新型抗微生物肽及其应用.pdf

本发明涉及一种至少包含氨基酸序列K X K X1 X2 X K G X的分子或其类似物，其中X是任意的氨基酸残基，X1和X2是K或R，并且其中所述分子具有大约10到大约100氨基酸残基的长度。本发明还涉及包含所述分子的组合物，以及本发明的分子和/或组合物来与微生物战斗的用途，所述微生物为例如细菌、病毒、真菌(包括酵母)和寄生虫。

1.  一种至少包含如下氨基酸序列的分子或其类似物
K X K X₁ X₂ X K G X
其中
X是任意的氨基酸残基
X₁和X₂是K或R
并且其中所述分子具有从大约10到大约100个氨基酸残基的长度。

2.  根据权利要求1的分子，其中所述分子至少包含氨基酸序列
K X K X₁ X₂ X K G X ₃ X₄ X₅ X X₆ C X₇ X₈
其中
X是任意的氨基酸残基
X₁，X₂X₄和X₅是K或R
X₃是任意的氨基酸残基，并且在第2位和第12位氨基酸残基之间
X₆是P或L
X₇是三个氨基酸残基，是任意的氨基酸残基
X₈是F或Y
并且其中所述肽具有从大约20到大约100个氨基酸残基的长度。

3.  根据权利要求1的分子，其中所述分子包含示于SEQ ID NO:20中的氨基酸序列，或者其中所述分子和示于SEQ ID NO:20中的氨基酸序列不同，不同之处为至少L9W氨基酸残基被置换。

4.  根据权利要求2的分子，其中所述分子包含示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列，或者其中所述分子和示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列不同，不同之处为选自L9W，R13K，D14W，D14L和Y20F的至少一个氨基酸残基被置换。

5.  根据权利要求4的分子，其中所述分子和示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列不同，不同之处为至少R13K和Y20F氨基酸残基被置换(SEQ ID NO:13)。

6.  根据权利要求4的分子，其中所述分子和示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列不同，不同之处为D14L氨基酸残基被置换(SEQ IDNO:14)。

7.  根据权利要求4的分子，其中所述分子和示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列不同，不同之处为至少L9W氨基酸残基被置换(SEQ IDNO:15)。

8.  根据权利要求4的分子，其中所述分子和示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列不同，不同之处为至少L9W和D14L氨基酸残基被置换(SEQ ID NO:16)。

9.  根据权利要求4的分子，其中所述分子和示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列不同，不同之处为至少L9W和D14W氨基酸残基被置换(SEQ ID NO:17)。

10.  根据权利要求4的分子，其中所述分子和示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列不同，不同之处为至少D14W氨基酸残基被置换(SEQ IDNO:18)

11.  根据权利要求1和3中任一项的分子，其中所述分子具有从大约10到大约50个氨基酸残基的长度。

12.  根据权利要求1和3中任一项的分子，其中所述分子具有从大约10到大约35个氨基酸残基的长度。

13.  根据权利要求1和3中任一项的分子，其中所述分子具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28.29、30、31、32、33、34或35个氨基酸残基的长度。

14.  根据权利要求2和权利要求4-10任一项的分子，其中所述分子具有从大约20到大约50个氨基酸残基的长度。

15.  根据权利要求2和权利要求4-10任一项的分子，其中所述分子具有从大约20到大约35个氨基酸残基的长度。

16.  根据权利要求2和权利要求4-10任一项的分子，其中所述分子具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸残基的长度。

17.  根据前面的任一权利要求的分子，其中所述分子被酰胺化、酯化、酰化、乙酰化、聚乙二醇化或烷化所修饰。

18.  根据前面的任一权利要求的分子，其中所述分子被1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的置换所修饰。

19.  包含至少一种根据前面的任一权利要求的分子的组合物。

20.  根据权利要求19的组合物，包含2-4种根据权利要求1-18的任一权利要求的分子。

21.  根据权利要求19或20的组合物，包含药学可接受的缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或赋形剂。

22.  根据权利要求19到21的任一项组合物，包含一种或多种抗生素和/或防腐剂和/或抗炎剂。

23.  包含根据权利要求1到18的分子或者根据权利要求19到22的组合物的产品，其中所述产品选自绷带、膏剂、缝线、肥皂、卫生棉条、尿布、洗发水、牙膏、湿巾、抗痘化合物、防晒霜、纺织品、粘性物、创伤敷料、清洁液或埋植物。

24.  根据权利要求1到18任一项分子用于药物中的用途。

25.  根据权利要求1到18任一项分子或者和SEQ ID NO:19具有至少80％序列一致性的多肽或者根据权利要求19-22的组合物的用途，其用于制备用于减少和/或清除微生物，来治疗或防止微生物感染的抗微生物组合物。

26.  根据权利要求25的用途，其中所述多肽和SEQ ID NO:19具有至少90％序列一致性。

27.  根据权利要求26的用途，其中所述多肽和SEQ ID NO:19具有至少95％序列一致性。

28.  根据权利要求27的用途，其中所述多肽和SEQ ID NO:19具有至少97％序列一致性。

29.  根据权利要求28的用途，其中所述多肽和SEQ ID NO:19具有至少99％序列一致性。

30.  根据权利要求25到29任一项的用途，其中所述微生物感染是细菌感染和/或真菌感染。

31.  根据权利要求25到30中任一权利要求的用途，其中所述抗微生物组合物是局部组合物。

32.  根据权利要求31的用途，其中所述的治疗的微生物感染选自特应性皮炎、脓疱性皮炎、慢性皮肤溃疡、感染的急性创伤和烧伤创面、粉刺、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂溢性皮炎、念珠菌性擦烂、念珠菌阴道炎、口咽念珠菌病、眼部感染和鼻感染。

33.  根据权利要求31的用途，其中所述的抗微生物组合物是用于在烧伤创面中、在手术后或皮肤创伤后防止微生物感染。

34.  减少和/或清除微生物来治疗和/或防止疾病和/或紊乱的方法，包括向哺乳动物给予治疗有效量的根据权利要求1到18的分子或者根据权利要求19到22的药物组合物或者根据权利要求23的产品。

新型抗微生物肽及其应用
技术领域
本发明涉及一种至少包含氨基酸序列K X K X₁ X₂ X K G X的分子或其类似物，其中X是任意的氨基酸残基，X₁和X₂是K或R，并且其中所述分子具有大约10到大约100氨基酸残基的长度。本发明还涉及包含所述分子的组合物，以及使用本发明的分子和/或组合物来和微生物战斗的用途，所述微生物是例如细菌、病毒、真菌(包括酵母)和寄生虫。
背景技术
哺乳动物(例如人类)通过免疫系统成功战胜了多种感染。但是，在一些情况下，细菌、真菌或病毒并不总是被清除的，它们可能引起局部的或全身的急性感染。在围产期、灼伤或加强医疗病房中和在免疫减弱个体中这是一个被严重忧虑的问题。在其它情况下，在上皮表面的持续性细菌存留有可能引起或加重慢性疾病。在人类中，其例子为慢性皮肤溃疡、特应性皮炎和其它类型的湿疹、粉刺或泌尿生殖器感染。例如，目前已经有大量证据表明革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的定殖或感染是特应性皮炎的触发或恶化因子。在所有特应性皮炎患者中大约90％是金黄色葡萄球菌的定殖或感染，而只有5％的健康个体窝藏(harbour)有该细菌。该细菌产生的超抗原刺激角蛋白细胞和T-淋巴细胞，并触发炎症过程。炎症导致皮肤屏障功能受损。
可以利用多种药物治疗有症状的感染。还可以通过例如疫苗来战胜一些疾病。但是，疫苗不总是最好的治疗选择，并且对于某些特定的微生物没有可用的疫苗。当没有可用的防护时，就寻找疾病的治疗方法。通常通过使用抗生素试剂来进行治疗，它杀伤微生物。但是，最近几年一些微生物变得对抗生素试剂有抗性。最有可能的是，在不久的将来抗性问题将越发严重。此外，一些个体对抗生素试剂出现了过敏，因此降低了有效应用某些抗生素试剂的可能性。
多种有机体的上皮表面持续暴露于细菌中。在最近几年里发现基于抗细菌肽的天然免疫系统在易受感染的生物界面中最初的细菌清除中扮演重要的角色(Lehrer，R.I.，and Ganz，T.(1999)Curr OpinImmunol 11：23-27，Boman，H.G.(2000)Immunol.Rev.173，5-16)。该分子通过渗入细菌的膜来杀死它们，因此缺乏特异性的、分子的微生物靶点使抗性发展最小化。
在本领域已知一些和此处描述的肽不相关的分子和蛋白质。
US 6,503,881公开了一种用作分子的阳离子肽，是indolicidin类似物。该阳离子肽来自于不同的物种，包括动物和植物。
US 5,912,230公开了抗真菌和抗细菌的基于富组蛋白的肽。所述肽基于天然产生的人富组蛋白的氨基酸序列的确定部分，和治疗真菌和细菌感染的方法。
US 5,717,064公开了甲基化的富含赖氨酸的溶解肽。所述溶解肽是胰蛋白酶消化抗性的，并且是非天然的。所述溶解肽适合体内给药。
US 5,646,014公开了一种分子。该肽分离自蚕血淋巴的抗微生物部分。所述肽表现出优秀的针对数种细菌菌株的抗微生物活性，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。
WO2004016653公开了一种基于天青杀素(azurocidin)的20-44序列的肽。这种肽含有一个由二硫键交联的环结构。
US 6495516以及相关专利公开了基于杀菌的55kDa的蛋白质杀菌/渗透性增强蛋白质(BPI)的肽。所述肽显示出抗微生物效果以及LPS-中和能力。
WO 01/81578公开了数个编码G-偶联蛋白质-受体相关多肽的序列，用于多种疾病。
目前，已知700多种不同的分子序列(www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/search.htm)，包括蛾血素、防御素马加宁(magainins)和cathelicidin。
虽然现在已有相对大量的可用分子，但是对新的改进的分子的需求仍然持续增加，这些分子能用于和微生物、对抗生素试剂和/或其它抗微生物试剂有抗性或耐受性的微生物战斗。更重要的是，需要新的分子，所述分子在被引入到哺乳动物例如人类中时是不会引起过敏的。细菌在进化中遇到内源产生的分子后未诱导出显著的抗性。
本发明概述
根据第一个实施方案，本发明涉及至少包含氨基酸序列K X K X₁ X₂X K G X的分子或其类似物，其中X是任意的氨基酸残疾，X₁和X₂是K或R，并且其中所述分子具有大约10到大约100氨基酸残基的长度。
根据第二个实施方案，本发明涉及至少包含一种如上面定义的分子的组合物。
根据第三个实施方案，本发明涉及包含所述分子和/或所述组合物的产品。
根据第四个实施方案，本发明涉及所述分子在用于药物中的用途。
根据第五个实施方案，本发明涉及所述分子或者和SEQ ID NO：19至少有80％序列一致性的多肽或者所述的组合物的用途，其用于制备用于减少和/或清除微生物来治疗或预防微生物感染的抗微生物组合物。
最后，本发明涉及通过使用如上面定义的分子或组合物或如上面定义的产品来减少和/或清除微生物来治疗或预防疾病和/或紊乱(包括微生物感染)的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的、包含本发明的一种或多种分子的药物组合物。
通过提供这种分子，因为如下事实：所述分子来自于内源蛋白质和/或肽的多肽序列，所以对所述分子的过敏反应的危险有可能降低了。通过使用短肽，和更长的肽和蛋白质相比，肽的稳定性增强了，并且降低了生产成本，因此本发明有可能在经济上具有优势。此外，和较长肽不同，可以使用本领域已知的合成方法容易地制备短肽，例如固相合成。和容易变性的较长多肽不同，短肽更加稳定。因为这个事实，使用这种短肽制备药物组合物在保存活性方面对所述药物组合物中其它组分的限制更少。
本发明的肽提供了有助于有效预防、减少或清除微生物的组合物。因此增加了战胜对目前的抗生素试剂有抗性或耐受性的微生物的可能性。此外，对可购买到的抗生素试剂过敏的哺乳动物可以被治疗并且该分子对接受治疗的哺乳动物没有毒性。通过提供来自于内源蛋白质的药物组合物，哺乳动物对这些特定肽产生过敏的可能性被降低或甚至消除。这使该药物组合物能够用于数种应用，其中所述药物组合物作为药剂或作为添加剂和哺乳动物接触来预防感染。
此外，使用短肽可以增强生物利用度。而且，使用结构不同的、对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌或真菌具有特异性或较好的作用的肽能够特异性的以多种微生物为靶点，因此使抗性产生和生态学问题降到最小。通过使用补肽(supplementing peptides)(和已经存在于哺乳动物中的肽互补)，新型抗生素造成的增加生态学压力危险被进一步降低了。最后，这些分子、肽和组合物还可以增强内源分子的效果。
因此本发明涉及具有改进特性的分子及其解决多种问题。
此外本发明的分子在哺乳动物中的生理环境下是稳定的，即，是有活性的并且不降解或者不会被蛋白酶降解。在微生物引起的感染中，哺乳动物和微生物中的多种系统被激活，例如不同的蛋白酶，一个例子是中性白细胞弹性蛋白酶。此外，当本发明的分子被溶解于生理盐中时，或存在人血浆时(来模拟人类环境)，所述分子仍将对不同微生物有活性，例如革兰氏阴性细菌，例如绿脓杆菌(P.aeruginosa)。此外，感兴趣的分子具有螺旋含量低的特点，使本发明和螺旋抗微生物肽相区别。此外，感兴趣的分子具有内源来源，使过敏产生降到最低。
本发明的分子增加了抗微生物试剂的清单，有助于在所有种类的应用中所进行的选择来预防、减少或清除微生物，所述应用包括但不限于侵入或感染哺乳动物(例如人类)的那些。
附图简要说明
图1.人FGF成员的多序列比对。对应于LKK21的区域在方框中标明。
图2.人HB-EGF和双向调节因子的配对序列比对。肽、GKR22和PKR21以粗体标记。
图3.人PDGF和VEGF成员的多序列比对。对应于GRP19、LRP24、QRA21和RVR21的区域在方框中标明。
图4a-e.生长因子的肽的抗菌活性。用RDA中的细菌清除区带对肽的抑制效果进行可视化，并且在Y轴上指明(按mm)。
图5.生长因子衍生肽的溶血效果分析。为了比较，还包括了人分子LL-37。
本发明详述
定义
在本申请和本发明的上下文中应用下述定义：
术语“核苷酸序列”意指两个或两个以上核苷酸的序列。所述核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、RNA、半合成或合成来源或其混合物。术语包括DNA或RNA的单链和双链形式。
术语“抗微生物组合物”意指任何含有根据本发明的分子的组合物，例如可用于和攻击哺乳动物的微生物战斗的药物组合物，以及包含一种或多种附加抗微生物试剂(例如抗生素和其它试剂)的组合物。
术语“置换”意指一个氨基酸残基被另一种氨基酸残基所取代。例如，S15V的意思是在SEQ ID NO：1中15号位置的丝氨酸氨基酸残基被取代了，即，被缬氨酸所取代。
术语“其类似物”意指包含肽序列的部分或整个分子是基于非蛋白质氨基酸残基的，例如氨基异丁酸(Aib)、正缬氨酸γ-氨基丁酸(Abu)或鸟氨酸。可以在http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polyam/po00008.htm找到其它非蛋白质氨基酸的例子。
术语“去除”意指至少一个氨基酸残基被去除了，即，从多肽中释放出来，不被另一种氨基酸残基所取代。
术语“序列一致性”表示的是等长的两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的同源程度的定量量度。如果待比较的序列不是等长的，必须排列它们来给出最可能的符合，允许插入间隔(gap)或者(可选的)在多肽或核苷酸序列的末端进行截断。可以用计算序列的一致性，其中N_dif是排列后两个序列中不相同残基的总数，其中N_ref是序列中一个序列的残基数量。因此，DNA序列AGTCAGTC和序列AATCAATC(N_dif＝2并且N_ref＝8)具有75％的序列一致性。间隔被计算为特定残基的不一致，即，DNA序列AGTGTC和DNA序列AGTCAGTC(N_dif＝2并且N_rep＝8)具有75％的序列一致性。对于本发明的涉及氨基酸序列的所有实施方案，一个或多个序列之间的序列一致性百分比还可以基于使用clustalW软件(http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html)、使用缺省设置进行的比对(alignment)。
术语“分子”意指预防、抑制、减少或破坏微生物的肽。带有或不带有修饰(例如置换)、化学修饰(酯化)的肽。可以通过任何方法测定抗微生物活性，例如在实施例5中的方法。
术语“两性的”意指亲水和疏水氨基酸残基沿着α螺旋结构、β片层、线性、环形或其它二级构象的相对表面的分布，以及沿着肽的一级结构的相对末端的分布，这导致分子的一面或一端主要是带有电荷的，并且是亲水的，而分子的另一面或另一端主要是疏水的。肽的两性程度可以测定，例如，通过多种基于万维网的算法标绘氨基酸残基的序列，例如，在http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl或http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html中找到的那些。可以利用螺旋轮图(helical wheel diagrams)来可视化疏水残基的分布。可以在www.expasy.com中找到二级结构预测算法，例如GORIV和AGADIR。
术语“阳离子的”意指一种在大约2到大约12的pH范围内具有净正电荷的分子，例如在大约4到大约10的pH范围内。
术语“微生物”意指任意的活的微生物。微生物的例子是细菌、真菌、病毒、寄生虫和酵母。
术语“抗微生物试剂”意指任意的预防、抑制或破坏微生物生命的试剂。可以在The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy(第32版，Antimicrobial Therapy，Inc，US)中找到抗微生物试剂的例子。
在本上下文中，氨基酸名称和原子名称按照Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)的定义来使用，它是基于IUPAC命名法的(IUPACNomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(残基名称，原子名称等)，Eur J Biochem.，138，9-37(1984)以及它们在Eur J Biochem.，152，1(1985)中的校正。术语“氨基酸”意指来自于丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天门冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、蛋氨酸(Met或M)、天(门)冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、serine(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)的氨基酸或其衍生物。
描述
分子
本发明涉及一种新本发明的、至少包含氨基酸序列K X K X₁ X₂XK G X的分子或其类似物，其中
X是任意的氨基酸残基
X_1，和X₂是K或R
并且其中所述分子的长度为大约10到大约100个氨基酸残基，例如包含示于SEQ ID NO：20中的氨基酸序列的分子或者，其中所述分子和示于SEQ ID NO：20中的氨基酸序列不同，至少氨基酸残基L9W被置换。术语“类似物”在上面进行了定义。新本发明的分子可用于和微生物战斗，例如细菌，病毒，真菌，包括酵母，和寄生虫，并且解决上面限定的问题。含有一些正电荷的、在整个分子长度中分布的残基的氨基酸序列(如上面定义)将有利于所述分子的抗微生物活性。该分子长度为大约10到大约50个氨基酸残基，例如10到大约35个氨基酸残基。例子为长度为10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28.29，30，31，32，33，34或35个氨基酸残基。在表3A中有一个根据本发明的分子的例子(KRK15)，包含15个氨基酸残基(SEQ ID NO：21)。
本发明还涉及至少包含氨基酸序列K X K X₁ X₂ X K G X₃ X₄ X₅ X X₆C X₇ X₈的分子，其中
X是任意的氨基酸残基
X_1， X₂ X₄和X₅是K或R
X₃是任意的氨基酸残基并且在2和12氨基酸残基之间
X₆是P或L
X₇是三个氨基酸残基，是任意的氨基酸残基
X₈是F或Y
并且其中所述分子的长度为大约20到大约100个氨基酸残基。该基序特异性地覆盖了来自于HB-EGF和双向调节因子及其具有抗微生物活性的衍生物的分子。
相应的，本发明还涉及至少包含氨基酸序列K X K X₁ X₂ X K G X₇X₄ X₅ X X₆ C X₇ X₈的分子，其中
X是任意的氨基酸残基
X_1， X₂ X₄和X₅是K或R
X₆是P或L
X₇是三个氨基酸残基，是任意的氨基酸残基
X₈是F是Y
并且其中所述分子的长度为大约20到大约100个氨基酸残基。
相应的，本发明涉及包含示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列的分子或者，所述分子和示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列不同，其不同之处在于选自L9W、R13K、D14W、D14L和Y20F的至少一个氨基酸残基被置换。其例子是一种和示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列不同的分子，至少氨基酸残基R13K和Y20F被置换(SEQ ID NO：13)，一种和示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列不同的分子，至少氨基酸残基D14L被置换(SEQ ID NO：14)，一种和示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列不同的分子，至少氨基酸残基L9W被置换(SEQ ID NO：15)，一种和示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列不同的分子，至少氨基酸残基L9W和D14L被置换(SEQ ID NO：16)，或者一种和示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列不同的分子，至少氨基酸残基L9W和D14W被置换(SEQ ID NO：17)，一种和示于SEQ ID NO：12的氨基酸序列不同的分子，至少氨基酸残基D14W被置换(SEQ ID NO：18)。根据第二个方面，所述分子长度为大约20到大约50个氨基酸残基，例如长度为大约20到大约35个氨基酸残基。例子为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸残基的长度。在表3A(SEQ IDNO：22-27)中是根据本发明的分子的例子，包括25、30、35、40和50个氨基酸残基。
相应的，本发明涉及选自包含SEQ ID NO：12-18或20或其衍生物的肽在制备用来减少和/或清除微生物来治疗或预防微生物感染的抗微生物组合物中的用途，例如包含SEQ ID：12或其衍生物的肽在制备用来减少和/或清除微生物或预防性治疗微生物感染的抗微生物组合物中的用途。
此外该肽中的一个或多个氨基酸残基可以被置换，例如2-21氨基酸残基。例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个氨基酸残基可以被去除和/或被置换。
该肽可以来自于内源人肽，或者是合成的或半合成的。
只要本发明的肽的抗微生物活性和稳定性得到保留，一个或多个氨基酸残基可以被去除和/或置换。
该分子可以扩展一个或多个氨基酸残基，例如1-100个氨基酸残基，5-50个氨基酸残基或6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。这种增加的氨基酸可以复制临近来自于非抗微生物蛋白质的分子的序列的序列。增加的数量依赖于要和哪种微生物战斗包括，肽的稳定性、毒性、等待治疗的哺乳动物或肽将存在于那种产品中以及所述分子基于哪种肽结构。向肽中增加的氨基酸残基的数量还依赖于生产的选择，例如，表达载体和表达宿主和制备药物组合物的选择。只要不干扰肽的抗微生物效果，可以在所述分子的N-或C-末端部分或者在两个部分都进行延伸。所述分子还可以是融合蛋白，其中所述分子被融合到另一个肽上。
此外，所述分子可以被操作连接到另一个已知的分子或其它物质上，例如其它肽、脂、蛋白质、低聚糖、多糖、其它有机化合物或无机物。例如所述分子可以偶联到保护所述分子在哺乳动物中在其抑制、预防或破坏微生物的生命之前不被降解的分子上。
相应的可以在C-末端部分通过酰胺化或酯化以及在N-末端部分通过酰化、乙酰化、聚乙二醇化、烷化等等来修饰所述分子。
可以从天然产生的来源(例如从人细胞)、cDNA、基因组克隆、化学合成来获得所述分子，或者通过重组DNA技术作为从细胞来源的表达产物来获得。
可以通过标准化学方法合成所述分子，包括通过自动程序进行合成。总体上，用HATU(N-[DIMETHYLAMINO-1H-1.2.3.-TRIAZOLO[4，5-B]PYRIDIN-1-YLMETHYLELE]-N-METHYLMETHANAMINIUM HEXAFLUOROPHOS-PHATEN-OXIDE)作为偶联试剂或其它偶联试剂例如HOAt-1-HYDROXY-7-AZABENZOTRIAZOLE根据标准固相Fmoc保护策略合成肽类似物。用含有合适清除剂的三氟乙酸将肽从固相树脂上切下来，还去保护了侧链功能基团。使用制备型反向色谱进一步纯化粗肽。可以使用其它的纯化方法，例如分配色谱、凝胶过滤、凝胶电泳或离子交换色谱。可以采用本领域已知的其它的合成技术，例如tBoc保护策略，或使用不同的偶联试剂或类似的，来制备同等的肽。
可选择的，可以通过重组生成来合成肽(参见，例如，美国专利U.S.Pat.No.5,593,866)。多种宿主系统适合生产肽类似物，包括细菌，例如大肠杆菌、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或毕赤酵母(pichia))、昆虫(例如Sf9)和哺乳动物细胞(例如CHO或COS-7)。对于每种宿主可以使用多种表达载体，并且本发明不限于它们中任何一种，只要载体和宿主能够生成所述分子。可以在例如Sambrook等人(Molecular Cloning.：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1987)和Ausubel等人(Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Co.，1995)中找到大肠杆菌中的载体和克隆与表达过程。
最终，可以从血浆、血液、多种组织等中纯化出肽。肽可以是内源的，或从纯化的蛋白质中经酶或化学消化后产生。例如，可以利用胰蛋白酶消化蛋白质，并大规模的分离所得到的抗细菌肽。
编码所述分子的DNA序列被引入到对宿主合适的表达载体中。在优选的实施方案中，基因被克隆到载体中来创建融合蛋白。为了方便肽序列的分离，使用容易遭受化学切割(例如，CNBr)或酶切割(例如，V8蛋白酶，胰蛋白酶)的氨基酸来桥接肽和融合伴体。对于在大肠杆菌中表达，融合伴体优选为引导表达向包涵体形式进行的普通的细胞内蛋白质。在这种情况下，切割释放最终产物后不需要肽的重新变性。在本发明中，包含融合伴体和肽基因的DNA盒可以被插入到表达载体中。优选的，表达载体是含有可诱导的或组成型的启动子的质粒，所述启动子促进插入的DNA序列在宿主中有效转录。
可以通过常规转化技术例如钙介导技术、电穿孔或其它本领域技术人员所熟知的方法将表达载体引入到宿主中。
编码所述分子的序列可以是来自于天然来源的(例如哺乳动物细胞)、已经存在的cDNA或基因组克隆或合成的。可以使用的一个方法是借助于PCR来扩增所述分子，使用来自于抗微生物DNA模板5′和3′末端的并且典型的引入根据载体克隆位点选择的限制性位点的扩增引物。如果必要，可以将翻译起始和终止密码子设计到引物序列中。只要密码子的选择顾及到最终治疗的哺乳动物，编码所述分子的序列可以是密码子优化的，来促进在特定宿主中的表达。因此，例如，如果所述分子在细菌中表达，对密码子进行对于细菌的优化。
表达载体可以含有启动子序列，来促进引入的分子的表达。如果必要，还可以包括调控序列，例如一个或多个增强子、核糖体结合位点、转录终止信号序列、分泌信号序列、复制起始区、选择标记等等。调控序列可被互相连接来进行转录和后续的翻译。如果所述分子在细菌中表达，调控序列是被设计为在细菌中使用的那些，并且是本领域技术人员所熟知的。合适的启动子(例如组成型的和诱导型的启动子)有广泛的选择，包括来自于T5、T7、T3、SP6噬菌体的启动子，和trp、lpp、lac操纵子。
如果含有所述分子的载体将在细菌中表达，起始区的例子可以是引起高拷贝数量的那些或引起低拷贝数量的那些，例如fl-ori和colEl ori。
优选的，质粒至少包含一个在宿主中有功能的可选择标记，它使转化的细胞被鉴别出来和/或选择性生长。对于细菌宿主，合适的选择标记基因包括氨卡青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因和其它本领域已知的。
用于在细菌中表达的质粒的例子包括pET表达载体pET3a、pET11a、pET 12a-c和pET 15b(购自Novagen公司，Madison，Wis.)。低拷贝载体(例如，pPD100)可用于有效的超量生产对大肠杆菌宿主有毒的肽(Dersch等人，FEMS Microbiol.Lett.123：19，1994)。
合适的宿主的例子是细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。但是，经常使用细菌，例如大肠杆菌。
通过常规的分离技术例如亲和、大小排阻或离子交换色谱，HPLC等等来分离表达的分子。可以在A Biologist′s Guide to Principlesand Techniques of Practical Biochemistry(eds.Wilson和Golding，Edward Arnold，伦敦)或者在Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley & Sons，Inc)中找到不同的纯化技术。
相应的，所述分子可以结合多种革兰氏阴性细菌的脂多糖并且使其失活，因此充当脂多糖诱导的炎症的抑制剂。所述分子还可以调节真核细胞的生长。
此外，本发明涉及包含所述分子的组合物或包含上述分子的药物组合物和药物可接受的缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或赋形剂。增加的化合物可以被包含在组合物中，例如其它分子。在WO 2005/061535和WO 2005/001737中公开了其它分子的例子。其它例子包括，螯合剂例如EDTA、EGTA或谷光苷肽。可以以本领域已知的方式制备足够的储存稳定的并适合对人和动物给药的药物组合物。药物组合物可以被冻干，例如，通过冷冻干燥、喷雾干燥或喷雾冷却。
“药学可接受的”表示一种不降低活性成分(即，所述分子)的生物活性效果的非毒性物质。这种药物可接受的缓冲液、载体或辅料本领域所熟知的(参见Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R Gennaro，Ed.，Mack出版公司(1990)和handbook ofPharmaceutical Excipients，第3版，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。
术语“缓冲液”意指一种含有酸-碱混合物的水溶液，其目的是稳定pH。缓冲液的例子是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、羟乙酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、甲次砷酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、氨基乙醇、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
术语“稀释剂”意指一种具有稀释药物制剂中的肽的目的的水溶液或非水溶液。稀释剂可以是盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉花子油或芝麻油)中的一种或多种。
术语“佐剂”意指加入到剂型中来增强肽的生物效果的任意化合物。佐剂可以是带有不同阴离子的锌、铜或银盐中的一种或多种，所述阴离子例如，但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、tiocyanate、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、羟乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐和不同酰基组成的醋酸盐。
赋形剂可以是碳水化合物、聚合物、脂和矿物质中的一种或多种。碳水化合物的例子包括乳糖、蔗糖、甘露醇和环糊精，加入到组合物中，例如，来促进冻干。聚合物的例子是淀粉、纤维素醚、纤维素、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻(朊)酸盐、鹿角菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐(polysulphonate)、聚二乙醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同水解度的聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、和聚乙烯吡咯烷酮，全都具有不同的分子量，被加入到组合物中，例如，用于粘(滞)性控制，用于实现生物粘附，或者用于保护脂不被化学和蛋白水解的降解。脂的例子为脂肪酸、磷脂、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、神经酰胺、神经鞘脂和糖脂，都具有不同的酰基链长度和饱和度，蛋卵磷脂、黄豆卵磷脂、氢化蛋和黄豆卵磷脂，因为和聚合物相似的原因被加入到组合物中。矿物质的例子为滑石粉、氧化镁、氧化锌和氧化钛，加入到组合物中来获得益处，例如降低液体蓄积作用或改进颜色特性。
本发明的组分还可以包含一种或多种单糖或二糖，例如木糖醇、山梨(糖)醇、甘露醇、拉克替醇、异麦芽酮糖醇(isomalt)、麦芽糖醇或木糖苷，和/或单酰基甘油，例如甘油-桂酸酯。载体的特性依赖于给药途径。一种给药途径是局部给药。例如，对于局部给药，优选的载体是包含活性肽的乳化的乳剂，但是可以使用其它常见的载体例如某种矿脂/基于无机物的和基于植物的软膏，以及聚合物凝胶、液晶相和微乳剂。
组合物可以包含一种或多种分子，例如在药物组合物中有1、2、3或4种不同的分子。在一个实施方案中，本发明涉及一种可被用于抑制、预防或破坏细菌(革兰氏阳性和阴性细菌，例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escheri ciacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna))、病毒、寄生虫、真菌和酵母(例如白色念珠菌(Candida albicans)和念珠菌属(Candida parapsilosi)以及马拉色霉菌(Malassezia species))的抗微生物组合物。通过结合使用不同分子可以增强效果并且/或者(降低)微生物产生针对抗微生物试剂的抗性和/或耐受性的可能性。但是，由于管控过程(regulatory process)的原因，在多数情况下一种分子/肽是更合适的。
所述分子/肽作为盐可以成为和无机酸的加合物，所述无机酸例如盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、磷酸、高氯酸、硫氰酸、硼酸等等，或者和有机酸，例如甲酸、乙酸、卤乙酸、丙酸、羟基乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、葡萄糖酸、乳酸、丙二酸、反式丁烯二酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、桂皮酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等等。可以加入无机盐例如单价盐、钾或二价锌、镁、铜、钙及其对应的阴离子，来增加抗微生物组合物的生物活性。
本发明的药物组合物还可以以脂质体的形式，其中除了其它的药物可接受载体以外肽还和两性试剂结合，例如以微胶粒、不溶单层和液晶聚集形式存在的脂类。用于脂质体剂型的合适的脂类包括，但不限于，甘油单酯、甘油二酯、硫脂、卵磷脂、磷脂、皂苷、胆酸等等。这种脂质体剂型的制备可参见例如US 4,235,871。
本发明的药物组合物还可以以生物可分解微球体形式存在。在微球体生产中脂肪族多酯(例如聚(乳酸)(PLA)、聚(羟基乙酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或者聚(羧基乙酸内酯)(PCL)和聚酐)已经被广泛用作生物可降解聚合物。这种微球体的制备可在US5,851,451和EP0213303中找到。
本发明的药物组合物还可以以聚合物凝胶的形式存在，其中使用聚合物例如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、鹿角菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙基乙二醇/聚氧化乙烯、聚环氧乙烷/聚氧化丙烯共聚物、聚乙烯醇/不同水解度的聚乙烯乙酸酯和聚乙烯吡咯烷酮来增稠含有肽的溶液。
本发明的药物组合物可以含有一种或多种芳香油，例如萜类、倍半萜类(sequiterpenes)和法尼醇。
此外，所述分子可被溶解于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉花子油或芝麻油)、黄蓍胶、和/或多种缓冲液中。
该药物组合物还可以包括离子和用于增强分子作用的确定的pH。
该药物组合物可接受常规的药物操作，例如灭菌并且/或者可以含有常规佐剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、填料等等，例如，如此处其它地方所述。
根据本发明该药物组合物可局部或系统给药。给药途径包括局部的、眼睛的、鼻的、肺的、口腔的、肠胃外的(静脉内的、皮下的和肌内的，等等)、耳、口服、阴道的、灌注(例如泌尿道等等)和直肠的。还可能从埋植剂给药。合适的抗微生物剂形为，例如颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、阴道栓剂(vagitories)、乳状剂、微乳剂(定义为含有水、油和表面活性剂的、光学上各向同性的、热力学稳定的系统)、液晶相(定义为具有长程有序但是短距离无序(例子包括薄层、六棱和立方相，水或油连续)特征的系统)或其分散对应物、凝胶、软膏、分散相、悬液、乳膏剂、喷雾剂、含漱液、气雾剂、微滴(droplets)或以安瓿形式的注射液以及活性化合物缓释制剂，在其制剂中按上述惯例使用辅药、稀释剂或载体。还可以在绷带、硬膏剂或在缝线等中提供所述药物组合物。
以药物有效剂量给予患者所述药物组合物。“药物有效剂量”的意思是足以产生针对给药病情的所需效果的剂量。确切的剂量根据，化合物的活性、给药方式、疾病本质和严重度、患者的年龄和体重而需要不同的剂量。可以以个体剂量单位形式或者以一些较小剂量单位进行单次给药并且还可以以再分的剂量以特定的周期多次给药。
可以单独给药本发明的药物组合物，或者和其它治疗试剂联合给药，例如抗生素、抗炎药或防腐剂例如抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和抗寄生虫剂。例子为青霉素类(penicillins)、头孢菌素类(cephalosporins)、碳头孢烯类(carbacephems)、头霉素类(cephamycins)、卡巴配能类(carbapenems)、单菌胺类(monobactams)、氨基糖苷类(aminoglycosides)、糖肽类(glycopeptides)、喹诺酮类(quinolones)、四环素类(tetracyclines)、大环内酯类(macrolides)、和荧光喹诺酮类(fluoroquinolones)。防腐剂包括碘、银、精胺、精脒、铜、氯己定(clorhexidine)、聚盐酸己双胍(polyhexanide)和其它双胍类、聚氨基葡糖、乙酸和过氧化氢。可以将这些试剂掺合作为相同药物组合物的部分或单独给药。所述药物组合物还可以含有抗炎药物例如甾类和巨内酰胺衍生物。
本发明关注人和其它哺乳动物其中例如马、狗、猫、牛、猪、骆驼。因此所述方法可应用于人体治疗和兽医应用。可以利用成熟的感染标志确定适合这种治疗的对象，例如发烧、脉搏(puls)、有机培养等。可以用所述分子治疗的感染包括被或者由于微生物引起的感染。微生物的例子包括细菌(例如，革兰氏阳性、革兰氏阴性)、真菌(例如，酵母和霉菌)、寄生虫(例如，原生动物、线虫、绦虫和吸虫)、病毒和朊病毒。这些类型中的特殊的有机体是被人所熟知的(参见例如，Davis等人，微生物学，3.sup.rd edition，Harper & Row，1980)。感染包括，但不限于，慢性皮肤溃疡、感染的急性创口和烧伤创、感染的皮肤湿疹、小脓疱疹、特应性皮炎、粉刺、外耳炎、阴道感染、脂溢性皮炎、口腔感染和牙周炎、念珠菌性擦烂、结膜炎和其它眼部感染，和肺炎。
相应的，所述药物组合物可用于烧伤创面、手术后和在皮肤创伤后的预防疗法。所述药物组合物还可以被包含于溶液中，用于和人体接触的外部材料的储存和处理，所述外部材料例如隐形眼镜、矫形外科埋植物和导管。
此外，所述药物组合物可用于治疗特应性皮炎、小脓疱疹、慢性皮肤溃疡、感染的急性创口和烧伤创面、粉刺、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂溢性皮炎、念珠菌性擦烂、念珠菌阴道炎、口咽念珠菌病、眼部感染(细菌性结膜炎)、和鼻感染(包括甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌携带(MRSA carriage))。
所述药物组合物还可用于清洗液中，例如镜片消毒剂和储存溶液或者用于防止尿管使用中或中央静脉导管使用中的细菌感染。
此外，所述抗微生物组合物可用在硬膏剂、粘着剂、缝线中或者和创伤敷料混合来防止手术后感染。
所述分子还可用于聚合物、纺织品等中来产生抗菌表面或化妆品中，并且在个人护理产品(肥皂、洗发水、牙膏、湿巾、抗痘、防晒霜、卫生棉条、尿布等)中可以添加该药物组合物。
本发明还涉及上面定义的分子和药物组合物在医物中的用途。
本发明还涉及上面定义的分子或和SEQ ID NO：19至少具有80％序列一致性的多肽，例如85％，90％，95％，97％，99％或100％序列一致性或如上面定义的组合物的用途，来制备用于减少和/或清除微生物，来治疗或预防微生物感染的抗微生物组合物。
所述分子、组合物和/或多肽还可用于防止/减少或治疗由一种或多种不同微生物的混合物引起的紊乱或疾病，例如不同细菌、不同病毒等的混合物或病毒、细菌、真菌、酵母和原生动物等的混合物。
最后，本发明涉及使用上面定义的药物组合物治疗哺乳动物的方法，例如患有微生物感染或者患有过敏症的哺乳动物，包括向患者给予治疗有效量的、上面定义的药物组合物。
实施例
序列定义
为了找到描述的抗菌肽的类似物，确定了特定区域的序列模式。使用ScanProsite搜索工具(http://www.expasy.org/tools/scanprosite/)对Swiss-Prot蛋白质数据库(http://www.expasy.org/sprot/)中的人蛋白质进行了搜索。
ScanProsite工具能够扫描蛋白质序列(UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot/TrEMBL)或PDB或使用者提供的)，寻找储存于PROSITE数据库中的模式、谱(profiles)和规则(基序，motifs)的存在，或者搜索蛋白质数据库寻找特定基序的命中(hit)。
根据下面语法构建保守区域的模式：
在PROSITE数据库中使用的模式语法：
1.使用氨基酸的标准IUPAC单字母编码。
2.在任意氨基酸都可被接受的位置使用符号′x′。
3.对于给定位置，在方括号′[]′之间通过列出的可接受氨基酸的清单来指征不确定性。例如：[ALT]代表Ala或Leu或Thr。
4.还通过在给定位置在一对大括号′{}′之间列出不可接受的氨基酸来指征不确定性。例如，{AM}代表除了Ala和Met以外的任意氨基酸。
5.在模式中每个元素之间都用′-′隔开。
6.可以通过在元素后面带有数值或者，如果它是一个缺口(′x′)，通过圆括号之间的数字范围，来指征模式的元素的重复。
例子：
x(3)对应于x-x-x
x(2，4)对应于x-x或x-x-x或x-x-x-x
A(3)对应于A-A-A。
备注：你只能对′x′使用范围，即，A(2，4)不是一种有效的模式元素。
7.当一个模式被限制在序列的N-或C-末端，该模式或者以′<′符号起始，或者以′>′符号结束。在某些罕见的情况下(例如，PSO0267或PS00539)，对于C-末端元素′>′还可以发生在方括号内。′F-[GSTV]-P-R-L-[G>]′的意思是或者考虑′F-[GSTV]-P-R-L-G′或者考虑′F-[GSTV]-P-R-L>′。
实施例1
获自人肝素结合生长因子(FGFs)的分子的肽结构的鉴定
成纤维细胞生长因子(FGFs)通过在存在肝素蛋白聚糖时结合到细胞表面的FGF受体(FGFRs)上来刺激多种细胞功能。受体激活使信号转导级联发生，导致基因激活和不同的生物响应。FGFs和FGFR以确定的空间和时间模式表达，并且它们参与了上皮细胞和神经细胞的分化。对于多种细胞类型，FGFs是有效的促有丝分裂剂。FGFs是分泌因子，最初是根据其向成纤维细胞的促细胞分裂性能鉴定出来的。它们是小蛋白质，已经确定了数种FGF晶体结构；所有的都在β-三叶草形折叠中具有12个β折叠(Szebenyi G.和Fallon J F，Int Rev Cytol.，1999，185，45-106)。
从肝素结合生长因子1(FGF1，存取码(accession code)为P05230)结合肝素的区域中获得的肽是抗菌的。对应于Leu126-Leu146的肽，LKK21在体外显示出抗菌活性。
下面的PROSITE基序找到19个属于β-三叶草形超家族的人肝素结合生长因子，该超家族对应于LKK21分子(图1，表1)。
[FILV]-X-[KRGQ]-X-G-X(2)-[KRMV]-X-[AG]-X(1，3)-[HKR]-[STV]-[HKRGS]-X(6)-[HL]-F
(最后的苯丙氨酸未包括在被检测的肽中，但是在所有的FGFs中它是保守的，并且需要它来定义该组)
表1.当用上面定义的PROSITE模式在Swiss Prot数据库中搜索发现的人序列。

实施例2
获自人肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和双向调节因子的分子的肽结构的鉴定
人肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF，存取码Q99075)可参与巨噬细胞介导的细胞增殖。它对成纤维细胞和平滑肌是促有丝分裂的，但对内皮细胞不是。它能以高于EGF自身的亲和力结合EGF受体，并且和EGF相比对于平滑肌是远更有效的促有丝分裂剂(Higashiyama S.等人1991，Science，251，936-939)。它还充当白喉毒素的受体。对应于HB-EGF的Gly92-lys113，GKR22的肽在体外显示出抗菌活性。
人两栖调节素或结肠直肠细胞衍生的生长因子(AR，存取码P15514)是一种双功能的生长调节糖蛋白。它抑制数种人癌细胞在培养基中的生长并且刺激人成纤维细胞和其它某些肿瘤细胞的增殖(ShoyabM.等人，1989，Science，243，1074-1076)。对应于双向调节因子的Pro124-Asn144，PKR21，的在体外肽显示出抗菌活性。
下面的PROSITE基序在两种对应于GKR22分子的生长因子蛋白质中发现了一个区域(表2)。
X-K-X-K-[KR]-K-X-K-G-X(2，10)-K-K-[KR]-X-P-C-X(3)-[FY]-X
表2.当用上面定义的PROSITE模式搜索Swiss Prot数据库时发现的人序列。双向调节因子衍生的分子PKR21被包含于显示区域，但是更短。

HB-EGF和双向调节因子具有非常相似的氨基酸序列，并且两种蛋白质都含有一个EGF样结构域。抗菌肽GKR22和PKR21都来自于对应于这个EGF样结构域的氨基末端的一个区域(图2)。
实施例3
来自于人血小板衍生的生长因子的分子的肽结构的鉴定。
血小板衍生的生长因子(PDGF)是间充质细胞来源的细胞的一种有效的促有丝分裂剂，包括平滑肌细胞和神经胶质细胞。在小鼠和人中，PDGF信号网络包括4种配基，PDGF A-D和两种受体，PDGFRα和PDGFRβ。所有的PDGFs以分泌的、二硫交联的同型二聚体来发挥功能，但是只有PDGF A和B形成异二聚体。PDGFRs也以同型和异二聚体发挥功能。所有已知的PDGFs都具有特征性的′PDGF结构域′，其包括8个保守的半胱氨酸，参与分子间和分子内的键。A链转录物的替代剪接可以形成两种不同的形式，其只在C-末端有差异。它们属于PDGF/VEGF生长因子家族(Hannink M和Donoghue DJ.，1989，Bio-chimBiophys Acta，989，1-10)。
对应于不同PDGFs的羧末端残基的肽在体外显示出抗菌活性。肽GRP19对应于人PDGF A(存取码P04085)的Gly194-Thr211并且肽LRP24对应于Leu148-Thr171、肽QRA21对应于Gln199-Pro219，并且肽RVR21对应于人PDGF B(存取码P01127)的Arg214-Ala234(图3)。
实施例4
分子
利用Innovagen AB(Ideon，SE-22370，Lund，瑞典)合成肽。通过质谱分析来确证这些肽的纯度(>95％)和分子量(MALDI.TOFVoyager)(见表1)。
在实验中使用的分子。
根据Uni-ProtKB/Swiss-Prot entry(http://www.expasy.org/sprot/)中未加工的前体的名称和编号。
表3