用于体细胞核移植的犬科出生率的提高方法 【技术领域】
本发明涉及一种通过体细胞核移植(SCNT)来增加在生产属于犬类(犬科)的动物中的后代的生产率的方法，更具体涉及通过SCNT来增加在克隆的犬类中的生产率的方法。该方法包括犬类卵母细胞的去除并将其与核供体细胞融合以形成核移植胚胎，并将该核移植胚胎转移到代孕母体(surrogate mother)的输卵管中。在特定细胞循环同步诱导物质诸如在其制备过程中的细胞周期蛋白B激酶抑制剂(roscovitine)的存在下培养核供体细胞。
背景技术
近年来，随着基因技术或者遗传工程的发展，报道了许多通过将所需特性结合到有用作物中得到的各种重组有机体的生产的成功例子。并且近年来，同样报道了克隆动物，诸如绵羊生产的许多成功例子。克隆动物的生产实际上只有在生物技术领域中高度积累的技术之后才可能变为事实，因此可以被认为是相关技术水平的晴雨计。
SCNT技术是一种使有生命后代出生的不需要经过减数分裂和通常在生殖过程中生产的单倍体生殖细胞保持的技术，是通过将成体双倍体细胞转移到去核卵母细胞中生产胚胎，然后在体内移植胚胎的新个体发育的方法。
一般说来，在SCNT技术中，与体细胞移植的受体卵母细胞在经过体外人工培养到减数分裂中期II之后被使用。然后，为了防止由SCNT导致的染色体异常的出现，在移植体细胞之前将成熟卵母细胞去核。在将体细胞注射到成熟卵母细胞的卵黄周隙或者细胞质中之后，将去核卵母细胞和体细胞通过电刺激彼此物理融合。融合的偶联体通过电刺激或者化学物质活化，然后移植到代孕母体中以生产有生命的后代。
这种SCNT技术可在下述领域中广泛地被使用，例如在高级动物的繁殖中，在稀有或者几乎灭绝的动物的保护中，在特定营养物的生产中，在治疗用生物材料的生产中，在用于器官移植的动物生产中，在患有疾病或生理紊乱的动物的生产中，以及在医疗上适用于作为器官移植的替代治疗诸如基因治疗的动物生产中。
通过体细胞核移植克隆哺乳动物的技术首先由Roslin Institute，England的Dr.Wilmut完成，其通过从六岁的老绵羊中获取乳腺细胞，将该细胞移植到去核卵母细胞中制备核移植胚胎，并在体内移植胚胎，从而生产了克隆动物Dolly。从那以后，使用得自成年动物的体细胞通过核移植生产了克隆牛、鼠、山羊、猪和兔(WO 99/37143A2，EP 930009A1，WO 99/34669A1，WO 99/01164A1和US 5,945,577)。
同时，不仅工业动物诸如牛和猪的克隆，而且宠物，诸如狗的克隆吸引了许多人的兴趣。近年来，在宠物中，猫首先被克隆，在研究基金中也投入了数百万美元对狗的克隆进行了研究。
但是，从没有发情的母狗的卵巢中取出不成熟的卵母细胞并且在体外培养卵母细胞以生产成熟的卵母细胞是非常困难的。这是为什么与其他动物相比通过体细胞核移植克隆狗非常困难的原因之一，即由于狗的独特物种特异性生殖特征。不过，狗具有与人类类似的生理特性，并具有与人类类似的发病模式，因此人和狗在病理和生理条件方面是类似的。实际上可在人类疾病研究中使用的遗传疾病地数量在狗中有224种，这显著大于猪中的65种或者猫中的136种(http://omia.angis.org.au/)。因此，如果这种遗传特定被用于生产克隆狗以便研究人类疾病模式，克隆狗将极大地有助于人类疾病研究。出于这种原因，克隆狗的尝试已经进行了很长时间，但狗克隆的成功率仍然很低，并且狗的克隆被认为难以成功。因此，需要发展对于提高犬类克隆效率的有效方法。
因此，本发明的发明人已经进行了使用SCNT方法来生产克隆犬类的改进方法的研究，结果发现克隆犬类可以通过这种方法高效生产，即在该方法中的核供体细胞制备过程中加入特定物质，诸如细胞周期蛋白B激酶抑制剂，从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供生产犬类核移植胚胎的方法，以及使用SCNT技术增加克隆有生命的后代的生产率的方法。
本发明的另一目的在于提供通过所述方法生产的犬科核移植胚胎。
本发明的还以目的在于提供增加了生产率的生产克隆犬的方法，所述方法包括将所述核移植胚胎转移到代孕母体中以生产有生命的后代的步骤。
为了实现上述目的，本发明提供了使用SCNT技术生产犬类核移植胚胎的方法，其中核移植胚胎使用经过在细胞循环同步诱导物质，诸如在其制备过程中的细胞周期蛋白B激酶抑制剂的存在下的培养过程在特定循环中同步化的核供体细胞来生产。
本发明还提供了根据所述方法生产的犬类核供体胚胎。
本发明还提供了具有增加的效率的生产克隆犬类的方法，所述方法包括将所述核移植胚胎转移到代孕母体中以生产有生命的后代的步骤。
通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加明显。
【附图说明】
图1是显示使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂(Roscovitine)处理的核供体细胞构建的克隆胚胎的核重塑的图片。在图1中，白色的箭头表示各个阶段的核形状。
图2是根据本发明的方法克隆的7个1月龄猎犬(Retriever)的图片(图2(a))，狗在4个月大时的图片(图2(b))和通过SCNT克隆的狗的图片(图2(c))。
图3是根据本发明的方法生产的四只癌症探查(cancer-sniffing)狗的图片(图3(a))和根据本发明的方法的五只克隆的美洲叭啦狗(PitBull terrie)的图片(图3(b))。
【具体实施方式】
在本文中使用的术语的定义如下。
本文中使用的术语“核移植”指的是通过将去核卵母细胞与细胞或者细胞核人工结合，使有生命的后代生产与母体相同特征和性质的基因操作技术。
本文中使用的术语“核移植胚胎”指的是被注射或者融合有核供体细胞的胚胎。
本文中使用的术语“克隆的(或者克隆)”指的是用于制备具有与另一个体单位相同基因组的新的个体单位的基因操作技术。特别是，在本发明中，术语“克隆的”在本文中被用于指细胞、胚胎细胞、胎儿细胞和/或动物细胞具有核DNA序列，该核DNA序列大体上与另一细胞的核DNA序列类似或相同。
本文中使用的术语“核供体细胞”指的是被移植到作为核受体的受体卵母细胞中的细胞或者细胞核。
在本文中，术语“继代培养”指的是在从前一培养板上分离达到汇聚的粘附细胞以防止过度生长，之后在新的培养板上重新培养细胞的方法。特别是，它指的是从动物中分离细胞并连续对细胞进行传代以进行初级培养、次级培养、三级培养等的方法，即通过以周期性替换新鲜培养基来保持细胞系的方法。
本文中使用的术语“受体卵母细胞”指的是在除去其原始细胞核之后接受来自核供体细胞的细胞核的卵母细胞。
本文中使用的术语“卵母细胞”指的是已经达到减数分裂中期II的成熟卵母细胞。本文中使用的术语“去核卵母细胞”指的是其细胞核已经被除去的卵母细胞。
本文中使用的术语“融合”指的是核供体细胞与受体卵母细胞的脂质膜结合。例如，脂质膜可以是细胞的细胞质膜或者核膜。当将核供体细胞与受体卵母细胞彼此相邻放置时或者当核供体细胞被放置在受体卵母细胞的卵黄周隙中时，在它们之间施加电刺激时可发生融合。
本文中使用的术语“活化”指的是在核移植之前、过程中或之后刺激细胞使其分裂。优选地，在本发明中其意味着在核移植之后刺激细胞使其分裂。
本文中使用的术语“有生命的后代”的意思是在子宫外可生存的动物。优选地，其为可生存一秒、一分钟、一天、一周、一个月、六个月或者一年以上的动物。即动物可以不需要在子宫环境内才能生存。
在本发明中，属于犬类(犬科)的动物可在广义上被分成Tribe Canini和Tribe Vulpini，包括狗、狼、狐狸、豺、山狗、韩国狼和狸。优选地，它们包括狗和狼。已知狗来自野生狼的驯养，狼和狗具有相同的染色体数目并在妊娠期显示相似性和性激素变化(Seal，US等人，BiologyReproduction，21：1057-1066，1979)。在本发明中，术语“术语犬类的动物”也简单地所写为“犬”。
在一个方面，本发明涉及通过体细胞核移植技术生产犬核移植胚胎的方法。
特别是，制备犬核移植胚胎的方法包括下列步骤：
(a)从犬卵母细胞中除去细胞核以制备去核卵母细胞；
(b)当培养来自犬的组织的体细胞时通过在细胞周期同步化诱导物质的存在下培养体细胞制备核供体细胞；
(c)将步骤(b)的核供体细胞微注射到步骤(a)的去核卵母细胞并将供体细胞与去核卵母细胞之间进行融合；并且
(d)活化步骤(c)融合的卵母细胞。
特别是，用于制备犬核移植胚胎的方法的特征在于，从犬组织中分离的体细胞在细胞周期同步化诱导物质的存在下被培养。细胞周期同步化物质是在细胞循环中的任一时期，包括有减数分裂期(M)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)中暂时抑制细胞的物质，并且当该物被除去时，在特定循环中被抑制的细胞循环将再次进行。通过加入上述细胞同步化诱导物质，经体细胞核移植的犬后代的生产率被增加。
细胞循环同步化诱导物质的例子包括：作为阻断G0/G1期的细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)的细胞周期蛋白B激酶抑制剂(分子式1)；阻断G0/G1期的放线菌酮(分子式2)；阻断G0/G1期的二甲基亚砜(DMSO)(分子式3)；作为阻断G1/S期的Cdk抑制剂的丁内酯I(分子式4)；作为阻断早期S期的DNA聚合酶A、D的抑制剂的巴菲敌柯林(aphidicolin，分子式5)；阻断减数分裂期的M期的秋水仙胺(分子式6)；作为阻断S期的DNA复制抑制剂的含羞草氨酸(分子式7)；作为阻断G2/M期的微管抑制剂的秋水仙素(分子式8)；以及作为DNA拓扑异构酶的荧光染料的Hoechst 33342(分子式9)，每种物质的化学分子式如下。优选的是细胞周期蛋白B激酶抑制剂、放线菌酮或者二甲基亚砜(DMSO)，最优选地是细胞周期蛋白B激酶抑制剂。
[分子式1]
[分子式2]
[分子式3]
[分子式4]
[分子式5]
[分子式6]
[分子式7]
[分子式8]
[分子式9]
在本发明的一种实施方式中，核供体细胞可通过将细胞周期蛋白B激酶抑制剂加入到分离自犬组织的体细胞中然后培养该细胞来制备。当对添加和不添加细胞周期蛋白B激酶抑制剂的克隆狗的生产率进行比较时发现，没有使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的对照组的怀孕率仅为10％，而使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的组的怀孕率为大约40％，表明在核供体细胞制备中加入细胞周期蛋白B激酶抑制剂显著地增加了克隆狗的生产率。因此，本发明包括根据上面描述的方法制备的核移植胚胎。
在另一方面，本发明涉及生产克隆犬的方法，其特征在于使用的是所述核移植胚胎。
更具体地说，本发明的生产克隆犬的方法包括下列步骤：
(a)从犬卵母细胞中除去细胞核以制备去核卵母细胞；
(b)当培养来自犬组织的体细胞时通过在细胞周期同步化诱导物质的存在下培养体细胞制备核供体细胞；
(c)将步骤(b)的核供体细胞微注射到步骤(a)的去核卵母细胞并将供体细胞与去核卵母细胞之间进行融合；
(d)活化步骤(c)的融合卵母细胞；并且
(e)将活化的卵母细胞移植到代孕母体的输卵管中。
在本发明的用于生产克隆犬的方法的步骤(b)中，为了增加通过体细胞核移植的犬后代的生产率，核供体细胞通过将细胞循环同步化诱导物质，诸如细胞周期蛋白B激酶抑制剂、放线菌酮、二甲基亚砜(DMSO)、丁内酯I、巴菲敌柯林、秋水仙胺、含羞草碱、秋水仙素、Hoechst 33342或者类似物加入到分离自犬组织的体细胞中来制备，然后培养该体细胞。上面这些物质的特定描述见上述。
下面将详细描述本发明的生产犬核移植胚胎的方法和生产克隆犬的方法。
步骤1：受体卵母细胞的去核
一般说来，哺乳动物(例如牛、猪和绵羊)的卵母细胞在卵母细胞成熟时进行排卵，即在减数分离的中期II时排卵，而与其他动物不同，犬卵母细胞在减数分离的前期I时进行排卵并保持在输卵管中48-72小时的时候成熟。
受体卵母细胞可以是犬未成熟的卵母细胞、成熟卵母细胞和初始老化的卵母细胞、中度老化和严重老化的卵母细胞。优选地，为了用作受体卵母细胞，从犬中收集的未成熟卵母细胞可在体外成熟，或者收集在体内成熟的卵母细胞。由于犬卵母细胞核在体外成熟的比例非常低，并且犬的排卵时间和生殖生理与其他动物不同，优选在体内收集成熟的犬卵母细胞以便用作受体卵母细胞。更具体地说，收集来自犬的成熟卵母细胞优选在犬中排卵诱导之后的48-72小时进行，更优选为72小时。
关于这方面，犬排卵的日期可通过本领域已知的任何方法来确定。用于确定排卵日期的方法的例子包括但不限于：阴道涂片检测，血清性激素水平测定，以及超声诊断系统的使用。犬发情期的开始可通过外阴膨胀和血性浆液排出(serosanguinous discharge)来确认。
在本发明的一个例子中，进行阴道涂片检测和血清孕酮浓度分析。结果，未角化上皮细胞达到80％以上并且血清孕酮浓度开始达到大约4.0ng/mL以上的日期被认为是排卵日期。
作为收集体内成熟卵母细胞的方法，可使用外科手术的方法，包括麻醉动物然后进行剖腹手术。更具体地说，体内成熟卵母细胞的收集可使用本领域已知的输卵管切除术进行。输卵管切除术是包括如下步骤的方法：外科切除输卵管，将卵母细胞收集培养基冲洗到输卵管中并从冲洗液中收集卵母细胞。
在另一种方法中，体内成熟的卵母细胞可通过将导管插入到输卵管的毛缘端中，并使用留置针将冲洗液注射到子宫输卵管接头处。该方法具有的优点在于，其不引起对输卵管的损伤，由此允许卵母细胞供体动物在下一发情期时还可以使用。
收集成熟的卵母细胞之后，卵母细胞的单倍体核被去除。卵母细胞的去核可使用本领域已知的任何方法来进行(US 4994384,US 5057420,US 5945577,EP 0930009A1,KR 10-0342437,Kanda等人，J.Vet.Med.Sci.，57(4)：641-646，1995；Willadsen，Nature，320：63-65，1986，Nagashima等人，Mol.Reprod.Dev.，48：339-343，1997；Nagashima等人，J.Reprod Dev.，38：37-78，1992；Prather等人，Biol.Reprod.，41：414-418，1989，Prather等人，J.Exp.Zool.，255：355-358，1990；Saito等人，Assis Reprod Tech Andro，259：257-266，1992；Terlouw等人，Theriogenology 37：309，1992)。
优选地，受体卵母细胞的去核可通过下列两种方法之一来进行。一种方法包括除去成熟受体卵母细胞的卵丘细胞，使用微注射针通过形成裂缝局部切割受体卵母细胞的透明带，并经过裂缝除去第一极体、核和细胞质(以可能的最小量)。另一种方法包括除去成熟受体卵母细胞的卵丘细胞，对卵母细胞染色，并使用抽吸移液管除去卵母细胞的第一极体和细胞核。更优选地是，就卵母细胞的去核而言，抽吸法被用于具有高发育能力的卵母细胞，而用于形成裂缝的方法被用于具有低发育能力的卵母细胞，所述发育能力通过视觉检查受体卵母细胞来决定。
步骤2：核供体细胞的制备
在通过体细胞核移植技术来表达目标基因的转基因动物的生产中，需要核供体细胞。作为本发明的核供体细胞，使用来自犬的体细胞。特别是，在本发明中使用的体细胞可以是犬胚胎细胞、来自胎儿的细胞、来自幼犬的细胞或者来自成年犬的细胞，优选来源自成年犬的组织细胞，诸如来源于卵丘、皮肤口腔粘膜、血液、骨髓、肝脏、肺、肾脏、肌肉和生殖器官等。
可在本发明中使用的体细胞的例子包括但不限于，卵丘细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞和胚胎生殖细胞。更优选地，可在本发明中使用的体细胞可包括胎儿成纤维细胞、成体成纤维细胞和卵丘细胞。更优选地是，使用分离自犬胎儿和成体的成纤维细胞。这些细胞具有的优点在于大量细胞可在初始分离阶段得到，细胞的培养相当容易，并且细胞在体外培养和操作也很容易。
作为核供体细胞提高的体细胞可通过制备外科样品或活检样品的方法并从样品中得到，在优化条件下培养的单个细胞可使用下列方法得到。
从动物体收集组织，并且从组织中分离细胞。然后，在组织培养基基中培养细胞，将细胞循环同步化诱导物质加入到其中，接着对细胞进行培养。当细胞生长完成时，细胞通过胰蛋白酶处理被收集，然后可被用作核供体细胞。
本发明的特征在于，细胞循环同步化诱导物质被加入一边增加克隆犬的生产效率。可在本发明中使用的细胞循环同步化诱导物质包括：作为阻断G0/G1期的Cdk(细胞周期蛋白依赖性激酶)的细胞周期蛋白B激酶抑制剂(分子式1)；阻断G0/G1期的放线菌酮(分子式2)；阻断G0/G1期的二甲基亚砜(DMSO)(分子式3)；作为阻断G1/S期的Cdk抑制剂的丁内酯I(分子式4)；作为阻断早期S期的DNA聚合酶A、D的抑制剂的巴菲敌柯林(aphidicolin，分子式5)；阻断减数分裂期的M期的秋水仙胺(分子式6)；作为阻断S期的DNA复制抑制剂的含羞草碱(分子式7)；作为阻断G2/M期的微观抑制剂的秋水仙素(分子式8)；以及作为DNA拓扑异构酶的Hoechst 33342(分子式9)，每种物质的化学分子式如下。优选的是细胞周期蛋白B激酶抑制剂、放线菌酮或者二甲基亚砜(DMSO)，最优选地是细胞周期蛋白B激酶抑制剂。在一种实施方式中，来自待克隆的动物的组织被无菌切割以得到外科样品或者活检样品，并将样品切碎，使用胰蛋白酶处理然后在组织培养基中培养。使用本领域已知的那些组织培养基，其包括TCM-199，DMEM(Dulbecco′smodifiedEagle′s培养基)以及类似物。
在组织培养基中培养3-4天之后，细胞在培养板上的生长被确认。当细胞生长完成时，使用胰蛋白酶对细胞进行处理，将一部分组织冰冻并储存在液氮中以便以后使用，将剩余组织进行继代培养以便在核移植中使用。将连续培养以用于核移植的细胞在新鲜培养板继代培养，然后使用胰蛋白酶处理以制备在核移植中使用的单个细胞。
最后，将细胞周期蛋白B激酶抑制剂加入到细胞中，所述细胞然后再继续进行培养。然后，细胞通过胰蛋白酶处理被收集并进行体细胞核移植。这里，加入的细胞周期蛋白B激酶抑制剂的浓度优选为5-30μM，更优选10-20μM，培养时间优选18-72小时，更优选24-48小时。
在一种实施方式中，当在新鲜培养板中培养后细胞浓度达到大约60％时，将细胞使用15μM的细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理18-24小时，然后使用胰蛋白酶处理以制备单个细胞。然后，细胞在核移植中使用。
步骤3：核供体细胞的微注射和融合-核移植胚胎的制备
在步骤2中制备的核供体细胞被微注射到在步骤1中制备的去核卵母细胞中。这里，微注射通过使用移液管将核供体细胞微注射到去核卵母细胞的细胞质和透明带之间来进行。
将微注射了核供体细胞的去核卵母细胞使用细胞操作仪与核供体细胞进行电刺激融合。电融合可使用直流电或者交流电来进行。优选地，其可在2.0-6.0kV/cm的电压下进行，更优选其可在3.0-5.0kV/cm的直流电压下10-30μs进行1-3次。最优选的是施加两次直电流，每次3.5-5.0kV/cm、进行15μs。
上面描述的在电融合中的电压范围的特征在于，其比到目前为止已知的常规电融合中的电压范围更高。该范围是对于电融合的最佳条件，并允许克隆犬以更高的克隆率生产。
核供体细胞通过电刺激与卵母细胞的融合可以在各种融合培养基中进行，例如齐默曼(Zimmerman)或者甘露醇。优选地，使用含有甘露醇、MgSO4，盐缓冲液(Hepes)和牛血清蛋白(BSA)的培养基。
在去核卵母细胞进行体细胞核移植，然后电融合之后，卵母细胞的核经历了重塑过程。作为表明重塑平稳发生的证据，在电融合之后大约1小时在融合的卵母细胞中出现早熟染色体凝集(PCC)。已知经历了早熟染色体凝集的融合卵母细胞在重塑和活化之后很容易发育并重新程序化。
在其中使用细胞循环同步化诱导物质，诸如细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的核供体细胞已经被移植的情况下，PCC以比其中核供体细胞没有被移植的情况下更高的比例出现。而且，甚至在融合的胚胎活化之后，核的继续膨胀和收缩仍在发生(参见本发明的实施例1)。特别是，作为在其正常形成过程中细胞核经历的过程：早熟染色体凝集(PCC)、核增大(NE)和核膨胀(NS)随着时间的流逝按照PCC→NE→NS的顺序出现。在通过移植使用细胞核同步化诱导物质，诸如细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的核供体细胞得到的克隆卵母细胞中，PCC以非常高的比例出现，因此核重塑活化的程度更大。
步骤4：核移植胚胎的活化
融合的核移植胚胎的活化是在成熟过程中重新活化暂时被抑制的细胞循环的步骤。出于该目的，需要降低作为细胞再循环抑制因子的细胞信号传递物质诸如MPF、MAP激酶等的活性。
一般说来，活化核移植胚胎的方法包括电方法和化学方法。在本发明的一种实施方式中，化学方法可被用于活化核移植胚胎。根据本发明，与电方法相比，化学方法可更好的促进核移植胚胎的活化。化学方法包括使用物质下列物质处理核移植胚胎的方法，诸如使用乙醇、纤维醇三磷酸、二甲离子(例如Ca2+或者Sr2+)、微管抑制剂(例如细胞松弛素B)、二价离子载体(例如Ca2+离子载体ionophore ionomycin)，蛋白激酶抑制剂(例如6-二甲基氨基嘌呤)、蛋白质合成抑制剂(例如放线菌酮)或者佛波醇12-豆蔻酸13-醋酸。
优选地，作为用于核移植胚胎活化的化学方法，使用钙离子载体和6-二甲基氨基嘌呤同时或者逐步处理核移植胚胎的方法可在本发明中被使用。更优选地是，核移植胚胎使用5-10μM钙离子载体在37-39℃下处理3-6分钟，然后使用1.5mM-2.5mM 6-二甲基氨基嘌呤在37-39℃下处理4-5小时。
在另一方面，本发明涉及根据上述方法制备的犬核移植胚胎。
步骤5：将核移植胚胎移植到代孕母体中和有生命的后代的生产
此外，通过将它们移植到代孕母体中以允许有生命的后代出生，犬核移植胚胎可被用于生产克隆犬。
在犬属的情况下，核移植胚胎在活化之后没有体外培养的情况下立即被移植。移植可通过本领域已知的任何方法进行，优选地，可使用导管来移植克隆的胚胎。
选择适于核移植胚胎移植并能够将胚胎发育成正常胎儿的代孕母体。用于移植的最佳时间是通过监测在达到成熟以后显示自然发情的犬，或者在性成熟之前或之后其发情期已经通过人工激素处理诱导的犬的发情期和排卵来确定。一般说来，合适的移植时间可在与提供了在核移植中使用的卵母细胞的犬卵母细胞供体的排卵日期一致的1-2天的范围内。优选地，移植时间为犬卵母细胞受体的排卵期的一天之后，更优选与犬卵母细胞供体的排卵期同一天。代孕母体的发情周期的优选的评定可基于其体内孕酮的浓度来进行。
将核移植胚胎移植到代孕母体中的方法是通过剖腹手术将胚胎移植到代孕母体的输卵管中来进行的。在将核移植胚胎移植到代孕母体的过程中，核移植胚胎可优选处于1-细胞期、2-细胞期或者4-细胞期。出于这种目的，核移植胚胎移植到代孕母体中优选在活化之后4小时内进行。而且，核移植胚胎可在覆盖有矿物油的25μl mSOF微滴中培养，直到代孕母体被准备好，然后移植到代孕母体中。
在胚胎移植3周后，代孕母体通过超声波来评估其怀孕情况。此后，每两周进行一次超声诊断以监测代孕母体的怀孕情况和胎儿的生长状态。
如果有生命的后代在甚至超过分娩间隔30分钟之后仍没有分娩，则经验丰富的助手应当帮助代孕母体的分娩。当预期的分娩日期已过，通过将激素制剂注射到代孕母体中诱导有生命的后代的分娩，或者通过外科操作诸如剖腹产手术诱导分娩。
本发明的用于克隆犬生产的方法具有增加在现有技术中犬类非常低的怀孕成功率的效果。因此，本发明的方法可克服在实践中由于低克隆效率而难以使用的先前已知方法的缺点，因此其可在实践中被应用于增加克隆犬的生产率。
实施例
此后，将参照实施例对本发明进一步详细描述。但是，应当理解，这些实施例仅仅用于说明的目的，而不应理解为对本发明的范围的限制。
实施例1：从狗中收集受体卵母细胞
在实验中用作卵母细胞供体的狗为有规律的发情周期并且生殖器官没有疾病的1-5岁的母狗。用作卵母细胞供体的狗由根据Seoul NationalUniversity for Accreditation of Laboratory Animal Care建立的标准来保存。排卵期通过进行阴道涂片检测并通过每天测定显示自然发情的发情期狗的血清孕酮浓度来确定。而且，成熟卵母细胞在排卵之后72小时通过外科手术获取。
为了测定血清孕酮浓度，每天收集3-5ml血液并将其离心以得到血清，使用DSL-3900孕酮活性涂层管放射免疫测定试剂盒(ACTIVEProgesterone Coated-Tube Radioimmunoassay Kit)(Diagnostic SystemsLaboratories，Inc.，USA)对血清进行分析。孕酮浓度开始达到4.0ng/ml以上的日期被认为是排卵期(Hase等人，J.Vet.Med.Sci.，62：243-248，2000)。
为了进行阴道涂片检测，从发情前期的初始标记的那天起每天获得涂片。涂片通过将拭子插入阴唇中并在载玻片上滚动来收集。在使用精子形态学快速染液(Diff-Quik)(International Chemical Co.，Japan)染色后，使用显微镜对涂片进行检查；表层细胞达到上皮细胞的80％以上(角化指数cornified index，Evans，J.M.等人，Vet.Rec.，7：598-599，1970)的时间被认为是排卵时间。
本发明的发明人根据上述方法确定了排卵时间，然后以下列方式通过剖腹手术从供体狗中获取卵母细胞。
首先，将作为卵母细胞供体的母狗通过给以6mg/kg克他命HCl和1mg/kg甲苯噻嗪麻醉。麻醉通过给以异氟烷来保持。
将具有圆形前端的针经过滑囊缝隙插入到被麻醉狗的输卵管的毛缘端。插入的针使用缝合线保持在原位。这里，使用快速释放装置包括3cm塑料管(直径2mm)和止血钳。为了使输卵管的管易于可看，将数字压力表(digital pressure)应用到输卵管和周围的子宫-输卵管结合部上，并插入静脉导管(24gauge)。然后，经过导管冲洗Hepes缓冲液作为表1中显示的卵母细胞收集介质，其含有10％(v/v)牛血清(FBS)、2mMNaHCO3和5mg/ml牛血清蛋白(BSA)(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以使得卵母细胞被冲出。
表1
成分含量 TCM粉末1L (Gibco 31100-027)9.9g P/S抗生素1％(青霉素10000IU，链霉素10mg) HEPES缓冲液2.38g FBS10％(v/v) NaHCO30.1680g BSA5mg/L
实施例2：受体卵母细胞的去核
将实施例1中得到的卵母细胞加入到表1中的卵母细胞收集介质中，并通过重复移液介质中的透明质酸酶(Sigma，USA)从而在卵母细胞中除去卵丘细胞。然后，使用5μg/mL的精子形态学快速染液(Hoechst33342)将已经除去卵丘细胞的卵母细胞染色5分钟，并在200X放大倍数的倒置显微镜下观察以便选择仅仅具有突出的第一极体的卵母细胞。
选择的卵母细胞使用显微操作仪(Narishige，Tokyo，Japan)在添加了5μg/mL细胞松弛素B的上述介质(表1)中去核。特别是，卵母细胞使用微量移液管(直径大约为150μm)保持，然后使用抽吸移液管(直径大约为20μm)将第一极体、相邻细胞质(不到5％)和卵母细胞核去除。将去核卵母细胞储存在添加了10％(v/v)牛血清(FBS)的TCM-199培养基(表2)中。
表2
实施例3：核供体细胞的制备
作为核供体细胞，使用从狗中收集的成体成纤维细胞。出于这种目的，对狗进行耳部皮肤活检。使用磷酸盐缓冲注(DPBS)(Dulbecco′sPhosphate Buffered Saline)将小片耳组织片段洗涤3次并使用外科刀片切碎。将切碎的组织加入到含有1mM含有乙二胺四乙酸(EDTA)的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s培养基)(DMEM Life Technologies，Rockville，MD)中并以300xg离心2分钟。然后，将细胞接种到60mm培养板(Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)上。
然后，将细胞在添加了10％(v/v)牛血清(FBS)、1mM谷氨酸盐、25mM NaHCO3和1％(v/v)最低必需培养基(MEM)非必需氨基酸溶液(Invitrogen，CA)的DMEM中，39℃下，在含5％CO2和95％的潮湿空气中培养3-4天。
在细胞培养融合后，将未附着的细胞除去，使用在培养基中添加0.1％的胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶处理剩余的附着细胞1分钟并进一步以4-6天为间隔在三个新鲜培养板继代培养。然后，将继代培养的细胞设置在由80％(v/v)DMEM，10％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)和10％(v/v)牛血清(FBS)组成的冰冻培养基中，并储存在-196℃的液氮中。
在进行体细胞核移植之前，将细胞解冻并在添加了15μM细胞周期蛋白B激酶抑制剂的培养基中(即DMEM+10％牛血清(FBS)+15μM细胞周期蛋白B激酶抑制剂)培养24小时。然后在体细胞核移植过程中使用胰蛋白酶对细胞处理2分钟并从单层中收集细胞。
实施例4：体细胞核移植
将在实施例3中制备的核供体细胞微注射到在实施例2中制备的去核卵母细胞中。核供体细胞以下列方式被微注射到去核卵母细胞的卵黄周隙中。在表1的培养基中使用100/mL植物凝集素处理去核卵母细胞，并且去核卵母细胞的裂缝由保持移液管支撑。然后，移植移液管被插入裂缝中，并且分离自实施例3中的成纤维细胞的单个细胞通过移植移液管被注射到去核卵母细胞的细胞质与透明带之间。
然后，将核供体细胞-卵母细胞偶联体设置在融合培养基中(含有0.26M甘露醇、0.1mM MgSO4、0.5mM HEPES和0.05％BSA)，并插入到与显微操作仪(Nikon-Narishige，Japan)连接的两个平行电极之间。然后，偶联体的融合通过使用电-细胞融合设备(NEPA GENE Co.，Chiba，Japan)以4kV/cm的电压每次15μs施加两次电刺激来诱导。
在电刺激1小时后，核供体细胞与卵母细胞细胞质的融合在立体显微镜下观察。融合胚胎被选择并在添加了10％(v/v)牛血清(FBS)的TCM-199(表2)中培养1.5-4小时.
实施例5：核移植胚胎的活化
将在实施例4中得到的核移植胚胎在含有10μM离子载体(Sigma)的mSOF中在39℃下培养4分钟，由此诱导核移植胚胎的活化。然后，洗涤核移植胚胎，并进一步在添加了1.9mM的6-二甲基氨基嘌呤的mSOF(表3)中培养4小时。
在它们被移植到代孕母体中之前，将核移植胚胎在由矿物油覆盖的25μl的mSOF微滴中培养。
表3
实施例6：将胚胎移植到代孕母体中并生产克隆狗
将来自实施例5中的核移植胚胎外壳移植到发情同步化的代孕母体的输卵管中。移植在核移植胚胎活化之后4小时内进行。作为代孕母体，使用没有疾病、显示正常发情周期重复并具有正常子宫状态的狗。为了移植，代孕母体通过血管注射0.1mg/kg的乙酰丙嗪和6mg/kg的丙泊酚麻醉，并使用2％的异氟烷保持麻醉状态。作为麻醉的母狗的手术台进行无菌处理，并按照常规剖腹手术在腹部中央切口以便暴露输卵管。腹腔通过手刺激以便将卵巢、输卵管和子宫拉到切口。仔细处理被拉卵巢的卵巢系膜以识别输卵管的开口，将装备有1.0ml结核菌素注射器(Latexfree，Becton Dickinson & CO.Franklin lakes，NJ 07417)的3.5F Tom cat导管(Sherwood，St.Louis，MO)插入到输卵管中以保证导管前面有足够空间。然后，将核移植胚胎经导管注射到输卵管中。在显微镜下观察核移植胚胎是否成功地被注射。使用吸收性缝合材料进行腹部缝合，然后进行皮肤缝合。为了防止术后感染，注射3天广谱抗生素。
在将核移植胚胎已知到代孕母体中之后23天，使用具有连接的7.0MHZ线性探头的SONOACE 9900(Medison Co.LTD，Seoul，Korea)超声扫描仪检查怀孕的情况。在最初确认之后每两周通过超声来监测怀孕情况。结果，确认狗已经怀孕，克隆狗通过诱导自然分娩或者进行剖腹产手术进行生产。克隆狗在图2和图3中显示。
测试实施例1：使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂的组与对照组之间的比较
在使用微注射法将犬体细胞核移植到去核卵母细胞中之后，检测了没有使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的对照组与使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理24小时的组之间的细胞核的形成和变化。
结果，可以看到，在使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的组中，早熟染色体凝集(PCC)以比对照组中更高的比例发生，并且细胞核的继续膨胀和重新浓缩甚至在融合胚胎活化之后仍然出现，同时显示与对照组的显著差别。这种结果表明，即使在犬卵母细胞的细胞核在使用微注射方法被替代之后，狗的重建克隆胚胎仍然可正常重塑，并且与对照组相比处理组以更好的方式发育。得自所述核重塑的细胞核的各种形态模式在表4和图1中显示。
表4显示了在将体细胞移植到去核卵母细胞中之后细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理组与对照组之间的重建卵母细胞的核重塑比较。在表4中，PCC、NE和NS表示在其正常发育过程中随着时间的流逝细胞核经历的现象，所述过程随着时间的流逝按照PCC→NE→NS的顺序出现。可以观察到，在电融合1小时后，在处理组中以比对照组中更高的比例出现PCC。而且可以观察到，在融合胚胎活化之后4小时，核膨胀(NS)在处理组中以比对照组中更多地出现。
表4
(hpf＝小时后融合；hpa＝小时后活化；IN＝完整细胞核；PCC＝早熟染色体凝集；NE＝核增大；NS＝核膨胀。(P＜0.05))
然后，将根据本发明的方法使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的核供体细胞的组和未使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的培养的核供体细胞的对照组进行体细胞核移植，然后检查每组的怀孕率。
结果，在对照组中，478个移植了体细胞核的胚胎被移植到26个代孕母体中，其中，4个动物怀孕(15.3％，怀孕的代孕母体数/代孕母体总数)。在使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理的对照组中，体细胞核移植后556个胚胎被移植到29个代孕母体中，其中，11个动物成功怀孕(39.9％，怀孕的代孕母体数/代孕母体总数)。
通过所述结果可以看出，当体细胞核移植在使用细胞周期蛋白B激酶抑制剂处理之后怀孕率显著增加。
表5
处理 移植胚 胎数 代孕母 体数 怀孕母 体数 怀孕率 (以代孕母体数 为基础) 怀孕率(以移 植胚胎数为基 础) 对照 478 26 4 15.38％ 1.040％ 使用细胞 周期蛋白 B激酶抑 制剂处理 的组 556 29 11 39.93％ 3.95％
工业实用性
如上面详细描述的那样，根据本发明的方法可通过使用特定物质诱导用于核移植的供体细胞的细胞循环同步化增加在犬克隆中成功地核移植的效率。因此，本发明的方法可有助于兽医药、人类学和医学科学诸如高级犬类的繁殖、稀有或者几乎灭绝犬类的保护、异种器官移植领域研究的开展。
虽然已经参照具体特征对本发明进行了详细描述，但本领域技术人员将会理解，该描述仅仅是优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同技术来限定。