蛋白质、固定蛋白质的方法、结构、生物传感器、核酸、载体和用于检测目标物质的试剂盒.pdf

本发明涉及一种蛋白质、固定蛋白质的方法、结构、生物传感器、核酸、载体和用于检测目标物质的试剂盒。具体来说，本发明提供一种能够与光交联基团特异性结合并可用于在微结构中基底和目的物质结合的抗-光交联基团抗体，一种至少包括所述抗体或其至少一部分的复合蛋白，以及一种将其用于目标物质检测的技术。本发明提供一种至少具有识别光交联基团的抗体结构的蛋白质。

1.  一种蛋白质，该蛋白质包括至少识别包括由以下通式1表示的反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的抗体：
式1

(其中R₁代表选自氢原子和可具有取代基的烷基的基团，R₂代表选自氢原子、卤素原子、烷氧基和可被烯化氧取代的烷基的基团)。

2.  根据权利要求1的蛋白质，其中所述蛋白质包括仅识别所述光交联基团的抗体。

3.  根据权利要求1的蛋白质，其中所述抗体由以选自FERM BP-10762、FERM BP-10763、FERM BP-10764、FERM BP-10825和FERM BP-10826(开始就是国际保藏)的保藏号保藏的杂交瘤产生。

4.  根据权利要求1的蛋白质，其中所述抗体具有包括下述(a)到(d)中任一的氨基酸序列的互补决定区或与其功能等价的互补决定区：
(a)包括序列SEQ ID NOs：1，2和3的氨基酸序列；
(b)包括序列SEQ ID NOs：4，5和6的氨基酸序列；
(c)包括序列SEQ ID NOs：7，8和9的氨基酸序列；和
(d)包括序列SEQ ID NOs：10，11和12的氨基酸序列。

5.  权利要求1的蛋白质，其中所述抗体选自嵌合抗体、互补决定区移植的抗体、单链抗体及其抗体片段。

6.  一种能够与目标物质结合的蛋白质，包括：
至少一个第一区域，该第一区域至少识别包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团，和
至少一个识别目标物质的第二区域，其中
第一区域包括根据权利要求1的蛋白质或其部分，且
被第二区域识别的目标物质与所述光交联基团不同。

7.  一种利用蛋白质识别交联基团的能力和交联反应将蛋白质固定到基底上的方法，包括：
1)提供具有包括作为交联基团的反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的基底表面，
2)利用权利要求1的蛋白质识别交联基团的能力将该蛋白质与基底表面上的交联基团反应，以将该蛋白质固定到基底上，
3)在反应后或同时用光照射基底以通过利用光交联基团的光交联反应在基底和蛋白质之间形成交联结构。

8.  一种包括基底和蛋白质的结构，其中所述基底在表面的至少一部分上具有包含作为交联基团的反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团，所述蛋白质是权利要求1的蛋白质。

9.  一种包括权利要求8的结构的生物传感器。

10.  一种编码权利要求1的蛋白质的核酸。

11.  一种包括权利要求10的核酸的载体。

12.  一种用于检测目标物质的检测试剂盒，其包括用于形成权利要求8的结构的基底和蛋白质。

蛋白质、固定蛋白质的方法、结构、生物传感器、核酸、载体和用于检测目标物质的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种蛋白质，将该蛋白质固定到基底上的方法，包括蛋白质和基底的结构，包括该结构的生物传感器，编码该蛋白质的核酸，包括该核酸的载体，以及用于检测目标物质的试剂盒，包括该基底和该蛋白质。
背景技术
已知核酸和蛋白质代表的生物分子用于构建精确的结构。该精确的结构在原子水平上受到控制以实施生物分子的功能。已经研究了通过利用生物分子的所述性质将生物分子提供到多种材料上。这些技术主要应用于包括生物传感器、生物分子纯化方法、以及近年来生物分子在半导体方法中纳米等级结构形成中的应用等领域。例如，日本专利申请公开No.2005-312446公开了一种能够特异性结合金和可用于金和目的物质(目标物质)结合的金-结合蛋白质。所公开的蛋白质包括具有与金的结合性质的抗体的至少一部分。这种蛋白质具有作为支架的抗体结构并基于抗体的抗原识别能力直接识别金。在日本专利申请公开No.2005-312446中，该蛋白质预期用于利用金基底的生物传感器。而且，在日本专利申请公开No.2005-312446中，该蛋白质通过分子识别而与金固定。因此，赋予被固定的蛋白质以一定的方向，从而均一地固定蛋白质。结果，可期望提高生物传感器的性能。
然而，在日本专利申请公开No.2005-312446中，在抗原-抗体反应中可见的分子识别被用于将蛋白质固定到金基底上。因此，蛋白质被非共价地固定于其上。从而，相当多的被固定的蛋白质可能被解离。结果，生物传感器的应用需要动力学分析。可选择地，当用于生物传感器时，该蛋白质的应用被限制于使用金基底的生物传感器。因此，必须设计一种防止对金基底的非特异性吸附的技术。
同时，此前已经研究了一种通过利用蛋白质的物理吸附或化学交联固定蛋白质到基底上的方法。可选择地，用于检测多种目标物质的生物传感器的生产通常需要被固定的蛋白质的数量与待检测的目标物质的数量相同或更多。因此，需要通过单一方法有效固定这些蛋白质的方法。但是，基本上，被固定的蛋白质在化学上是多样的。这些被固定的蛋白质在官能团的类型和数量以及蛋白质表面上官能团的位置方面都不相同。结果，通常很难利用同样的固定方法将多种蛋白质均一地固定到基底上。
另一方面，Langmuir(2002)18，2463-2467公开了一种通过光交联基团将蛋白质共价固定到基底上的技术。在这种技术中，应用一种具有光交联基团的防止非特异性吸附的聚合体。因此，依赖于蛋白质类型的官能团的不同几乎可以忽略。从而，相对于常规的固定方法，蛋白质可通过这种技术更均一地固定。但是，Langmuir(2002)18，2463-2467仅仅提到根据其类型被固定的蛋白质量的变化减少。Langmuir(2002)18，2463-2467没有提到具有生物传感器需要的蛋白质均一定位的固定。
另一种广泛已知的固定方法包括将一种特定序列(例如，His标记或半胱氨酸残基)导入待固定蛋白质的末端或特定位点以赋予这样修饰的蛋白质提高的定位。但是，由于导入残基的低分子量对基底表面的影响，所述蛋白质修饰可能不利地影响到微生物中某种蛋白质的产率，或可能降低蛋白质的目标物质捕获活性。
日本专利申请公开No.2005-312446中的蛋白质通过分子识别反应被固定在一种金基底上。因此，可获得很好定位的非常均一的固定状态。但是，这种仅仅利用分子识别反应的固定化在获得的结构上是非共价的。因此，蛋白质有一定的可能从基底上解离。因此，日本专利申请公开No.2005-312446提供了均一的固定化，但是没有公开共价固定蛋白质的方法。而且日本专利申请公开No.2005-312446没有公开通过利用分子识别反应将蛋白质固定到金基底之外的基底上的方法。
另一方面，Langmuir(2002)18，2463-2467公开了通过光交联基团的蛋白质共价固定化。根据Langmuir(2002)18，2463-2467的方法，多种蛋白质的官能团的不同基本上可以忽略。从而，某种程度上蛋白质可均一地固定于基底上。但是，Langmuir(2002)18，2463-2467没有公开可赋予蛋白质定位的固定化方法。
同时，从商业上考虑生产方法、成本和多种仪器例如生物传感器或诊断装置的性能，需要通过利用较少量的捕获蛋白质以获得目的功能例如敏感性。也需要减少仪器的生产步骤或生产时间。从而，在短时间内将较少量的对目标物质有高结合活性的蛋白质有效地固定到基底上是重要的。可选择地，所述蛋白质固定技术被用于生产商业上可获得的、装有捕获蛋白质的医疗装置例如生物传感器、诊断药物或诊断装置。在这种情况中，将更精确定位的蛋白质固定于基底上对于再现率和精确度是重要的。因此，需要在微生物中大量生产捕获蛋白质。
本发明的一个目标是扩大提供用于满足捕获蛋白质和蛋白质固定技术的需求的技术的可能性。本发明的另一个目标是提供一种能够通过光照射与基底表面交联的蛋白质。特别地，这种蛋白质可通过基因工程生产在微生物中稳定地生产，并可以以良好的定位共价固定于基底上。
发明内容
本发明提供一种蛋白质，该蛋白质包括至少识别包括由以下通式1表示的反应性苯基重氮甲烷(phenyldiazirine)衍生物的光交联基团的抗体：

(其中R₁代表选自氢原子和可具有取代基的烷基的基团，R₂代表选自氢原子、卤素原子、烷氧基和可被烯化氧取代的烷基的基团)。
本发明的蛋白质可以包括仅仅识别光交联基团的抗体或可以包括识别与其他部分结合的光交联基团的抗体。
抗体的例子包括以如下保藏号保藏的杂交瘤中生产的抗体：FERM P-20855(FERM BP-10762(转为国际保藏))、FERM P-20856(FERM BP-10763(转为国际保藏))、FERM P-20857(FERM BP-10764(转为国际保藏))、FERM BP-10825(开始就是国际保藏)和FERM BP-10826(开始就是国际保藏)。
可选择地，抗体的例子包括如下的抗体，其具有包括下述(a)到(d)中任一的氨基酸序列的互补决定区或与其功能等价的互补决定区：(a)包括序列SEQ ID NOs：1，2和3的氨基酸序列；(b)包括序列SEQ ID NOs：4，5和6的氨基酸序列；(c)包括序列SEQ IDNOs：7，8和9的氨基酸序列；和(d)包括序列SEQ ID NOs：10，11和12的氨基酸序列。
可选择地，抗体的例子包括选自嵌合抗体、互补决定区移植的抗体、单链抗体及其抗体片段的抗体。
本发明还提供了一种能够与目标物质结合的蛋白质，其包括至少一个识别包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的第一区域，和至少一个识别目标物质的第二区域，其中第一区域包括任一上述蛋白质或其部分，被第二区域识别的目标物质与包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团不同。
本发明还提供了一种通过利用蛋白质识别交联基团的能力和交联反应将蛋白质固定到基底上的方法，包括步骤：1)提供一种具有包括作为交联基团的反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的基底表面，2)通过利用蛋白质识别交联基团的能力将上述任一蛋白质与基底表面的交联基团反应，以将蛋白质固定到基底上，和3)反应后或同时用光照射基底以通过利用光交联基团的光交联反应在基底和蛋白质之间形成交联结构。
本发明还提供了一种包括基底和蛋白质的结构，其中基底在其表面的至少一部分上具有作为交联基团的反应性苯基重氮甲烷衍生物，该蛋白质是上述的任一蛋白质。
本发明还提供了一种包括所述结构的生物传感器。
本发明还提供了一种编码上述任一蛋白质的核酸。
本发明还提供了一种包括所述核酸的载体。
本发明还提供一种用于检测目标物质的试剂盒，包括用于形成所述结构的基底和蛋白质。
本发明进一步的特征从下面参考附图对示例性实施方式的描述中得到明显的展示。
附图说明
图1A、1B、1C和1D分别是示例性图示本发明复合蛋白的一个实例的结构构造的示意图。
图2A和2B分别是示例性图示本发明复合蛋白的一个实例的结构构造的示意图。
图3是示例性图示本发明复合蛋白的一个实例的结构构造的示意图。
图4A和4B分别是示例性图示本发明复合蛋白的一个实例的结构构造的示意图。
图5是示例性图示本发明复合蛋白的一个实例的结构构造的示意图。
图6是示例性图示本发明复合蛋白的一个实例的结构构造的示意图。
图7是示例性图示本发明复合蛋白的一个实例的结构构造的示意图。
图8是示例性图示本发明复合蛋白的一个实例的结构构造的示意图。
图9A、9B、9C、9D、9E、9F、9G、9H、9I、9J、9K和9L分别是图示实施例2中获得结果的图，
其中，图9A是1号小鼠/抗血清-4的滴定曲线；
图9B是1号小鼠/抗血清-5的滴定曲线；
图9C是2号小鼠/抗血清-4的滴定曲线；
图9D是2号小鼠/抗血清-5的滴定曲线；
图9E是3号小鼠/抗血清-4的滴定曲线；
图9F是3号小鼠/抗血清-5的滴定曲线；
图9G是4号小鼠/抗血清-4的滴定曲线；
图9H是4号小鼠/抗血清-5的滴定曲线；
图9I是5号小鼠/抗血清-4的滴定曲线；
图9J是5号小鼠/抗血清-5的滴定曲线；
图9K是1-5号小鼠/抗血清-4的滴定曲线；
图9L是1-5号小鼠/抗血清-5的滴定曲线。
图10A、10B、10C、10D、10E和10F分别是图示实施例8中获得结果的图，
其中，图10A是6C9-A5B10单克隆抗体的滴定曲线；
图10B是6H11-F11F4单克隆抗体的滴定曲线；
图10C是6A8-1C6-1B6单克隆抗体的滴定曲线；
图10D是1E2-2H6-1A9单克隆抗体的滴定曲线；
图10E是4G2-1E10-1F10单克隆抗体的滴定曲线；
图10F是3E12-1B6-1A5单克隆抗体的滴定曲线。
图11是图示实施例11中获得结果的图。
图12是示例性图示适用本发明结构的生物传感器的一个实例的结构的图。
具体实施方式
本发明的一种蛋白质包括至少识别包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的抗体。本发明的蛋白质可以是仅仅识别包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的蛋白质，或者可以是识别包括光交联基团(光交联基团及其相邻部分)的位点的蛋白质。前者是一种“包括仅仅识别包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的抗体的蛋白质”。特别的，该蛋白质包括识别其自身的光交联基团的抗体。后者是一种包括“至少识别包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的抗体”的蛋白质。在此情况中，该蛋白质也识别光交联基团之外的部分。
这种识别光交联基团的抗体被用作具有期望功能的蛋白质的至少一部分。更进一步的，该光交联基团在基底表面上提供。结果，通过利用分子识别可以获得蛋白质在基底表面上良好的固定状态。而且，蛋白质的良好的共价固定状态可以通过光照射而获得。
这种在本发明中可利用的识别光交联基团的抗体通过下列保藏在国际专利生物保藏机构产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)的杂交瘤生产，保藏号为FERM P-20855(FERM BP-10762(转为国际保藏))、FERM P-20856(FERM BP-10763(转为国际保藏))、FERM P-20857(FERM BP-10764(转为国际保藏))、FERM BP-10825(开始就是国际保藏)和FERM BP-10826(开始就是国际保藏)：小鼠-小鼠杂交瘤1E2-2H6-1A9(FERMP-20855)：保藏日2006年3月29日、(FERM BP-10762)：于2007年1月19日转为国际保藏；小鼠-小鼠杂交瘤6A8-1C6-1B6(FERM P-20856)：保藏日2006年3月29日，(FERM BP-10763)：于2007年1月19日转为国际保藏；小鼠-小鼠杂交瘤6C9-A5B10(FERM P-20857)：保藏日2006年3月29日，(FERM BP-10764)：于2007年1月19日转为国际保藏；小鼠-小鼠杂交瘤4G2-1E10-1F10(FERM BP-10825)：保藏日2007年5月10日；小鼠-小鼠杂交瘤6H11-F11F4(FERM BP-10826)：保藏日2007年5月10日。
这种抗体的进一步的例子可以包括如下抗体，该抗体具有包括下列(a)到(d)的任一氨基酸序列的互补决定区或与之功能等价的互补决定区：(a)包括SEQ ID NO：1，2和3的序列的氨基酸序列；(b)包括SEQ ID NO：4，5和6的序列的氨基酸序列；(c)包括SEQ IDNO：7，8和9的序列的氨基酸序列；和(d)包括SEQ ID NO：10，11和12的序列的氨基酸序列。
在上下文中，“功能等价的互补决定区”指甚至当通过氨基酸缺失、取代或插入的修饰之后，仍然保持识别光交联基团的能力的氨基酸序列。其例子包括通过缺失、取代或插入一个或几个氨基酸而被修饰并保持识别光交联基团的能力的氨基酸序列。
这样的抗体可以具有选自嵌合抗体、互补决定区移植的抗体、单链抗体及其抗体片段的任何形式。
这样的抗体可被用于获得能够结合目标物质的蛋白质。特别的，所述蛋白质包括下列结构：(1)至少一个识别包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的第一区域，(2)至少一个识别不同于第一区域所识别的物质的第二区域，(3)其中所述第一区域包括蛋白质，该蛋白质包括所述抗体或其部分。
被第二区域识别的目标物质根据适合该结构应用的蛋白质的期望功能而变化。例如，目标物质是一种在生物传感器中待检测的物质，或是一种在分离程序中待分离的物质。所述第二区域可以在两个或更多位置提供。在此情况中，所述两个或多个不同的第二区域可以识别两个或更多不同的目标物质。
本发明进一步提供一种固定蛋白质的方法，所述蛋白质包括一种至少识别光交联基团的抗体，或者所述蛋白质可以通过利用蛋白质识别光交联基团的能力和交联反应而结合目标物质。所述固定方法包括以下步骤：1)提供一种以反应性苯基重氮甲烷衍生物为交联基团的基底表面，2)通过利用蛋白质识别交联基团的能力，使包括至少识别包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的光交联基团的抗体的蛋白质与基底表面上的交联基团反应，以将蛋白质固定在基底上，3)在反应同时或之后用光照射基底，以通过利用光交联基团的光交联反应在基底与蛋白质之间形成交联结构。
包括至少识别光交联基团的抗体的蛋白质或可结合目标物质的蛋白质可以被固定在基底上以获得一种结构，该结构能够预期用于多种领域，例如生物传感器和生物分子纯化方法。具有生物传感器作用的酶或用于捕获待检测基底的蛋白质被用作构建这一结构的蛋白质。在此情况中，这种结构可以用作生物传感器的传感器部分。而且，至少用于形成这一结构的蛋白质和基底可以用于构建检测待测目标物质的试剂盒。
另一方面，编码包括至少识别光交联基团的抗体的蛋白质或者可以结合目标物质的蛋白质的核酸被导入载体，并在宿主细胞例如微生物中表达。结果，可以稳定地生产所述蛋白质。
本发明的能够识别光交联基团的蛋白质具有光交联基团结合位点和结构部分。结果，与这种结构部分连接的目标物质结合位点向基底表面上的固定对目标物质结合位点的原始功能没有影响或有非常小的影响。目标物质结合位点和基底由于存在所述结构部分而保持一定的距离。因此，目标物质结合位点并不与对其功能有影响的基底发生反应。结果，所述蛋白质可以保持捕获目标物质的较强能力。
当本发明的具有识别光交联基团的能力的蛋白质被应用于生物传感器中时，测定方法基本上没有限制。任何测定方法都是适用的。因此，任何方法都可以没有具体限制地使用，只要所述结构可以在使用光交联基团的情况下保持固定状态。特别地，本发明的具有识别光交联基团的能力的蛋白质可以通过光照射与基底表面交联从而得到固定。所述蛋白质，当被使用在生物传感器中时，可以被共价固定，并非常稳定且均一地定位，从而提高生物传感器的精确性。
图12图示了本发明的结构适用的生物传感器的一个实例的构造。首先，在该生物传感器的基底上提供一个包括能够防止非特异性吸附的蛋白质的非特异性吸附防止层。利用在这种非特异性吸附防止层的表面上提供的光交联基团将具有目标物质捕获功能的光交联基团识别复合蛋白固定。基于被这种光交联基团识别复合蛋白捕获的目标物质的存在或不存在，感测目标物质。
此外，具有识别光交联基团的能力并且进一步具有识别目标物质的能力，也就是，进一步具有与本发明所述目标物质特异性结合特性(下文称为光交联基团识别复合蛋白)的蛋白质，可以被应用于形成至少包括下列因素(i)-(iii)的多层体：(i)至少在表面的一部分上具有光交联基团的基底；(ii)本发明的光交联基团识别复合蛋白；和(iii)可以被本发明的光交联基团识别复合蛋白结合的目标物质。
也可以使用识别两个或更多个不同目标物质的光交联基团识别复合蛋白。在此情况中，光交联基团识别复合蛋白可以有至少一种具有空间稳定化β-折叠作为光交联基团识别位点的免疫球蛋白结构。结果，在基底和目标物质结合位点之间可以保持空间位置。特别地，光交联基团识别复合蛋白的目标物质结合位点不与包括光交联基团的基底进行某种反应，并可以保持结合目标物质的能力。这也允许形成一种非常薄的、精确定位的多层结构。利用这种光交联基团识别复合蛋白的特性可以构建出一种检测装置。例如，可以通过在薄的金膜上提供至少具有光交联基团的分子层，并进一步向上面提供可以结合一种或更多种所需目标物质的光交联基团识别复合蛋白，生产出感测所需目标物质的感应装置。在此情况中，可以使用光学单元，例如利用表面等离子体共振的单元，作为检测光交联基团识别复合蛋白捕获的目标物质的方法。
当本发明的具有识别光交联基团的能力的蛋白质被固定在基底上时，可以通过改变光照射量和照射时间在很短时间内将蛋白质的固定量控制在所需的水平上。可以预期，这种方法在商业上具有优点，例如减少生物传感器的生产步骤，减少使用的蛋白质量。
在下文中，更详细地描述本发明的具有识别光交联基团的能力的蛋白质、利用这种蛋白质的结构、以及它们在检测目标物质中的用途。
(1)具有识别光交联基团的能力的蛋白质
·光交联基团
本发明的具有识别光交联基团的能力的蛋白质包括至少识别光交联基团的抗-光交联基团抗体。被这种抗体识别的光交联基团是设置在基底的预定位点而没有功能损失的反应性苯基重氮甲烷衍生物。这种反应性苯基重氮甲烷衍生物由下述通式1所表示：
式1

(其中R₁代表选自氢原子和可具有取代基的烷基的基团，R₂代表选自氢原子、卤素原子、烷氧基和可被烯化氧取代的烷基的基团)。
R₁选自氢原子和可被取代的烷基。R₁的烷基的取代基可以是吸电子基团，例如氟原子，特别是三氟甲基。
R₂选自氢原子、卤素原子、烷氧基和可被烯化氧取代的烷基。R₂可代表选自氢原子和烷氧基的基团。这种烷氧基可具有1到3个碳原子。可被烯化氧取代的烷基可以由通式-(C_mH_2mO)_n-(CH₂)_o-R₄代表，其中m代表2或3的整数，n代表1到6之间的任何整数，o代表1到4之间的任何整数，R₄代表选自氢原子、羧基、氨基和羟基的基团，并可以代表氢原子。例如，为了稳定被固定的蛋白质，可以使用聚乙二醇链作为烯化氧。可替代的，R₂可以采取相对于-CN₂R₁的间位。化合物重氮甲烷可以具有多个相同或不同的R₂部分，只要光交联基团识别蛋白质可以识别该化合物即可。这些多个R₂部分也可以采用相对于-CN₂R₁的间位。
包括反应性苯基重氮甲烷衍生物的基团，当提供到基底表面上时，具有如下述通式2所示的结构：
式2

R₃代表将光交联基团保持并固定到基底上的官能团。R₃可以是任何可与保持在基底表面上的官能团反应的基团，选自，例如，羧基、甲酰基、活性酯基、羟基、硫醇、硫化物、氨基、卤素取代的烷基、三烷氧基甲硅烷基及具有其取代基的基团。R₃的位置可以在-CN₂R₁的对位。
为了防止目标物质向基底上的非特异性吸附，制备了具有防止非特异性吸附的功能的蛋白质与提供光交联基团的化合物的偶联物。这种偶联物可以作为一种具有光交联基团的分子使用。例如，可以用BSA(牛血清白蛋白)或酪蛋白制备一种偶联物。在此情形下，光交联基团可以通过R₃与例如BSA或酪蛋白的蛋白质相连。这些偶联物可以用于同时防止向基底表面预定位点上的非特异性吸附，以及将捕获蛋白质固定在基底上，例如，在生物传感器中。可替代地，可以制备在免疫步骤中用于产生抗-光交联基团抗体的蛋白质和载体蛋白质例如OVA(卵白蛋白)或KLH(匙孔血蓝蛋白)的偶联物。只要具有识别所述蛋白质的光交联基团的能力，可以使用任何具有光交联基团的分子。
光交联通过大约350nm的UV照射而实现。通过本发明的光交联进行的蛋白质的定向固定可被质谱法例如TOF质谱证实。特别地，本发明的蛋白质通过分子识别来识别光交联基团，并通过光照射进一步交联。因此，特定区域的光交联可通过使用适当的蛋白酶处理本发明的结构并将降解产物进行质谱分析而证实。
分子识别
本发明的蛋白质至少具有识别光交联基团的分子识别能力。分子识别包括作为生物分子反应的抗原-抗体反应。其偶联物的解离常数K_D可以是10^-4M或更小。当K_D为10^-4M或更小时，被非特异性吸附的蛋白质的吸附行为可以与分子识别充分地区分开来，例如，通过生物分子相互作用检测装置，如热量测定仪、SPR或QCM。从减少蛋白质固定的操作时间的观点来看，解离常数K_D可以是10^-6M或更小。
·抗体
本发明中使用的抗-光交联基团抗体可以使用完整的抗-光交联基团抗体或包括交联基团识别位点的部分而形成。所述抗-光交联基团抗体用于结合光交联基团(或其衍生物)或至少包括光交联基团(或其衍生物)的位点。这样的能被使用的抗体可以是由任一脊椎动物的淋巴细胞产生的抗体，或可以是在氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或几个氨基酸并保持原始抗体的结构和功能的抗体(变异抗体)。在特征(免疫学或物理学)分类中，抗体被分为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。本发明中使用的抗体可以属于任一类。而且，这些抗体可以形成多聚体。例如，IgG和IgM分别形成二聚体和五聚体。只要这些形式可以结合光交联基团，则都可以无问题地应用。当在体外应用时，抗体不限于哺乳动物抗体，也可以是IgW或IgY。
本发明的抗体特别包括“嵌合”抗体。嵌合抗体具有衍生自特定物种或特定抗体类别或亚类的重链(H)和/或轻链(L)的部分，链的其余部分衍生自其他物种或其他抗体类别或亚类。本发明的抗体进一步包括上述的变异抗体和抗体片段。这些抗体已经公开于美国专利4816567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984)中。
在本发明中，“变异抗体”指具有一个或多个修饰的氨基酸残基的抗体的氨基酸序列变体。例如，抗体的可变区可以进行修饰以增强结合光交联基团的能力。这样的修饰可以通过诸如位点特异性诱变、PCR诱变和盒式诱变等方法而实现进行。这样的变体与抗体的重链或轻链可变区的氨基酸序列具有至少70％的同一性，并可以具有90％的同一性，特别地，至少95％的同一性。此处的序列同一性定义为经过为了获得最高序列同一性而适当进行序列排列并适当引入空位之后，与原始抗体的氨基酸序列中的残基相同的残基的百分比。
与本发明抗体的互补决定区(CDR)功能等价的互补决定区指具有类似于本发明抗体的CDR氨基酸序列的氨基酸序列并通过分子识别至少结合光交联基团的互补决定区。CDR区域存在于抗体的可变区中，决定抗原结合特异性。每条H和L链上都存在三个CDR，从N端依次命名为CDR1、CDR2和CDR3。在四个区域之间的CDR具有高度保守的氨基酸序列。这四个区域被称为框架区。这些CDR可以被移植到其他抗体上。可以将CDR与一种期望的抗体的框架区组合以获得重组抗体。可选择地，一个或几个CDR氨基酸可以在维持抗原结合特性的条件下被修饰。例如，一个或几个CDR氨基酸可以被取代、缺失和/或添加。
为了通过氨基酸残基取代来诱导变异，期望将氨基酸残基取代为其中氨基酸侧链的性质被保持的另外的氨基酸。例如，氨基酸侧链的性质可以分为下列几组：(1)疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y和V)；(2)亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S和T)；(3)具有脂肪族侧链的氨基酸(G，A，V，L，I和P)；(4)具有含羟基侧链的氨基酸(S，T和Y)；(5)具有含硫原子侧链的氨基酸(C和M)；(6)具有含羧酸和酰氨基的侧链的氨基酸(D，N，E和Q)；(7)具有含碱的侧链的氨基酸(R，K和H)；(8)具有含芳香基的侧链的氨基酸(H，F，Y和W)。
在每一组内进行的氨基酸取代被认为是保守取代。已经知道具有通过缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基和/或用其他氨基酸取代而修饰的某种氨基酸序列的多肽保持其生物活性。这一点已经公开于Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666中。改变的氨基酸的数目没有特别限制。一般而言，在每个CDR中40％或更少的氨基酸被改变。可选择地，35％或更少的氨基酸，特别是30％或更少的氨基酸可以被改变。氨基酸序列同一性可以如上所述确定。
具体来说，核苷酸序列和氨基酸序列同一性可以通过Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993)来确定。基于这种算法，已经发展出了被称为BLASTN和BLASTX的程序。这一点已经公开于Altschul等人J.Mol.Biol.215：403-410，1990。本领域公知这些分析方法的具体步骤。在这点上，可以参考NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
嵌合抗体、互补决定区(CDR)-移植的抗体和抗体片段
在本发明中，为了展示多种抗体分子，可以使用人工修饰的、基因重组的抗体，例如，嵌合抗体和人源化抗体。这些修饰抗体可以使用已知方法生产。嵌合抗体的例子包括具有不同物种的可变区和恒定区的抗体。具体的例子包括将小鼠抗体的重链和轻链可变区导入人抗体的重链和轻链恒定区的抗体。为获得这样的抗体，将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接。然后将这种连接产物导入表达载体中。该载体可以导入宿主中以生产抗体。
人源化抗体可以是，例如，用人抗体的互补决定区(CDR)取代非人抗体例如小鼠抗体的重链或轻链CDR的抗体。一种普通的基因重组方法已经为人所知(例如，Jones等人，Nature 321：522-525(1986))。具体来说，设计一种DNA序列将小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区(FR)连接。这种DNA序列由产生的几种寡核苷酸通过PCR方法合成，其具有末端重叠部分。所获得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接。然后将该连接产物导入表达载体中。将该载体导入宿主中以生产抗体。选择通过CDR连接的人抗体的FR，使得互补决定区形成满意的抗原结合位点。人源化抗体可以包含在导入接受抗体的CDR和框架区中都没有的氨基酸残基。所述氨基酸残基的导入通常是为了更精确地优化抗体识别/结合抗原的能力。例如，如果需要，重构的人抗体的可变区中框架区的氨基酸可以以一种方式被取代，使该抗体的互补决定区形成适当的抗原结合位点(Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
可选择地，本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合位点的抗体片段或其修饰的片段。所述“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是包括抗原结合区域或抗体可变区的片段。本发明所述的抗体片段表示单克隆抗体的部分区域。具体的例子包括F(ab′)2、Fab′、Fab、Fd、Fv(抗体可变片段)、scFv(单链Fv)、dsFv(二硫键稳定的Fv)和包括一个重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的单域抗体(dAb)。
·抗-光交联基团抗体的获得
本发明的具有识别光交联基团能力的抗体(抗-光交联基团抗体)可以通过适当选自常规抗血清制备技术和利用细胞融合的单克隆抗体制备技术的方法获得。例如，可制备具有待结合的光交联基团的半抗原，因为光交联基团是一种低分子量化合物。半抗原与载体蛋白质KLH(匙孔血蓝蛋白)结合以制备免疫原。利用这种免疫原免疫合适的免疫动物。当证实抗体滴度上升时，可以从血清中收集抗体。免疫可以如下进行：将作为免疫原的光交联基团-载体蛋白质偶联物在适当的溶剂(例如，盐水)中稀释至适当的浓度，并通过静脉内或腹膜内将该溶液导入免疫动物。此外，如果需要，也可以使用并施用弗氏完全佐剂。在一个普通方法中，对动物的施用以1到2周的间隔大约进行3到4次。被免疫的动物在最后免疫后的第三天解剖。从切下的脾中获取脾细胞以用作免疫细胞。本发明的光交联基团会在UV照射下(350nm)失活。因此，可以预期所述方法直到免疫为止应该在黑暗的房间中进行。
所获得的抗体可以是多克隆抗体。然而，当获得单克隆抗体时，可以选择对于光交联基团特异性更好的克隆。单克隆抗体可以通过克隆单克隆抗体生产细胞而获得。通常，免疫球蛋白生产细胞例如从免疫动物中收集的脾细胞可与癌细胞融合以形成杂交瘤(Gulfre G.，Nature 266.550-552，1977)。癌细胞的例子包括：小鼠来源的骨髓瘤细胞P3/X63-AG8.653(ATCC No.CRL-1580)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/O，Sp2)、NS0、PAI、F0和BW5147；大鼠来源的骨髓瘤细胞210RCY3-Ag.2.3.；和人源骨髓瘤细胞U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11和CEM-T15。
单克隆抗体生产细胞可以通过如下方法筛选：在滴定板中培养细胞，并测定在孔中具有可见生长的培养上清液与光交联基团的反应。在这种测定中，例如，可以利用酶免疫测定法(例如，RIA(放射免疫测定法)或ELISA(酶联免疫吸附测定))和免疫沉淀法。利用表面等离子体共振(SPR)装置也可以定量检测与光交联基团的结合性质。在利用SPR装置的检测中，可以通过物理吸附或化学交联将辅助蛋白质直接固定在传感器的金表面上，从而实现检测。
·抗体片段
本发明描述的抗体片段表示单克隆抗体的部分区域。具体的例子包括F(ab′)2、Fab′、Fab、Fd、Fv(抗体可变片段)、scFv(单链Fv)、dsFv(二硫键稳定的Fv)和包括一个重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的单域抗体(dAb)。
在上下文中，″F(ab′)2″和″Fab′″片段表示通过在铰链区的重(H)链间二硫键的上游或下游位置消化抗体而获得的抗体片段。这种抗体片段可以通过使用蛋白酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理抗体而获得。例如，用木瓜蛋白酶处理在铰链区的重链间二硫键的上游位置处切割IgG。结果，获得了两个同源片段，其中包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)的轻链(L链)片段和包括重链可变区(HL)和重链恒定区1(CH1)的重链(H链)片段通过C末端区的二硫键连接在一起。这两个同源片段分别被称为Fab′。此外，用胃蛋白酶处理在铰链区的重链间二硫键的下游位置处切割IgG。结果，可获得通过铰链区连接的略大于两个Fab′片段的抗体片段。这种抗体片段被称为F(ab′)2。
因此，本发明的光交联基团识别抗体可以是Fab′或F(ab′)2片段。可选择地，本发明的抗体可以是包括彼此连接的VH和CH1域的Fd片段。
此外，本发明的抗体可以是Fv(抗体可变片段)或其一部分。例如，本发明的抗体可以是构成Fv或其一部分的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。另一方面，也可利用单链Fv(scFv)，该单链Fv是通过肽连接的VH和VL的复合体，该肽包括源于这些区域之一的羧基端和其他区域的氨基端的几个氨基酸。可以预期包括一个或多个氨基酸的连接体应该在VH和VL之间(没有特定顺序)提供以形成scFv片段。而且，为了避免阻止VH或VL与抗原结合所需要的结构形成的结合力，氨基酸连接体的残基长度的设计是重要的。作为一个具体的例子，氨基酸连接体通常是5到18个残基长度。最经常使用并研究的是具有15个残基的氨基酸连接体。这些片段可通过基因工程方法获得。
此外，本发明的抗体可以是VH或VL单域抗体(dAb)。通常，单域结构经常是不稳定的。因此，所述抗体片段可以通过化学修饰例如PEG修饰而被稳定化。可选择地，本发明的抗体可以是骆驼重链抗体可变区VHH(J.Mol.Biol，311：p 123，2001)或护士鲨(Nurseshark)免疫球蛋白质样分子可变区IgNAR。已知这些重链抗体在体内存在并且起作用。而且，如图1到4所示，包括重链和轻链的抗体分子(典型地来源于人或小鼠)的VH或VL区被作为每个单独结构域而使用。在此情形下，可以相对于重链抗体的相应部分向(例如)VH-VL界面中引入变异，以提高稳定性。
光交联基团识别位点可以包括至少选自下组之一：(1)抗体重链可变区(VH)，及其变体和其部分，(2)抗体轻链可变区(VL)，及其变体和其部分。可使用的抗体重链可变区(VH)中的一组互补决定区的例子可以包括选自氨基酸组SEQ ID NO：1到3和SEQ ID NO：4到6的蛋白质。可使用的抗体轻链可变区(VL)中的一组互补决定区的例子可以包括选自氨基酸组SEQ ID NO：7到9和SEQ ID NO：10到12的蛋白质。这些序列如下所示。
PM1-VH CDR
SEQ ID NO：1(H链CDR1)
S H N M L
SEQ ID NO：2(H链CDR2)
G I Y P G D G D T S Y N Q N F K G
SEQ ID NO：3(H链CDR3)
W D L L C F D Y
PM2-VH CDR
SEQ ID NO：4(H链CDR1)
S Y W M H
SEQ ID NO：5(H链CDR2)
Y I N P S T G Y T E Y N Q K F
SEQ ID NO：6(H链CDR3)
N G N G Y
PM1-VL CDR
SEQ ID NO：7(L链CDR1)
R A S S S I S Y M H
SEQ ID NO：8(L链CDR2)
A S Q S I S
SEQ ID NO：9(L链CDR3)
Q Q W S N S P P Y T
PM2-VL CDR
SEQ ID NO：10(L链CDR1)
T A S Q S I S Y V V
SEQ ID NO：11(L链CDR2)
S A S N L A S
SEQ ID NO：12(L链CDR3)
G Q G Y S P L T
可以同样地使用包括一个或多个来源于氨基酸序列SEQ ID NO：1到12并缺失、取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列而且具有结合光交联基团的性质的抗体片段，只要该抗体片段与之功能等价。
包括氨基酸序列的CDR区可以被插入到框架区(FR)之间以获得目的V或L链。SEQ ID NO：13到16(氨基酸序列)和SEQ IDNO：21到24(DNA序列)分别代表包括设置在FR之间的CDR区的序列的一个例子。氨基酸序列SEQ ID NO：13的31到35位代表包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的H链CDR1。在下文中，氨基酸序列SEQ ID NO：13也包括含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的H链CDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO：3的H链CDR3。此外，氨基酸序列SEQ ID NO：14到16包括含有SEQ ID NO：4到12中的每个氨基酸序列的CDR区。框架区没有特别的限制，只要可以获得目的抗体功能即可。框架区可以按照目的从本领域已知的多种框架中选择，并与CDR区组合。
·光交联基团识别抗体片段的获得
·利用酶处理法获得
抗体也可以使用某种酶处理，以获得具有抗体的抗原结合位点和一定程度上具有该抗体结合抗原的能力的抗体片段。例如，可使用木瓜蛋白酶处理获得的抗体以获得Fab片段或其类似物。可选择地，可使用胃蛋白酶处理抗体以获得F(ab′)2片段或其类似物。除了酶法，抗体片段也可通过化学降解法制备。任何具有结合光交联基团的能力的抗体片段都可以毫无问题地使用。
本发明的Fab′、Fv和VH或VL dAb片段可以通过基因工程方法获得。例如，制备VH或VL区的基因文库。这些基因被广泛地表达为蛋白质。在这种方法中，根据其基因选择具有结合光交联基团或目标物质的性质的蛋白质。所述基因文库可从，例如，脐带血、扁桃腺、骨髓、外周血细胞或脾细胞中获得。例如，从人外周血细胞中提取mRNA，由该mRNA合成cDNA。接下来，利用人VH-或VL-编码序列作为探针制备人VH或VL的cDNA文库。例如，本领域已知能够广泛地扩增人VH家族中的每一个(VH1到VH7)的引物或能够扩增人VL的引物。使用对每种VH和VL适当组合的这些引物进行RT-PCR以获得编码VH和VL的基因。可选择地，可使用噬菌体展示技术。在所述噬菌体展示技术中，编码VH、VL或包括这些区域的复合体(如Fab或scFv)的基因文库与编码噬菌体外壳蛋白的基因结合以制备一种噬菌粒文库。用该噬菌粒文库转化大肠杆菌。这些基因表达为具有作为外壳蛋白的一部分的多种VH或VL区域的噬菌体。可以利用所述噬菌体通过上述相同方法选择具有与光交联基团或目标物质结合性质的物质。编码在噬菌体上展示为融合蛋白的VH或VL的基因由噬菌体中的噬菌粒编码，因此可以通过DNA测序而鉴定。
·用于选择文库的具有光交联基团的待结合物质
用于通过淘选(panning)选择抗-光交联基团抗体片段的待结合物质可以根据用途选自至少在表面的一部分具有光交联基团的物质。为了通过淘选选择抗-光交联基团抗体片段，更期望仅仅只有光交联基团存在于待结合物质的表面上。这是因为要防止被吸附到光交联基团之外的物质之上的蛋白质的污染。表面之外的内核基底的材料根据用途可以选自许多已知的材料。待结合物质可以具有任何表面，只要包括光交联基团的分子可以直接或间接地固定到该表面上即可。待结合物质可以进行处理以抑制非特异性吸附。而且，淘选选择应该尽可能在黑暗的房间中或在围绕着过滤紫外线的黄色幕布的地方进行。这是为了防止本发明的光交联基团失活。
本发明也包括一种编码光交联基团识别抗体的核酸。本发明进一步包括一种包括作为基因载体的核酸的构建体。使用这种用于表达光交联基团识别抗体的构建体转化宿主细胞(例如，通常所知的用于蛋白质表达的大肠杆菌、酵母、小鼠、或人来源的细胞)。结果，光交联基团识别抗体可从这些宿主细胞中表达。可被单个表达载体表达的本发明的光交联基团识别抗体可以根据设计选自完整抗体分子和其抗体片段(F(ab′)2、Fab、Fv(scFv)、VH和VL)及其复合体。当一个表达载体编码多个抗体片段时，这些抗体片段可以各自作为独立的肽链表达。可选择地，可以构建一种载体以表达作为一条肽链的抗体片段，该肽链包括连续结合的或通过氨基酸结合的结构域。
为了构建表达本发明的光交联基团识别抗体的载体，可根据选择的宿主细胞，通过整合转基因表达所必需的结构，如启动子，以设计并构建所述载体。可以根据选择的宿主细胞参照诸如已知启动子等结构来构建载体结构。可选择地，当大肠杆菌用作宿主细胞时，作为外源基因产物而获得的本发明的光交联基团识别抗体或其构建体会直接被移入细胞质外。这会减少蛋白质酶带来的降解。现已知道即使该外源基因产物对于细菌细胞是有毒的，将外源基因产物分泌到细胞外也可以减低这种影响。大多数已知的通过细胞质膜或内膜分泌的蛋白质通常在其前体的N端具有信号肽。其前体在分泌过程中经历了信号肽酶切除信号肽的过程，成为成熟蛋白质。大多数信号肽具有碱性氨基酸、疏水性氨基酸，和位于N端的信号肽酶切割位点。
编码公知信号肽(典型的，pelB)的核酸可以设置在编码本发明的光交联基团识别抗体的核酸的5’端，以分泌并表达光交联基团识别抗体。
可选择地，包括本发明的光交联基团识别抗体(包括多个抗体片段)的多个多肽链可以各自独立地插入一个载体中。在此情况中，编码pelB的核酸可以设置在编码每个结构域或多肽链的核酸的5’端，以促进分泌。为表达包括一个或多个结构域的多肽链，编码pelB的核酸可以用同样的方法设置在多肽链的5’端以促进分泌。在N端融合了信号肽的本发明的光交联基团识别抗体可以从周质部分或培养基上清液中纯化。
获得的抗体可以均匀地纯化。可以采用常用于蛋白质的分离纯化方法进行抗体的分离纯化。例如，可以选择层析柱、过滤器、超滤、盐析、透析、用于制备的聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦，并适当组合以分离并纯化抗体。层析法的例子包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析。这些层析技术可以用于液相层析，例如HPLC或FPLC。
当光交联基团识别抗体作为完整的抗体获得并纯化时，亲和纯化柱的例子包括蛋白A和蛋白G柱。
考虑到方便的抗体片段表达和纯化方法，可以通过基因工程方法将亲和纯化标记设置于多肽链的N或C端以形成多种抗体片段。用于纯化的标记的例子包括含有六个连续组氨酸残基的组氨酸标记(下文称为His x 6)以及谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽结合位点。标记导入方法的例子包括：包括将编码纯化标记的核酸导入表达载体中编码光交联基团识别抗体的核酸的5’或3’端的方法，以及使用用于导入纯化标记的商业上可获得的载体的方法。
可选择地，可利用与抗原的结合活性使用固定有抗原的载体纯化抗体。
在下文中，将描述一种使用表达载体生产本发明的光交联基团识别抗体的方法。本发明的光交联基团识别抗体或作为其组分的多肽链可以通过用根据宿主细胞设计的表达光交联基团识别抗体的载体转化一种公知用于蛋白质表达的宿主细胞而生产。特别地，光交联基团识别抗体或作为其组分的多肽链通过宿主细胞中的蛋白质合成系统在宿主细胞中合成。然后，从细胞内部或细胞培养上清液中纯化在宿主细胞的内部或外部积累或分泌的目的蛋白质。纯化的蛋白质在目的应用中是有用的。例如，当利用大肠杆菌作为宿主细胞时，编码公知的信号肽(典型的，pelB)的核酸定位于编码本发明的光交联基团识别抗体的核酸的5’端。由此表达的蛋白质具有容易分泌并表达到细胞质外的形式。
当组成本发明的光交联基团识别抗体的多个多肽链被一个表达载体表达时，可将编码pelB的核酸设置在编码每个多肽链的核酸的5’端。在表达中可以促进蛋白质分泌到细胞质外部。在N端融合了信号肽的光交联基团识别抗体可从周质部分或培养基上清液中纯化。融合了作为纯化标记的His标记和GST的抗体可分别通过使用镍螯合柱和谷胱甘肽固定柱的纯化方法来纯化。
在细菌细胞内表达的光交联基团识别抗体可以作为不溶性颗粒而获得。在此情况中，通过弗氏压碎器或超声处理破碎从培养物溶液中获得的细菌细胞。不溶性颗粒可以从细胞匀浆中离心获得。获得的不溶性颗粒部分在包括公知的含有尿素和盐酸胍的变性剂的缓冲液中溶解。然后，溶解的部分可在变性条件下以上述同样的方法进行柱纯化。获得的柱洗脱级分可以进行再折叠过程以除去变性剂并重建活性结构。重折叠方法可从公知方法中适当地选择使用。特别地，例如，可以根据目的蛋白质使用分步透析或稀释方法。
本发明的光交联基团识别抗体的多个结构域或多肽链可在同一个宿主细胞中表达或在不同的宿主细胞中分开表达，组装然后由此转化为形成的复合体。
此外，可以利用细胞提取物，由编码本发明的光交联基团识别抗体的载体在体外表达蛋白质。可以使用的细胞提取物的例子包括大肠杆菌、麦胚和兔网织红细胞。然而，利用无细胞提取物的蛋白质合成通常在还原条件下进行。因此，可以进行在抗体中形成二硫键的某些处理方法。
·抗体片段蛋白质的表达
编码光交联基团识别抗体的DNA使用期望的限制性内切酶酶切，例如，对于上面的例子使用NcoI/NheI，以获得编码光交联基团识别抗体的DNA片段。这种DNA可以导入本领域公知用于在宿主细胞中表达蛋白质的质粒中以获得抗体片段。例如，目的抗体片段可以从大肠杆菌胞外表达的或周质部分中收集。在此情况中，可以将公知的信号肽导入编码抗体片段的基因的上游。信号肽的例子包括pelB。可选择地，用于纯化的公知的标记可以与易于在表达后将目的蛋白质从培养上清液或细菌细胞提取物中纯化的基因融合。特别地，六组氨酸残基(His x 6)或谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽结合位点可以被导入基因中以形成融合蛋白。这种具有His标记的融合蛋白可以通过金属(例如，镍)螯合柱轻易地纯化。具有GST标记的融合蛋白可以通过包括固定有谷胱甘肽的载体(例如，Sepharose)的柱而纯化。
可选择地，当在细菌细胞中表达的目的蛋白质不能以不溶性颗粒的形式获得时，蛋白质可以用包含尿素和盐酸胍的公知的缓冲液溶解，然后进行重折叠。重折叠方法可从公知方法中适当地选择使用。特别地，例如，可根据目的蛋白质使用分步透析或稀释方法。
甚至对这样获得的抗体、其片段(例如，Fab、(Fab′)2、Fd、VH或VL)或其复合体进行删除、取代或缺失一个或几个氨基酸而产生的氨基酸序列也包括在本发明的范围中，只要该氨基酸序列表现出对光交联基团的结合性质。
·基底和结构
结构可以由抗光交联基团抗体和具有至少形成表面的一部分的光交联基团的基底获得。所述结构可应用于多种用途。至少在表面的一部分上具有光交联基团的基底可以由任何材料制成并可以具有任何形式，只要基底可以形成本发明的结构即可。光交联基团可通过利用本领域所知的反应在基底上形成。该反应的例子包括玻璃表面与硅烷偶联剂的反应，塑料表面上的官能团与具有活性卤化物的反应，纤维素树脂与异氰酸盐的反应，以及物理吸附。例如，预先在基底表面上导入的基团的反应可以根据基底的类型选自亲核基团(例如，氨基和羟基基团)与吸电子基团(例如，羧基、酯、异氰酸盐和硫氰酸盐基团、共轭酮、丙烯酸酯、乙烯砜、酸酐、卤化酰基、卤化磺酰基)的组合，利用生命反应的组合(生物素-抗生物素蛋白和底物-酶)，以及金和硫醇的组合。可选择地，进行反应的材料可以设置在基底的一部分之中。例如，可通过使用压模或制图实施这样的设置。基底可以用任何材料制成，只要基底可以形成本发明的结构即可。这样的材料包括选自金属、金属氧化物、无机半导体、有机半导体、玻璃、陶瓷、天然聚合物、合成聚合物、塑料中的任意一种或几种，或者包括其复合物。本发明使用的基底可以具有任何形状，只要基底可以形成本发明的结构即可。这样的形状包括选自盘样、颗粒样、多孔、突出、纤维、圆柱、网孔样形状中的任意一种或多种形状。
可用于本发明的基底材料和由其制成的基底在日本专利申请公开2005-312446中举例说明。具体来说，可使用的基底材料是选自金属、金属氧化物、无机半导体、有机半导体、玻璃、陶瓷、天然聚合物、合成聚合物、塑料中的任意一种或几种，或是其复合物。基底形状的例子包括选自盘样、颗粒样、多孔、突出、纤维、圆柱、网孔样形状中的一种或多种。当然，基底材料和形状并不限于这些材料和形状。本发明的基底可以具有根据其用途不同选择的尺寸。
·用于检测目标物质的试剂盒
本发明的具有结合目标物质性质的抗-光交联基团抗体的结构可用于获得用于检测目标物质的试剂盒。例如，用于检测目标物质的试剂盒可以包括：用于形成结构的基底和抗-光交联基团抗体；用于检测目标物质与该结构的结合的检测单元。通过光照射交联将抗-光交联基团抗体固定到基底上的方法将在后文进行描述。在所述试剂盒中的抗-光交联基团抗体可以用作，例如，展示结合多种抗体的糖链的形式。特别地，目标物质可作为抗体的糖链结合物质。目标物质可通过利用物理或化学方法检测目标物质和抗体之间的结合的形成而被检测。目标物质和抗-光交联基团抗体之间的结合可通过测定物理量的变化例如光、电或热的变化来检测。
具有结合目标物质(特别是抗原)性质的构造的可被使用的例子包括随后描述的用作光交联基团识别复合蛋白的构造。
·表面等离子体共振装置和石英晶体微天平装置
目标物质与具有识别光交联基团能力的蛋白质的结合可以通过(例如)公知的表面等离子体共振(SPR)测量装置或石英晶体微天平(QCM)来定量检测。通常，等离子体共振是这样一种方法，它根据金薄膜上的自由电子和从玻璃侧以不大于总反射角的入射角入射的入射光在玻璃-金界面上产生的隐失波之间的共振而产生的共振角改变，来检测设置在玻璃基底上的薄金膜上的折射率改变。检测的折射率改变可以转化为结合的目标物质的量，然后进行评价。可通过制备具有在薄金膜上化学或物理形成的光交联基团的芯片来进行所述评价。通常，QCM可根据晶体频率的变化作为指标定量并评价发生在晶体振荡器上的金电极表面上的生物分子的相互作用。结果，频率的改变可评价为与金结合的目标物质的量。可以象SPR那样，通过制备具有在薄金膜上化学或物理形成的光交联基团的芯片来进行所述评价。
·解离常数(K_D)
“解离常数(K_D)”指通过用“解离率(kd)”值除以“结合率(ka)”值得到的数值。这一常数可以用作表示单克隆抗体或其片段与光交联基团的亲和力的指标。这一常数可通过多种方法进行分析。在本发明中，解离常数通过对用检测装置Biacore2000(Biacore制造)获得的结合曲线根据包括在装置中的分析软件进行分析而获得。
·光交联基团识别复合蛋白
本发明的光交联基团识别复合蛋白可包括两个或多个结构域。一个或多个结构域具有由此构建的抗-光交联基团抗体。然而，不是所有的结构域都有抗-光交联基团抗体。至少提供一个结构域，以形成具有识别目标物质的能力的目标物质结合域。在所述复合蛋白中，形成目标物质结合域的结构域可以是具有任何结构的分子，只要该分子可以特异性识别并与目标物质结合即可。这种结构域可包括蛋白质、糖链、核酸或脂质。蛋白质的例子包括锚蛋白-结构分子(AndreasPluckthun等人，Nature Biotechnology Vol 22，No.5，575-582(2004))、Affilin分子(Scil蛋白)、Affibody分子(Per-Ake Nygren等人，Proteins：Structure，Function，and Genetics 48，454-462(2002))、纤连蛋白III型10th、脂笼蛋白、GFP、凝集素、硫氧还蛋白以及omp(外膜蛋白)分子，及其片段或衍生物。这些分子经基因工程修饰具有非抗体结构，预期该非抗体结构具有超过抗体的亲和力以及不能被抗体识别而能够与目标物质特异性结合的分子识别。结构域可以至少具有抗体的一部分。所述复合蛋白可以示例为具有下列构造的蛋白质：(a)具有包括这样构建的抗-光交联基团抗体的第一结构域和包括具有目标物质结合位点的蛋白质的第二结构域的复合蛋白；和(b)除了第一和第二结构域以外，还包括至少一个与第一结构域形成复合体的第三结构域和与第二结构域形成复合体的第四结构域的复合蛋白。
第一到第四结构域与待结合物质的结合性质可各自独立地设置。在这些结构域中，两个或多个结构域可以具有相同的结合性质。可选择地，这些结构域可以包括具有不同结合性质的结构域。此外，选自第一到第四结构域的至少两个成员可以包括在同一多肽链中。所述构造的例子包括下述构造：(1)第一和第二结构域形成一条多肽链的构造；(2)第一和第二结构域通过一个或多个氨基酸连接的构造；(3)第三和第四结构域形成一条多肽链的构造；(4)第三和第四结构域通过一个或多个氨基酸结合的构造；(5)包括含有第一和第二结构域的第一多肽链以及含有第三和第四结构域的第二多肽链的构造；(6)包括含有第一和第二结构域的第一多肽链以及含有第三和第二结构域的第三多肽链的构造；(7)包括含有第一和第二结构域的第一多肽链以及含有第一和第四结构域的第四多肽链的构造；(8)包括一条至少含有第一、第二和第三结构域的多肽链的构造；(9)包括一条至少含有第一、第二和第四结构域的多肽链的构造，和(10)包括一条含有第一到第四结构域的多肽链的构造。
作为光交联基团识别复合蛋白的组分的蛋白质指这样一种分子，该分子包括至少一个或多个通过至少两个或多个氨基酸彼此结合而形成的多肽链，并具有多肽链重折叠的结构以形成特定的三维结构。这种蛋白质由于其结构可发挥其独特的功能(如，转化和分子识别)。如上所述，本发明的光交联基团识别复合蛋白具有至少一个或多个光交联基团结合位点，并进一步具有至少一个或多个目标物质结合位点。因此，这种复合蛋白表现出多价或多结合特异性。在可以使用的构造中，具有光交联基团结合位点的第一结构域至少包括抗体轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)的一部分，而第二结构域具有至少包括VH或VL的一部分的目标物质结合位点(在下文中，光交联基团结合的VH和VL分别以VH(P)和VL(P)来表示，目标物质结合的VH和VL以VH(T)和VL(T)表示)。
如上所述，抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别是抗体重链和轻链中的可变区。抗体重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)通常包含大约110个氨基酸。这些区域呈圆柱形结构，其中形成包括反平行的β折叠的层状结构。这种层状结构通过一个S-S键结合形成非常稳定的结构。已知可变区(VH或VL)具有决定抗体的抗原结合多样性的被称为互补决定区(CDR)的部分。每个VH和VL链中存在三个CDR，位于包括多样性相对较低的氨基酸序列的框架区之间。CDR可以识别目标识别位点中官能团的空间位置，从而获得更高特异性的分子识别。
下文将描述本发明的光交联基团识别复合蛋白的一个例子。本发明的光交联基团识别复合蛋白的最小单元包括第一和第二结构域。图1A到1D图示了其示意图。第一和第二结构域组合的例子包括VH(P)-VH(T)、VH(P)-VL(T)、VL(P)-VH(T)和VL(P)-VL(T)的组合。(P)表示的蛋白质是抗-光交联基团抗体蛋白质。在此例子的光交联基团识别复合蛋白中，第一和第二结构域不形成互补结合位点，分别独立地与光交联基团和目标物质结合。第一和第二结构域可以是独立的多肽链或是包括连续结合的结构域的多肽链。然而，在示例性实施方式中，可以形成包括连续结合的多肽链的多肽链，以简化生产步骤并显示功能。在包括连续结合的第一和第二结构域的多肽链中，第一和第二结构域可以直接连接或通过包括一个或多个氨基酸的连接体连接。氨基酸连接体可以包括1到10个氨基酸。特别地，可以使用包括1到5个氨基酸的连接体。当连接体的长度是11到15个氨基酸时，第一和第二结构域有时由于很少的排列限制在这些结构域之间形成互补结合(转化为scFv)。已知由于结构域之间较短连接体引起的结构限制的添加对于抑制VH和VL之间互补复合体的形成是有效的。另一方面，可以提供11个或更多个残基的有意延长的连接体，以阻止对于与目标物质结合性质的空间位阻。在此情况中，期望使用包括(例如)用基因工程方法修饰的重链抗体抗原识别位点VHH或VH-VL界面的VH或VL。期望第一和第二结构域中的每一个与光交联基团或目标物质结合引起的结构改变不会影响它与光交联基团或目标物质结合的能力。因此，可赋予连接体二级结构如α-螺旋，或将与原始期望结合性质无关的多肽结构域插入蛋白质中，而对于期望的性质或生产率不会产生显著的影响。
此外，如上所述，本发明的光交联基团识别复合蛋白还可以包括与第一结构域形成复合体的第三结构域或/和与第二结构域形成复合体的第四结构域。第三和第四结构域中的每一个都可以至少包括VH或VL的一部分。更希望第三结构域与第一结构域形成复合体，从而与第一结构域形成互补光交联基团结合位点。例如，当第一结构域是如图2A的示意图中所示的VH(P)时，第三结构域可以是能够与第一结构域形成Fv的VL。特别地，第一和第三结构域可以互相联合形成光交联基团结合位点。第一和第三结构域形成Fv在结构上稳定了蛋白质，预期可以阻止由于结构变化产生的功能降低。第三和第一结构域互相联合形成光交联基团结合位点预期可以进一步改善与光交联基团结合的能力(例如，提高结合率和降低解离率)。
第一和第三结构域可以如图2B所示以互相独立的多肽链的形式提供，或以相互连接的多肽链的形式提供(例如，如图2B所示顺序连接的第三结构域、第一结构域和第二结构域；该构造可以适当地确定，以行使结合光交联基团和目标物质的能力)。在另一个例子中，结构域可以如图3所示构建。特别地，这种复合蛋白包括含有第一和第二结构域的多肽链以及含有第三和第二结构域的多肽链。在此情况中，第一和第三结构域形成的Fv或Fv样复合体与光交联基团结合，同时第一结构域与第二结构域作为目标物质结合锚点。
可选择地，本发明的光交联基团识别复合蛋白还可以包括与第二结构域形成复合体的第四结构域。该第四结构域至少包括VH或VL的一部分。期望第四结构域与第二结构域一起互补形成目标物质结合位点。例如，当第二结构域是如图4A所示的VL时，第四结构域可以是能够与第二结构域形成Fv的VH。特别地，第二和第四结构域可以互相联合形成目标物质结合位点。可选择地，可以如图4B所示形成包括连接在一起的第一、第二和第四结构域的多肽链。在图4B的构造中，可以如下方式选择每个结构域：第一结构域与至少在表面的一部分上具有光交联基团的基底结合，并且第二和第四结构域与目标物质结合。在这种构造中，特别地，由于第一结构域与基底结合产生的不可逆结构改变对第二和第四结构域与目标物质结合的能力的影响可以通过恰当地设计连接体而被最小化。
此外，可以如图5所示构建结构域。特别地，这种复合蛋白包括含有第一和第二结构域的多肽链和含有第一和第四结构域的多肽链。在此情况中，第二和第四结构域形成的Fv或Fv样复合体与目标物质结合，而第一结构域与两条多肽链作为光交联基团结合锚点。
可选择地，所述光交联基团识别复合蛋白可以包括第三和第四结构域作为组分。第三和第四结构域可以是如图6所示的彼此独立的多肽链或是如图7所示的彼此连接的多肽链。对于彼此连接的多肽链，第三和第四结构域可以直接连接或如图7所示通过包括一个或多个氨基酸的连接体连接。可选择地，第一到第四结构域可以如图8所示在一条多肽链中连接。在此情况中，结构域可以如下方式排列：第一和第三结构域可形成复合体并与光交联基团结合，第二和第四结构域可以形成复合体并与目标物质结合。因此，可以在结构域之间提供连接体。例如，在第一和第二结构域之间以及第三和第四结构域之间提供1到5个氨基酸。在第二和第三结构域之间提供15到25个氨基酸。在相似的构造中，可在第一和第二结构域之间和/或在第三和第四结构域之间进行交换。
可以根据期望的性质，如对光交联基团和目标物质的结合性质以及所述光交联基团识别复合蛋白的长期稳定性，适当地选择和确定在单链多肽内的这些结构域序列。
第一结构域的例子包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：1到3和SEQID NO：4到6中每组的三个CDR或与之功能等价的CDR的第一结构域。相应的氨基酸序列对应于抗体H链CDR1、CDR2和CDR3。功能等价的CDR具有通过在这些氨基酸序列中进行缺失、取代或添加一个或几个氨基酸而获得的氨基酸序列。只要具有这些CDR的第一结构域保持与光交联基团结合的性质，这些CDR都可以没有问题地使用。只要具有这些CDR的第一结构域保持结合光交联基团的性质，每组中相应的CDR都可以没有问题地适当地组合。这些序列可以用作第三结构域。
第三结构域的例子包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：7到9和SEQ ID NO：10到12中每组的三个CDR或与之功能等价的CDR的第三结构域。相应的氨基酸序列对应于抗体L链的CDR1、CDR2和CDR3。功能等价的CDR具有通过在这些氨基酸序列中进行缺失、取代或添加一个或几个氨基酸而获得的氨基酸序列。只要具有这些CDR的第三结构域保持与光交联基团结合的性质，这些CDR都可以没有问题地使用。只要具有这些CDR的第三结构域保持结合光交联基团的性质，每组中相应的CDR都可以没有问题地适当地组合。这些序列可以用作第一结构域。
第一和第三结构域的CDR可以按所述组使用，或在这些结构域之间恰当地组合，只要具有这些CDR的第一和第三结构域可以保持对光交联基团的结合性质。第一和第三结构域的组合可以是衍生自H和L链的CDR组的组合。
本发明还包括一种编码光交联基团识别复合蛋白的核酸。本发明进一步包括一种包括作为基因载体的核酸的构建体。这种用于表达蛋白质的构建体可用于转化宿主细胞(如，公知用于蛋白质表达的大肠杆菌、酵母、小鼠或人来源的细胞)。结果，光交联基团识别复合蛋白可以从宿主细胞中表达。
可通过单个表达载体表达的本发明的光交联基团识别复合蛋白的每个结构域可以根据设计选自第一到第四结构域。当本发明的光交联基团识别复合蛋白的多个结构域由一个表达载体编码时，这些结构域可以分别表达为独立的多肽链。可选择地，可以构建一种载体，以将蛋白质表达为包括连续结合的或通过氨基酸结合的结构域的一条多肽链。用于表达本发明的光交联基团识别复合蛋白的表达载体可以根据选择的宿主细胞通过整合转基因表达必需的构造例如已知的启动子而设计和构建。可根据选择的宿主细胞参考例如已知的启动子等结构来构建载体构造。可选择地，当大肠杆菌被用作宿主细胞时，作为外源基因产物获得的光交联基团识别复合蛋白被直接转移到细胞质之外。这可以减少蛋白酶的降解。已知即使外源基因产物对于细菌细胞是有毒的，将外源基因产物分泌到细胞外也可降低这种影响。大多数通过细胞质膜或内膜分泌的已知蛋白质通常在其前体的N末端具有信号肽。这种前体的信号肽在分泌过程中被信号肽酶切除，成为成熟的蛋白质。大多数信号肽具有碱性氨基酸、疏水性氨基酸，以及位于N末端的信号肽酶切割位点。
编码公知的信号肽(典型的，pelB)的核酸可以设置在编码本发明的光交联基团识别复合蛋白的核酸的5’末端，以分泌并表达该蛋白质。可选择地，包括构成光交联基团识别复合蛋白的每个结构域或多个结构域的多个多肽链可独立地插入一个载体中。在此情况中，编码pelB的核酸可设置在编码每个结构域或多肽链的核酸的5’末端以促进其分泌。为表达包括一个或多个结构域的多肽链，编码pelB的核酸可以同样的方式设置在多肽链的5’末端以促进其分泌。在N-末端与信号肽融合的光交联基团识别复合蛋白或作为其组成的结构域可从周质部分或培养基上清液中纯化。为了方便地纯化被表达的蛋白质，可以通过基因工程方法在由每个独立结构域或多个彼此结合的结构域形成的多肽链的N-或C-末端设置纯化标记。纯化标记的例子包括含有六个连续组氨酸残基的组氨酸标记(下文称为His x 6)以及谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽结合位点。导入标记的方法的例子包括：包括将编码纯化标记的核酸导入表达载体中编码光交联基团识别复合蛋白的核酸的5’或3’端的方法，以及使用用于导入纯化标记的商业上可获得的载体的方法。
下文中，将描述一种通过使用表达载体生产本发明的光交联基团识别复合蛋白的方法。
本发明的光交联基团识别复合蛋白或作为其组分的多肽链可以通过利用根据宿主细胞设计的用于表达光交联基团识别复合蛋白的载体转化公知的用于蛋白质表达的宿主细胞而生产。在此情况中，蛋白质或作为其组分的多肽链通过利用宿主细胞内的蛋白质合成系统在宿主细胞内合成。然后，可从细胞内部或细胞培养上清液中纯化在宿主细胞内部或外部积累或分泌的目的产物，以获得蛋白质或作为其组分的多肽链。例如，当大肠杆菌用作宿主细胞时，编码公知信号肽(典型的，pelB)的核酸位于编码光交联基团识别复合蛋白的核酸的5’末端。由此表达的蛋白质可以具有容易分泌并表达到细胞质外部的形式。当用于获得构成光交联基团识别复合蛋白的每个结构域的多个多肽链由一个表达载体表达时，编码pelB的核酸设置在编码每个多肽链的核酸的5’末端。可促进表达中蛋白质分泌到细胞质之外。因此，在N-末端融合了信号肽的光交联基团识别复合蛋白可从周质部分或培养基上清液中纯化。融合了作为纯化标记的HIS标记和GST的抗体分别可以通过利用镍螯合柱和固定有谷胱甘肽的柱的纯化方法进行纯化。希望蛋白质表达诱导之后的步骤应该在黑暗的房间中进行或在尽可能用黄色幕布围绕的地方进行。
在细菌细胞中表达的本发明的光交联基团识别复合蛋白可以作为不溶性颗粒而获得。在此情况中，从培养液中获得的细菌细胞通过弗氏压碎器或超声处理而破碎。从细胞匀浆中离心获得不溶性颗粒。获得的不溶性颗粒部分用包括公知的含有尿素和盐酸胍的变性剂的缓冲液溶解。然后，溶解的部分可通过上述同样的方法在变性条件下进行柱纯化。获得的柱洗脱级分可进行重折叠步骤以除去变性剂和重建活性结构。重折叠方法可适当地选自公知的方法。特别地，例如，可根据目的蛋白质使用分步透析或稀释方法。
本发明的光交联基团识别复合蛋白的多个结构域或多肽链可在同一个宿主细胞中表达或在不同的宿主细胞中分开表达，组合，然后转化为由此形成的复合体。
此外，可利用细胞提取物通过编码本发明的光交联基团识别复合蛋白的载体在体外表达蛋白质。可利用的细胞提取物的例子包括大肠杆菌、麦胚和兔网织红细胞。然而，利用无细胞提取物的蛋白质合成通常在还原条件下进行。因此，可以进行在抗体片段中形成二硫键的某些处理。
本发明的光交联基团识别复合蛋白对于光交联基团的解离常数(K_D)可以是10^-4M或更小。
用于获得所述能够结合本发明的目标物质的抗体重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的方法的一个例子可以包括下述的方法。
首先，制备VH或VL基因文库。这些基因广泛表达为蛋白质。然后，根据其基因选择出具有对于目标物质的结合性质的蛋白质。
基因文库可从(例如)脐带血、扁桃腺、骨髓、外周血细胞或脾细胞中获得。例如，从人外周血细胞中提取mRNA，由该mRNA合成cDNA。接下来，利用人VH-或VL-编码序列作为探针制备人VH或VL的cDNA文库。例如，本领域已知能够广泛扩增人VH家族每个成员(VH1到VH7)的引物或能够扩增人VL的引物。利用对每种VH和VL适当组合的这些引物进行RT-PCR，以获得编码VH和VL的基因。
可选择地，可使用噬菌体展示技术。在噬菌体展示技术中，首先，编码VH、VL或包括这些区域的复合体(如Fab或scFv)的基因文库与编码噬菌体外壳蛋白的基因结合以制备噬菌粒文库。接下来，用该噬菌粒文库转化大肠杆菌。这些基因表达为具有作为外壳蛋白一部分的多种VH或VL区域的噬菌体。可以利用所述噬菌体通过上述相同的方法选择具有与目标物质结合性质的期望的VH、VL或包括这些区域的复合体。编码在噬菌体上展示为融合蛋白的VH或VL的基因由噬菌体中的噬菌粒编码，因此可以通过DNA测序而鉴定。当然，也可以使用与噬菌体展示方法等同的选择方法。
此外，也可利用选择方法选择具有能够结合本发明的目标物质的非抗体结构的目标物质捕获蛋白质(例如，锚蛋白或affilin)。此外，也可从利用目标物质免疫的动物中收集产生目的抗体的细胞。VH或VL的核苷酸序列和氨基酸序列可利用上述同样的引物进行鉴定。
本发明的第二和第四结构域可在针对目标物质的已知抗体和抗体片段的可变区氨基酸序列的基础上设计。当针对目标物质的抗体或抗体片段尚未获得时，要首先获得针对该目标物质的抗体。然后，分析该抗体的氨基酸序列。也可以基于该氨基酸序列设计结构域。第三和第四结构域都可构成本发明的光交联基团识别复合蛋白。可利用获得的VH或VL的核苷酸序列制备本发明的光交联基团识别复合蛋白。
·具有光交联基团的待结合物质
可通过免疫或淘选用于选择光交联基团识别复合蛋白的待结合物质的例子如以上关于抗-光交联基团抗体所述。
·基底和结构
本发明的光交联基团识别复合蛋白可与一种基底组合以获得一种结构。这种结构可用在多种用途中。可用于该目的的基底的例子如以上关于抗-光交联基团抗体所述。
·目标物质
本发明的光交联基团识别复合蛋白构建为包括具有对光交联基团结合性质的结构域和具有结合目标物质的性质的结构域。结果，这种蛋白质可用作检测目标物质的复合蛋白。任何分子都可用作待检测的目标物质，只要该分子是可以在利用抗原-抗体反应的方法中作为抗原的物质。例如，目标物质被概括地分类为非生物材料和生物材料。
本发明中可作为目标物质使用的非生物材料、生物材料或特异性蛋白质在日本专利申请公开No.2005-312446的第0108到0111段的公开内容中举例说明。更特别地，非生物材料的例子包括在氯取代数目和位置上不同的作为环境污染物的PCB、同样在氯取代数目和位置上不同的二噁英、以及也称为所谓的环境激素的内分泌干扰化学物质。生物材料的例子包括选自核酸、蛋白质、糖链、脂质及其复合物的生物材料。蛋白质的例子包括疾病标记物。当然，目标物质的例子不限于这些物质。
·用于检测目标物质的试剂盒
本发明的光交联基团识别复合蛋白可用于构建用于检测目标物质的试剂盒。例如，使用一种光交联基团识别复合蛋白，其中在第二结构域和任选使用的第四结构域中使用特异性结合目标物质的抗体及其变体。用于检测目标物质的试剂盒可包括这种光交联基团识别复合蛋白、在表面上具有光交联基团的基底、以及任选的用于检测通过光交联基团识别复合蛋白固定在基底上的目标物质的检测单元。例如，当使用在表面上具有光交联基团的金基底作为基底时，可通过利用表面等离子体共振检测装置的测定方法检测通过光交联基团识别复合蛋白固定在包括光交联基团的基底上的目标物质。
实施例
下文中，将参考实施例对本发明作更详细的描述。然而，本发明的范围并不限于下面的实施例。在下述实施例中，除了通过光照射对本发明的蛋白质进行光交联的步骤之外，其他步骤基本上在黑暗的房间中或在环绕着黄色幕布的地方进行。
实施例1(利用免疫原进行小鼠免疫)
为获得本发明的抗-光交联基团抗体，利用4-(1-Azi-2，2，2-三氟乙基)苯甲酸-KHL偶联物(Yanaihara Institute Inc.生产)作为免疫原对小鼠免疫六次。免疫原溶液于免疫前在环绕着黄色幕布的地方进行处理。
首次免疫通过以下步骤进行；首先，将0.7ml弗氏完全佐剂(CALBIOCHEM生产，编号344289)添加到0.7ml的2mg/ml免疫原溶液中(1.4mg免疫原)。在通过接合件连接的注射器管中将该混合液混合大约10分钟以制备乳液。接下来，对小鼠(Balb/c，雌性，七周龄)以每只鼠0.2ml(0.2mg)乳液的量进行腹膜内免疫。以这种方法总共免疫了五只小鼠。
第二到第六次免疫以下述步骤进行：首先，将0.7ml弗氏完全佐剂(DIFCO生产，编号263910)加入到0.7ml的1mg/ml免疫原(0.7mg免疫原)溶液中。在通过接合件连接的注射器管中将该混合液混合大约10分钟以制备乳液。接下来，对小鼠以每只鼠0.2ml(0.1mg)乳液的量进行腹膜内免疫。在第四次免疫后的第12天以及第五次免疫后的第7天通过部分血液收集获得抗血清，并在抗体滴度测定中使用。
实施例2(抗血清的抗体滴度测定)
实施例1的部分血液收集样品中的抗体滴度根据下述不同的方法(1)和(2)通过公知的ELISA进行测定。下述所有步骤都尽可能在黑暗的环境中进行。
(1)利用山羊抗-小鼠IgG(Fc)抗体固定的测定方法
使用的抗原样品是4-(1-Azi-2，2，2-三氟乙基)苯甲酰-Arg-Arg-NHNH-生物素(Yanaihara Institute Inc.生产)。将下述成分加入到固定有山羊抗-小鼠IgG(Fc)抗体的96孔微量滴定板的每个孔中：(1)50μl的稀释为0.01ng/ml到10μg/ml的抗原样品溶液；和(2)50μl的稀释了2000到1600倍的抗血清(在第四和第五次免疫后通过部分血液收集获得的每种抗血清)。
在此情形下，反应在室温下进行3小时。接下来，洗涤96孔滴定板。然后，以100μl/孔的浓度加入稀释了3000倍的SA-HRP溶液(ONCOGENE生产，目录号OR03L)。反应在室温下进行2小时。进一步洗板。然后，以100μl/孔的浓度加入底物溶液(OPD；SIGMA生产，目录号UK-B25)。反应在室温下进行20分钟。最后，加入100μl的2N硫酸溶液终止反应。利用酶标仪测量在OD492nm时的吸光度。
图9A、9C、9E、9G和9I图示了利用在第四次免疫之后通过局部血液收集获得的1到5号小鼠的抗血清(用生物素标记)测定抗体滴度的结果。另外，图9B、9D、9F、9H和9J图示了利用在第五次免疫之后通过局部血液收集获得的1到5号小鼠的抗血清(用生物素标记)测定抗体滴度的结果。将第四次和第五次免疫后通过部分血液收集获得的抗血清进行比较，所有小鼠的抗体滴度几乎相同。3号小鼠显示最高的抗体滴度，接下来依次是2号、4号、1号和5号。在图9A到9L中，线条-●-表示×2000，线条-■-表示×4000，线条-▲-表示×8000，线条-○-表示×16000。
(2)利用抗原固定的测定方法
使用的抗原样品是4-(1-Azi-2，2，2-三氟乙基)苯甲酸-BSA偶联物(Yanaihara Institute Inc.生产)。首先，使用0.1M的NaHCO₃溶液制备1μg/ml的抗原样品溶液。将该抗原样品溶液以0.1ml/孔的浓度加入到96-孔微量滴度板中并在4℃放置过夜。弃去溶液。以0.3ml/孔的浓度加入Block Ace(稀释4倍)并在4℃放置过夜。移去板中的溶液。在干燥器中将板干燥两天以制备固定有抗原样品的96孔微量滴度板。该板在4℃下保存直至使用。将稀释3000到375000倍的抗血清(在第四和第五次免疫后通过部分血液收集液获得的每种抗血清)以100μl/孔的浓度加入板中。反应在室温下进行3小时。接下来，洗涤96-孔滴度板。然后，以100μl/孔的浓度加入稀释了10000倍的山羊抗-小鼠抗体-HRP偶联物溶液(ICN生产，编号674281)。反应在室温下进行2小时。进一步洗板。然后，以100μl/孔的浓度加入底物溶液(OPD；SIGMA生产，目录号UK-B25)。反应在室温下进行20分钟。最后，加入100μl的2N硫酸溶液终止反应。利用酶标仪测量在OD492nm的吸光度。
图9K图示了利用固定有BSA偶联物的板对第四次免疫之后通过部分血液收集获得的1到5号小鼠的抗血清的抗体滴度测定结果。图9L图示了利用固定有BSA偶联物的板对第五次免疫之后通过部分血液收集获得的1到5号小鼠的抗血清的抗体滴度测定结果。所有小鼠的抗血清都几乎不与BSA对照板反应。将第四和第五次免疫后通过部分血液收集获得的抗血清进行比较，所有小鼠具有几乎相同的抗体滴度。5号小鼠显示最高的抗体滴度，然后依次是4号、3号、2号和1号。
实施例3(杂交瘤的制备(细胞融合))
在实施例2的部分血液收集后的抗体滴度测定结果的基础上，使用3号和5号小鼠作为制备杂交瘤的样品。首先，将5ml培养液(RPMI 1640；ICN生产)加入一个5-cm培养皿中。进一步加入一个已火焰灭菌的钢网。将从小鼠中切除的脾在网上手工压碎以获得分离的脾细胞。将脾细胞转入50-ml离心管并用20ml培养液洗涤两次。预先培养的P3U1骨髓瘤细胞用20ml培养液洗涤两次。分别计数脾细胞和骨髓瘤细胞的数目。以10∶1的比例混合脾细胞和骨髓瘤细胞并进行离心。在30秒的时间里向细胞沉淀物中加入2ml PEG溶液HYBRI-MAX(SIGMA生产)。然后，将混合液缓慢混合30秒。在2分钟的时间里向该混合液中加入5ml培养液。再加入另外5ml培养液。然后，将混合液在37℃培养3分钟，并在800rpm下离心5分钟。将HAT培养基(Invitrogen生产)逐渐加入细胞沉淀物中以将脾细胞数目调节到2-3×10⁵细胞/0.2ml/孔。然后，将混合物以0.2ml/孔的浓度加入到96孔培养板中。然后该混合物在CO₂孵箱中培养10天至细胞完全融合。
实施例4(筛选和抗体滴度测定)
实施例3获得的杂交瘤以与实施例2(2)所述的抗体滴度测定方法相同的方法进行测定。当证实抗体滴度增长时，完成杂交瘤的筛选。进行二次筛选以获得高抗体滴度的杂交瘤细胞。结果，获得来自3号小鼠的两株和来自5号小鼠的四株、总共六个杂交瘤株，所述杂交瘤株产生与固定有4-(1-Azi-2，2，2-三氟乙基)苯甲酸-BSA偶联物的板反应的抗体。所获得的六个杂交瘤株被命名为6H11-F11F4、6C9-A5B10、6A8-1C6-1B6、1E2-2H6-1A9、4G2-1E10-1F10和3E12-1B6-1A5。
实施例5(克隆(两次)和腹水的制备)。
切下小鼠的胸腺，由此制备胸腺细胞。胸腺细胞用培养液调整为5×10⁶细胞/ml。向96孔培养板的每个孔中加入100μl等份上述细胞液。利用培养溶液将实施例4中通过二次筛选得到的杂交瘤细胞分别稀释到10细胞/ml。向准备好的培养板的每孔中各加入100μl等份的稀释细胞溶液。培养10天之后，每孔中都观察到集落。确认只有一种集落的孔。然后，收集培养上清液。以通过抗体滴度测定方法测定的OD值的降序选择阳性孔。将大约5×10⁶从每个杂交瘤获得的克隆细胞加入到事先腹膜内注射了0.5ml降植烷的两只裸鼠中。在大约10天后，从小鼠中收集腹水。
实施例6(单克隆抗体的纯化)
将实施例5中获得的腹水进行脱脂处理。逐滴加入等量的硫酸铵，然后在4℃放置1小时。悬液以3500rpm离心30分钟。除去上清液后，将沉淀物在与原始腹水量等量的Dulbecco′s PBS(-)(NISSUIPHARMACEUTICAL CO.，LTD.)中溶解。溶液用盐水(5L×2)进行透析，并在-30℃低温保藏。从实施例5的每种杂交瘤获得的单克隆抗体被命名为与原杂交瘤株相同的名称。表1显示了收集的腹水的量以及纯化的抗体的量。
表1单克隆抗体