽的部分 ( 例如, 通过体外重组表 达 ), 然后使用本领域内已知的测定法和本文中下面提供的测定法估量所编码的细胞色素 P450 多肽的部分的活性, 即促进烟碱至降烟碱的转化的能力。
     作为本发明的细胞色素 P450 核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少 16、 20、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 800、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 1250、 1300、 1350、 1400、 1450、 1500、 1550、 1600、 1650 或 1700 个 连 续 核 苷 酸, 或直至存在于本文中公开的全长细胞色素 P450 多核苷酸中的核苷酸数目 ( 例如, 对于 SEQ ID NO : 1, 1554 个核苷酸 ; 或对于 SEQ ID NO : 4, 2608 个核苷酸 )。作为本发明的细胞 色素 P450 核苷酸序列的片段的多核苷酸包含大约 20 至大约 1700 个连续核苷酸, 大约 50 至大约 1600 个连续核苷酸, 大约 75 至大约 1500 个连续核苷酸, 大约 100 至大约 1400 个连 续核苷酸, 大约 150 至大约 1300 个连续核苷酸, 大约 150 至大约 1200 个连续核苷酸, 大约 175 至大约 1100 个连续核苷酸, 大约 200 至大约 1000 个连续核苷酸, 大约 225 至大约 900 个连续核苷酸, 大约 500 至大约 1600 个连续核苷酸, 大约 775 至大约 1700 个连续核苷酸, 大约 1000 至大约 1700 个连续核苷酸, 或大约 300 至大约 800 个连续核苷酸的来自本文中 公开的细胞色素 P450 多核苷酸的片段。例如, 多核苷酸片段可包含多核苷酸序列, 所述多 核苷酸序列含有来自在细胞色素 P450 编码序列的大约位点 700 至大约位点 1250 上的, 在 细胞色素 P450 基因组序列的大约位点 700 至大约位点 1250 上的, 在细胞色素 P450 内含子 序列的大约位点 10 至大约位点 900 上的, 或在细胞色素 P450 内含子序列的大约位点 100 至大约位点 800 上的多核苷酸的核酸序列。
     本发明还包括公开的多核苷酸的变体和由其编码的多肽。 天然发生的变体包括与 本文中公开的细胞色素 P450 多核苷酸和多肽共有大体上的序列同一性的变体。天然发生 的变体可与本文中公开的细胞色素 P450 多核苷酸共有大体上的功能同一性。本发明的组 合物和方法可用于靶向任何天然发生的细胞色素 P450 的表达或功能, 所述细胞色素 P450 与公开的细胞色素 P450 多肽共有大体上的序列同一性。此类细胞色素 P450 可具有或不具 有相关的细胞色素 P450 活性, 即, 参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化。此类变体可通过 例如遗传多态性或人工操作 ( 如通过育种和选择发生 ) 产生。本发明的细胞色素 P450 蛋 白的生物学活性变体例如 SEQ ID NO : 2 和 5-24 中所示的多肽的变体, 将与野生型蛋白的 氨基酸序列具有至少大约 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更大的序列同一性, 如通过本文中其 他地方描述的序列比对程序和参数所测定的, 并且可以表征为功能性参与或不参与植物中 烟碱至降烟碱的代谢转化。 本发明的多肽的生物学活性变体可以与野生型多肽相异于少至 1-15 个氨基酸残基, 少至 10 个, 少至 9 个, 少至 8 个, 少至 7 个, 少至 6 个, 少至 5 个, 少至 4 个, 少至 3 个, 少至 2 或少至 1 个氨基酸残基。本发明的蛋白的生物学无活性变体可与该多 肽相异于少至 1 至 15 个氨基酸残基, 少至 10 个, 少至 9 个, 少至 8 个, 少至 7 个, 少至 6 个, 少至 5 个, 少至 4 个, 少至 3 个, 少至 2 个或少至 1 个氨基酸残基。
     本发明的多核苷酸的变体包括天然发生的多核苷酸, 所述多核苷酸编码参与植物 中烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶多肽。 此类多核苷酸变体可在本文中公开的天 然多核苷酸内的一个或多个位点上包含一个或多个核苷酸的缺失和 / 或添加和 / 或在天然多核苷酸中的一个或多个位点上包含一个或多个核苷酸的置换。由于遗传密码子的简并 性, 多核苷酸的保守变体包括编码本发明的细胞色素 P450 多肽之一的氨基酸序列的那些 序列。 天然发生的变体例如此类变体可利用熟知的分子生物学技术例如用本领域内已知的 和本文中公开的聚合酶链式反应 (PCR) 和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源 的多核苷酸, 例如通过例如使用定点诱变产生的但与本文中公开的天然发生的序列仍然共 有大体上的序列同一性, 从而可用于本发明的方法以抑制参与烟碱至降烟碱的代谢转化的 烟碱脱甲基酶 ( 包括 SEQ ID NOS : 2、 5、 7-11、 13、 16-21 和 23-24 中所示的烟碱脱甲基酶多 肽 ) 的表达或功能的多核苷酸。通常, 本发明的特定多核苷酸 ( 例如, SEQ ID NO : 3 的多核 苷酸序列或编码 SEQ ID NO : 2 和 5-24 中所示的氨基酸序列的多核苷酸序列 ) 的变体, 将与 该特定多核苷酸具有至少大约 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或更大的序列同一性, 如通过本 文中其他地方描述的序列比对程序和参数所测定的。
     本发明的特定多核苷酸 ( 也称为参照多核苷酸 ) 的变体还可通过比较由参照多核 苷酸编码的多肽与由变体多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性来估量。 任何两个 多肽之间的百分比序列同一性可使用本文中其他地方描述的序列比对程序和参数来计算。 当通过比较由它们编码的两个多肽所共有的百分比序列同一性来评估任何给定的本发明 的多核苷酸对时, 两个编码的多肽之间的百分比序列同一性为至少大约 40%、 45%、 50%、 55 %、 60 %、 65 %、 70 %、 75 %、 80 %、 85 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或更大的序列同一性。本发明的变体多肽可包括在细胞色素 P450 多肽的位点 458 上具有丝氨酸、 位点 364 上具有天冬酰胺、 在细胞色素 P450 的位点 329 上具有终止密码 子或其任何组合的多肽, 其中编号相应于 SEQ ID NO : 13。
     此外, 本发明的多核苷酸可用于从其他生物, 特别地其他植物, 更特别地烟草属的 其他成员分离相应的细胞色素 P450 序列。PCR、 杂交和其他类似的方法可用于鉴定此类序 列 ( 基于它们与本文中所示序列的序列同源性 )。基于它们与本文中所示的核苷酸序列或 与其变体和片段的序列同一性分离的序列包括在本发明中。此类序列包括这样的序列, 其 是公开的序列的直系同源物。
     如本文中所使用的, “直系同源物” 意指来源于共同祖先基因的基因, 其由于物种 形成而在不同物种中发现。在不同物种中发现的基因, 当它们的核苷酸序列和 / 或它们 的编码的蛋白质序列共有至少 60%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更大的序列同一性时, 被认为是直系同源物。直系同源物的 功能在物种间通常高度保守。因此, 编码烟碱脱甲基酶多肽 ( 其参与烟碱至降烟碱的代谢 转化 ) 并且在严格条件下与本文中公开的细胞色素 P450 序列或与其变体或片段杂交的分 离的多核苷酸包括在本发明中。 此类序列可用于本发明的方法中以抑制参与植物中烟碱至 降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶多肽的表达。
     通过使用 PCR, 可设计寡核苷酸引物来用于 PCR 反应中以从提取自任何目的植物 的 cDNA 或基因组 DNA 扩增相应 DNA 序列。用于设计 PCR 引物和 PCR 克隆的方法通常在 本领域内是已知的, 其公开于 Sambrook 等人 (1989)Molecular cloning : a laboratory manual( 第 2 版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), Innis 等 人, eds.(1990)PCR protocols : a guide to methods andapplications(Academic Press,New York) ; Innis & Gelfand, eds.(1995)PCR strategies(Academic Press, New York) ; 和 Innis& Gelfand, eds.(1999)PCR methods manual(Academic Press, NewYork)。 已知的 PCR 方法包括但不限于使用成对引物、 嵌套此物、 单特异性引物、 简并引物、 基因特异性引物、 载 体特异性引物、 部分错配的引物等的方法。
     杂交技术包括将已知的多核苷酸的全部或部分用作探针, 所述探针与存在于来自 选择的生物的克隆的基因组 DNA 片段或 cDNA 片段的群体 ( 即, 基因组或 cDNA 文库 ) 中的 其他相应多核苷酸选择性杂交。
     可在严格条件下进行杂交。如本文中所使用的, “严格条件” 或 “严格杂交条件” 意 指这样的条件, 在该条件下探针将与其靶序列杂交至比与其他序列杂交更高的可检测程度 ( 例如, 高于背景至少 2 倍 )。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境下是不同的。通过 控制杂交和 / 或清洗条件的严格性, 可鉴定与探针 100%互补的靶序列 ( 同源探测 )。备选 地, 可调整严格性条件以允许序列中存在一些错配, 从而可检测较低程度的相似性 ( 异源 探测 )。通常, 探针在长度上短于大约 1000 个核苷酸, 最佳地在长度上短于 500 个核苷酸。
     通常, 严格条件可以是这样的条件, 其中在 pH 7.0 至 8.3 下盐浓度低于大约 1.5M Na 离子, 通常大约 0.01 至 1.0M Na 离子浓度 ( 或其他盐 ) 并且温度是至少大约 30℃。严 格条件还可通过加入去稳定剂例如甲酰胺来获得。示例性低严格条件包括使用 30 至 35% 的甲酰胺, 1M NaCl, 1% SDS( 十二烷基硫酸钠 ) 的缓冲溶液于 37℃下的杂交, 和在 1X 至 2X SSC(20X SSC = 3.0M NaCl/0.3M 柠檬酸三钠 ) 中于 50 至 55℃下的清洗。示例性中等严格 条件包括在 40 至 45%的甲酰胺, 1.0MNaCl, 1% SDS 中于 37℃下进行的杂交, 和在 0.5X 至 1X SSC 中于 55 至 60℃下进行的清洗。示例性高严格条件包括在 50%的甲酰胺, 1MNaCl, 1% SDS 中于 37℃下进行的杂交和在 0.1X SSC 中于 60 至 65℃下进行的清洗。任选地, 清 洗缓冲液可包含大约 0.1%至大约 1% SDS。杂交的持续时间通常低于大约 24 小时, 通常 大约 4 至大约 12 小时。清洗的持续时间可以为至少足以达到平衡的时间长度。
     优选, 严格条件包括在含有 5X SSC, 0.5% SDS, 5X Denhardt′ s, 0.45ug/ul poly A RNA, 0.45ug/ul 小牛胸腺 DNA 和 50%甲酰胺的溶液中于 42℃下进行的杂交, 和在包含大 约 0.01X SSC 至大约 1X SSC 的溶液中进行的至少一次杂交后清洗。杂交的持续时间是大 约 14 至大约 16 小时。
     特异性通常是杂交后清洗的函数, 临界因子 (critical factor) 是终清洗溶液的 离子强度和温度。对于 DNA-DNA 杂交, Tm 根据 Meinkoth& Wahl(1984)Anal.Biochem.138 : 267-284 的公式近似得出 : Tm = 81.5℃ +16.6(log M)+0.41(% GC)-0.61(% form)-500/L ; 其中 M 是单价阳离子的摩尔浓度, % GC 是 DNA 中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比, % form 是杂交溶液中甲酰胺的百分比, L 是碱基对形式的杂交物的长度。Tm 是 50%的互补靶序列 与完全匹配的探针杂交时所处的温度 ( 在确定的离子强度和 pH 下 )。每错配 1%, Tm 下降 大约 1℃; 因此, 可调整 Tm、 杂交和 / 或清洗条件以与具有期望的同一性的序列杂交。例如, 如果寻找具有≥ 90%的同一性的序列, 那么可将 Tm 降低 10℃。通常, 选择严格条件, 使其 比在确定的离子强度和 pH 下特定序列与其互补序列的熔解温度 (thermal melting point, Tm) 低大约 5℃。然而, 高度严格条件可使用在低于熔解温度 (Tm)1、 2、 3 或 4℃的温度下进 行的杂交和 / 或清洗 ; 中度严格条件可使用在低于熔解温度 (Tm)6、 7、 8、 9 或 10℃的温度下 进行的杂交和 / 或清洗 ; 低严格性条件可利用在低于熔解温度 (Tm)11、 12、 13、 14、 15 或 20℃的温度下进行的杂交和 / 或清洗。本领域技术人员将理解杂交和 / 或清洗溶液的严格性的 变化可通过使用公式, 杂交和清洗组合物以及期望的 Tm 进行内在描述。如果期望的错配程 度导致低于 45℃ ( 水溶液 ) 或 32℃ ( 甲酰胺溶液 ) 的 Tm, 则增加 SSC 浓度以便可使用更高 的温度是最佳的。 对核酸杂交的更详尽的指导见于 Tijssen(1993)Laboratory techniques inbiochemistry and molecular biology-hybridization with nucleicacid probes, 第 I 部分, 第 2 章 (Elsevier, New York) ; 和 Ausubel 等人, eds.(1995)Current protocols in molecular biology, 第 2 章 (Greene Publishing 和 Wiley-Interscience, New York)。 也参见, Sambrook 等人 (1989)Molecular cloning : a laboratory manual( 第 2 版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
     杂交探针可以是基因组 DNA 片段、 cDNA 片段、 RNA 片段或其他寡核苷酸, 并且可用 32 可检测基团例如 P 或任何其他可检测的标记物来标记。 例如, 用于杂交的探针可通过标记 基于本发明的细胞色素 P450 多核苷酸序列合成的寡核苷酸来制备。用于制备用于杂交的 探针和用于构建 cDNA 和基因组文库的方法通常在本领域内是已知的并且公开于 Sambrook 等人 ( 同上 ) 中。
     例如, 本文中公开的细胞色素 P430 多核苷酸或其一个或多个部分可用作能够特 异性杂交相应的细胞色素 P450 多核苷酸和信使 RNA 的探针。 为了在多种条件下获得特异性 杂交, 此类探针包括在细胞色素 P450 多核苷酸序列间是独特的或对于一种细胞色素 P450 多核苷酸序列 ( 包括编码序列的上游 5′区和编码序列的下游 3′区以及内含子区 ) 是独 特的序列, 并且优选地长度为至少大约 10 个连续核苷酸, 更优选地长度为至少大约 20 个连 续核苷酸, 更优选地长度为至少大约 50 个连续核苷酸, 更优选地长度为至少大约 75 个连续 核苷酸, 和更优选地长度为至少大约 100 个连续核苷酸。此类探针可用于扩增相应的细胞 色素 P450 多核苷酸。该技术可用于从期望的植物分离另外的编码序列或突变, 或可用作确 定植物中编码序列的存在的诊断测定。杂交技术包括涂板的 DNA 文库 ( 噬菌斑或集落 ; 参 见例如, Sambrook 等人, 同上 ) 的杂交筛选。
     如本文中所使用的, 关于两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系, 术语 “参照序列” 意指用作序列比较的基础的确定的序列。参照序列可以是指定的序列的子集 (subset) 或整体 ; 例如全长 cDNA 或基因序列的区段或完整 cDNA 或基因序列。
     如本文中所使用的, “比较窗口” 意指多核苷酸序列的连续和指定的区段, 其中比 较窗口中的多核苷酸序列, 与参照序列 ( 其不包含添加或缺失 ) 相比较, 可包含添加或缺失 ( 即, 缺口 ) 以进行两个多核苷酸的最佳比对。 通常, 比较窗口在长度上是至少 20 个连续核 苷酸, 任选地可以是 30、 40、 50 或 100 个连续核苷酸或更长。本领域技术人员理解为了避免 由于在多核苷酸序列中包含缺口而导致的与参照序列的高相似性, 通常引入缺口罚分并且 将其从匹配的数目中扣除。
     用于比较的序列比对方法在本领域内是是熟知的。因此, 任何两个序列之间百分 比序列同一性的测定可使用数学算法来完成。此类数学算法的非限定性实例是 Myers & Miller(1988)CABIOS 4 : 11-17 的算法 ; Smith 等人 (1981)Adv.Appl.Math.2 : 482 的局部比 对算法 ; Needleman & Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48 : 443-453 的全局比对算法 ; Pearson & Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85 : 2444-2448 的搜索局部比对法 (search-for-local alignmentmethod) ; Karlin & Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264 的算法, 如在 Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 : 5873-5877 中进行改进的。
     Altschul 等 人 (1990)J.Mol.Biol.215 : 403 的 BLAST 程 序 基 于 Karlin & Altschul(1990)( 同上 ) 的算法。 可使用 BLASTN 程序, 评分= 100, 字长= 12 进行 BLAST 核 苷酸搜索以获得与编码本发明的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。使用 BLASTX 程 序, 评分= 50. 字长= 3 进行 BLAST 蛋白质搜索以获得与本发明的蛋白质或多肽同源的氨 基酸序列。为了获得带缺口的比对 ( 用于比较目的 ), 可如 Altschul 等人 (1997)Nucleic Acids Res.25 : 3389 中所述使用 GappedBLAST( 在 BLAST 2.0 中 )。备选地, PSI-BLAST( 在 BLAST 2.0 中 ) 可用于进行检测分子之间的疏远关系的迭代搜索。参见 Altschul 等人 (1997), 同上。 当使用 BLAST、 带缺口的 BLAST、 PSI-BLAST 时, 可使用各自程序 ( 例如, 用于核 苷酸序列的 BLASTN, 用于蛋白质的 BLASTX) 的缺省参数 ( 参见 www.ncbi.nlna.nih.gov)。 还可通过目测来人工地进行比对。
     使 用 BLASTX(Altschul 等 人 (1997) 同 上 )、 Clustal W(Higgins 等 人 (1994) Nucleic Acids Res.22 : 4673-4680) 和 GAP(university ofWisconsin Genetic Computing Group software package) 算法, 利用缺省参数计算本文中提供的序列同一性 / 相似性值。 本发明还包括其任何等同的程序用于分析和比较核酸和蛋白质序列的用途。 “等同的程序” 意指任何这样的序列比较程序, 对于任何两个考虑的序列, 当与利用 BLASTX、 Clustal W 或 GAP 产生的相应比对相比较时, 其产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比序 列同一性的比对。
     为了本发明包括的变异核苷酸和多肽序列的上述目的, 两个多核苷酸或多肽序列 背景中的 “序列同一性” 或 “同一性” 涉及两个序列中的残基, 当就指定的比较窗口上的最 大相应性进行比对时所述残基是相同的。当百分比序列同一性用于指蛋白质时, 应认识到 不相同的残基位点通常相异在于保守氨基酸置换, 其中氨基酸残基替代为具有相似化学特 性 ( 例如, 电荷或疏水性 ) 的其他氨基酸残基, 从而不改变分子的功能特性。当序列相异在 于保守置换时, 可向上调整百分比序列同一性以就置换的保守性质进行矫正。相异在于此 类保守置换的序列据认为具有 “序列相似性” 或 “相似性” 。用于进行 (malting) 该调整的 方法对于本领域技术人员来说是熟知的。 一般地这包括将保守置换评分为部分而非完全错 配, 从而增加百分比序列同一性。因此, 例如, 在给予相同氨基酸 1 的评分且给予非保守置 换 0 的评分的情况下, 给予保守置换 0 与 1 之间的评分。计算保守置换的评分, 例如, 如程 序 PC/GENE(Intelligenetics ; Mountain View, CA) 中所进行的。
     如本文中所使用的, “序列同一性百分比” 意指通过在比较窗口上比较两个最佳比 对的序列所确定的值, 其中与参照序列 ( 其不包含添加或缺失 ) 相比较, 比较窗口中多核苷 酸序列的部分可包括添加或缺失 ( 即, 缺口 ) 以进行两个序列的最佳比对。通过下述来计 算百分比 : 测定在两个序列上发生相同核酸碱基或氨基酸残基的位点的数目以产生匹配的 位点的数目, 将匹配的位点的数目除以比较窗口中总的位点数目, 然后将结果乘以 100 以 产生序列同一性百分比。
     因此, 可使用本文中提供的序列鉴定细胞色素 P450 多核苷酸和多肽序列。此类方 法包括获得与 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 的多核苷酸序列或其互补序列或片段, 或 SEQ ID NO : 2 或 5-24 的多肽序列具有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 98%或 99%的序列同一性的多核苷酸 或多肽序列。优选实施方案包括在细胞色素 P450 多肽的位点 458 上具有丝氨酸, 位点 364上具有天冬酰胺, 或在细胞色素 P450 的位点 329 上具有终止密码子或其组合的相应于 SEQ ID NO : 13 的多肽, 其中编号相应于 SEQ IDNO : 13。
     用于本发明的方法的表达盒
     本发明的组合物还包括表达盒, 所述表达盒包含能够抑制参与烟草属植物或其植 物部分中烟碱至降烟碱的转化的烟碱脱甲基酶多肽的表达或功能的抑制性序列, 其中抑制 性序列有效地连接至在植物细胞中具有功能的启动子。通过这种方式, 构建表达盒以用于 本文中下面描述的本发明的基因沉默方法, 所述表达盒包含与在植物细胞中具有功能的启 动子有效连接的全部或部分的 SEQ ID NO : 1, 3 或 4 中所示的序列或编码 SEQ ID NO : 2或 5-24 的序列、 其互补序列或片段、 与此类序列共有大体上的序列同一性的序列或其互补序 列或片段。此类序列在本文中称为 “抑制性序列” 或 “抑制性多核苷酸序列” , 因为它们能够 表达为抑制靶细胞色素 P450 多肽, 例如 SEQ ID NO : 2 或 5-24 中所示的多肽和其变体的表达 ( 即, 转录和 / 或翻译 ) 的 RNA 分子, 其中变体多肽与这些公开的细胞色素 P450 多肽具有大 体上的序列同一性。此类变体可参与或不参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化。此类序列 还包括靶细胞色素 P450 多核苷酸或多肽的片段序列。 例如, 片段序列可包括细胞色素 P450 序列的任何部分, 包括编码和非编码序列 ( 例如, 5′ UTR、 内含子和 3′ UTR 序列 ), 且可包 括 100 至大约 350 个核苷酸, 大约 125 至大约 300 个核苷酸, 或大约 125 至 275 个核苷酸的 片段。优选, 烟碱脱甲基酶的片段可在大约 20 至大约 420, 大约 30 至大约 420, 大约 40 至 大约 320, 大约 50 至大约 200, 大约 50 至大约 400, 大约 50 至大约 420, 大约 60 至大约 320, 大约 70 至大约 220, 大约 100 至大约 200, 大约 100 至大约 320, 大约 150 至大约 200, 大约 150 至大约 220, 大约 150 至大约 400, 大约 200 至大约 300, 或大约 300 至大约 400 个连续 核苷酸之间。备选地, 细胞色素 P450 的片段在长度上可以是大约 100、 大约 150、 大约 200、 大约 220、 大约 250、 大约 300、 大约 320 或大约 350 个连续核苷酸。备选地, 与全长相比较, 细胞色素 P450 片段在长度上减少大约 20、 大约 40、 大约 60、 大约 80、 大约 100、 大约 120、 大 约 140、 大约 160、 大约 180、 大约 200、 大约 220、 大约 240、 大约 260、 大约 280、 大约 290、 大 约 300、 大约 320、 大约 340、 大约 360、 大约 380、 大约 400 个连续核苷酸。对于所有这些细胞 色素 P450 片段, 截断或缺失可始于 5′末端, 始于 3′末端, 或在细胞色素 P450 或细胞色素 P450 内含子内部。对于细胞色素 P450 内含子片段, 细胞色素 P450 内含子的完整序列可以 是 SEQ ID NO : 3。
     此外, 细胞色素 P450 多核苷酸或多肽的片段可包含来自完整基因的大约 1、 2、 5、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80 或 90%的连续核苷酸。备选地, 细胞色素 P450 多核苷酸或多肽 的片段可以是完整细胞色素 P450 的长度的大约 5%至大约 80%, 大约 10%至大约 70%, 大 约 10%至大约 60%, 大约 10%至大约 50%, 大约 25%至大约 60%, 大约 25%至大约 50%, 大约 40%至大约 60%, 大约 40%至大约 80%, 大约 50%至大约 90%。
     本发明的表达盒包括包含调控表达水平、 表达的发育时间选择或发生表达的组织 类型的另外的结构域的表达盒 ( 例如, AU 专利 AU-A-77751/94 和美国专利 5,466,785 和 5,635,618)。可基于期望的结果选择启动子。可将本发明的核酸与诱导型、 组成型、 病原体 或创伤诱导的、 受环境或发育调控的、 细胞或组织偏爱型启动子或其他启动子组合以在植 物中进行表达。
     通过应用外源化学调节剂, 化学诱导型启动子可用于抑制参与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素 P450 的表达。化学诱导型启动子在本领域内是已知的并且包括 但不限于烟草 PR-1a 启动子, 所述启动子由水杨酸激活。其他目的化学诱导型启动子包括 类固醇响应型启动子 (steroid-responsive promoter)( 参见例如, 糖皮质激素诱导型启 动 子 (Schena 等 人 (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 : 10421-10425 ; 和 McNellis 等 人 (1998)Plant J.14(2) : 247-257) 和四环素诱导型启动子 ( 参见例如, Gatz 等人 (1991)Mol. Gen.Genet.227 : 229-237 ; 和美国专利 5,814,618 和 5,789,156), 其各自通过引用合并入本 文就如同以其全文显示一样。
     组成型启动子包括例如美国专利 6,072,050 中公开的 Rsyn7 启动子的核心启动子 和外部组成型启动子 ; 核心 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人 (1985)Nature 313 : 810-812) ; 泛 素 (Christensen 等人 (1989)Plant Mol.Biol.12 : 619-632 ; 和 Christensen 等人 (1992) PlantMol.Biol.18 : 675-689) ; pEMU(Last 等 人 (1991)Theor.Appl.Genet.81 : 581-588) ; MAS(Velten 等 人 (1984)EMBO J.3 : 2723-2730) ; ALS 启 动 子 ( 美 国 专 利 5,659,026) 等。 其 他 组 成 型 启 动 子 包 括 例 如 美 国 专 利 5,608,149 ; 5,608,144 ; 5,604,121 ; 5,569,597 ; 5,466,785 ; 5,399,680 ; 5,268,463 ; 5,608,142 和 6,177,611 中公开的启动子。
     组织偏爱型启动子可用于将本发明的抑制性多核苷酸序列的表达靶向特定 植 物 组 织 内。 组 织 偏 爱 型 启 动 子 包 括 Yamamoto 等 人 (1997)Plant J.12(2) : 255-265 ; Kawamata 等 人 (1997)Plant Cell Physiol.38(7) : 792-803 ; Hansen 等 人 (1997)Mol. Gen Genet.254(3) : 337-343 ; Russell 等 人 (1997)Transgenic Res.6(2) : 157-168 ; Rinehart 等 人 (1996)Plant Physiol.112(3) : 1331-1341 ; Van Camp 等 人 (1996)Plant Physiol.112(2) : 525-535 ; Canevascini 等 人 (1996)PlantPhysiol.112(2) : 513-524 ; Yamamoto 等 人 (1994)Plant Cell Physiol.35(5) : 773-778 ; Lam(1994)Results Probl. Cell Differ.20 : 181-196 ; Orozco 等 人 (1993)Plant Mol Biol.23(6) : 1129-1138 ; Matsuoka 等人 (1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20) : 9586-9590 ; 和 Guevara-Garcia 等 人 (1993)Plant J.4(3) : 495-505 中公开的组织偏爱型启动子。
     本文中特别感兴趣的是主要在叶组织中提供表达的叶偏爱型启动子。参见, 例 如, Yamamoto 等人 (1997)Plant J.12(2) : 255-265 ; Kwon 等人 (1994)Plant Physiol.105 : 357-67 ; Yamamoto 等 人 (1994)PlantCell Physiol.35(5) : 773-778 ; Gotor 等 人 (1993) Plant J.3 : 509-18 ; Orozco 等人 (1993)Plant Mol.Biol.23(6) : 1129-1138 ; Baszczynski 等 人 (1988)Nucl.Acid Res.16 : 4732 ; Mitra 等 人 (1994)PlantMolecular Biology 26 : 35-93 ; Kayaya 等人 (1995)Molecular andGeneral Genetics 248 : 668-674 ; 和 Matsuoka 等 人 (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20) : 9586-9590。Senecence-regulated 等 人 (1998)Plant Physiol.116 : 329-335) ; SAG 13(Gan 和 Amasino(1997)PlantPhysiol.113 : 313-319) ; SAG 15(Gan(1995)“MolecularCharacterization and Genetic Manipulation of PlantSenescence, ” Ph.D.Thesis, University of Wisconsin, Madison) ; SEN1(Oh 等人 (1996)Plant Mol.Biol.30 : 739-754) ; 用于 IPT 表达的衰老特异性基因的启动子 (Gan 和 Amasino 91995)Science 270 : 1986-1988) 等等 ( 参见例如, Or 等人 (1999)Plant Cell 11 : 1073-1080 ; 和 McCabe 等人 (2001)Plant Physiol.127 : 505-516)。
     本发明的表达盒可包括可用于增强翻译的 5 ′前导序列。翻译前导序列在本领 域内是已知的并且包括但不限于微小核糖核酸病毒前导序列, 例如 EMCV 前导序列 ( 脑心肌炎 5 ′非编码区 ; Elroy-Stein 等人 (1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA 86 : 6126-6130) ; 马铃薯 Y 病毒 (potyvirus) 前导序列, 例如, TEV 前导序列 ( 烟草蚀纹病毒 ; Gallie 等人 (1995)Gene 165(2) : 233-238)、 MDMV 前导序列 ( 玉米矮花叶病毒 ; Virology 154 : 9-20) 和人免疫球蛋白重链结合蛋白 (BiP ; Macejak 等人 (1991)Nature 353 : 90-94) ; 来自苜蓿 花叶病毒的外壳蛋白 mRNA 的非翻译前导序列 (AMV RNA 4 ; Jobling 等人 (1987)Nature 325 : 622-625) ; 烟草花叶病毒前导序列 (TMY ; Gallie 等人 (1989)inMolecular biology of RNA, ed.Cech(Liss, New York), pp.237-256) ; 和玉蜀黍萎黄斑点病毒 (Maize chlorotic mottle virus) 前 导 序 列 (MCMV ; Lommel 等 人 (1991)Virology 81 : 382-385)。 也 参 见, Della-Cioppa 等人 (1987)Plant Physiol.84 : 965-968。还可使用已知增强翻译的其他方 法。
     抑制烟碱脱甲基酶的表达或功能的方法
     提供了在烟草属植物或植物部分, 特别地叶组织中减少本发明的细胞色素 P450 多肽的浓度、 含量和 / 或活性的方法。可单独或组合地使用许多方法来减少或消除本发明 的细胞色素 P450 多肽, 特别地 CYP82E5v2 烟碱脱甲基酶的活性。此外, 可将方法的组合用 于减少或消除两种或更多种不同细胞色素 P450 多肽, 更特别地 CYP82E5v2 和 CYP82E4v2 烟 碱脱甲基酶的活性。优选, CYP82E5v2 是在 SEQ ID NO : 2 中具有至少一个氨基酸突变的多 肽, 所述多肽在绿叶中负面影响转化, CYP82E4v2 具有 SEQ ID NO : 13 中所示的序列 ( 所述 序列具有至少一个在衰老的叶中负面影响转化的氨基酸突变 )。
     根据本发明, 如果细胞色素 P450 多肽的蛋白质水平在统计学上低于植物 ( 所述植 物未进行遗传修饰或诱变以抑制该细胞色素 P450 多肽的表达并且已使用相同的方案进行 种植和收获 ) 中相同细胞色素 P450 多肽的蛋白质水平, 则本发明的细胞色素 P450 多肽的 表达被抑制。在本发明的特定实施方案中, 根据本发明的修饰的植物中细胞色素 P450 多肽 的蛋白质水平低于 95%, 低于 90%, 低于 80%, 低于 70%, 低于 60%, 低于 50%, 低于 40%, 低于 30%, 低于 20%, 低于 10%, 或低于 5%的植物 ( 所述植物不是突变体或未进行遗传修 饰以抑制该细胞色素 P450 多肽的表达并且使用相同方案进行种植和收获 ) 中相同细胞色 素 P450 多肽的蛋白质水平。可以例如通过测定烟草属植物或植物部分中表达的细胞色素 P450 转录物或细胞色素 P450 多肽的水平来直接测量, 或例如通过测量烟草属植物或植物 部分中烟碱至降烟碱的转化来间接测量细胞色素 P450 多肽的表达水平。用于监控多肽的 表达水平的方法在本领域内是已知的, 包括但不限于 Northern 印迹分析和 RNA 差异测定。 用于测定被靶向的细胞色素 P450 多肽在将烟碱转化成降烟碱中的活性的方法在本领域内 是已知的并且描述于本文中下面的其他地方, 且包括但不限于使用气相色谱进行的生物碱 分析。
     在一些情况下, 通过用表达盒转化植物或植物部分来减少或消除一种或多种细胞 色素 P450 多肽的活性, 所述表达盒包含编码抑制本发明的一种或多种细胞色素 P450 多肽 的活性的多肽的多核苷酸。许多方法已用于在一个植物中组合转基因或突变 - 包括有性杂 交、 再转化、 共转化和连接的转基因的使用。 具有连接的部分基因序列的嵌合转基因可用于 协同抑制许多植物内源基因。 模仿病毒多聚蛋白质的构建体可用于同时将多个编码基因导 入植物细胞。关于综述, 参见 Halpin 等人, Plant Mol.Biol.47 : 295-310(2001)。可将在 CYP82E4v2 中具有突变 ( 其在衰老的叶中抑制烟碱脱甲基酶活性 ) 的植物与在 CYP83E5v2中具有突变 ( 其在绿叶中抑制烟碱脱甲基酶 ) 的植物杂交以产生具有低于大约 0.2 %、 0.3%、 0.4%、 0.5%、 0.6%或 0.7%的转化水平的植物。备选地, 可将在 CYP82E4v2 中在位 点 458、 364、 38、 201、 169、 459、 296、 427、 329、 376 或 171 上具有一个或多个突变的植物与在 CYP83E5v2 中在位点 235、 449、 174、 410、 224、 72 或 143 上具有一个或多个突变的植物杂交以 产生具有低于 0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.5%、 0.6%或 0.7%的转化水平的植物。备选地, 可将 在 CYP82E4v2 中在位点 458、 364 或 329 上具有一个或多个突变的植物与在 CYP83E5v2 中在 位点 235、 449、 174、 410、 224、 72 或 143 上具有一个或多个突变的植物杂交以产生具有低于 0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.5%、 0.6%或 0.7%的转化水平的植物。烟碱至降烟碱的特别优选 的转化水平可以是 0.05%至 0.4%、 0.1 至 0.6%、 0.1%至 0.3%、 0.1%至 0.5%、 0.1%至 0.4%、 0.1%至 0.7%、 或 0.1%至 1.0%。导致 CYP83E4v2 或 CYP83E5v2 多肽在保守的血红 素结合基序之前被截断的本发明的多核苷酸的任何突变将抑制酶并且可用于上述杂交。 细 胞色素 P450 蛋白的结构域在本领域内是已知的。参见, 例如, Xu 等人 (2007)Physiologia Plantarum 129 : 307-319, 其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。 通过杂交具有 无功能或被抑制的 CYP82E4v2 基因、 无功能或被抑制的 CYP82E5v2 基因、 或无功能或被抑制 的 CYP82E4v2 和 CYP82E5v2 基因的植物可在烟草植物中降低降烟碱的水平。
     如果烟草属植物或植物部分中的烟碱脱甲基酶多肽将烟碱转化成降烟碱的活性 在统计学上低于烟草属植物或植物部分 ( 所述植物或植物部分未进行遗传修饰以抑制该 细胞色素 P450 多肽的转化活性并且使用相同的方案进行种植和收获 ) 中的相同细胞色素 P450 多肽的转化活性, 则根据本发明烟草属植物或植物部分中的烟碱脱甲基酶多肽的该 转化活性被抑制。在特定的实施方案中, 如果根据本发明的修饰的烟草属植物或植物部分 中细胞色素 P450 多肽将烟碱转化成降烟碱的活性低于 95 %、 低于 90 %、 低于 80 %、 低于 70%、 低于 60%、 低于 50%、 低于 40%, 、 低于 30%、 低于 20%、 低于 10%、 低于 5%、 低于 2% 或低于 1%的烟草属植物 ( 所述植物未进行遗传修饰以抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达并且 使用相同的方案进行种植和收获 ) 中相同细胞色素 P450 多肽的转化活性, 则根据本发明的 修饰的烟草属植物或植物部分中细胞色素 P450 多肽的该活性被抑制。当烟草属植物或植 物部分中烟碱脱甲基酶多肽将烟碱转化成降烟碱的活性通过本领域内已知的或本文中描 述的测定法不能检测到时, 根据本发明该活性被消除。使用气相色谱测定烟草属植物中细 胞色素 P450 多肽将烟碱转化成降烟碱的活性的方法公开于下文实施例中。
     在特定的实施方案中, 将本文中描述的细胞色素 P450 抑制性多核苷酸或烟碱 脱甲基酶突变导入烟草属植物或植物部分。然后, 使用本领域技术人员已知的方法选择 具有导入的本发明的抑制性多核苷酸的烟草属植物或植物部分, 所述方法包括但不限 于 Southern 印迹分析、 DNA 测序、 PCR 分析或表型分析。本发明的多核苷酸或多肽序列 包括全长多核苷酸或多肽序列、 截断的多核苷酸或多肽序列、 多核苷酸或多肽序列的片 段、 多核苷酸或多肽序列的变体、 有义方向 (sense-oriented) 的核苷酸序列、 反义方向 (antisense-oriented) 的核苷酸序列、 有义或反义方向的核苷酸序列的互补序列、 核苷酸 序列的反转区 (inverted regions)、 核苷酸序列的发夹、 双链核苷酸序列、 单链核苷酸序 列、 其组合等。 将通过上述方法改变或修饰的植物或植物部分在形成植物的条件下培养, 进 行足以调控植物中本发明的多肽的浓度和 / 或活性的时间。形成植物的条件在本领域内是 熟知的并且在本文中的其他地方进行了概述。含有本文中描述的烟碱脱甲基酶抑制性多核苷酸序列的转化的烟草植物具有降 低的烟碱至降烟碱的转化水平。在特定的实施方案中, 根据本发明的转化的烟草植物或植 物部分中烟碱至降烟碱的转化低于 95%、 低于 90%、 低于 80%、 低于 70%、 低于 60%、 低于 50%、 低于 40%、 低于 30%、 低于 20%、 低于 10%、 低于 5%、 低于 2%或低于 1%的烟草植物 ( 所述植物未进行遗传修饰以抑制该烟碱脱甲基酶多肽的表达并且使用相同的方案进行种 植和收获 ) 中的转化。 在一些情况下, 转化的烟草植物是转换子 (converter) 烟草植物。 备 选地, 转化的烟草植物是非转换子烟草植物。 仍然备选地, 转化的烟草植物具有低于在商业 非转换子烟草植物中观察到的转换率的转换率。
     可通过使用不能在转化的植物中指导蛋白质或 RNA 的表达的多核苷酸调节多 肽的水平和 / 或活性。例如, 可将本发明的多核苷酸用于设计可用于改变或突变生物 的基因组核苷酸序列的方法中的多核苷酸构建体。此类多核苷酸构建体包括但不限 于 RNA:DNA 载体、 RNA:DNA 突变载体、 RNA:DNA 修复载体、 混合双链寡核苷酸、 自我互补 (self-complementary)RNA:DNA 寡核苷酸和致重组寡核碱基。此类核苷酸构建体和使用方 法在本领域内是已知的。参见, 美国专利 5,565,350 ; 5,731,181 ; 5,756,325 ; 5,760,012 ; 5,795,972 和 5,871,984 ; 其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。也参 见, 国际专利申请公开案 WO 98/149350、 WO 99/107865 和 WO99/125921 ; 和 Beetham 等人 (1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96 : 8774-8778 ; 其各自通过引用合并入本文就如同以其 全文显示一样。
     本发明的方法不依赖于完整烟碱脱甲基酶抑制性多核苷酸至基因组的整合, 只要 求烟草属植物或其植物部分由于该抑制性多核苷酸至细胞内的导入而发生改变。同样, 基 因组可在烟碱脱甲基酶抑制性多核苷酸导入细胞后发生改变。例如, 抑制性多核苷酸或其 任何部分可整合入植物的基因组。对基因组的改变包括但不限于核苷酸至基因组的添加、 缺失和置换。 虽然本发明的方法不依赖于任何特定数目的核苷酸的添加、 缺失和置换, 但应 认识到此类添加、 缺失和 / 或置换包含至少一个核苷酸。
     此外, 可通过只在某些发育阶段引发序列的效应并在其他阶段 ( 其中不再期望表 达 ) 关闭效应来降低烟碱脱甲基酶序列的水平和 / 或活性。可通过使用诱导型或组织偏爱 型启动子获得烟碱脱甲基酶表达的控制。 备选地, 可使用位点特异性重组酶、 转座子或重组 系统反转或缺失基因, 这也可打开或关闭细胞色素 P450 序列的表达。
     根据本发明, 本发明的细胞色素 P450 多肽的水平、 比率、 活性或分布的变化或烟 草属植物或植物部分表型的变化, 特别地降烟碱和其致癌代谢物 NNN 的减少的积累, 可通 过将受试植物或植物部分与对照植物或植物部分相比较来测量, 其中使用相同的方案种植 和 / 或收获受试植物或植物部分和对照植物或植物部分。如本文中所使用的, 受试植物或 植物部分是其中已就目的烟碱脱甲基酶多肽进行了遗传改变例如转化的植物或植物部分, 或是源自这样改变的并且包含改变的烟草属植物或植物部分的烟草属植物或植物部分。 对 照植物或植物部分提供了用于测量受试植物或植物部分的表型变化的参照点。可在任何 时间 ( 包括在植物发育过程中、 衰老过程中或在处理后 ) 测量植物或植物部分中的表型变 化。在其他实施方案中, 可测量在任何条件下生长的植物 ( 包括在生长室、 温室中或在田间 生长的植物 ) 中的表型变化。在一个实施方案中, 表型变化可通过测定烟碱至降烟碱的转 化率来测量。在优选实施方案中, 转化可通过将降烟碱的百分比 ( 作为总组织重量的百分比 ) 除以烟碱和降烟碱的百分比的和 ( 作为总组织重量的百分比 ), 然后乘以 100 来测量。
     根据本发明, 对照植物或植物部分可包括野生型烟草属植物或植物部分, 即与用 于遗传改变以产生受试植物或植物部分的起始材料具有相同的基因型的植物或植物部分。 对照植物或植物部分还可包括与起始材料具有相同的基因型但已用无效构建体 ( 即, 对目 的性状没有已知效应的构建体, 例如包含选择标记基因的构建体 ) 转化的烟草属植物或植 物部分。备选地, 对照植物或植物部分可包括在受试植物或植物部分的后代中为非转化的 分离子的烟草属植物或植物部分, 或在遗传上与受试植物或植物部分相同但未暴露于诱导 目的烟碱脱甲基酶基因的抑制的条件或刺激的烟草属植物或植物部分。最后, 对照植物或 植物部分可包括在其中不表达烟碱脱甲基酶抑制性序列的条件下的受试植物或植物部分 本身。在所有此类情况下, 使用相同的方案种植和收获受试植物或植物部分以及对照植物 或植物部分。
     如本文中其他地方所描述的, 提供了方法, 其通过向烟草属植物或植物部分中导 入能够抑制烟碱脱甲基酶多肽 ( 其参与烟碱至降烟碱的代谢转化 ) 的表达或功能的烟碱脱 甲基酶抑制性多核苷酸序列来减少或消除本发明的烟碱脱甲基酶多肽的活性和 / 或浓度。 在一些情况下, 可通过用表达抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物 或植物部分例如植物细胞来导入抑制性序列。 多核苷酸可通过阻止烟碱脱甲基酶多肽信使 RNA 的翻译直接地, 或通过编码抑制编码烟碱脱甲基酶多肽的烟碱脱甲基酶多肽基因的转 录或翻译的多肽间接地抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达。 用于抑制或消除植物中基因产物的 表达的方法在本领域内是熟知的, 并且任何这样的方法可在本发明中用于抑制烟碱脱甲基 酶多肽的表达。 在其他实施方案中, 本发明的烟碱脱甲基酶多肽的活性可通过破坏编码烟碱脱甲 基酶多肽的基因来减少或消除。本发明包括在细胞色素 P450 基因中具有突变的经诱变的 植物, 其中所述突变减少烟碱脱甲基酶基因的表达或抑制编码的本发明的烟碱脱甲基酶多 肽的活性。
     为了获得期望的植物, 可用能够表达抑制烟碱脱甲基酶序列的表达的多核苷酸的 表达盒转化烟草属植物或植物部分。此类方法可包括有义抑制 / 共抑制、 反义抑制、 双链 RNA(dsRNA) 干扰、 发夹 RNA 干扰和含有内含子的发夹 RNA 干扰、 扩增子介导的干扰、 核酶和 小干扰 RNA 或微 RNA 的使用。
     为了进行共抑制, 设计表达盒以表达 RNA 分子, 所述 RNA 分子在 “有义” 方向上相 应于编码目的细胞色素 P450 多肽 ( 例如, 包含 SEQ IDNO : 2 或 5-24 中所示的序列或与 SEQ ID NO : 2 或 5-24 具有大体上的序列同一性的序列的细胞色素 P450 多肽 ) 的信使 RNA 的全 部或部分。RNA 分子的过表达可导致减少的天然基因的表达。然后筛选用共抑制表达盒转 化的多个植物品系以鉴定显示最大的烟碱脱甲基酶多肽表达的抑制的植物品系。
     用于共抑制的多核苷酸可相应于编码本发明的细胞色素 P450 多肽的序列的全部 或部分, 细胞色素 P450 多肽转录物的 5′和 / 或 3′非翻译区的全部或部分, 或编码细胞色 素 P450 多肽的转录物的编码序列和非翻译区的全部或部分。在一些其中多核苷酸包括本 发明的细胞色素 P450 多肽的编码区的全部或部分的实施方案中, 可设计表达盒来消除多 核苷酸的起始密码子以便不转录多肽产物。
     共抑制可用于抑制植物基因的表达以产生具有不可检测的由此类基因编码的多
     肽的水平的植物或还可用于抑制相同植物中多个蛋白质的表达 ( 例如, Broin 等人 (2002) Plant Cell 14 : 1417-1432 ; 和美国专利 5,942,657)。使用共抑制来抑制植物中内源基 因的表达的方法描述于 Flavell 等人 (1994)Proc Nati.Acad.Sci.USA 91 : 3490-3496 ; Jorgensen 等人 (1996)Plant Mol.Biol.31 : 957-973 ; Johansen 和 Carrington(2001)Plant Physiol.126 : 930-938 ; Brain 等人 (2002)Plant Cell 14 : 1417-1432 ; Stoutjesdijk 等人 (2002)Plant Physiol.129 : 1723-1731 ; Yu 等人 (2003)Phytochemistry 63 : 753-763 ; 和美 国专利 5,034,323 ; 5,283,184 和 5,942,657 ; 其各自通过引用合并入本文就如同以其全文 显示一样。可通过在表达盒中在有义序列 3′端的位点和多腺苷酸化信号的 5′端处包括 poly-dT 区来增加共抑制的效率。参见, 美国专利申请公开案 2002/0048814, 其通过引用合 并入本文就如同以其全文显示一样。通常, 这样的核苷酸序列与内源基因的转录物的序列 具有大体上的序列同一性, 优选大于大约 65%的序列同一性, 更优选大于大约 95%的序列 同一性, 最优选大于大约 99%的序列同一性 ( 例如, 美国专利 5 ; 283,184 和 5,034,323 ; 其 通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样 )。
     本发明的细胞色素 P450 多肽的表达的抑制还可通过反义抑制来获得。关于反义 抑制, 设计表达盒以表达与编码细胞色素 P450 多肽的信使 RNA 的全部分或部分互补的 RNA 分子。反义 RNA 分子的过表达可导致减少的天然基因的表达。因此, 筛选用反义抑制表达 盒转化的多个植物品系以鉴定显示最大的烟碱脱甲基酶多肽表达的抑制的品系。
     用于反义抑制的多核苷酸可相应于编码细胞色素 P450 多肽的序列的互补序列的 全部或部分, 细胞色素 P450 多肽转录物的 5′和 / 或 3′非翻译区的互补序列的全部或部 分, 或编码细胞色素 P450 多肽的转录物的编码序列和非编码区的互补序列的全部或部分。 此外, 反义多核苷酸对于靶序列可以是完全互补的 ( 即, 与靶序列的互补序列 100%同一 ) 或部分互补的 ( 即, 与靶序列的互补序列低于 100%同一 )。
     反 义 抑 制 还 可 用 于 抑 制 相 同 植 物 中 多 个 蛋 白 质 的 表 达 ( 例 如, 美国专利 5,942,657)。此外, 反义核苷酸的部分可用于破坏靶基因的表达。通常, 可使用至少 50 个 核苷酸、 100、 200、 300、 400、 450、 500、 550 个核苷酸或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制 来抑制植物中内源基因的表达的方法公开于例如 Liu 等人 (2002)Plant Physiol.129 : 1732-1743 ; 和美国专利 5,759,829 和 5,942,657 中 ; 其各自通过引用合并入本文就如同以 其全文显示一样。可通过在表达盒中在反义序列 3′端的位点和多腺苷酸化信号的 5′端 处包括 poly-dT 区来增加反义抑制的效率。 参见, 美国专利申请公开案 2002/0048814, 其通 过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
     为了进行 dsRNA 干扰, 在相同的细胞中表达有义 RNA 分子 ( 如上文对于共抑制描 述的 ) 和与有义 RNA 分子完全或部分互补的反义 RNA 分子, 从而导致相应的内源信使 RNA 的表达的抑制。有义和反义分子的表达可通过设计包含针对靶细胞色素 P450 序列的有义 序列和反义序列的表达盒来实现。备选地, 可针对有义和反义序列使用分开的表达盒。然 后筛选用 dsRNA 干扰表达盒转化的多个植物品系以鉴定显示被靶向的细胞色素 P450 多肽 的表达的最大抑制的植物品系。使用 dsRNA 干扰来抑制内源植物基因的表达的方法描述 于 Waterhouse 等 人 (1998)Pros.Natl.Acad.Sci.USA 95 : 13939-13964 ; Liu 等 人 (2002) Plant Physiol.129 : 1732′ -1743 ; 和国际专利申请公开案 WO99/149024, WO 99/153050, WO 99/161631 和 WO 00/149035 中 ; 其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。扩增子表达盒包含含有靶基因的全部或部分但通常不包含天然病毒的全部基因 的植物病毒来源的序列。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列允许转录产物指导其自 己的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列 ( 即, 参与烟碱至降烟碱的代谢转化的 细胞色素 P450 多肽的信使 RNA) 可以是有义的或反义的。使用扩增子抑制内源植物基因 的表达的方法描述于例如, Angell & Baulcombe(1997)EMBO J.16 : 3675-3684 ; Angell & Baulcombe(1999)Plant J.20 : 357-362 ; 和美国专利 6,646,805 中, 其各自通过引用合并入 本文就如同以其全文显示一样。
     在一些情况下, 由本发明的表达盒表达的多核苷酸是催化 RNA 或具有特异于本文 中描述的细胞色素 P450 多肽的信使 RNA 的核酶活性。因此, 多核苷酸引起内源信使 RNA 的 降解, 从而导致减少的细胞色素 P450 多肽的表达。该方法描述于例如美国专利 4,987,071 中, 其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
     在其他情况下, 一个或多个烟碱脱甲基酶多肽的表达的抑制可通过表达编码微 RNA(miRNA) 的基因利用 RNA 干扰来获得。miRNA 是由大约 22 个核糖核苷酸组成的调控试 剂。 miRNA 在抑制内源基因的表达上高度有效。 参见, 例如, Javier 等人 (2003)Nature 425 : 257-263, 其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
     为了进行 miRNA 干扰, 设计表达盒以表达模仿内源 miRNA 基因的 RNA 分子。miRNA 基因编码形成含有与另一个内源基因 ( 靶序列 ) 互补的 22- 核苷酸序列的发夹结构的 RNA。 为了抑制烟碱脱甲基酶多肽的表达, 22- 核苷酸序列选自细胞色素 P450 多肽转录物序列并 且包含以有义方向编码该细胞色素 P450 多肽序列的 22 个核苷酸和与有义序列互补的相应 反义序列的 21 个核苷酸。miRNA 分子在抑制内源基因的表达上高度有效, 并且它们诱导的 RNA 干扰由植物的后代继承。
     备选地, 一个或多个细胞色素 P450 多肽的表达的抑制可通过发夹 RNA(hpRNA) 干 扰或含有内含子的发夹 RNA(ihpRNA) 干扰获得。此类方法在内源基因的表达的抑制上高度 有效。参见, Waterhouse &Helliwell(20013)Nat.Rev.Genet.4 : 29-38 和其中引用的参考 资料。
     还可设计用于 hpRNA 干扰的表达盒, 以便有义序列和反义序列不相应于该实施方 案中的内源 RNA, 有义和反义序列侧翼于包含相应于靶基因的内源信使 RNA 的全部或部分 的核苷酸序列的环序列。因此, 环区域确定了 RNA 干扰的特异性。参见, 例如, 国际专利申 请公开案 WO 02/00904, 其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
     可通过使用其中发夹的反向重复与待沉默的基因的启动子区域共有序列同一性 的 hpRNA 构建体来实现转录基因沉默 (TGS)。将 hpRNA 加工成可与同源启动子区域相互作 用的短 RNA 可引发降解或甲基化, 从而导致沉默 (Aufsatz 等人 (2002)Proc.Natl.Acad. Sci.99 : 16499-16506 ; 和 Mette 等人 (2000)EMBO J.19 : 5194-5201)。
     在一些情况下, 多核苷酸编码结合至少一种细胞色素 P450 多肽, 并且减少本发明 的细胞色素 P450 多肽的活性的抗体。在另一个实施方案中, 抗体的结合通过细胞质量控制 机制导致增加的抗体 - 细胞色素 P450 多肽复合物的周转。植物部分中抗体的表达以及植 物部分中由抗体的表达和与蛋白质的结合引起的分子途径的抑制在本领域内是熟知的。 参 见, 例如, Conrad & Sonnewald(2003)Nature Biotech.21 : 35-36, 其通过引用合并入本文 就如同以其全文显示一样。可通过破坏编码细胞色素 P450 多肽的基因来减少或消除本发明的细胞色素 P450 多肽的活性。可通过本领域内已知的任何方法来破坏编码细胞色素 P450 多肽的基因, 例如 通过转座子标记或通过使用随机或靶向诱变 (targeted mutagenesis) 诱变植物, 并选择具 有减少的烟碱脱甲基酶活性或在 CYP82E4v2 或 CYP82E5v2 中具有突变的植物。
     转座子标记 (transposon tagging) 可用于减少或消除本发明的一种或多种细胞 色素 P450 多肽的活性。转座子标记包括将转座子插入内源细胞色素 P450 基因内以减少或 消除细胞色素 P450 多肽的表达。
     用于植物中特定基因的转座子标记的方法在本领域内是熟知的。 参见, 例如, Maes 等 人 (1999)Trends Plant Sci.4 : 90-96 ; Dharmapuri& Sonti(1999)FEMS Micerobiol. Lett.179 : 53-59 ; Meissner 等 人 (2000)Plant J.22 : 265-274 ; Phogat 等 人 (2000) J.Biosci.25 : 57-63 ; Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2 : 103-107 ; Gai 等 人 (2000) Nucleic Acids Res.28 : 94-96 ; 和 Fitzmaurice 等人 (1999)Genetics 153 : 1919-1928)。
     用于减少或消除植物中内源基因的表达的另外的方法在本领域内也是已知的并 且可类似地用于本发明。此类方法包括其他形式的诱变, 使用诱变或致癌化合物的诱变 包括甲基磺酸乙酯诱导的诱变、 缺失诱变和在反向遗传学 ( 使用 PCR) 中用于鉴定其中内 源基因已缺失的植物品系的快中子缺失诱变。关于此类方法的实例, 参见, Ohshima 等人 (1998)Virology 213 : 472-481 ; Okubara 等人 (1994)Genetics 137 : 867-874 ; 和 Quesada 等人 (2000)Genetics 154 : 421-4315 ; 其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示 一样。此外, 用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法, TILLING(Targeting InducedLocal Lesions In Genomes)( 其使用变性 HPLC 或选择的 PCR 产物的选择性内切核 酸酶降解 ) 也可用于本发明。参见, McCallum 等人 (2000)Nat.Biotechnol.18 : 455-457, 其 通过引用合并入本文。
     影响基因表达或干扰编码的细胞色素 P450 蛋白的功能的突变可使用本领域内熟 知的方法来确定。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基中的突变在抑 制编码的蛋白质的代谢功能中可以是特别有效的。 已描述了适合用于目的在于消除细胞色 素 P450 多肽在烟草属植物或植物部分中将烟碱转化成降烟碱的活性的诱变的植物细胞色 素 P450 多肽的保守残基。植物细胞色素 P450 多肽的保守残基公开于图 1A-C, 其中与其他 P450 多肽不同的残基以灰色阴影显示。 保守残基是各位点上不以灰色阴影显示的残基。 此 类突变体可根据熟知的方法来分离。
     显性突变体可用于触发因基因倒位和重复基因座的重组而引起的 RNA 沉默。参 见, 例如, Kusaba 等人 (2003)Plant Cell 15 : 1455-1467。
     许多序列可用于实施本发明, 特别地编码 SEQ ID NO : 2 和 13 的序列具有特定的用 途。然而不希望受任何特定作用机制限制, 本发明者认为此类序列编码催化烟碱至降烟碱 的氧化 N- 脱甲基化的烟碱脱甲基酶。因此, 特异性抑制此类编码序列而不抑制其他 P450 序列的方法对于重组植物是有益的。即, 可证明导致该个体基因座的基因功能的抑制的策 略优于抑制整个基因家族的策略。P450 酶参与植物中的许多机制, 其抑制对植物的生长和 发育是不利的或有害的或可负面地影响因素例如植物的疾病防御能力。同样地, 因为烟草 属植物 P450 酶牵涉植物代谢产物例如类苯基丙烷 (phenylpropanoid)、 生物碱、 萜类化合 物、 脂质、 生氰糖苷 (cyanogenic glycoside)、 芥子油苷 (glucosinolate) 和许多其他化学实体, 因此 P450 活性的破坏可改变参与烟草风味、 质地或影响植物的商业用途的其他特性 的组分。因此, 使用上述方法以特异性靶向编码 SEQ ID NO : 2 或 13 的序列的方式抑制表达 可以是优选的, 包括靶向突变策略, 例如嵌合修复术 (chimeraplasty)。 参见, 例如, Stewart 等 人 (2000)Biotechniques24 : 838-843 ; 和 Graham 等 人 (2002)Biochim Biophys Acta 1587 : 1-6 ; 其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。在一些实施方案中, 上 述方法用于以特异性靶向 SEQ ID NO : 1( 编码 SEQ ID NO : 2)、 SEQ ID NO : 50( 编码 SEQ ID NO : 13) 或这两个序列的方式抑制表达。
     本发明的组合物可用于筛选方法中以鉴定用于育种程序的非转换子植物。 以这样 的方式, 本发明的核苷酸序列可用于筛选在一个或多个本文中鉴定的 P450 基因中具有稳 定的突变的非转换子植物的天然种质。 通过本发明的方法鉴定的这些非转换子植物可用于 开发育种系。
     除了编码 P450 编码序列的核苷酸序列外, 本发明的组合物包含可用于筛选方法 的 CYP82E5v2 序列的内含子序列。然而不希望受任何特定作用机制的束缚, CYP82E5v2 基 因可能代表细胞色素 P450 家族中参与烟草绿叶中烟碱至降烟碱的代谢转化 ( 并且如之前 所述存在极大可能性 --CYP82E5v2 cDNA 源自单个独特的基因座的 ) 的出众的成员。对于 某些应用, 具有在诊断上将细胞色素 P450 基因家族的该特定成员与该家族内的其余密切 相关的序列相区别的方法是有用的。例如, 在天然存在的烟草种质中 ( 或在诱变群体中 ), 可能存在这样的增加物 (accession), 其中该基因是天然功能失常的, 并因此其作为永久性 非转换子来源可能是有价值的。此类功能失常的基因可包括编码 SEQID NOS : 6 和 12 中所 示的多肽的基因。特异性地测定此类基因型 ( 例如, 缺失突变体、 重排等 ) 的方法可用作强 有力的工具。本发明包括设计用于特异性扩增 CYP82E5v2 或 CYP82E4v2 的外显子 1 和外显 子 2 的引物, 其中两个引物对之一相应于外显子之间的内含子。用于扩增 CYP82E4v2 的外 显子的引物的实例包括 SEQ ID NO : 32 与 SEQ IDNOS : 33-35。用于扩增 CYP82E5v2 的外显 子的引物的实例包括 SEQ IDNO : 36 与 37 和 SEQ ID NO : 38 与 39。这些相同的引物可用于 产物的序列分析。
     当相应于 CYP82E2 家族的成员的任何 cDNA 在烟草基因组 DNA 的 Southern 印迹测 定中用作杂交探针时, 观察到复合模式 (complexpattern)。 这是预料之中的, 因为存在多个 关系密切的该基因家族的成员。因为基因的内含子区域通常不如外显子保守, 因此预期内 含子特异性探针的使用减少该复杂性并且使技术人员能够更好地将相应于 CYP82E4v2 基 因或 CYP82E5v2 基因的基因与家族的其他成员相区分。CYP82E4v2 或 CYP82E5v2 内含子特 异性探针和 / 或用于产生产物的 PCR 引物的使用在确定任何天然发生的或诱变的烟草植物 是否具有缺失或重排 ( 其可使所述基因失活 ) 的测定中提供了强有力的工具。然后可将这 样的植物用于育种程序以产生不能转换的烟草品系。
     具有降低的降烟碱和 NNN 含量的转化的植物、 植物部分和产物
     本发明的细胞色素 P450 多核苷酸和其变体和片段可用于本发明的方法以抑制参 与植物中烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素 P450。以这样的方式, 将靶向本文中公开的 细胞色素 P450 多肽的表达或功能的抑制性序列导入目的植物或植物细胞。可以使用本领 域内已知的任何合适的转化方法包括本文中描述的方法将本文中描述的表达盒导入目的 植物, 例如本文中下面提及的烟草属植物。本发明的方法不依赖于将序列导入植物或植物部分的特定方法, 只要期望的序列 能够进入植物或植物部分的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸序列导入植物的方法 在本领域内是已知的并且包括但不限于稳定转化方法、 瞬时转化方法和病毒介导的转化方 法。
     转化方案以及用于将异源多核苷酸序列导入植物的方案取决于被靶向以进行 转化的植物或植物细胞的类型。本发明的将多核苷酸导入植物细胞的合适的方法包 括 显 微 注 射 (Crossway 等 人 (1986)Biotechniques 4 : 320-334)、 电 穿 孔 (Shillito 等 人 (1987)Meth.Enzymol.153 : 313-336 ; 和 Riggs 等 人 (1986)Proc.Natl.Acad Sci. USA 83 : 5602-56116)、 农 杆 菌 (Agrobacterium) 介 导 的 转 化 ( 美 国 专 利 5,104,310 ; 5,149,645 ; 5,177,010 ; 5,231,019 ; 5,463,174 ; 5,464,763 ; 5,469,976 ; 4,762,785 ; 5,004,863 ; 5,159,135 ; 5,563,055 和 5,981,840)、直 接 基 因 转 移 (Paszkowski 等 人 (1984)EMBO J.1 : 2717-2722) 和弹道微粒加速 (ballistic particleacceleration)( 美 国 专 利 4,945,050 ; 5,141,131 ; 5,886,244 ; 5,879,918 和 5,932,782 ; Tomes 等 人 (1995) in Plant cell, tissue, and organ culture fundamental methods, ed.Gamborg & Phillips(Springer-Verlag, Berlin) ; McCabe 等 人 (1988)Biotechnology 6 : 923-926)。 也 参 见, Weissinger 等 人 (1988)Ann.Rev.Genet.22 : 421-477 ; Christou 等 人 (1988) Plant Physiol.87 : 671-674( 大豆 ) ; McCabe 等人 (1988)Bio/Technology 6 : 923-926( 大 豆); Finer &McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P : 175-182( 大豆 ) ; Singh 等人 (1998)Theor.Appl.Genet.96 : 319-324( 大豆 ) ; De Wet 等人 (1985)in The experimental manipulation of ovule tissues, ed.Chapman 等人 (Longman, New York.) ; pp.197-209( 花 粉); Kaeppler 等 人 (1990)Plant Cell Reports 9 : 415-418 ; 和 Kaeppler 等 人 (1992) Theor.Appl.Genet, 84 : 560-566(whisker 介 导 的 转 化 ) ; D ′ Halluin 等 人 (1992)Plant Cell 4 : 1495-1505( 电穿孔 ) ; 其各自通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。
     随后可使用克隆方法 ( 无论是通过器官发生还是胚发生 ) 繁殖的任何植物组织可 用包含细胞色素 P450 抑制性序列的重组构建体, 例如本发明的表达盒进行转化。如本文中 所使用的, “器官发生” 意指籍以从分生组织中心相继发育芽 (shoot) 和根的方法。如本文 中所使用的, “胚发生” 意指籍以以协同的方式 ( 非相继地 ) 一起发育芽和根 ( 无论从体细 胞还是从配子 ) 的方法。适合用于本文中描述的各种转化方案的示例性组织包括但不限 于愈伤组织、 现有分生组织 ( 例如, 顶端分生组织、 腋芽和根分生组织 (root ineristem)) 下胚轴、 子叶、 叶盘、 花粉、 胚 和诱导的分生组织 ( 例如, 子叶分生组织和下胚轴分生组织 )、 等。
     如本文中所使用的, “稳定转化” 意指导入植物的目的核苷酸构建体整合入植物的 基因组并且能够由其后代继承。同样, “瞬时转化” 意指将序列导入植物并且其仅短暂地表 达或仅短暂地存在于植物中。
     可使用多种瞬时转化方法给植物提供本发明的抑制性序列。 可使用本领域内已知 的技术将本发明的抑制性序列瞬时转化入植物。 此类技术包括病毒载体系统和多核苷酸的 沉淀 ( 以防止 DNA 的随后释放的方式 )。 因此, 可发生从颗粒结合的 DNA 进行的转录, 但其被 释放以整合入基因组的频率大大降低。此类方法包括使用包被有聚乙烯亚胺的颗粒 (PEI ; Sigma 4P3143)。备选地, 可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来将本发明的抑制性序列导入植 物。一般地, 此类方法包括将本发明的表达盒整合在病毒 DNA 或 RNA 分子内。用于本发明 的表达盒的启动子还包括用于通过病毒 RNA 聚合酶进行转录的启动子。用于将多核苷酸 ( 包括病毒 DNA 或 RNA 分子 ) 导入植物并且表达其中编码的蛋白质的方法在本领域内是已 知的。参见, 例如, 美国专利 5,889,191 ; 5,889,190 ; 5,866,785 ; 5,589,367 ; 5,316,931 ; 和 Porta 等 (1996)Molecular Biotechnology5 : 209-221 ; 其各自通过引用合并入本文就如同 以其全文显示一样。
     可 按 照 常 规 方 法 将 转 化 的 细 胞 培 养 成 烟 草 属 植 物。 参 见, 例 如, Vasil & Hildebrandt(1965)Science 150 : 889 ; Negaard & Hoffman(1989)Biotechniques 7(8) : 808-812。然后种植此类植物, 用相同的转化品系或不同品系对其进行授粉, 鉴定表达期望 的表型特征的所得后代, 即, 植物中, 特别地叶组织中一种或多种参与烟碱至降烟碱的代谢 转化的烟碱脱甲基酶的减少的表达, 从而减少的降烟碱的含量, 和伴随的减少的其亚硝胺 代谢产物 NNN 的含量。可种植两代或更多代以确保期望的表型特征的表达得到稳定保持和 遗传, 然后收获种子以确保已获得期望的表型特征的表达。 通过该方式, 本发明提供了具有 稳定地整合入它们的基因组的本发明的多核苷酸, 例如本发明的表达盒的转化的种子 ( 也 称为 “转基因种子” )。 本发明的组合物和方法可用于在烟草属任何植物的特别地叶和茎中减少降 烟 碱 的 含 量, 所述烟草属植物包括但不限于下列物种 : acuminata, affinis, 花烟草 (alata), attenuate, 毕 基 劳 氏 烟 草 (bigelovii), 克 氏 烟 草 (clevelandii), 香密烟 草 (excelsior), 福 氏 烟 草 (forgetiana), 粉 蓝 烟 草 (glauca), 心 叶 烟 草 (glutinosa), 朗 氏 烟 草 (langsdorffii), 长 花 烟 草 (longiflora), obtusifolia, palmeri, 圆锥烟草 (paniculata), 皱叶烟草 (plumbaginifolia), qudrivalvis, repanda, 黄花烟草 (rustica), suaveolens, 林 烟 草 (sylvestris), 普 通 烟 草 (tabacum), 绒 毛 烟 草 (tomentosa), 三角 叶 烟 草 (trigonophylla) 和 红 花 烟 草 (x sanderae)。 本 发 明 还 包 括 任 何 品 种 的 烟 草 属 植 物 的 转 化, 包 括 但 不 限 于 Nicotianaacuminata multiflora, 大 花 烟 草 (Nicotiana alata grandiflora), Nicotiana bigelovii quadrivalvis , Nicotiana bigelovii wallacei, Nicotiana obtusifolia obtusifolia, Nicotiana obtusifoliaplameri, Nicotiana quadrivalvis bigelovii, Nicotianaquadrivalvis quadrivalvis, Nicotiana quadrivalvis wallacei 和 Nicotiana trigonophylla palmeri, 以及通常称为烤烟品种或 浅色烟品种、 白肋烟品种、 深色烟品种和东方型 / 土耳其烟品种的品种。
     本文中描述的烟草属转基因植物适合于常规种植和收获技术, 例如在富含粪肥的 土壤中或不含粪肥的情况下栽培, 给花套袋或不套袋, 或截梢或不截梢。 收获的叶和茎可用 于任何传统烟草制品, 包括但不限于烟斗烟 (pipe tobacco)、 雪茄和香烟, 以及任何形式的 嚼烟 ( 包括叶烟、 烟丝 (shredded tobacco) 或烟丝 (cut tobacco))。
     因此本发明提供了包含本发明的表达盒和减少量的降烟碱和 N′ - 亚硝基降烟碱 的烟草属植物, 特别地此类植物的叶组织。如本文中所使用的, “减少的量” 或 “减少的水平” 意指经处理的或转基因的烟草属的植物或其植物部分或烟草制品中降烟碱和 / 或 NNN 的量 低于来自相同烟草品种 ( 其以相同方式进行操作 ( 即, 种植和收获 ), 但未进行处理或未进 行转基因以减少降烟碱和 / 或 NNN) 的烟草属植物或植物部分或烟草制品中发现的量。降
     烟碱的量可减少大约 10%至大于大约 90%, 包括大于大约 20%、 大约 30%、 大约 40%、 大 约 50%、 大约 60%、 大约 70%和大约 80%。在本发明的植物、 植物部分和制品中, 更特别地 在 CYP82E4v2 和 CYP825v2 中具有突变的植物, 植物部分中, 烟碱至降烟碱的转化可以低于 0.3%、 低于 0.5%、 低于 0.7%、 在 0.1%至 0.5%之间、 在 0.1%至 0.4%之间、 在 0.1%至 0.7%之间或在 0.1%至 1.0%之间。
     如本文中所使用的, “烟草制品” 是指, 但不限于, 发烟材料 (smoking material) ( 例如, 任何香烟, 包括小雪茄、 不透气 (non-ventilated) 或透气 (vented) 嵌入式过滤嘴香 烟 (recessfilter cigarette)、 雪茄、 烟斗烟 )、 无烟制品 ( 例如, 鼻烟、 嚼烟、 生物可降解嵌 入物 ( 例如, 树胶 (gum)、 锭剂、 溶解性条 (dissolvingstrip))。参见, 例如, 美国专利申请 公开案 2005/0019448, 其通过引用合并入本文就如同以其全文显示一样。烟草制品还包括 可通过将常规烟草与不同量的本文中描述的低降烟碱和 / 或 NNN 烟草组合来制备的混合物 (blend)。烟草制品还包括上文描述为烤烟的烟草属植物或植物部分。
     本文中描述的烟草制品降低了通过消费烟草制品例如雪茄、 香烟或烟斗烟直接吸 入的或作为二手烟吸入 ( 即, 个体吸入由消费烟草制品例如雪茄、 香烟或烟斗烟的个体产 生的烟草烟雾 ) 的烟草烟雾的致癌潜能。本文中描述的烤烟可用于制备烟草制品, 特别地 由于加热而经历化学变化的烟草制品, 其在直接吸入的或作为二手烟吸入的烟流中包含减 少量的降烟碱和 / 或 NNN。同样地, 本发明的烟草制品可用于制备无烟烟草制品例如嚼烟、 鼻烟等。
     来源于本发明的转基因烟草植物的烟草制品因此可用于降低此类烟草制品的致 癌潜能和减少人 ( 特别地其为此类烟草制品的使用者的个体 ) 对致癌亚硝胺 NNN 的暴露的 方法中。以举例说明而非限定的方式提供下列实施例。
     实验
     在下文描述的实验中使用下列材料和方案。
     植物材料
     所 有 植 物 材 获 自 Dr.Earl Wernsman, Department of Crop Science, North Carolina State University(Raleigh, NC)。绒毛状烟草 (N.tomentosiformis) 和林烟草 (N.sylvestris) 种子获自由 NorthCarolina State University 维持的烟草属种质收集中 心。 在将植物转移至温室之前, 将它们在生长室中培养 2 个月。 白肋烟品系 DH98-325-5( 非 转换子 ) 和 DH 98-325-6( 转换子 ) 代表接近同基因的品系, 即, 从相同母本单倍体植物回 收的品系。SC58 是烤烟品种, 其非转换子个体称为 SC58(cTcT)。SC58(CTCT) 是接近同基因 的稳定转换子品系, 其通过将烟草祖先物种绒毛状烟草中发现的单显性转换子基因座 (Cr) 基因渗入至 SC58 内产生 (Mann 等人 (1964)Crop Sci., 4: 349-353)。在与 SC58 进行 8 次 另外的回交后, 产生接近同基因的 SC58(CTCT) 品系, 其随后通过自花受精进行维持。
     使用标准盆栽土和肥料将所有植物维持在生长室或温室中。植物保持在 14/10 光 / 黑暗周期中, 根据需要每天浇灌一次, 用 Peters All Purpose Plant Food 肥料 (20-20-20 ; SpectrumBrands Inc. ; Madison, WI) 每周施肥一次。为了促进衰老, 通过将各叶浸入 0.2%乙烯利溶液中 30 秒来处理离体绿叶。 在黑暗的条件下在塑料袋中烘 烤叶直至它们变黄。
     为了进行甲烷磺酸乙酯 (EMS) 诱变, 用 50%的漂白剂对 2 克来自强转换子白肋烟草品系 DH98-325-6 的种子进行表面消毒, 进行 12 分钟, 然后在无菌 dH2O 中漂洗 6 次。然后 将大约 80mg 等分试样置于螺旋盖小瓶中并且在 1ml dH2O 中浸渗 12 小时。 轻轻倒出 dH2O, 将 种子在黑暗中在室温下于 1ml 0.5% EMS(Sigma ; St.Louis, MO) 中温育并且在 Mixer(TCS Scientific Corp. ; New Hope, PA) 上轻轻摇动, 进行 12 小时。在除去 EMS 溶液 后, 将处理的种子在 1ml 体积的 dH2O 中 ( 轻轻摇动 5 分钟 ) 清洗 8 次。在最后一次清洗后, 将种子收集至布氏漏斗 (Buchner funnel) 上以进行最后的漂洗, 然后在土壤上播种之前让 其在滤纸上干燥。幼苗在标准浮盘 (float tray) 上生长大约 7 周, 然后将其移植至田间。 使田间生长的植物自花授粉, 每株植物收集 5 至 10 个荚果 ( 含有 M1 代种子 ), 并编制目录 ( 相应于大约 4000 个独立的 M0 个体 )。
     NtabCYP82E5v2 cDNA 的分离
     使用(Invitrogen ; Carlsbad, CA) 按照厂商的方案从 DH98-325-6 烟草的绿叶和衰老的叶中提取总 RNA。通过按照厂商的方案用 TURBO DNA-freeTM DNase 试剂盒 (Ambion ; Austin, TX) 处理提取物来除去基因组 DNA。使用 StrataScriptTM First-Strand 试剂盒 (Stratagene ; Cedar Creek, TX), 用 oligo dT 引物和 3μg 的不含 DNA 酶的总 RNA 进 行 cDNA 合成。按照厂商的方案, 使用 E5Orf_F 正向和 E5Orf_R 反向引物, 10ng 烟草叶 cDNA TM 文库 ( 作为模板 ) 和 LongRange PCR Enzyme Blend(GeneChoice, Inc. ; Frederick, MD) 扩 增全长 NtabCYP82E5v2 cDNA。引物的 DNA 序列信息列于序列表和上文中。PCR 条件如下 : 在 95℃下进行 3 分钟起始变性, 然后进行 33 个循环的在 94℃下 30 秒、 在 60℃下退火 30 秒 和在 68℃下延伸 90 秒, 然后在 68℃下温育 7 分钟。将 PCR 产物克隆入 -T Easy 克 隆性载体 (Promega Corp. ; Madison, WI), 然后按照双脱氧法使用合成的寡核苷酸作为引物 进行测序 (Sanger 等人 (1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74 : 5463-5467)。
     基因组 CYP82E5 片段的分离
     按照Plant 试剂盒 (BD Bioscience Clontech ; PaloAlto, CA) 的说明书, 使用基于十六烷基三甲基溴化铵的提取法从绒毛状烟草和 DH98-325-6 烟草的绿 叶中分离基因组 DNA。
     使用嵌套引物在两个连续的 PCR 反应中扩增 CYP82E5 直系同源物的基因组片段。 第一 PCR 混合物包含 0.5μM 的各 E5Gen_F1 正向 (SEQID NO : 40) 和 E5Gen_R1 反向 (SEQ ID NO : 41) 引物, 200μM 的各 dNTP, 20ng 的基因组 DNA 模板和 2U 的 Taq 聚合 酶 (Invitrogen)。在下列条件下进行 PCR 扩增 : 在 90℃下进行 3 分钟 ; 进行 30 个循环的 在 94℃下变性 30 秒、 在 57℃下退火 30 秒和在 68℃下延伸 2.2 分钟, 然后在 68℃下进行最 后的延伸, 进行 5 分钟。除了加入引物 E5Gen_F2(SEQ ID NO : 42) 和 E5Gen_R2(SEQ ID NO : 43) 且使用 1μl 的 50 倍稀释的第一 PCR 产物的样品作为模板外, 第二 PCR 的组成和条件与 对于第一扩增所描述的组成和条件相同。将纯化的终 PCR 产物连接入 pGEM-T-Easy 克隆性 载体, 然后经历 DNA 测序。
     酵母中 NtabCYP82E5v2 cDNA 的表达
     为了促进酵母中 NtabCYP82E5v2 cDNA 的表达, 将基因的开放阅读框插入 pYeDP60 酵母表达载体的半乳糖诱导的、 葡萄糖抑制的 GAL10-CYC1 启动子的下游 (Cullin & Pompon 1988)。使用 Gietz 等人 (1992)Nucleic Acids Res.20 : 1425-1425 描述的基于醋酸锂的转化方法将重组质粒导入 WAT11 酵母株系。按照 Pompon 等人 (1996)Methods Enzymol.272 : 51-64 的方案进行酵母培养、 半乳糖介导的基因表达的诱导和微粒体级分的分离。
     NtabCYP82E5 介导的烟碱代谢的动力学分析
     在 150μl Pi 缓冲液, pH 7.1 的终体积中于含有 0.75mM NADPH, 2.5μM[ 吡咯 14 烷 -2- C] 烟碱 (Moravek Biochemicals ; Brea, CA) 和 90μg 的酵母微粒体的反应混合物中 进行烟碱代谢测定。可通过加入非放射性标记的烟碱至范围在 0.7 和 13μM 之间的终浓度 来调整烟碱浓度。从含有空载体的酵母分离的微粒体制剂用作阴性对照。将反应混合物在 25℃下温育 7 分钟, 然后用 50μl 丙酮终止反应。 在以 16,000xg 离心 3 分钟后, 将 50μl 样 品点在 250-μm Whatman K6F 硅板 (silicaplate) 上。在氯仿∶甲醇∶铵 (60 ∶ 10 ∶ 1) 溶剂系统中将板显影。 通过用 Bioscan System 400 图像扫描仪测量它们的放射性示踪剂的 相对丰度来定量烟碱和其降烟碱衍生物。通过使用 10.0 制图软件 (Systat Software, Inc. ; San Jose, CA) 使 Michaelis-Menten 方程式拟合不同底物浓度上的烟碱脱 甲基测量值来计算 Km 和 vmax 值。
     CYP82E4v2 和 CYP82E5v2 表达的定量实时 PCR 分析
     使用Green I 荧光化学药品 (Morrison 等人 (1998)Biotechniques 24 :954-962) 通过等位基因特异性定量实时 PCR(qrt-PCR) 分析 CYP82E4v2 和 CYP82E5v2 的绒 毛状烟草和烟草直系同源物的表达。 使用本文中针对 NtabCYP82E5v2 cDNA 分离的所描述的 方法从 3 月龄的植物的绿叶和烘烤叶中提取总 RNA。使用 E4Rt_F(SEQ IDNO : 44) 和 E5Rt_ F(SEQ ID NO : 46) 正向引物 ( 与 E4Rt_R(SEQ ID NO : 45) 和 E5Rt_R(SEQ ID NO : 47) 反向 引物组合 ) 分别扩增 CYP82E4v2 和 CYP82E5v2 转录物。qrt-PCR 混合物包含 1xiQTM Green Supermix(Bio-Rad Laboratories)、 0.5μM 的各引物和 0.5μg cDNA。使用通过扩 增已知量的靶 DNA 和甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (G3PDH) 基因的 220-bp 片段 ( 用 G3PDH_F(SEQ ID NO : 48) 和 G3PDH_R(SEQ ID NO : 49) 引物扩增, 以提供 cDNA 测量的内部标准 ) 产生的标 准曲线获得转录物的测量值。在下列条件下使用实时 PCR 系统 (Bio-Rad Laboratories ; Hercules, CA) 进行 DNA 扩增 : 在 95℃下进行 2 分钟 ; 进行 35 个循环的 95℃下 30 秒、 57℃ 下 30 秒、 72℃下 50 秒, 然后在 72℃下进行终延伸 5 分钟。通过克隆 PCR 产物和测定 20 个 随机选择的克隆的序列验证通过 qrt-PCR 产生的扩增子的 DNA 序列。
     转基因植物分析
     在 pKYL80 克隆性载体 (Schardl 等人 (1987)Gene 61 : 1-11) 中装配基于 RNAi 的 基因沉默构建体, 所述 pKYL80 克隆性载体经工程改造在多接头的 Xhol 与 Sacl 限制性位 点之间包含 151-bp 的大豆 FAD3 基因内含子片段 (pKYLX80I)。为了产生其中 FAD3 内含子 被 CYP82E5v2 的有义和反义片段侧翼连接的构建体, 分别以其有义和反义方向将 400-bp 的 内含子区域克隆在 pKYLX801 的 HindIII-Xhol 和 Sacl-Xbal 限制性位点之间。将所得的 HindIII-Xbal 片段 ( 其包含 CYP8E5v2 有义臂、 FAD3 内含子和 CYP82E5v2 反义臂 ) 亚克隆入 pKYLX71 植物二元表达载体 (Maiti 等人 (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 : 6110-6114) 的 35S CaMV 启动子与核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基终止子之间。
     通过用 CYP82E5v2、 CYP82E5v2 变体或 CYP82E4v2 变体 cDNA 的全长编码区替代植 物二元表达载体 pBI121(Clontech) 的 3- 葡糖醛酸糖苷酶 ORF 来产生过表达构建体。这 将烟草 P450 置于 35S CaMV 启动子的转录控制之下。将基于 pBI121 和 pKYLX71 的构建体转化入根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 株系 LBA 4404 并且使用已建立的方案 (Horsch 等人 (1985)Science 227 : 1229-1231) 将其分别导入烟草品种 Petite Havana 和 DH98-325-6( 转换子 )。
     Northern 印迹分析
     如厂商 (Invitrogen) 所描述的, 使用法从烟草叶分离的总细胞 RNA。 在1.2%的于 TBE 缓冲液中制备的琼脂糖凝胶上按大小分级分离 5 至 10 微克的 RNA。按照厂 商的说明书 (Roche), 使用 DIG 核酸标记和检测试剂盒进行 RNA 固定、 探针标记和信号检测。 备选地, 按照 Random Primed DNA Labeling 试剂盒 (Roche) 附带的方案使用 32P-dCTP 合成 探针。
     来自 EMS- 诱变处理的植物的 DNA 的分离
     从单株温室培养的 M1 植物 ( 其来自各独立的 M1 种子库 ) 的幼叶材料分离基因组 DNA。1.5ml 螺旋盖小瓶用于从各植物收集单个叶盘, 然后在 -80℃下贮存样品直至对它们 进行处理。通过离心将叶组织沉积在瓶子底部, 将试管置于浅量的液氮中以帮助使用研杵 进行研磨。通过加入 320μl 提取缓冲液 (200mM Tris-Cl, pH 7.5, 250mM NaCl, 25mMEDTA, 0.5% SDS) 从研磨的材料中分离基因组 DNA。 将样品涡旋 20 秒, 在室温下静置 5 分钟, 然后 在 37℃下温育 3 分钟。将裂解的材料离心 10 分钟, 将上清液转移至新试管中。加入 50μl 的蛋白沉淀溶液 (Qiagen), 短暂地涡旋样品, 然后置于冰上进行 5 分钟, 然后以 16,000xg 离 心 4 分钟。通过向上清液中加入 0.7 体积的异丙醇, 然后以 12,000xg 离心 7 分钟来进行核 酸的沉淀。在 70%乙醇清洗后, 将沉淀重悬浮于 50μl TE 中。
     用于测序的模板的制备
     CYP82E4v2 和 CYP82E5v2 各自包含被大内含子 ( 分别 1001bp 和 1054bp) 分隔的 2 个外显子。设计 PCR 引物以特异性扩增各基因的外显子 1 和外显子 2。由于 CYP82E2 基 因家族成员的 cDNA 之间共有高序列同源性, 因此两个引物对相应于内含子序列以获得特 异于期望的基因的扩增产物 ( 归因于这样的事实, 该基因家族的内含子序列远不如外显子 序列保守 )。CYP82E4v2 的外显子 1- 特异性引物是 5′ -TGGAATTATGCCCATCCTACA-3′ ( 正 向 )(SEQ ID NO : 32) 和 5 ′ -CATTAGTGGTTGCACCTGAGG-3 ′ ( 反 向 )(SEQ ID NO : 33)。 CYP82E4v2 外显子 2- 特异性引物是 5′ -GATGAGATGTGTGCATACTTG-3′ ( 正向 )(SEQID NO : 34) 和 5′ -CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG-3′ ( 反向 )(SEQ ID NO : 35)。对于 CYP82E5v2, 用 于扩增外显子 1 的特异性引物是 5′ -ATTGTAGGACTAGTAACCCTTACAC-3′ ( 正向 )(SEQ ID NO : 36) 和 5′ -GAGGCACAAAGAATTCTCATC-3′ ( 反向 )(SEQ ID NO : 37) ; 对于 CYP82E5v2 的 外显示子 2, 使用引物 5′ -GAGTAGAGGGATTGTTTCCG-3′ ( 正向 )(SEQ ID NO : 38) 和 5′ -GT ACAATCAAGATAAAACATCTAAGG-3′ ( 反向 )(SEQ ID NO : 39)。 在 96 孔微量滴定板中使用 1μl 模板于 25μl 含有 10pmole 的各引物, 200μM dNTP, 1.5mM MgCl 和 1.4 单位的高保真 Taq DNA 聚合酶 (Roche) 的反应体积中进行 PCR 反应。使用下述条件来进行 CYP82E4v2 序列的 DNA 扩增 : 最初在 94℃下变性 3 分钟, 然后进行 30 个循环的在 94℃下变性 30 秒、 在 55℃下 引物退火 30 秒和在 72℃下延伸 1.5 分钟, 然后在 72℃下进行最后的延伸 7 分钟。除了退 火温度为 53℃外, 用于 CYP82E5v2 基因片段的扩增条件相同。 使用 Millipore′ s Montage PCRμ96 过滤单元纯化 PCR 反应产物。在测序之前使用琼脂糖凝胶电泳评估经纯化的 PCR 产物的量和质量。序列分析
     按 照 厂 商 的 说 明 书,使 用 Applied Biosystems Big Dye Version3.1 在 96 孔 版 式 的 测 序 反 应 中 将 PCR 产 物 经 历 循 环 测 序。 用 于 测 序 的 引 物 (3.2pmole/ 反 应 ) 如 下 : 5 ′ -TGGAATTATGCCCATCCTACA-3 ′ (SEQ IDNO : 32) 和 5 ′ -CCTATAAAAAGGAAGTTGCCG-3 ′ (SEQ ID NO : 44)( 用 于 CYP82E4v2 的 外 显 子 1 的 正 向和反向引物 ) ; 5 ′ -GATGAGATGTGTGCATACTTG-3 ′ (SEQ ID NO : 34) 和 5 ′ -CCAAATT AGAAAAACTCGTACTG-3 ′ (SEQ ID NO : 35)( 用 于 CYP82E4v2 的 外 显 子 2 的 正 向 和 反 向 引 物); 5 ′ -ATTGTAGGACTAGTAACCCTTACAC-3 ′ (SEQ ID NO : 36) 和 5 ′ -CTCATCTTTTTTCCA TTTATCATTC-3 ′ (SEQ ID NO : 45)( 用于 CYP82E5v2 的外显子 1 的正向和反向引物 ) ; 和 5′ -CAAGGTTCGGCAGATAGTG-3′ (SEQ ID NO : 46) 和 5′ -GTACAATCAAGATAAAACATCTAAGG-3 ′ (SEQ ID NO : 39)( 用于 CYP82E5v2 的外显子 2 的正向和反向引物 )。 使用 EdgeBioSystems 96 孔板清洁测序反应, 使用高通量 Applied Biosystems 3700 或 3730 毛细管测序仪进行分 析。使用 Vector NTI 软件包 (Invitrogen) 中提供的 ClustalW 算法比对序列。通过对姐 妹 M1 植物 ( 来自相应的 (cognate)M0 种子批次 ) 重复序列分析来验证假定的突变。
     生物碱分析 如之前所述通过气相色谱法进行生物碱分析。简而言之, 通过分离烟草叶并且将 它们浸入 1%乙烯利的溶液中, 然后在生长室中晾干 7 至 10 天来进行生物碱分析。 将处理的 叶子在 50℃下干燥 2 天, 然后研磨成细粉。按照 University of Kentucky 建立的 “LC- 方 案” ( 可在 University of Kentucky 的网站上在线获得, 其通过引用合并入本文 ) 使用 Perkin Elmer Autosystem XL Gas Chromatograph 进行烟碱、 降烟碱、 新烟草碱和新烟碱含 量的定量测定。
     实施例 1 : CYP82E5V2 的分离的和表征
     绒毛状烟草和各种烟草基因型中的烟碱转化
     为了评估野生型植物的生物碱组成, 使用气相色谱法测定绒毛状烟草和各种烟草 基因型的绿叶和烘烤叶中烟碱和降烟碱的浓度。在绒毛状烟草中, 降烟碱在绿叶和烘烤 叶中都表现为主要的生物碱 ( 表 1)。转换子白肋烟品种 DH-98-325-6 和转换子烤烟品种 SC58C 在绿叶中含有低水平的降烟碱 ( 大约 3% ), 但大百分比 ( 分别地大约 95 和 25% ) 的烟碱含量在叶子衰老时代谢成降烟碱 ( 参见, 表 1)。降烟碱的水平在非转换子白肋烟和 烤烟品种 ( 分别地 DH98-325-5 和 SC58NC) 的绿叶和烘烤叶中都较低, 尽管烟碱转化在烘烤 后略微增加。
     表 1. 绒毛状烟草和各种烟草基因型的绿叶和烘烤叶的生物碱分析。
     叶干重的百分比。
     [%降烟碱 (%烟碱 +%降烟碱 )-1]X100。 c
     用 0.2%乙烯利处理叶并烘烤叶直至它们变黄。 d
     3 株植物的生物碱含量的平均值, 除了 SC58C( 其中由于较低的转换频率而使用一 株植物 ) 外。 e
     括号内的值代表平均值的标准误。
     缩写 : GLC, 绿叶转换子 ; NC, 非转换子 ; SLC, 衰老叶转换子。
     NtabCYP82E5v2 cDNA 自烟草的分离
     为了鉴定来自烟草的假定的烟碱脱甲基酶基因, 使用基于 PCR 的基因扩增策略, 其中引物与 NtabCYP82E3 编码区的 5′和 3′末端互补。引物设计基于这样的观察结果, 密切相关的 CYP82E2 基因亚家族的所有成员在紧接 ATG 起始信号之后和 TAA 终止密码子 之前的区域上展示高度的 DNA 序列同一性 (Siminszky 等人 (2005)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.102 : 14919-14924), 从而为另外的家族成员的扩增提供充分保守的引物靶位点。进 行使用 CYP82E3- 特异性引物和允许的退火温度的 PCR 以从烟草绿叶 cDNA 文库扩增假定 的烟碱脱甲基酶基因。20 个随机选择的从 PCR 产物产生的克隆的 DNA 序列分析产生 19 个 NtabCYP82E3cDNA 序列和一个其 DNA 序列与 CYP82E2 基因亚家族的所有功能上得到表征的 成员不同的 cDNA(Siminszky 等人 (2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102 : 14919-14924)。 使用 BLAST 算法对 GenBank 数据库进行的同源性搜索显示代表独特 DNA 序列的克隆与未知 功能的烟草 CYP82E5v1 cDNA 共有 99.7%的核苷酸同一性和 99.2%的预测的氨基酸同一 性。根据 P450 命名委员会的指导方针, 将 cDNA 命名为 NtabCYP82E5v2。NtabCYP82E5v2 的 预测的氨基酸序列分别与 NtabCYP82E2、 NtabCYP82E3 和 NtabCYP82E4v2 的序列 89.2、 91.9 和 91.3%同一。
     NtabCYP82E5v2 编码功能性烟碱脱甲基酶
     为了确定 NtabCYP82E5v2 是否编码烟碱脱甲基酶活性, 在 WAT11 酵母株系中表 达 NtabCYP82E5 cDNA。对 WAT11 株系进行工程改造以提供高效转基因表达和通过表达在
     ba半乳糖诱导型启动子的转录控制下的拟南芥 P450 还原酶基因 ATR1 来为 P450 介导的反 应提供最佳氧化还原环境 (Pompon 等人 (1996)Methods Enzymol.272 : 51-64)。从表达 NtabCYP82E5v2 的酵母分离的微粒体片段活跃地催化烟碱的 N- 脱甲基化。NtabCYP82E5v2 介导的烟碱脱甲基酶反应的 Km 和 vmax 值分别为 5.6±1.4μM 和 0.7±0.02nmol 分钟 -1mg-1 蛋白质 ( 平均值 ± 标准误 )。相反地, 当向催化测定中加入从用空质粒转化的酵母分离的 微粒体时, 烟碱脱甲基酶活性不明显。
     NtabCYP82E5v2 来源于祖先绒毛状烟草
     烟草的异源四倍体基因组由两个遗传组分组成, 由林烟草贡献的 S 基因组和来源 于绒毛状烟草的 T 基因组, 因此这两个祖先物种中哪一个将 NtabCYP82E5v2 贡献给烟草还 不清楚。为此, 设计 CYP82E5- 特异性引物以扩增来自烟草和贡献 NtabCYP82E5v2 的祖先 的 CYP82E5 基因的基因组片段。当从烟草或绒毛状烟草分离的基因组 DNA 用作模板时 PCR 扩增产生独特的 2243bp 产物, 但当扩增林烟草的基因组 DNA 时未检测到扩增子, 这表明 NtabCYP82E5v2 来源于绒毛状烟草。DNA 序列分析显示 NtabCYP82E5v2 和 NtomCYP82E5 的 基因组片段包含侧翼于 604bp 5′和 585bp 3′编码区的 1054bp 内含子并且在 15 个位点 ( 其中 9 个和 6 个位点分别位于编码区和内含子内 ) 上相异。
     此外, 10 个随机选择的从烟草分离的基因组克隆的编码区与 NtabCYP82E5v2 cDNA 共有 100 %的核苷酸同一性, 这表明 NtabCYP82E5v2 是位于 DH98-325-6 烟草中的唯一 CYP82E5 变体。
     NtabCYP82E5v2 以低水平在绿叶和黄叶中表达
     为了研究植物中 CYP82E5 的催化作用, 使用定量实时 (qrt)-PCR 分析测定转换子 (DH98-325-6) 和非转换子 (DH98-325-5) 白肋烟、 转换子和非转换子烤烟 (SC58) 以及绒毛 状烟草的绿叶和衰老的叶中的 CYP82E5v2 的转录特征谱。
     表 2. 通过定量实时聚合酶链式反应分析进行的来源于绒毛状烟草和不同烟草基 因型的绿叶和烘烤的叶的 CYP82E4v2 和 CYP82E5v2cDNA 的绝对定量。
     * 平均值针对于 3 株独立植物的 1 片叶, 每样品 3 次 cDNA 测量 (n = 9), 除了 SC58C 外 ( 其中使用一株植物 )(n = 3)。
     * 根据 F 测验保护最小显著差数法 (Fisher’ s protected LSD), 不同字母前的数 字差异显著 (0.05)。
     NtabCYP82E5v2 在 所 有 烟 草 品 种 的 绿 叶 或 黄 叶 中 低 水 平 表 达 ( 参 见, 表 2)。 NtabCYP82E5v2 的表达在转换子和非转换子白肋烟品种的烘烤叶中相对于在绿叶中显著增 加, 但在烤烟中保持未变。
     NtomCYP82E5 在绒毛状烟草的绿叶中的表达比在烟草中高, 但在两个物种的 烘烤叶之间差异不显著 ( 表 2)。为了比较 CYP82E5v2 的表达水平与 CYP82E4v2( 之前 表征的烟碱脱甲基酶基因, 其转录经显示在绒毛状烟草和转换子烟草的衰老的叶中急 剧 上 调 (Gavilano 等 人 (2007)J.Biol.Chem.282 : 249-256)) 的 表 达 水 平, 在用于定量 CYP82E5v2mRNA 的相同提取物中比较 CYP82E4v2 的转录物积累。在所有烟草品种、 绒毛 状烟草的绿叶中和在非转换子烟草植物的烘烤的叶中, NtabCYP82E5v2 的转录显著高于 NtabCYP82E4v2 的转录。然而, 在转换子烟草和绒毛状烟草的烘烤的叶中趋势相反 ( 表 2)。 迄今, 在两个表征的烟碱脱甲基酶基因中, CYP82E4v2 是绒毛状烟草和烟草中衰老诱导的降 烟碱产生中的主要因素 (dominant factor)。此外, NtabCYP82E5v2 的活性是烟草绿叶中烟 碱转化的关键决定因素。
     实施例 2 : 对细胞色素 P450 基因家族成员的序列同一性
     即使 CYP82E5v2 和 CYP82E4v2 都是烟碱脱甲基酶, 它们彼此的序列同源性比例如 CYP82E5v2 与 CYP82E3 的序列同源性更低。
     表 3.CYP82E4v2 烟碱脱甲基酶与已就烟碱脱甲基酶活性进行测定的其他 CYP82E2
     蛋白之间共有的氨基酸序列同一性。CYP82E5v2 和 CYP82E4v2 是提供的具有烟碱脱甲基酶 活性的仅有的蛋白质。
     42101939431 A CN 101939434说CYP82E5v2明书36/43 页CYP82E2v2CYP82E2v1CYP82E3CYP82E4v1258-166CYP82E4v699.6%4399.4% SEQ ID NO : 13 CYP82E4v2
     表 4.CYP82E4v2 烟碱脱甲基酶与其他 CYP82E2 蛋白之间共有的氨基酸序列同一 性。CYP82E5v2 和 CYP82E4v2 是提供的具有烟碱脱甲基酶活性的仅有的蛋白质。94.8%94.2%92.6%92.6%91.1%101939431 A CN 101939434
     说明书CYP82E3 CYP82E237/43 页CYP82E4v2 CYP82E5v2 91.1% SEQ ID NO : 291.9%91.3%表 5. 已就烟碱脱甲基酶活性进行了测定的 CYP82E2 基因家族成员的表达特征谱。 CYP82E5v2 和 CYP82E4v2 是提供的对于烟碱脱甲基酶活性呈阳性的仅有的蛋白质。
     44101939431 A CN 101939434说在绿叶中较 低; CYP82E5v2明书38/43 页CYP82E2v2在绿叶中极 低; 在绿叶和 乙烯诱导 在绿叶 和乙烯 在绿叶中较 低; 在绿叶中极 低; 无报导无报导 在乙烯诱导 的衰老的叶 中极高45CYP82E2v1CYP82E3CYP82E4v1258-166实施例 3 : CYP82E4V2 和 CYP82E5V2 中的突变
     获得 CYP82E4v2 的 EMS- 衍生的变体
     为了促进将随机突变导入至烟草基因组内, 用化学诱变剂甲烷磺酸乙酯 (EMS) 处 理数千粒强转换子白肋烟品系 DH98-325-6 的种子。 在田间种植大约 4000 株诱变的植物 (M0
     CYP82E4v2CYP82E4v6在乙烯诱导 的衰老的叶 中较高诱导的 衰老的 叶中都 极低的衰老的 叶中都较 低在乙烯诱导 的衰老的叶 中极高在乙烯诱导 的衰老的叶 中非常低101939431 A CN 101939434说明书39/43 页代 ), 让其自花授粉。将来自各个体植物的几个荚果组合以产生分离的 M1 种子群体, 各自相 应于个体 M0 植物。从单株温室培养的 M1 植物 ( 来自各 M1 种子库 ) 的幼叶组织分离基因组 DNA。为了鉴定在 CYP82E4v2 基因中具有突变的植物, 设计特异性引物来独立地扩增基因的 两个外显子的每一个。使用扩增产物的 96 孔高通量序列分析来获得 DNA 序列信息。96 株 个体植物的完全分析包括 4 个分开的 96 孔测序反应 : 外显子 1 的扩增产物的正向和反向测 序, 和外显 2 的 PCR 产物的正向和反向测序。
     通过对给定的实验进行所有 96 个序列的多序列比对, 并寻找与野生型序列的差 异来鉴定突变。预期在亲本 M0 植物中发生的任何给定的突变以 1 ∶ 2 ∶ 1 的比在 M1 代中 分离 ( 突变型对野生型等位基因 )。对于 EMS 诱导的突变是纯合的 M1 植物容易地被识别, 因为多态性偏离野生型序列 ( 在两个方向上都得到验证 )。对于 CYP82E4v2 中的突变是杂 合的 M1 植物预期具有突变型和野生型等位基因 ( 各自代表 50%的扩增产物 )。在测序后, 这样的突变的位置预期注释为 “N” , 因为在该位点上的荧光读数是两个可选择的碱基的混 合物。使用互补引物, 结合相应色谱图的目测检查发现的相同核苷酸位置上 “N” 的出现辨 别出对于 CYP82E4v2 中的突变是真实杂合的植物, 并且使此类真实杂合子与人工序列异常 相区分。
     CYP82E4v2 中的突变
     672 株独立的 M1 植物的高通量序列分析导致 11 株在 CYP82E4v2 基因内具有点突 变的个体的鉴定 ( 参见, 表 6)。经鉴定具有 CYP82E4v2 突变的 11 株植物中有 6 株对于突变 等位基因是纯合的 ( 参见, 表 6)。 所有 11 个突变都导致编码的蛋白质的预测的氨基酸序列 的变化。
     表 6. 在 CYP82E4v2 基因中具有突变的 EMS 处理的 DH98-325-6 植物的 M1 品系。
     植物品系 DH98-325-6 #101 DH98-325-6 #121 DH98-325-6 #164 DH98-325-6 #321 DH98-325-6 #377 DH98-325-6 #569 DH98-325-6 #506 DH98-325-6 #453核苷酸突变 * C1372T G1092T C113T G601A G506A G1375A G886A C1280T氨基酸变化 ** P458S K364N P38L E201K R169Q G459R E296K T427I突变等位基因的接合性 纯合的 纯合的 纯合的 杂合的 杂合的 杂合的 杂合的 杂合的46101939431 A CN 101939434说G986A G1126A G511A明书纯合的 纯合的 纯合的40/43 页DH98-325-6 #775 DH98-325-6 #610 DH98-325-6 #761
     W329Stop V376M D171N* 核苷酸位置以 CYP82E4v2 cDNA( 参见 SEQ ID NO : 50) 的 ATG 起始密码子为参照。 数字左边的核苷酸表示野生型残基, 而右边的核苷酸表示突变残基 ( 例如 C1372T 表示位于 位点 1372 的 C 残基突变成 T 残基 )。
     ** 氨基酸位置以 CYP82E4v2 多肽 ( 参见 SEQ ID NO : 13) 的起始甲硫氨酸为参照。 数字左边的氨基酸表示野生型残基, 而右边的氨基酸表示由突变等位基因产生的残基 ( 例 如, P458S 表示位于蛋白质序列的位点 458 上的脯氨酸残基已变成丝氨酸 )。 “Stop” 表示 未成熟终止密码子的导入。
     植物 #775 在密码子 329 上具有突变, 其将色氨酸密码子 (TGG) 改变成未成熟终止 密码子 (TAG)。该突变使得编码的蛋白质完全丧失功能, 因为酶的必需的血红素结合结构 域和其他高度保守的区域位于密码子 329 的下游。其他植物包含影响由绝大多数 P450 酶 共有的高度保守的基序的突变, 包括 : 植物 #101( 其中紧邻血红素结合 Cys 氨基酸的保守的 Pro 残基变成 Ser) ; 植物 #164( 蛋白质的高度保守的富含 Pro 的 “铰链” 区内的 Pro 残基变 成 Leu) ; 和植物 #569( 作为非常高度保守的血红素结合基序的部分的 Gly 残基变成 Arg)。
     CYP82E4v2 变体的生物碱分析
     对变异个体的烘烤的叶进行生物碱分析以估量突变对烟碱至降烟碱的代谢转化 的影响。如表 7 中所示, 3 个个体 (#101、 #121 和 #775) 显示与来自已经进行了筛选从而消 除了转换子个体 (TN90 LC 植物 ) 的种子批次的非转换子对照植物相似的转化率。此类植 物中产生的变异 CYP82E4v2 酶是完全 ( 或几乎完全 ) 无功能的。两株植物 (#164 和 #761) 展示高转化率并且对酶活性没有不利作用。植物 #164 的该结果令人惊讶, 因为其在界定高 度保守的富含 Pro 的铰链基序的残基中的一个残基内包含 Pro 至 Leu 的突变。在残基 376 上的 Val 至 Met 的改变部分地抑制了酶的功能, 因为纯合突变植物 (#610) 显示中间的转化 表型 (41.5% )。
     表 7. 对于 CYP82E4v2 基因中的突变是纯合的 M1 植物的生物碱含量 ( 表示为百分 比干重 )
     植物 DH98-325-6 #101 DH98-325-6 #121 DH98-325-6 #164烟碱 2.17 2.5 0.216降烟碱 0.0376 0.0333 0.84新烟碱 0.00514 0.00557 0.00499新烟草碱 0.0384 0.043 0.0532转化% * 1.7% 1.3% 79.5%47101939431 A CN 101939434说0.214 0.214 0.505 0.206 3.11 2.46 0.152 0.999 0.0159 0.565 0.0647 0.0521明书0.00429 0.00429 0.00417 0.00412 0.00901 0.00846 0.0121 0.0426 0.0136 0.0197 0.0487 0.0417 41.5% 82.4% 3.1% 73.3% 2.0% 2.1%41/43 页DH98-325-6 #610 DH98-325-6 #761 DH98-325-6 #775 SC58 CtCt( 对照 ) TN90 LC( 对照 ) TN90 LC( 对照 )
     *[% 降烟碱 /(%烟碱 +%降烟碱 )]X100
     烤烟基因型 SC58 的转换子植物用作强转换子对照 ; 选自就低转换子 (LC) 进行筛 选的批次的两株基因型 TN90 的植物用作非转换子对照。
     植物 #121 的位点 364 上的 Lys 残基至 Asn 的置换不在 P450 酶间保守的任何基序 中发生, 也不在由 Xu 等人 (Physiologia Plantarum129 : 307-319, 2007) 预测为底物识别部 位的任何区域内发生。针对保存在 GenBank 中的蛋白质序列的 BLAST 比对显示几种在类似 的位点上具有 Asn 残基的 P450( 例如豌豆的 CYP82A1 基因 - 登录号 Q43068)。植物 #121 中 的变异 CYP82E4v2 基因是完全失活的。植物 #121 的另一个异常在于 EMS- 诱导的突变的性 质。EMS 已知通过 G 残基的烷基化诱导突变 ( 导致 G 至 A 或 C 至 T 的转换突变 )(Anderson, Methods Cell Biol.48 : 31-58, 1995)。EMS 极少导致 G 至 T 的颠换突变例如植物 #121 中 发现的颠换突变 ( 参见, 表 3)。对于 CYP82E4v2 或 CYP82E5v2 基因所描述的所有其他突变 是预期中的 G 至 A 或 C 至 T 的转换突变。
     CYP82E5v2 中的突变
     将相似的高通量测序策略用于鉴定 CYP82E5v2( 烟草基因组中发现的另一种经验 证的烟碱 N- 脱甲基酶基因 ) 中的突变。768 株 M1 植物的筛选显示 11 个在 CYP82E5v2 中具 有突变的个体 ( 参见, 表 8)。3 株植物 (#744、 #561 和 #340) 包含不改变预测的蛋白质序 列的沉默核苷酸置换。在导致蛋白质序列发生变化的 8 个突变中, 特别注意到 2 个。植物 #1013 包含导致使产物完全无功能的截断的产物的突变。 位点 1266 上的 G 至 A 的突变将 Trp 密码子 (TGG) 变成未成熟终止密码子 (TGA)。从该截断的阅读框产生的预测的 CYP82E5v2 蛋白缺少酶的最后 96 个氨基酸 ( 包括必需的血红素结合结构域的区域 )。不受机制限制, 该截断的蛋白质可能不能催化烟碱的 N′甲基的氧化消除 ( 以形成降烟碱 )。无论什么机 制, #1013 植物都具有无功能的 CYP82E5v2 等位基因。植物 #680 具有将位点 449 上的 Pro 残基变成 Leu 的突变。该 Pro 在植物 P450 中是非常保守的并且紧邻界定血红素结合区域 的 F-x-x-G-x-R-x-C-x-G 基序。植物 #680 中发现的突变对酶的功能具有负面影响。
     表 8. 在 CYP82E5v2 基因中具有突变的 EMS 处理的 DH98-325-6 植物的 M1 品系
     植物品系核苷酸突变 *氨基酸变化 **48突变等位基因的接合性101939431 A CN 101939434说C703T C1346T G558A C521T G1458A C1229T G1248A G672A C215T C427T G1266A明书杂合的 纯合的 纯合的 杂合的 杂合的 杂合的 杂合的 杂合的 杂合的 杂合的 纯合的42/43 页DH98-325-6 #198 DH98-325-6 #680 DH98-325-6 #744 DH98-325-6 #163 DH98-325-6 #561 DH98-325-6 #154 DH98-325-6 #340 DH98-325-6 #780 DH98-325-6 #799 DH98-325-6 #540 DH98-325-6 #1013
     P235S P449L 无 S174L 无 A410V 无 M224I P72L L143F W422Stop* 核苷酸位置以 CYP82E5v2 cDNA( 参见 SEQ ID NO : 1) 的 ATG 起始密码子为参照。 数字左边的核苷酸表示野生型残基, 而右边的核苷酸表示突变残基 ( 例如 C703T 表示位于 位点 703 的 C 残基突变成 T 残基 )。
     ** 氨基酸位置以 CYP82E5v2 多肽 ( 参见 SEQ ID NO : 2) 的起始甲硫氨酸为参照。 数字左边的氨基酸表示野生型残基, 而右边的氨基酸表示由突变等位基因产生的残基 ( 例 如, P235S 表示位于蛋白质序列的位点 235 上的脯氨酸残基已变成丝氨酸 )。 “Stop” 表示 未成熟终止密码子的导入。 “无” 表示导致不改变预测的氨基酸序列的沉默置换的突变。
     在 CYP82E4v2 和 CYP82E5v2 中具有突变的植物
     当 将 具 有 抑 制 CYP82E4v2 的 烟 碱 脱 甲 基 酶 活 性 的 突 变 的 植 物 与 具 有 抑 制 其在环境 CYP82E5v2 的烟碱脱甲基酶活性的突变的植物杂交时, 产生这样的烟草植物品系, 影响的限度内对于烟碱至降烟碱的减少的转化 ( 大约 0.5%的水平 ) 显示一致性和稳定性。
     示例性杂交是 CYP82E4v2 突变植物 ( 表 9 的 ) 与 CYP82E5v2 突变植物 ( 表 9 的 ) 之间的杂交。
     表 9. 在 CYP82E5v2 和 CYP82E4v2 基因中具有突变的 DH98-325-6 植物的示例性杂 交。
     本说明书中提及的所有公开案和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的水 平。所有公开案和专利申请通过引用合并入本文, 其引用程度就如同已明确地且单独地将 各个公开案或专利申请通过引用合并入本文。
     虽然为了清楚理解的目的, 已通过举例说明和实施例的方式对上述发明进行了相 当详细的描述, 但很明显可在所附权利要求的范围内实施某些改变和修饰。
     50101939431 A CN 101939434序列 序列表表1/63 页<110>Dewey, Ralph E. Siminszky, Balazs Bowen, Steven W. Gavilano, Lily <120> 通过修饰特定细胞色素 P450 基因改变烟草生物碱含量 <130>035051/364220 <150>60/987,243 <151>2007-11-12 <160>50 <170>PatentIn version 3.5 <210>1 <211>1554 <212>DNA <213> 普通烟草 (Nicotiana tabacum) <400>1 atggtttctc ctatggccca tggccggtaa cgaaaactcg ccgcttgtgt gccattttct atgctatttt gaagttctct acgagcatta gattggttag gaatccggta attttatcaa gattttcaag cagaattggt aatgaacaagccgtagaagc aaaaatttca tcggccatct gagacttagc tagttgtaag ccaatcgtcc tgacaaaata ctgctagtcg agagtttata aagaattgaa aaggagatga tggagtttgt gccatgttaa tagaggaaca atttcattgacattgtagga aataccttca tttctacttc tgacaaatac cagttacgaa agcttttctt cggaccttat tctcgaaaaa cactcgaatt ttttggtctg acaagtggag gttatgggat ggccatgaaa tgtcaagaaa tgtggtgcttctagtaaccc aaaccattac gatgatgacg ggcccggttt gctgtaaaag tacggtgaat tggcgaaaaa ttgaagcacg gatggaaatt atcgtgaaaa agatttagga gcttttccaa aggacattta agagaaaaaa tcaaaaatga51ttacacttct caccgaaaat gcgacgaccg tcactttccg actgcttctc accttggcta atagaaaatt tgagatttgg cgagtacgat tgatcgctgg aagcgtttaa ttccattgtt aggatataga tggaggttaa gtaatgaatacttctacttc tcccggaggg tccattagct gctaggcctt tacaaatgac cagtaatgcc agtcattcag taaaattcaa aaatctaact gaaaaattat ggattttata caaatgggtg ttctgttttt tgcacaaggg tcttgatgaa60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900101939431 A CN 101939434序gtgatactgt ctcttcacat cacaagaaga aggatttggt ctttattagt aagggactag atcctgataa actatgagtt tacaagcgga atgacgagcc tagaagtgac cataaaagca gaattgggga gatcgataaa ctacctccaa acctcatgaa actattcgcg gtttgatcca tatcccattt acacctaaca cttggatatg aattacggct列表gtttggtctt tgataaacaa aggaaagatg aagaagtgtt attgtgttgt aattgcagcg tcgctgatga gacgatcttg tgatccaggg caggattaac ctgagcttta ggatgctgcg tcaacatgcc ggtagaagag acgattatat tagtggatat cgatcctaaa tattgactac tccggggatg tttcaattac tatacgtaaa ttaa2/63 页ggttactctc gacacagttg ttgaagaaag agtgatatta ccaccaggac cacattccta ctctggtcaa cgtggtcagc acttatgcat aaaactccaa gtaaatcctgacagtgttta atggcattac aaagttggta gctattgtta aatgtagagg aacgttatga gagagattct ggttctggaa atagcacatt aaggaaggtg cgcctggcac960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1554<210>2 <211>517 <212>PRT <213> 普通烟草 <400>2 Met Val Ser Pro 1 Leu Phe Tyr Phe 20 Leu Pro Pro Lys 35 Tyr Phe Asp Asp 50 Asp Leu Ala Asp 65 Pro Leu Val Leu Ser Thr Asn Asp 100 Glu Tyr Leu Gly 115 Pro Tyr Trp Arg 130 Ala Ser Arg Leu 145 Thr Ser Ile LysVal Glu Ala Ile Val 5 Leu Trp Pro Lys Lys 25 Ile Pro Gly Gly Trp 40 Asp Gly Asp Asp Arg 55 Lys Tyr Gly Pro Val 70 Val Val Ser Ser Tyr 85 Ala Ile Phe Ser Asn 105 Tyr Ser Asn Ala Met 120 Lys Asn Arg Lys Leu 135 Glu Lys Leu Lys His 150 Ser Leu Tyr Thr Arg52Gly Leu Val Thr Leu 10 Phe Gln Ile Pro Ser 30 Pro Val Ile Gly His 45 Pro Leu Ala Arg Lys 60 Phe Thr Phe Arg Leu 75 Glu Ala Val Lys Asp 90 Arg Pro Ala Phe Leu 110 Leu Phe Leu Thr Lys 125 Val Ile Gln Glu Val 140 Val Arg Phe Gly Lys 155 Ile Asp Gly Asn SerThr Leu 15 Lys Pro Leu Phe Leu Gly Gly Leu 80 Cys Phe 95 Tyr Gly Tyr Gly Leu Ser Ile Gln 160 Ser Thr101939431 A CN 101939434序列表175 Leu Ile Val 190 Asp Glu Gln Leu Ser Met Lys Trp Val 240 Lys Asp Ile 255 Lys Arg Glu 270 Ile Asp Val Tyr Ser Arg Asp Ala Ala 320 Leu Ile Asn 335 Lys Lys Val 350 Leu Val Tyr Pro Gly Pro Ser Gly Tyr 400 Lys Leu Gln 415 Pro Glu Arg 430 Glu Phe Ile Tyr Ala Leu Phe Asn Tyr 4803/63 页Ile Lys Val Glu 225 Asp Asp Lys Val Asp 305 Asp Asn Gly Leu Leu 385 His Arg Phe Pro Gln 465165 Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu 180 Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr 195 200 Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe 210 215 Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe 230 Phe Gln Gly His Val Lys Ala 245 Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu 260 Met Glu Val Asn Ala Gln Gly 275 280 Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu 290 295 Thr Val Ile Lys Ala Thr Val 310 Thr Val Ala Leu His Met Asn 325 Gln His Ala Leu Lys Lys Ala 340 Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu 355 360 Gln Ala Ile Val Lys Glu Val 370 375 Leu Val Pro His Glu Asn Val 390 Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu 405 Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn 420 Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr 435 440 Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser 450 455 Ala Glu His Leu Thr Ile Ala 470170 Glu Leu Asn Phe Gly 185 Glu Ser Gly Lys Gly 205 Lys 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ttattttatt acactagata atttaaaaaa atagaacaag aattttattccattattcag tctaaatact gagaattctt aggggacttt acttcacgaa aaacttcatt ttagggagaa ttctaataat ctaatatcca aaataataac aacaactgac cttaccccta caaaaagaga gaattaaaga aatttgacct aaaattcatt gttcggcaga taatttgtcttctgattttg aaggatgatt tgtgcctcga tcctcatagc ctctgatgat actcccattg attctttaat aatggttctt tgttatttgg attattattt tcagtgaaat ccccgaagga caatatcagt tgaaatatac cgtacatctc agtataatga tagtgacact acagaggaatagac atatatagta ctaatctata tcaagttaga aaaagtaaat agcataaaaa tgtttgttaa gaatcaggtc ttttcgaaca ataggatata tttactagtg gtagagggat accaccacag aggtaaggta taagagaaag gatgtgcata aacctactttaggttaataa aaaatgtaga tatctttggg agtttgatta gagatataac aaaaagtaaa atatagattc gttgactttg agttatactg ctttttttat gggtatgggg tgtttccgaa atcatattat taaaacgtgt ctgaaataaa cttgacaatt tgcattgaat60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1054<210>4 <211>2608 <212>DNA <213> 普通烟草 <400>4 atggtttctc ccgtagaagc cattgtagga ctagtaaccc ttacacttct 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aagcgtttaa ttccattgtt aggatataga tggaggttaa gtaatgaata taagttcatt aatttaagta tgataaatgg gttaaaagtg agatgaaaga agttataatt gggacttctt tgtttttttt agcagcaata aattatatat gggtaaatat gggtagtgtg gaccctcggc aggtaaatgt tttgatttta gaattttaga ctatactaaa atccttttta gttgctcttc aaagcacaag attaaggatt ggacctttat cctaaaggga tcaaatcctg cagcactatg tcccggaggg tccattagct gctaggcctt tacaaatgac cagtaatgcc agtcattcag taaaattcaa aaatctaact gaaaaattat ggattttata caaatgggtg ttctgttttt tgcacaaggg tcttgatgaa ttcatttttc attagattat aaaaaagatg cttcaccaaa gtatttatca gatagaataa ctcttttttt ttcttctatt tagtcaaagc acgggtatta tacaacaaca tatgcagacc tcaagaaaac tattttattg cactagataa tttaaaaaaa tagaacaagg attttattct acatgaattg aagagatcga tggtctacct tagtacctca ctagactatt ataagtttga agtttatccc5/63 页ctatggccca tggccggtaa cgaaaactcg ccgcttgtgt gccattttct atgctatttt gaagttctct acgagcatta gattggttag gaatccggta attttatcaa gattttcaag cagaattggt aatgaacaag ggttactctc attattcagt ctaaatacta agaattcttt ggggactttt cttcacgaac aacttcatta 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Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro 375 380 Glu Asn Val Lys Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr 390 395 400 Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln 410 415 Leu Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg 425 430 Ile Asp Phe Arg Gly His His Tyr Glu Phe Ile 440 445 Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu 455 460 Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr 470 475 480 Glu Ala Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile 490 495 Asn Pro ValGlu Leu Ile Ile Thr Pro Arg Leu 505 510<400>31 Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Phe Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe 1 5 10 15 Leu Leu Tyr Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Leu Pro Lys Pro103101939431 A CN 101939434序列表30 Gly His Leu Phe 45 Arg Lys Leu Gly Arg Leu Gly Leu 80 Lys Asp Cys Phe 95 Leu Leu Tyr Gly 110 Ala Asn Tyr Gly 125 Glu Val Leu Ser Thr Arg Ile Gln 160 Asn Ser Ser Thr 175 Gly Leu Ile Val 190 Gly Asp Glu Gln 205 Val Leu Ser Met Phe Lys Trp Val 240 Phe Lys Asp Ile 255 Asn Lys Arg Glu 270 Phe Ile Asp Val 285 Gly Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Ala 320 Leu Leu Ile Asn 33554/63 页20 Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly 35 His Phe Asn Asn Asp Gly Asp 50 55 Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly 65 70 Pro Leu Val Leu Val Val Ser 85 Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe 100 Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn 115 Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg 130 135 Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe 145 150 Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr 165 Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu 180 Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn 195 Val Glu Arg Phe Lys Asn Ala 210 215 Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala 225 230 Asp Phe Gln Gly His Ile Lys 245 Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp 260 Lys Ile Glu Val Gly Ala Glu 275 Val Leu Ser Lys Leu Ser Lys 290 295 Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr 305 310 Asp Thr Val Ala Leu His Ile 32525 Gly Trp Pro Val Ile 40 Asp Arg Pro Leu Ala 60 Pro Val Phe Thr Phe 75 Ser Tyr Glu Ala Ile 90 Ser Asn Arg Pro Ala 105 Thr Met Leu Phe Leu 120 Lys Leu Val Ile Gln 140 Lys Gln Val Arg Phe 155 Thr Arg Ile Asn Gly 170 Glu Glu Leu Asn Phe 185 Tyr Glu Ser Gly Lys 200 Phe Lys Asp Phe Met 220 Phe Pro Ile Pro Leu 235 Ala Met Lys Arg Thr 250 Leu Glu Glu His Ile 265 Gly Asn Glu Gln Asp 280 Glu Tyr Leu Asp Glu 300 Val Phe Ser Leu Val 315 Asn Trp Gly Met Thr 330104101939431 A CN 101939434序列表Glu Glu Ile Asp Thr 350 Asp Ile Lys Asp Leu 365 Arg Leu Tyr Pro Pro 380 Asp Cys Val Val Ser 395 Ala Asn Val Met Lys 410 Asp Lys Phe Asp Pro 430 Gly His His Tyr Glu 445 Pro Gly Met Thr Tyr 460 Leu Ile Gln Gly Phe 475 Met Lys Glu Gly Ala 490 Leu Ile Ile Thr Pro 510 Lys Val Val Tyr Gly Pro Gly Tyr 400 Leu Gln 415 Glu Arg Phe Ile Ala Leu Asn Tyr 480 Gly Ile 495 Arg Leu55/63 页Asn Gln Asn Ala 340 Gly Lys Asp Arg 355 Leu Gln Ala Ile 370 Leu Leu Val Pro 385 His Ile Pro Lys Arg Asp Pro Lys 420 Phe Ile Ala Gly 435 Pro Phe Gly Ser 450 Gln Val Glu His 465 Lys Thr Pro Asn Thr Ile Arg Lys 500 Ala Pro Glu Leu 515 <210>32 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列Leu Met Lys Ala Gln 345 Trp Val Glu Glu Ser 360 Val Lys Lys Val Leu 375 His Glu Asn Val Lys 390 Gly Thr Arg Leu Phe 405 Leu Leu Ser Asn Pro 425 Asp Ile Asp Phe Arg 440 Gly Arg Arg Ser Cys 455 Leu Thr Met Ala His 470 Asp Glu Ala Leu Asp 485 Val Asn Pro Val Glu 505 Tyr<220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>32 tggaattatg cccatcctac a <210>33 <211>21 <212>DNA10521101939431 A CN 101939434序列表56/63 页<213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>33 cattagtggt tgcacctgag g <210>34 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>34 gatgagatgt gtgcatactt g <210>35 <211>23 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>35 ccaaattaga aaaactcgta ctg <210>36 <211>25 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>36 attgtaggac tagtaaccct tacac10621212325101939431 A CN 101939434序列表57/63 页<210>37 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>37 gaggcacaaa gaattctcat c <210>38 <211>20 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>38 gagtagaggg attgtttccg <210>39 <211>26 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>39 gtacaatcaa gataaaacat ctaagg <210>40 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <220>107212026101939431 A CN 101939434序列表58/63 页<223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>40 cggtgaatac cttggctaca g <210>41 <211>25 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>41 aattgtcact tctacaggat ttact <210>42 <211>18 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>42 atggtttttc cggtagaa <210>43 <211>18 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>43 ttaataaagc tcaggtgc <210>44 <211>2310821251818101939431 A CN 101939434序列表59/63 页<212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>44 acgtgatcct aaactctggt ctg <210>45 <211>19 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>45 gcctgcacct tccttcatg <210>46 <211>23 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>46 gggatgactt atgcattaca agc <210>47 <211>25 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>47109231923101939431 A CN 101939434序列表60/63 页aattgtcact tctacaggat ttact <210>48 <211>20 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>48 ggtgtccaca gacttcgtgg <210>49 <211>20 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工序列的描述 : 合成的引物 <400>49 gactcctcac agcagcacca <210>50 <211>1733 <212>DNA <213> 烟草属物种 <220> <221>CDS <222>(1)...(1551) <400>3 atg ctt Met Leu 1 ctc ttc Leu Phe252020tct ccc ata Ser Pro Ile 5 ttc ttc cta Phe Phe Leu 20gaa gcc att gta gga Glu Ala Ile Val Gly 10 tgg aca aaa aaa tct Trp Thr Lys Lys Ser 25110cta gta acc ttc aca Leu Val Thr Phe Thr 15 caa aaa cct tca aaa Gln Lys Pro Ser Lys 30ttt Phe ccc Pro4896101939431 A CN 101939434序aaa atc ccc gga gga Lys Ile Pro Gly Gly 40 gac gac ggc gac gac Asp Asp Gly Asp Asp 55 gac aaa tac ggc ccc Asp Lys Tyr Gly Pro 70 tta gtt gta agc agt Leu Val Val Ser Ser 85 gac gcc att ttt tcc Asp Ala Ile Phe Ser 100 ggc tac aat aat gcc Gly Tyr Asn Asn Ala 120 cga aaa aat cga aaa Arg Lys Asn Arg Lys 135 ctc gaa aaa ttc aaa Leu Glu Lys Phe Lys 150 aag aat tta tat act Lys Asn Leu Tyr Thr 165 act gat tgg tta gaa Thr Asp Trp Leu Glu 180 gct gga aaa aat tat Ala Gly Lys Asn Tyr 200 ttt aag aaa gcg ttt Phe Lys Lys Ala Phe 215 tta tgg gat gca ttt Leu Trp Asp Ala Phe 230列表61/63 页tta cca ccg Leu Pro Pro 35 cac ttc aat His Phe Asn 50 gac tta gct Asp Leu Ala 65 ccc ctt gtc Pro Leu Val tct aca aat Ser Thr Asn gat tac ctt Asp Tyr Leu 115 cct tac tgg Pro Tyr Trp 130 gct agt cgt Ala Ser Arg 145 gcg agc att Ala Ser Ile ata aat tta Ile Asn Leu aag atg atc Lys Met Ile 195 gtg gag aga Val Glu Arg 210 gag ttt gtg Glu Phe Val 225tgg ccg gta atc ggc cat ctt ttc 144 Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe 45 cgt cca tta gct cga aaa ctc gga 192 Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly 60 gtt ttc act ttt cgg cta ggc ctt 240 Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu 75 80 tac gaa gct gta aaa gac tgt ttc 288 Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe 90 95 aat cgt cca gct ttt ctt tac ggc 336 Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly 105 110 atg cta ttt ttg gcc aat tac gga 384 Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly 125 tta gtt att cag gaa gtt ctc tcc 432 Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser 140 cac gtg aga ttt gca aga att caa 480 His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln 155 160 cga att gat gga aat tcg agt acg 528 Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr 170 175 gaa ttg aat ttt ggt ctg atc gtg 576 Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val 185 190 gaa tcc ggt aaa gga gat gaa caa 624 Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln 205 aag gat ttt atg att tta tca atg 672 Lys Asp Phe MetIle Leu Ser Met 220 cca att cca tta ttt aaa tgg gtg 720 Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val 235 240111101939431 A CN 101939434序列表62/63 页gat ttt caa ggg cat Asp Phe Gln Gly His 245 gat tct gtt ttt cag Asp Ser Val Phe Gln 260 aaa atg gag gtt aat Lys Met Glu Val Asn 275 gtg ctt tca aaa atg Val Leu Ser Lys Met 290 gat act gtc att aaa Asp Thr Val Ile Lys 305 gac aca gtt gct ctt Asp Thr Val Ala Leu 325 aat caa aag gcc ttg Asn Gln Lys Ala Leu 340 ggt aag gac aga tgg Gly Lys Asp Arg Trp 355 ctc caa gct att gtt Leu Gln Ala Ile Val 370 ttg tta gta cca cac Leu Leu Val Pro His 385 cac att cct aaa ggg His Ile Pro Lys Gly 405 cgt gat cct aaa ctc Arg Asp Pro Lys Leu 420 ttc att gct act gat Phe Ile Ala Thr Asp 435gtt aag gct atg aaa agg act ttt aaa gat ata Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile 250 255 aat tgg tta gag gaa cat att aat aaa aga gaa Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu 265 270 gca gaa ggg aat gaa caa gat ttc att gat gtg Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val 280 285 agt aat gaa tat ctt ggt gaa ggt tac tct cgt Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg 295 300 gca acg gtg ttt agt ttg gtc ttg gat gca gca Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala 310 315 320 cac ata aat tgg gga atg gca tta ttg ata aac His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn 330 335 acg aaa gca caa gaa gag ata gac aca aaa gtt Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val 345 350 gta gaa gag agt gat att aag gat ttg gta tac Val Glu Glu Ser AspIle Lys Asp Leu Val Tyr 360 365 aaa gaa gtg tta cga tta tat cca cca gga cct Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro 375 380 gaa aat gta gaa gat tgt gtt gtt agt gga tat Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr 390 395 400 aca aga tta ttc gca aac gtc atg aaa ctg caa Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln 410 415 tgg tct gat cct gat act ttc gat cca gag aga Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg 425 430 att gac ttt cgt ggt cag tac tat aag tat atc Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile 440 44511276881686491296010081056110411521200124812961344101939431 A CN 101939434序列表63/63 页ccg ttt ggt Pro Phe Gly 450 caa gtg gaa Gln Val Glu 465 aga act cca Arg Thr Pro act ata cgt Thr Ile Arggca cct gag Ala Pro Glu 515 tactcctaaa tggatattca tttacctttt atcaattaat tgtcagtacg agtttttcta atttggtaca tttgtaataa taagtaaaga ataattgtgc taatatataa aggtttgtag aagataattg actgattgtc cctct gga aga cga tct tgt cca ggg atg act tat gca ttg Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu 455 460 cac tta aca atg gca cat ttg atc caa ggt ttc aat tac His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr 470 475 480 aat gac gag ccc ttg gat atg aag gaa ggt gca ggc ata Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile 485 490 495 aag gta aat cct gtg gaa ctg ata ata gcg cct cgc ctg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu 500 505 510 ctt tat taaaacctaa gatctttcat cttggttgat cattgtataa Leu Tyr139214401488153615911651 1711 1733

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1、10申请公布号CN101939431A43申请公布日20110105CN101939431ACN101939431A21申请号200880120735022申请日2008111260/987,24320071112USC12N15/53200601C12N15/82200601A01H5/12200601C12Q1/6820060171申请人北卡罗来纳州立大学地址美国北卡罗来纳州申请人肯塔基大学研究基金会72发明人RE德维B斯明茨基SW鲍文L贾维拉诺74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人罗菊华54发明名称通过修饰特定细胞色素P450基因改变烟草生物碱含量57摘要提。

2、供了用于降低烟草属植物和其植物部分中降烟碱和N亚硝基降烟碱NNN的水平的组合物和方法。组合物包含在此类植物中参与烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素P450的分离的多核苷酸和多肽。还提供了包含靶向公开的细胞色素P450多肽的表达或功能的抑制性序列的表达盒、载体、植物和其植物部分。还提供了使用此类新型序列抑制参与该代谢转化的细胞色素P450多肽的表达或功能的方法。该方法用于产生烟草制品,所述烟草制品具有降低水平的降烟碱和其致癌代谢产物NNN,从而对于消费此类烟草制品或暴露于源自此类制品的二手烟的个体具有降低的致癌潜能。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010061386PCT申请的申请数据。

3、PCT/US2008/0832152008111287PCT申请的公布数据WO2009/064771EN2009052251INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书6页说明书43页序列表63页附图3页CN101939434A1/6页21包含选自SEQIDNOS1和3的核苷酸序列的分离的多核苷酸。2编码选自SEQIDNOS2,512和1424的氨基酸序列的分离的多核苷酸。3分离的多核苷酸,其包含能够在植物细胞中发挥功能的启动子,该启动子有效地连接至核酸序列,所述核酸序列包含从含有选自在位点253、353、647、733、1050、1397和其组合上的核酸的核酸的核酸序。

4、列获得的SEQIDNO1的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域。4包含编码绿叶烟碱脱甲基酶的核酸序列的分离的多核苷酸,其中所述烟碱脱甲基酶在选自残基235,449,174,410,224,72,143和422的位点中的氨基酸残基上具有置换,其中编号根据SEQIDNO2。5分离的多核苷酸,其包含能够在植物细胞中发挥功能的启动子,所述启动子有效地连接至包含SEQIDNO4的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域的核酸序列。6分离的多核苷酸,其编码具有与其他P450多肽不同的残基至保守残基的突变的SEQIDNO2。7分离的多核苷酸,其编码在选自残基85、118、216、245和466的。

5、位点上具有突变的SEQIDNO2,其中85位上的残基不是异亮氨酸,118位上的残基不是天冬酰胺,216位上的残基不是酪氨酸,245位上的残基不是酪氨酸且466位上的残基不是缬氨酸。8权利要求7的分离的核酸分子,其中所述突变选自118位上的残基和466位上的残基。9权利要求7的分离的核酸分子,其中存在至少3个至保守残基的突变。10包含编码SEQIDNO2的多核苷酸的表达盒,所述多核苷酸有效地连接至在植物细胞中具有功能的启动子。11权利要求10的表达盒,其中将所述表达盒整合入载体。12包含多核苷酸的表达盒,所述多核苷酸包含与在植物细胞中具有功能的启动子有效连接的SEQIDNO3或其至少25个连续核。

6、苷酸的片段。13权利要求12的表达盒,其中所述启动子选自诱导型、组成型、病原体或创伤诱导的、受环境或发育调控的、或细胞或组织特异性启动子。14包含SEQIDNO3的至少25个核苷酸的分离的多核苷酸。15权利要求14的分离的多核苷酸,其还包含SEQIDNO3的至少50个核苷酸。16包含选自SEQIDNO2,512和1424的氨基酸序列的分离的多肽。17包含与SEQIDNO299同一的氨基酸序列的分离的多肽,其中所述多肽能够在烟草的绿叶中将烟碱转化成降烟碱。18包含表达盒的烟草属植物或其植物部分,所述表达盒编码SEQIDNO2、其片段、或任一个的互补序列。19与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平。

7、的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物,所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源多核苷酸构建体,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的核酸序列,所述第一核酸序列包含编码SEQIDNO2的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域。20权利要求19的转基因烟草属植物,其中所述第一核酸序列包含所述绿叶烟草烟碱权利要求书CN101939431ACN101939434A2/6页3脱甲基酶序列的大约200至大约500个核苷酸的区域。21与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植。

8、物,所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源多核苷酸构建体,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链RNA的第二核酸序列的核酸序列,所述第一核酸序列包含SEQIDNO3的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域。22与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物,所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源多核苷酸构建体,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链RNA的第二核酸序列的核酸序列,所述第一核酸序列包含SEQIDNO4的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域。。

9、23与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物的种子,所述植物包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的核酸序列,所述第一核酸序列包含具有SEQIDNO4的氨基酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域。24权利要求23的种子,其中所述植物在绿叶中具有大约1的烟碱至降烟碱的转化。25权利要求23的种子,其中所述植物在绿叶中具有大约05的烟碱至降烟碱的转化。26可再生的烟草植物细胞的组织培养物,其中所述烟草植物细胞包含具有SEQIDNO1。

10、,3或4的片段的第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链RNA的第二核酸序列。27包含烟草植物材料的烟草制品,所述烟草植物材料包含与非转基因植物相比在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物细胞,所述植物细胞包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链RNA的第二核酸序列的核酸序列,所述第一核酸序列包含SEQIDNO4的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域。28权利要求27的烟草制品,其中所述烟草植物材料还包含与非转基因植物相比在衰老叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物细胞,所。

11、述植物细胞包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子,所述启动子有效地连接至具有第三核酸序列和能够与所述第三序列形成双链RNA的第二序列的核酸序列,所述第三核酸序列包含编码选自SEQIDNO1224的氨基酸的核酸序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域。29权利要求27的烟草制品,其中所述制品是无烟烟草制品例如鼻烟或嚼烟。30权利要求27的烟草制品,其中所述制品是雪茄、香烟、烟斗烟、小雪茄、不透气或透气嵌入式过滤嘴香烟、溶解性条、树胶或片剂。31具有经改变以抑制至少绿叶烟碱脱甲基酶的表达的基因组的烟草植物。32具有经改变以抑制至少绿叶烟碱脱甲基酶的表达的基因组的烟草细胞,其中所述细胞对。

12、于编码绿叶烟碱脱甲基酶的基因中的突变是纯合的。权利要求书CN101939431ACN101939434A3/6页433权利要求32的烟草细胞,其中所述基因组还包含编码选自SEQIDNOS1324的衰老诱导的烟碱脱甲基酶的基因中的突变。34包含含有绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列的转基因的烟草细胞,所述核酸序列侧翼于选择标记基因,其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因,从而产生其中内源绿叶烟碱脱甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。35包含含有绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列的转基因的烟草细胞,所述核酸序列侧翼于选择标记基因,其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因,从而产生其中内源绿叶烟碱脱甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。

13、。36用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法,所述方法包括步骤A抑制烟碱脱甲基酶的表达,其中所述烟碱脱甲基酶具有SEQIDNOS2和512中所示的氨基酸序列;和B降低来源于烟草属植物的植物部分中的降烟碱。37权利要求36的方法,其中所述抑制包括在所述植物中表达多核苷酸,其中所述多核苷酸抑制所述植物中所述绿叶烟碱脱甲基酶的表达。38权利要求36的方法,其中所述抑制性核酸序列能够转录为选自单链RNA多核苷酸、双链RNA多核苷酸和其组合的抑制性多核苷酸。39权利要求36的方法,其中所述抑制包括在所述植物中表达多肽,其中所述多肽抑制所述植物中所述绿叶烟碱脱甲基酶的表达。40权利要求39。

14、的方法,其中所述多肽是识别具有SEQIDNO2的氨基酸序列的多肽的抗体。41权利要求36的方法,其中所述抑制包括在所述植物中消除基因,其中所述基因编码所述绿叶烟碱脱甲基酶。42权利要求36的方法,其中所述抑制包括将表达盒导入来自烟草属植物的植物细胞,其中所述表达盒包含SEQIDNOS1,2和4中所示的核酸序列的至少25个连续核苷酸的核酸序列、其互补序列或这些序列的混合物。43权利要求36的方法,其中所述抑制包括将表达盒导入来自烟草属植物的植物细胞,并且所述表达盒包含编码SEQIDNOS2,512中所示的序列的至少25个连续核苷酸的核酸序列和其互补序列。44权利要求43的方法,其中所述抑制还包括。

15、将表达盒导入来自烟草属植物的植物细胞,并且所述表达盒包含编码选自SEQIDNOS1324的序列的至少25个连续核苷酸的核酸序列,和所述核酸序列的互补序列。45权利要求36的方法,其中所述抑制包括在所述植物中消除基因,并且所述基因编码所述烟碱脱甲基酶。46权利要求36的方法,其中所述烟碱脱甲基酶有效地连接至选自诱导型、组成型、病原体或创伤诱导的、受环境或发育调控的、或细胞或组织偏爱型启动子的启动子。47权利要求46的方法,其中所述启动子是叶偏爱型启动子。48权利要求36的方法,其中所述植物选自NICOTIANAACUMINATAMULTIFLORA、大花烟草NICOTIANAALATAGRAND。

16、IFLORA、NICOTIANABIGELOVIIQUADRIVALVIS、权利要求书CN101939431ACN101939434A4/6页5NICOTIANABIGELOVIIWALLACEI、NICOTIANAOBTUSIFOLIAOBTUSIFOLIA、NICOTIANAOBTUSIFOLIAPLAMERI、NICOTIANAQUADRIVALVISBIGELOVII、NICOTIANAQUADRIVALVISQUADRIVALVIS、NICOTIANAQUADRIVALVISWALLACEI和NICOTIANATRIGONOPHYLLAPALMERI。49用于减少烟草制品中的降烟碱的。

17、方法,所述方法包括步骤A种植转基因烟草植物,其中所述植物包含这样的植物部分,其包含含有异源启动子和烟碱脱甲基酶的表达盒,其中所述烟碱脱甲基酶具有选自SEQIDNOS2和512的氨基酸序列;和B从所述烟草植物部分制备烟草制品。50用于减少烟草制品中的降烟碱的方法,所述方法包括步骤A种植转基因烟草植物,其中所述植物包含这样的植物部分,其包含特异性结合具有选自SEQIDNOS2和512的氨基酸序列的多肽的抗体;和B从所述烟草植物部分制备烟草制品。51权利要求50的方法,其中所述烟草制品选自嚼烟、鼻烟、香烟、烟斗烟和雪茄。52用于减少烟草制品中的降烟碱的方法,所述方法包括步骤A种植转基因烟草植物,其中。

18、所述植物包含这样的植物部分,其包含有效地连接至异源启动子的绿叶烟碱脱甲基酶的片段,并且所述片段具有来自编码选自SEQIDNOS2和512的多肽的核酸序列的至少25个连续核苷酸;和B从所述烟草植物部分制备烟草制品。53权利要求52的权利要求,其中所述转基因植物部分还包含有效地连接至异源启动子的衰老诱导的烟碱脱甲基酶的片段,并且所述片段具有来自编码选自SEQIDNOS1324的多肽的核酸序列的至少25个连续核苷酸。54用于减少来源于烟草属植物的植物部分中的降烟碱的方法,所述方法包括步骤A修饰功能性CYP82E5V2等位基因以将等位基因变成无功能的CYP82E5V2,其中所述无功能的CYP82E5V。

19、2的氨基酸序列在选自残基235、449、174、410、224、72、143和422的位点中的氨基酸残基上具有置换,其中编号根据SEQIDNO2;和B降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。55权利要求54的方法,其中所述修饰包括定点诱变。56用于减少烟草制品的致癌潜能的方法,所述方法包括通过下述制备所述烟草制品的步骤A种植转基因烟草植物,其中所述植物包含这样的植物部分,其包含有效地连接至异源启动子的绿叶烟碱脱甲基酶的片段,并且所述片段包含来自编码选自SEQIDNOS2和512的多肽的核酸序列的至少25个连续核苷酸;和B从所述烟草植物部分制备烟草制品。57权利要求56的方法,其中所述片段。

20、包含至少100个核苷酸。58权利要求57的方法,其中所述转基因烟草植物还包含这样的植物部分,其包含有效地连接至异源启动子的烟碱脱甲基酶的片段,并且所述片段具有来自编码选自SEQIDNOS1324的多肽的核酸序列的至少25个连续核苷酸。59减少烟草属植物中烟碱至降烟碱的转化的方法,其包括步骤权利要求书CN101939431ACN101939434A5/6页6A用包含能够在植物细胞中发挥功能的启动子的核酸构建体转化烟草属植物,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列和能够与所述第一核酸序列形成双链RNA的第二核酸序列的核酸序列,所述第一核酸序列包含SEQIDNO1,3或4的100个核苷酸至大约350。

21、个核苷酸的区域;和B再生转基因烟草属植物。60权利要求59的方法,其中所述100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域获自SEQIDNO1的大约位点100和大约位点500之间的序列。61权利要求60的方法,其中所述转基因烟草属植物具有低于2的烟碱至降烟碱的转化。62权利要求60的方法,其中所述转基因烟草属植物具有低于1的烟碱至降烟碱的转化。63权利要求60的方法,其中所述第一核酸序列包含选自编码序列和内含子序列的烟草烟碱脱甲基酶的区域。64筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法,其包括步骤A获得与SEQIDNO1具有至少200个核苷酸的序列同一性的核酸序列;和B鉴定在所编码的多肽的位点422上编码终止密码。

22、子的密码子序列,其中编号根据SEQIDNO2。65权利要求64的方法,其中在编码的蛋白质的位点422上的突变对酶的功能具有负面效应。66筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法,其包括步骤A获得与SEQIDNO1具有至少200个核苷酸的序列同一性的核酸序列;和B鉴定在编码的多肽的位点449上编码不是脯氨酸的密码子的密码子序列,其中编号根据SEQIDNO2。67权利要求66的方法,其中所述在编码的多肽的位点449上的密码子通过选自单核苷酸多态性和RTPCR的方法来鉴定。68权利要求66的方法,其中在编码的蛋白质的位点499上的突变对酶的功能具有负面效应。69用于鉴定具有低水平的降烟碱的烟草植物的方法,所述。

23、方法包括步骤A从目的烟草植物获得DNA样品;和B就SEQIDNO1中突变的存在筛选所述样品。70权利要求69的方法,其中所述烟草植物是非转换子。71用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法,所述方法包括步骤A抑制CYP82E4V2烟碱脱甲基酶和CYP82E5V2烟碱脱甲基酶的表达;和B降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。72权利要求71的方法,其中所述CYP82E4V2具有选自SEQIDNOS1324的氨基酸序列,并且所述CYP82E5V2具有选自SEQIDNOS2和512的氨基酸序列。73包含在选自残基458、364、329和其组合的位点上具有突变的氨基酸SEQIDN。

24、O13的烟草植物材料。权利要求书CN101939431ACN101939434A6/6页774权利要求73的烟草植物材料,其中位点458上的残基不是脯氨酸,位点364上的残基不是赖氨酸或位点329上的残基是终止密码子。75包含在选自残基458、364、329和其组合的位点上具有突变的CYP82E4V2的烟草植物材料,其中编号相应于SEQIDNO13。76包含在残基376上具有突变的CYP82E4V2的烟草植物材料,其中所述残基不是缬氨酸并且残基的编号相应于SEQIDNO13。权利要求书CN101939431ACN101939434A1/43页8通过修饰特定细胞色素P450基因改变烟草生物碱含量。

25、发明领域0001本发明涉及用于降低作为烟草属NICOTIANA的成员的植物中降烟碱和其代谢物N亚硝基降烟碱NNN的水平的组合物和方法,特别地用于抑制参与烟碱至降烟碱的代谢转化的细胞色素P450多肽的表达或功能的组合物和方法。0002发明背景0003商业烟草品种中发现的主要生物碱是烟碱,其通常占据总生物碱库的90至95。剩下的生物碱级分主要是3种另外的吡啶类生物碱降烟碱、新烟碱和新烟草碱。降烟碱通过烟碱N脱甲基酶直接从烟碱产生。降烟碱通常代表低于5的总吡啶类生物碱库。然而,最初产生非常少量的降烟碱的烟草植物可产生将大百分比的叶的烟碱代谢“转化”成降烟碱的后代。该过程称为“转换”。在已进行遗传转换。

26、的烟草植物即,“转换子”中,大部分降烟碱的产生在成熟叶的衰老和加工过程中发生WERNSMANMATZINGER1968TOBSCI12226228。白肋烟BURLEYTOBACCOS特别易于遗传转换,在一些栽培品种中观察到高达每代20的比率。0004在烟草叶的处理和加工过程中,一部分降烟碱代谢成NNN被认定为在实验室动物中致癌的烟草特异性亚硝胺TSNAHECHTHOFFMANN1990CANCERSURVEYS8273294;和HOFFMANN等人1994JTOXICOLENVIRONHEALTH41152;HECHT1998CHEMRESTOXICOL11559603。在烤烟中,TSNA主要。

27、通过生物碱与极少量的氮氧化物存在于用于常规烘烤室的直燃式加热系统中的燃烧气体中反应形成PEELEGENTRY1999“FORMATIONOFTOBACCOSPECIFICNITROSAMINESINFLUECUREDTOBACCO,”CORESTAMEETING,AGROPHYTOGROUPS,SUZHOU,CHINA。然而,当用热交换器其可消除燃烧气体与烘烤气体CURINGAIR的混合,从而减少以该方式烘烤的烟中的TSNA改进烘烤室时,可消除燃烧气体BOYETTEHAMM2001RECADVTOBSCI271722。相反地,在晾干的白肋烟中,TSNA主要通过烟草生物碱与亚硝酸盐的反应由叶生L。

28、EAFBORNE微生物催化的过程形成BUSH等人2001RECADVTOBSCI272346。迄今,对于晾干的烟草,通过改变处理条件同时保持可接受的质量标准来减少TSNA的努力仍未获得成功。0005在白肋烟植物中,叶的降烟碱含量与经处理的叶中积累的NNN的量之间存在正相关BUSH等人2001RECSDVTOBSCI,272346;和SHI等人2000TOBCHEMRESCONF54ABSTRACT27。然而,由于转换的原因,在白肋烟植物中将降烟碱水平保持在最低水平是非常困难的。植物育种者和种子生产者传统上负责使积累高水平降烟碱的白肋烟植物的数量减少至最少。尽管最终生长在田间的转换子的百分比通过。

29、在种子库SEEDSTOCK繁殖过程中除去ROGUING转换子而减少。不幸地,该方法花费高,非常费时并且有缺陷。0006在植物转换后,高降烟碱性状以单显性基因的形式遗传GRIFFITH等人1955SCIENCE121343344;BURKEJEFFREY1958TOBSCI2139141;和MAN等人1964CROPSCI4349353。然而该基因的性质目前还不清楚。在最简单的场景中,转换基因座CONVERSIONLOCUS可代表在转换子中可能通过动员突变诱导性转座元件重新获得其功能说明书CN101939431ACN101939434A2/43页9的无功能烟碱N脱甲基酶基因。备选地,转换子基因座。

30、可编码起始最终使得转换子能够将烟碱代谢成降烟碱的级联事件的蛋白质,这表明可能牵涉多个基因。0007无论存在一个还是许多个与转换相关的基因,编码具有烟碱脱甲基酶活性的多肽的基因在该过程中起着中枢作用。虽然不能从粗制提取物中纯化活性烟碱N脱甲基酶阻碍了该酶的分离和鉴定,但存在一些证据证明单加氧酶的细胞色素P450超家族的成员可能牵涉其中HAOYEOMAN1996PHYTOCHEM41477482;HAOYEOMAN1996PHYTOCHEM42325329;CHELVARAJAN等人1993JAGRIC,FOODCHEM41858862;和HAOYEOMAN1998JPLANTPHYSIOL152。

31、420426。不幸地,这些研究不是结论性的,因为经典P450抑制剂例如一氧化碳和TETCYLASIS不能以与其他报导的P450介导的反应相当的速率降低酶活性CHELVARAJAN等人1993JAGRICFOODCHEM41858862。0008此外,细胞色素P450是独特的跨膜蛋白质,其参与代谢许多种化合物由SCHULER1996CRITREVPLANTSCI15235284;和SCHULERWERCKREICHHART2003ANNUREVPLANTBIOL54629667综述。由细胞色素P450介导的生物化学反应的实例包括羟基化、脱甲基化和环氧化。在植物中,细胞色素P450基因家族非常大。。

32、例如,总基因组序列检查在拟南芥中发现272个预测的细胞色素P450基因和在稻中发现至少455个独特的细胞色素P450基因参见,例如,NELSON等人2004PLANTPHYSIOL1352756772。即使细胞色素P450牵涉烟碱至降烟碱的转化,该蛋白质家族的至关重要的参与成员的鉴定仍然是个挑战。0009除了用作NNN的前体外,最近的研究表明烟草制品中发现的降烟碱具有不期望的健康后果。例如,DICKERSONJANDA证明降烟碱在细胞内引起异常的蛋白质糖基化DICKERSONJANDA2002PROCNATLACADSCIUSA991508415088。同样,降烟碱修饰蛋白的浓度在吸烟者的血浆。

33、中远比非吸烟者高。此外,降烟碱可共价修饰经常开于处方中的类固醇药物例如泼尼松,这可以改变此类药物的功效和毒性。0010考虑到与转换相关的困难以及降烟碱积累的不期望的健康效应,因而期望获得用于减少烟草品种特别地白肋烟植物中的降烟碱含量的改进方法。此类方法不仅帮助改善上述的降烟碱本身的潜在负面健康后果,而且还帮助降低NNN水平。0011发明概述0012提供了用于减少作为烟草属的成员的植物中降烟碱含量的组合物和方法。组合物包括参与植物特别地烟草属物种中烟碱至降烟碱的转化的分离的细胞色素P450多核苷酸和多肽。分离的多核苷酸包括包含SEQIDNO1,3或4中所示的核酸序列、编码SEQIDNO2,512。

34、,1424中所示的多肽的核酸序列的多核苷酸,以及其片段和变体。本发明的分离的多肽包括包含SEQIDNO2,512或1424中所示的氨基酸序列、由SEQIDNO1,3或4中所示的核酸序列编码的氨基酸序列的多肽,以及其片段和变体。0013在第一方面,本发明概述为可在植物中抑制参与烟碱至降烟碱的代谢转化的烟碱脱甲基酶包括本发明的烟碱脱甲基酶的表达的多核苷酸。本发明提供了具有能够在植物细胞中发挥功能的有效连接至核酸序列的启动子的分离的多核苷酸,所述核酸序列包含SEQIDNO1的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域,所述区域从选自在位点253、353、647、733、1050、1397和其组合上。

35、的核酸的序列获得。本发明还提供了包含编码绿叶烟碱脱甲基酶的核酸序列的分离的多核苷酸,其中编码的烟碱脱甲基酶的氨基酸序列在说明书CN101939431ACN101939434A3/43页10选自残基235,449,174,410,224,72,143和422的位点中的氨基酸残基上具有置换,其中编号根据SEQIDNO2。还提供的是分离的多核苷酸,其包含能够在植物细胞中发挥功能的启动子,所述启动子与包含SEQIDNO4的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域的核酸序列有效连接。还提供的是编码SEQIDNO2中所示的氨基酸序列其具有与其他P450多肽不同的残基至保守残基的突变的分离的多核苷酸。备。

36、选地,还提供的是编码SEQIDNO2中所示的氨基酸序列其在选自残基85、118、216、245和466的位点上具有突变,其中85位上的残基不是异亮氨酸,118位上的残基不是天冬酰胺,216位上的残基不是酪氨酸,245位上的残基不是酪氨酸以及466位上的残基不是缬氨酸的分离的多核苷酸。0014在第二方面,本发明概述为包含编码SEQIDNO2的氨基酸序列的多核苷酸的表达盒,所述多核苷酸有效连接至在植物细胞中具有功能的启动子。本发明提供了包含多核苷酸的表达盒,所述多核苷酸包含与在植物细胞中具有功能的启动子有效连接的SEQIDNO3的核酸序列或其至少25个连续核苷酸的片段。还提供了包含SEQIDNO3。

37、的核酸序列的至少25个核苷酸的分离的多核苷酸。另外提供的是包含选自SEQIDNO2,512和1424的氨基酸序列的分离的多肽。在第二方面的一个实施方案中,分离的多肽包含与SEQIDNO299同一的氨基酸序列,从而其能够在烟草的绿叶中将烟碱转化成降烟碱。0015在第三方面,本发明概述为包含表达盒的烟草属植物或其植物部分,所述表达盒编码SEQIDNO2、其片段或任一个的互补序列。还提供的是与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物,所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源核酸构建体,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列所述序列包含编码SEQID。

38、NO2的氨基酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸。还提供的是与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱转化率的转基因烟草属植物,所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源核酸构建体,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列所述序列包含具有SEQIDNO3的核酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸。还提供的是与非转基因植物相比较,在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱转化率的转基因烟草属植物。

39、,所述植物包含含有能够在植物细胞中发挥功能的启动子的外源核酸构建体,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列所述序列包含具有SEQIDNO4的核酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸。0016在第四方面,本发明概述为与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物的种子,所述植物包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列所述序列包含具有SEQIDNO4的氨基酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲基酶序列的大约100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域。

40、和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸。还提供的是可再生烟草细胞的组织培养物,其包含含有第一多核苷酸所述多核苷酸具有SEQIDNO1,3或4的核酸序列的片段和能够与第一多核苷酸形成双链RNA的第二多核苷酸的植物细胞。说明书CN101939431ACN101939434A4/43页110017在第五方面,本发明概述为烟草制品,所述烟草制品包含与非转基因植物相比较在绿叶中具有更低水平的烟碱至降烟碱的转化率的转基因烟草属植物细胞,所述植物细胞包含能够在植物细胞中发挥功能的异源启动子,所述异源启动子有效地连接至具有第一核酸序列所述序列包含具有SEQIDNO4的核酸序列的绿叶烟草烟碱脱甲。

41、基酶序列的大约100个核苷酸与大约350个核苷酸的区域和能够与第一核酸序列形成双链RNA的第二多核苷酸的多核苷酸。还提供的是具有经改变抑制至少绿叶烟碱脱甲基酶的表达的基因组的烟草细胞,其中所述细胞对于编码绿叶烟碱脱甲基酶的基因中的突变是纯合的。还提供的是包含转基因的烟草细胞,所述转基因包含侧翼连接选择标记基因的绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列,其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因,从而产生其中内源绿叶烟碱脱甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。备选地,提供的是包含转基因的烟草细胞,所述转基因包含侧翼连接选择标记基因的绿叶烟碱脱甲基酶核酸序列,其中选择标记基因破坏了烟碱脱甲基酶基因,从而产生其中内源绿叶烟碱脱。

42、甲基酶基因已被破坏的烟草细胞。0018在第六方面,本发明概述为用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱水平的方法,所述方法包括A抑制烟碱脱甲基酶的表达,其中烟碱脱甲基酶具有SEQIDNOS2和512中所示的氨基酸序列;和B降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。还提供的是降低烟草制品中降烟碱的水平的方法,所述方法包括A种植转基因烟草植物,其中植物具有包含含有异源启动子和烟碱脱甲基酶的表达盒的植物部分,其中烟碱脱甲基酶具有选自SEQIDNOS2和512的氨基酸序列;和B从烟草植物部分制备烟草制品。还提供的是用于降低烟草制品中降烟碱的水平的方法,所述方法包括A种植转基因烟草植物,其中植物具。

43、有包含特异性结合具有选自SEQIDNOS2和512的氨基酸序列的多肽的抗体的植物部分;和B从烟草植物部分制备烟草制品。备选地,提供的是降低烟草制品中降烟碱的水平的方法,所述方法包括A种植转基因烟草植物,其中植物具有包含与异源启动子有效连接的绿叶烟碱脱甲基酶的片段的植物部分,并且所述片段具有来自编码选自SEQIDNOS2和512的多肽的多核苷酸的至少25个连续核苷酸;和B从烟草植物部分制备烟草制品。还提供的是用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法,所述方法包括A修饰功能性CYP82E5V2等位基因以将等位基因变成无功能的CYP82E5V2,其中无功能的CYP82E5V2在选自残基。

44、235,449,174,410,224,72,143和422的位点的氨基酸残基上具有置换,其中编号根据SEQIDNO2;和B降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。本发明还提供了用于减少烟草制品的致癌潜能的方法,所述方法包括通过A种植转基因烟草植物,其中植物包括包含与异源启动子有效连接的绿叶烟碱脱甲基酶的片段的植物部分,并且所述片段包含来自编码选自SEQIDNOS2和512的多肽的多核苷酸的至少25个连续核苷酸;和B从烟草植物部分制备烟草制品来制备烟草制品。此外,本发明提供了减少烟草属植物中烟碱至降烟碱的转化的方法,所述方法包括A用包含能够在植物中发挥功能的启动子的核酸构建体转化烟草属植。

45、物,所述启动子有效地连接至具有第一核酸序列所述序列包含SEQIDNO1,3或4的100个核苷酸至大约350个核苷酸的区域和能够与第一序列形成双链RNA的第二核酸序列的多核苷酸;和B再生转基因烟草属植物。0019在第七方面,本发明概述为筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法,所述方法包括A获得与SEQIDNO1具有至少200个核苷酸的序列同一性的核酸序列;和B鉴定在编码的说明书CN101939431ACN101939434A5/43页12多肽的位点422上编码终止密码子的密码子序列,其中编号根据SEQIDNO2。还提供的是筛选绿叶烟碱脱甲基酶序列的方法,所述方法包括A获得与SEQIDNO1具有至少200。

46、个核苷酸的序列同一性的核酸序列;和B鉴定在编码的多肽的位点449上编码不是脯氨酸的密码子的密码子序列,其中编号根据SEQIDNO2。还提供的是用于鉴定具有低水平的降烟碱的烟草植物的方法,所述方法包括A从目的烟草植物获得DNA样品;和B就SEQIDNO1中的突变筛选样品。本发明还提供了用于降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平的方法,所述方法包括A抑制CYP82E4V2烟碱脱甲基酶和CYP82E5V2烟碱脱甲基酶的表达;和B降低来源于烟草属植物的植物部分中降烟碱的水平。还提供的是包含多肽的烟草植物材料,所述多肽具有在选自残基458、364、329和其组合的位点上具有突变的SEQIDNO13。

47、的氨基酸序列。此外还包括的是包含在选自残基458,364,329和其组合的位点上具有突变的CYP82E4V2的烟草植物材料,其中编号根据SEQIDNO13。还包括的是包含在残基376上具有突变的CYP82E4V2的烟草植物材料,其中所述残基不是缬氨酸并且残基的编号根据SEQIDNO13。0020附图概述0021图1AC显示已在酵母和/或转基因植物中就烟碱脱甲基酶活性进行了测定的CYP82E2基因家族成员的氨基酸序列比对。以斜体字和下划线标示的序列对于烟碱脱甲基酶活性是阳性的CYP82E4V2和CYP82E5V2;以黑色开头的序列在测定中未显示活性。在成员之间不同的残基以灰色阴影标示。在图1中,。

48、CYP82E4V2示于SEQIDNO13;CYP82E4V6示于SEQIDNO26;CYP82E4V12示于SEQIDNO27;58166示于SEQIDNO28;CYP82E3示于SEQIDNO29;CYP82E2V1示于SEQIDNO30;CYP82E2V2示于SEQIDNO31;和CYP82E5V2示于SEQIDNO2。0022核酸序列的描述0023SEQIDNO1显示CYP82E5V2的编码区的核酸序列。0024SEQIDNO2显示CYP82E5V2的氨基酸序列。0025SEQIDNO3显示CYP82E5V2的内含子的核酸序列。0026SEQIDNO4显示基因组CYP82E5V2的核酸序。

49、列。0027SEQIDNO5显示CYP82E5V2P235S的氨基酸序列。0028SEQIDNO6显示CYP82E5V2P449L的氨基酸序列。0029SEQIDNO7显示CYP82E5V2S174L的氨基酸序列。0030SEQIDNO8显示CYP82E5V2A410V的氨基酸序列。0031SEQIDNO9显示CYP82E5V2M224I的氨基酸序列。0032SEQIDNO10显示CYP82E5V2P72L的氨基酸序列。0033SEQIDNO11显示CYP82E5V2L143F的氨基酸序列。0034SEQIDNO12显示CYP82E5V2W422STOP的氨基酸序列。0035SEQIDNO13显示CYP82E4V2的氨基酸序列。0036SEQIDNO14显示CYP82E4V2P458S的氨基酸序列。0037SEQIDNO15显示CYP82E4V2K364N的氨基酸序列。0038SEQIDNO16显示CYP82E4V2P38L的氨基酸序列。0039SEQIDNO17显示CYP82E4V2E201K的氨基酸序列。说明书CN101939431ACN101939434A6/43页130040SEQIDNO18显示CYP82E4V2R169Q的氨基酸序列。0041SEQIDNO19显示CYP82E4V2G459R的氨基酸序列。0042SEQIDNO20显示CYP82E。

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