异养型硝化细菌、 包含其的生物传感器、 及检测水体毒性的 方法 【技术领域】
本发明涉及微生物领域， 具体地， 本发明涉及异养型硝化细菌、 包含其的生物传感 器、 及检测水体毒性的方法。背景技术
随着我国现代化进程的加快， 诸多领域会产生如工业污水、 农业污水、 生活污水， 这些污水通常含有有机污染物、 重金属等直接排放会对环境造成严重污染。其中工业污水 和农业污水含有大量合成有毒有机物， 一般难以被微生物所降解或完全去除， 生活污水中 也存在多种有毒物质， 如合成洗涤剂、 药品、 内分泌干扰物质等。因此水环境中不可避免地 存在毒性物质。尽管这些污染物在水中浓度低， 但毒性危害大， 有的还具有致癌、 致畸和致 突变特性。由于技术和经济原因， 国内很少有对环境水中的有毒有害污染物进行生物毒性 监测。而在国外， 对出流的城市污水进行生物毒性监测已有不少的报道。如在美国北卡罗 来纳州， 掺杂了纺织厂废水的城市污水出流受到了急性毒性和慢性毒性的指标限制。
目前的毒性测试方法都是基于测定化学品毒性发展起来的。 生物毒性监测不仅能 直接反映有毒物质联合作用对环境和生态的综合影响， 还可以直接检测多种有毒物质共存 时水质的综合毒性。近年来国内外一直在致力于生物毒性试验新方法的探索。用于毒性检 测的生物传感器有酶传感器、 微生物传感器、 DNA 传感器和免疫传感器等。酶、 DNA 和抗原 / 抗体的专一性强， 只能特异地检测某种有毒物质的毒性， 而微生物传感器是一类用完整细 胞作为识别元件的传感器， 其体内的各种酶系及代谢系统可以检测和识别相应底物， 从而 达到测试多种有毒物质综合毒性的目的。因此， 微生物传感器是目前具有很好发展前途的 毒性检测生物传感器。
硝化菌是专性好氧菌， 易受到外界环境因素的影响， 重金属、 农药、 有机污染物等 可以通过抑制硝化作用的酶类 ( 如氨单加氧酶、 羟氨氧化酶、 亚硝酸氧化酶 ) 而影响这一过 程的进行， 这一特点常被用作毒性测试中。开发硝化菌毒性检测系统技术关键在于硝化菌 的选择， 因为硝化菌的有氧呼吸和底物氨的利用是硝化作用的两个特征。当毒性污染物存 在时， 其硝化作用因而受到毒性抑制， 因此， 将硝化菌制成传感器， 该传感器使用溶解氧探 头， 可以通过测试水样中溶解氧的变化来评价水样毒性的大小。
异养型硝化菌在水体毒性检测生物传感器上的应用关键在于如何筛选、 分离、 选 优、 组合培养以及生物膜固定化等几大难点。 发明内容 为了解决上述难点， 本发明经过长期的科学研究与科学实验， 对异养型硝化菌的 筛选、 培育、 应用新技术等进行了研究， 并将筛选、 培育出的异养型硝化复合菌。 本法明采用 原位多点采样法， 采集鱼塘、 小溪、 湖泊等水体中泥样品， 并将其进行富集、 分离， 从而得到 的异养型硝化菌菌株， 经固定化后组合于生物传感器上， 用于水体毒性检测的目的。
本发明的目的是提供一种能够用于检测水体毒性的异养型硝化细菌， 紫红红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)。
本发明的再一目的是提供一种能够用于检测水体毒性的异养型硝化细菌， 马红球 菌 (Rhodococcus equi)。
本发明的再一目的是提供一种能够用于检测水体毒性的异养型硝化细菌， 产碱假 单胞菌 (Pseudomonas alcaligenes)。
本发明的再一目的是提供一种能够用于检测水体毒性的异养型硝化细菌， 藤黄微 球菌 (Micrococcus luteus)。
本发明的再一目的是提供一种异养型硝化菌复合菌指示剂。
本发明的再一目的是提供用于水体毒性检测的生物传感器。
本发明的另一目的是提供一种检测水体毒性的方法。
本发明从筛选到能够效检测毒性的微生物的目的出发， 采用原位多点采样法从鱼 塘、 小溪、 湖泊等水体中泥样品， 通过用于富集、 分离的方法成功的筛选到四株能够检测水 体中溶解氧的变化， 从而检测水体毒性的异养型硝化细菌， 建立了一种简单、 快速， 高效的 筛选方法。 采用 Sherlock 微生物鉴定系统 (Sherlock Microbial Identification System， Sherlock MIS) 对所筛选得到菌种进行鉴定。经鉴定， 筛选到的菌株分别是紫红红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)、 马红球菌 (Rhodococcus equi)、 产碱假单胞菌 (Pseudomonas alcaligenes)、 藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)， 其保藏编号分别是 CGMCC No.3890、 CGMCC No.3901、 CGMCC No.3902、 CGMCC No.3903。( 中国科学院微生物研究所， 地址 ： 北京 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 邮编 ： 100101 保藏日期为 2010 年 6 月 2 日 )。
根 据 本 发 明 的 四 种 异 养 型 硝 化 细 菌， 其 形 态 学 特 征 分 别 是， 紫红红球菌 CGMCCNo.3890(Rhodococcus rhodochrous) 菌落形态为圆形， 表面粘稠， 中间凸起， 不透 明， 边缘不平整， 橙红色 ； 马红球菌 CGMCC No.3901(Rhodococcus equi) 菌落形态为圆形， 表面粘稠， 扁平， 不透明， 边缘平整， 乳白色 ； 产碱假单胞菌 CGMCC No.3902(Pseudomonas alcaligenes) 菌落形态为圆形， 表面粘稠， 扁平， 半透明， 边缘平整， 黄褐色 ； 藤黄微球菌 CGMCC No.3903(Micrococcus luteus) 菌落形态为圆形， 表面粘稠， 扁平， 不透明， 边缘平 整， 亮黄色。
根据本发明提供的异养型硝化菌复合菌剂指示剂， 其包含了上述四种异养型硝化 细菌之一或多种。优选紫红红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)、 马红球菌 (Rhodococcus equi)、 产碱假单胞菌 (Pseudomonas alcaligenes)、 藤黄微球菌 (Micrococcus luteus) 按 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 的比例混合制成复合菌剂指示剂。
根据本发明提供的检测水体毒性的方法包括以下步骤 ：
1) 扩大培养上述异养型硝化细菌 ；
2) 将上述异养型硝化细菌固定于载体上， 加入培养基， 使异养型硝化细菌生长形 成生物膜 ；
3) 将上述生物膜固定于溶解氧电极， 然后检测水体毒性。
根据本发明提供的方法， 其中， 异养型硝化菌复合菌剂经扩大培养后， 固定在改进 了的溶解氧电极上组成传感器， 同时加入复合菌剂培养基， 将此生物体系投放于待测的水
体中， 以 KCN 为毒性参照物， 通过检测硝化细菌呼吸速率的变化来达到检测水体中化学成 分毒性的目的。 其中， 投加异养型硝化菌复合菌剂和复合菌剂培养基的比例是 1 ∶ 10， 复合 菌剂培养基的成分是 ： 牛肉蛋白胨 15g/L， NaCL 5g/L， pH 7.0。另外， 还要定期补加复合菌 剂培养基， 使菌剂在生物系统能良好的生长并形成生物膜， 该复合菌剂生物膜具有稳定毒 性检测功能， 从而完成对重大环境污染事件风险源识别与监控以及饮用水、 污水、 河流、 湖 泊等水体的生物毒性检测。
本发明筛选到了能有效检测毒性的微生物， 其可用于重大环境污染事件风险源识 别与监控技术及饮用水、 污水、 河流、 湖泊等水体的生物毒性检测。
本法明的优势在于 ：
1) 原位多点采样法筛选出多株微生物， 克服了单点采样培养成的菌液稳定性差的 难点 ：
2) 通过大量的单因素以及正交实验， 实现了菌株的选优并掌握了复合菌剂最佳的 生长条件 ；
3) 异养型硝化菌生物传感器上的成功运用解决了生物毒性检测连续在线监测的 难题， 实现了快速检测水体毒性， 从而完成对重大环境污染事件风险源识别与监控以及对 饮用水、 污水、 河流、 湖泊等水体的生物毒性检测。 附图说明
图 1 本发明的流程图。
图 2 红球菌属 F1(CGMCC No.3890) 全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图。
图 3 红球菌属 F4(CGMCC No.3901) 全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图。
图 4 假单胞菌属 Y2(CGMCC No.3902) 全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图。
图 5 微球菌属 Z1(CGMCC No.3903) 全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图。
图 6 硝化菌传感器对不同浓度 HgCl2 溶液的响应。
图 7 硝化菌传感器对不同浓度苯酚溶液的响应。 具体实施方式
实施例 1、 异养型硝化细菌的筛选
1、 异养型硝化细菌菌株的分离
原位多点采集异养型硝化菌样品， 鱼塘 8 个点、 小溪 10 个点、 湖泊 10 个点等水体 中的泥样品， 在富集培养基中经过 3-10 天的富集培养， 将富集培养的培养液在分离培养基 中进行分离培养， 则得到分离单菌株。再将分离得到的单菌株进行 2-6 次纯化分离培养， 从 而得到的异养型硝化菌 10 株。
其中， 富集培养基的成分是 ： 牛肉蛋白胨 15g/L， NaCL 5g/L， pH 7.0， 在 25-35℃条 件下培养。
分离培养基的成分是 ： 牛肉蛋白胨 15g/L， NaCL 5g/L， pH 7.0， 琼脂 20g/L， 在 25-35℃条件下培养。
2、 异养型硝化细菌菌株的筛选及异养型硝化细菌复合菌剂的制备
将分离得到的异养型硝化菌单一菌 10 株进行逐一筛选， 即将每一个单菌株进行硝化速率的测定， 并鉴定硝化速率在 3.4mg/(L·d) 以上的菌株。硝化速率的测定方法是， 将菌株分别接种在液体培养基中， 35℃， 黑暗培养 21d， 并设立零对照即不加任何细菌的培 养液对照。采用纳氏试剂比色法测量培养基中氨氮的量， 在 420nm 下测量其吸光度， 按下列 公式计算其硝化速率 ： 硝化速率 [mg/(L· d)] ＝ ( 零对照氨氮浓度 - 实验组氨氮浓度 )/ 时 间。
经过 21 天的培养， 菌株 F1、 F4、 Y2、 Z1 的硝化速率 [mg/(L·d)] 分别达到 ： 3.51、 3.43、 3.46、 3.52。四株菌按照 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 的比例组合后， 处理效果为 3.93， 组合后产生 了协同增效的效果。在温度为 35℃， pH 值为 8.5， 装瓶量为 20mL/250mL， 投菌量 25％为时， + 复合菌 NH4 -N 的降解率最高， 达到 70.02％。因此在本研究中最终使用的是由上述四株菌 按照 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 的比例组合而成的复合菌剂检测水体毒性， 即异养型硝化菌复合菌剂。
采用 Sherlock 微生物鉴定系统 (Sherlock Microbial Identification System， Sherlock MIS) 对上述四株菌所筛选得到菌种进行鉴定， 具体鉴定方法如下 ：
1) 获菌用无菌接种环将待分析的微生物从培养皿中取出， 放入一个干净、 干燥 13mm×100mm 旋转培养试管底部， 灼烧接种环重复上一动作， 使得菌量不少于 40mg。
2) 皂化向旋转培养试验管中加入 1.0±0.1ml 的试剂 1， 拧紧试管的 Telfon-lined 盖子， 在涡旋仪上震荡试管 5-10 秒， 然后将样品试管放入 95-100℃的水浴中。5 分钟之后， 从沸腾的水中取出试管并轻微的冷却， 此时不要打开盖子， 震荡试管 5-10 秒后再次将试管 放回沸水浴中， 继续加热 25 分钟。 皂化在沸水浴中时间是 30min， 可根据实际需要设置两部 分的加热时间。
3) 甲基化向经历过上述步骤的试管中加入 2.0±0.1ml 的试剂 2， 拧紧盖子震荡液 体 5-10 秒。于 80℃水浴加热试管 10min， 完成水浴加热后取出冷却。
4) 萃取向冷却的旋转培养试管中加入 1.25±0.1ml 的试剂 3， 盖紧盖子， 将试管温 和的混合旋转 10min。打开管盖， 利用干净的胶头滴管取出每个样品的下层似水部分丢弃。
5) 基本洗涤最后向完成萃取的旋转培养试管中加入 3.0±0.21ml 试剂 4， 拧紧盖 子温和旋转试管 5min， 静置待分层。 打开每个试管的盖子， 利用干净的胶头滴管吸取上层有 机样到干净的 GC 样品小瓶。两层的液面有时会不易看见， 必须小心不可取出任何似水部份 ( 下面 ) 部份进入自动的样品小瓶。
Sherlock Microbial Identification System 为 美 国 MIDI 公 司 依 据 自 20 世 纪 60 年代以来对微生物细胞脂肪酸的研究经验， 开发的一套根据微生物中特定短链 脂 肪 酸 (C9-C20) 的 种 类 和 含 量 进 行 鉴 定 和 分 析 的 软 件。 按 照 Sherlock Microbial Identification System 的程序要求， 检测任何样品必须将标准品连续进样两次， 只有两次 全部合格， 系统才会自动运行所测样品， 否则测样程序就会停止运行。
经 鉴 定， 本 发 明 筛 选 得 到 的 菌 株， 分 别 为 F1(Rhodococcus-rhodochrous) CGMCCNo.3890、 F4(Rhodococcus-equi)CGMCC No.3901 属 于 红 球 菌 属， Y2(Pseudomonas alcaligenes)CGMCC No.3902 属于假单胞菌属、 Zl(Micrococcus luteus)CGMCCNo.3903 属 于微球菌属， 其全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图分别是图 2-5。
实施例 2、 使用本发明的硝化细菌检测水体毒性
1、 异养型硝化菌复合菌剂的扩大培养
扩 大 培 养 实 施 例 1 筛 选 得 到 的 四 株 菌， 采用复合菌剂培养基 ( 四株菌按照1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 的比例组合 )， 按所需要的量进行扩大培养。
复合菌剂培养基的成分是 ： 牛肉蛋白胨 15g/L， NaCL 5g/L， pH 7.0， 在 25-35℃条 件下培养。
2、 水体中毒性的检测
将 复 合 菌 剂 固 定 于 聚 乙 烯 醇 - 海 藻 酸 钠 (PVA-CA) 载 体 上， 将 900mL 复 合 菌 剂 7000rpm， 4 ℃离心 10min， 然后加入 3mL 缓冲液。将聚乙烯醇 (PVA)4.8g 和海藻酸钠 (CA)0.36g 用 30mL 无氨水溶解， 在电炉上加热， 要不断搅拌。当 PVA-CA 混合液冷却到室温 时， 将混合液和细胞浓缩液等体积混合， 然后倒入模具， 晾干 1h， 把膜浸入 50％ w/v NaNO3 和 2％ w/v CaCl2 中， 凝固 1h， 再把膜用无氨水洗两次。按照 1 ∶ 10 的比例投加复合菌剂培养 基， 同时， 定期补加复合菌剂培养基， 使菌剂在该系统能良好的生长形成生物膜， 将生物膜 固定在溶氧电极上， 然后投入待测的水体中， 检测水体中的毒性。
本实验以 HgCl2 和苯酚作为标准毒性物质， 通过溶氧仪测定水样中氧浓度的变化 分别测试不同毒性物质浓度对硝化菌硝化作用的抑制程度。用哈希 HQ40d 溶氧测定仪来测 定由于硝化菌的呼吸而消耗的溶氧量， 设定每 5s 自动读取并存贮 DO 的数值。HgCl2 浓度梯 度设置为 0.01mmol/L、 0.03mmol/L、 0.05mmol/L、 0.07mmol/L、 0.09mmol/L。实验结果见图 6。苯酚浓度梯度设置为 0.003mmol/L、 0.006mmol/L、 0.009mmol/L、 0.012mmol/L， 实验结果 见图 7。 结果表明， 随着毒性物质的浓度的提高， 对硝化菌的硝化作用的抑制程度增强， 说明 本发明提供的硝化菌测定水体毒性的方法具有可行性。