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本发明涉及病毒载体，其包括编码HIV多肽的寡核苷酸，更具体地，其中所述病毒是腺病毒。具体而言，此类腺病毒是非人类的灵长类动物腺病毒，诸如猿猴腺病毒，更具体地，黑猩猩腺病毒。具体而言，本发明涉及腺病毒载体，其包括编码多种不同HIV抗原的HIV多核苷酸序列，例如两种或三种或者更多种的HIV抗原。本发明进一步涉及制备所述病毒载体的方法，涉及由此方法制备的病毒载体，并涉及所述载体在医药，尤其是在预防性或治疗性疫苗接种方面的用途。

1.  一种腺病毒载体，包括编码至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它们的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸被如此安排以便使它们按照Gag、RT、Nef的顺序被转录。

2.  根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中所述RT是被截短的。

3.  根据权利要求1或2所述的腺病毒载体，其中所述Nef是被截短的。

4.  根据权利要求1至3任一项所述的腺病毒载体，其中所述Gag只是p17和p24。

5.  根据前述权利要求中任一项所述的腺病毒载体，其中所述的一种或多种HIV多核苷酸的大小使得所述载体的总体大小为所述病毒大小的90至100％。

6.  根据前述权利要求中任一项所述的腺病毒载体，其中所述病毒是非人灵长类动物腺病毒。

7.  根据权利要求6所述的腺病毒载体，其中所述病毒是黑猩猩腺病毒。

8.  根据权利要求7所述的腺病毒载体，其中所述的腺病毒选自pan5、6、7和9。

9.  根据权利要求8所述的腺病毒载体，其中所述的腺病毒是pan6。

10.  根据权利要求8所述的腺病毒载体，其中所述的腺病毒是pan7。

11.  根据前述权利要求中任一项所述的腺病毒载体，其中所述病毒是复制缺陷型的。

12.  根据前述权利要求中任一项所述的腺病毒载体，其中所述病毒的E1和E3区是缺失的。

13.  根据前述权利要求中任一项所述的腺病毒载体，其中编码所述HIV抗原的多核苷酸序列被安排为融合形式。

14.  一种黑猩猩腺病毒载体，包括下列多核苷酸构建物之一:
p17，p24(密码子经优化)Gag-p66RT(密码子经优化)-截短的Nef；
截短的Nef-p66RT(密码子经优化)-p17，p24(密码子经优化)Gag；
截短的Nef-p17，p24(密码子经优化)Gag-p66RT(密码子经优化)；
p66RT(密码子经优化)-p17，p24(密码子经优化)Gag-截短的Nef；
p66RT(密码子经优化)-截短的Nef-p17，p24(密码子经优化)Gag；
p17，p24(密码子经优化)Gag-截短的Nef-p66RT(密码子经优化)。

15.  根据权利要求14的腺病毒载体，其中所述腺病毒是Pan6或Pan7，条件是当所述腺病毒是Pan6时，所述构建物不是p66RT(优化)-trNef-p17，p24(优化)Gag。

16.  一种免疫原性组合物，包括前述权利要求中任一项所述的病毒载体和药学上可接受的载体或佐剂。

17.  根据权利要求1至15任一项所述的腺病毒载体的用途，其被用于制备治疗或预防HIV感染的药物。

18.  制备权利要求1至15任一项所述的载体的方法，包括步骤:
a)提供腺病毒载体；
b)提供携带所述HIV抗原序列的质粒，所述序列可操作地连接于合适的启动子；
c)用所述质粒和所述载体一起转染细胞；
d)给予充足的时间使重组发生；以及
e)回收携带所述HIV抗原序列的重组病毒载体。

19.  一种在哺乳动物中产生免疫反应的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用适当量的根据权利要求16的免疫原性组合物。

20.  由权利要求1至15任一项所述的载体表达的融合蛋白。

21.  根据权利要求20的融合蛋白，其在人体内产生。

疫苗组合物
技术领域
本发明涉及病毒载体，包括编码HIV多肽的寡核苷酸，更具体地，其中所述病毒载体是腺病毒。具体而言，此类腺病毒是非人灵长类动物腺病毒，诸如猿猴腺病毒(simian adenovirus)，更具体地，是黑猩猩腺病毒。具体而言，本发明涉及包括HIV多核苷酸序列的腺病毒载体，该序列编码多种不同的HIV抗原，例如，两种或三种或者更多种HIV抗原。本发明进一步涉及制备所述病毒载体的方法，涉及通过本方法所制备的病毒载体，并涉及所述载体在医药，尤其是在预防性或者治疗性疫苗接种方面的用途。
HIV-1是导致获得性免疫缺陷综合征(the acquired immunedeficiency syndrome，AIDS)的主要原因，该病症被认为是世界上的主要健康问题之一。尽管在世界范围内已进行了广泛的研究，但生产疫苗的努力至今尚未获得成功。
HIV-1是反转录病毒科的一种RNA病毒。HIV基因组编码至少九种蛋白，其被划分为三个种类:主要的结构蛋白Gag、Pol和Env，调控蛋白Tat和Rev，以及辅助蛋白(accessory proteins)Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因组显示了所有反转录病毒的5′LTR-gag-pol-env-LTR3′组织方式。
腺病毒是一种双链DNA病毒，基因组大小大约36kb，由于其具有在多种靶组织中获得高效基因转移的能力以及巨大的转基因容量而被广泛地用于基因转移。按常规，腺病毒的E1基因缺失，并用转基因盒替换，该转基因盒由所选的启动子、感兴趣基因的cDNA序列和polyA信号组成，从而产生复制缺陷型重组病毒。
腺病毒具有典型的二十面体衣壳形态，其包括三种主要的蛋白，六邻体(hexon)(II)、五邻体基底(penton base)(III)和具圆柄的纤维(IV)，以及大量的其它次要蛋白Vl、VIII、IX、IIIa和IVa2(Russell W.C.2000，Gen Virol，81:2573-2604)。该病毒的基因组是线性双链DNA，5′末端与末端蛋白共价结合，所述5′末端具有反向末端重复序列(invertedterminal repeats，ITRs)。病毒DNA与高碱性蛋白VII以及被命名为.mu小肽紧密结合。另一种蛋白，V，与此DNA-蛋白复合体包装在一起，并通过蛋白VI提供了一种连接至衣壳的结构链。此病毒同样包含病毒编码的蛋白酶，其对于加工一些结构蛋白以产生出成熟的传染性病毒而言是必要的。
100种以上不同血清型的腺病毒已被分离出来，其感染不同种类的哺乳动物，其中51种是人类起源的。此类人类起源的腺病毒实例为Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Ad11、Ad24、Ad34、Ad35。人类的血清型根据一些生物学、化学、免疫学和结构标准已被划分为六个亚类(A-F)[第一页，WO04018627]。
尽管基于Ad5的载体已在大量的基因治疗试验中被广泛地使用，但是由于自然感染而在总体人群中预先存在的免疫性，使得Ad5以及其它C组腺病毒载体的使用可能受到限制。Ad5以及其它C组成员容易成为血清阳性率最高的血清型之一。对现有载体的免疫性可能由于在治疗期间暴露于该载体而得以发展。此类对血清阳性载体的预先存在的或者发展的免疫性可能会限制基因治疗或者接种疫苗努力的功效。因此，在寻找能够规避宿主免疫反应的基因递送系统时，可选的腺病毒血清型构成了非常重要的靶标。
可选血清型的一种此类范围是非人灵长类动物的腺病毒，尤其是黑猩猩腺病毒。参见美国专利6,083,716，其描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组。
已表明黑猩猩(＂Pan＂或＂C＂)腺病毒载体如同人腺病毒载体一样有效地诱导对转基因产物的强烈的免疫反应(Fitzgerald et al.J.Immunol.170:1416)。
HIV Tat和Nef蛋白是早期蛋白，即它们是在感染的早期，在缺乏结构蛋白的情况下表达。
Nef基因编码一种早期的辅助性HIV蛋白，其已被表明具有若干种活性。例如，已知Nef蛋白能够引起CD4，HIV受体，从细胞表面的清除，尽管此功能的生物学重要性还有争议。此外，Nef与T细胞的信号通路相互作用并诱导了一种活化状态，此状态反过来可以促进更有效的基因表达。一些HIV分离物在此区域内具有突变，其致使它们无法编码功能蛋白并导致其在体内复制和致病过程中严重受损。
Gag基因是由全长RNA翻译而来，以产生一种前体多聚蛋白，其随后被剪切成3-5种衣壳蛋白；基质蛋白、衣壳蛋白和核酸结合蛋白以及蛋白酶。(Fundamental Virology，Fields BN，Knipe DM andHowley M 1996 2.Fields Virology vol 2 1996)。
Gag基因产生出55-千道尔顿(kD)的Gag前体蛋白，也被称为p55，其由未经剪接的病毒mRNA表达。在翻译过程中，p55的N末端被豆蔻酰化，这引发了其与细胞膜胞质面的结合。膜结合的Gag多聚蛋白募集了病毒基因组RNA的两个拷贝，以及其它病毒蛋白和细胞蛋白，这引发了病毒颗粒从感染细胞的表面出芽。出芽后，在病毒成熟期间p55被病毒编码的蛋白酶(Pol基因的产物)切割为四种更小的蛋白，被命名为MA(基质matrix[p17])、CA(衣壳capsid[p24])、NC(核壳体nucleocapsid[p9])和p6.(4)。
除三种主要的Gag蛋白(p17，p24 and p9)之外，所有Gag前体都含有若干个其它区域，其被切割下来并作为各种大小的肽保留在病毒粒子中。这些蛋白具有不同的作用，例如p2蛋白被提出在调节蛋白酶活性方面具有作用，并且有助于对蛋白水解加工进行正确的时间选择。
MA多肽来源于p55的N-端，豆蔻酰化末端。大多数MA分子保持连接于病毒粒子脂双层的内表面，使该病毒颗粒稳定。一套(subset)MA在病毒粒子更深层的内部被募集，在其中它成为复合物的一部分，该复合物护送病毒DNA至细胞核。这些MA分子促进了病毒基因组的核转运，因为MA上的亲细胞核信号被细胞的核输入机器所识别。此现象使HIV能够感染不发生分裂的细胞，对反转录病毒而言是一种不寻常的特性。
p24(CA)蛋白构成病毒颗粒的圆锥形核心。亲环蛋白A(CyclophilinA)已被证实与p55的p24区域相互作用，导致其整合入HIV颗粒中。Gag与亲环蛋白A之间的相互作用是必不可少的，因为通过环孢菌素A破坏这种相互作用抑制了病毒的复制。
Gag的NC区负责特异性地识别所谓HIV包装信号。该包装信号由定位于病毒RNA 5′末端附近的四个茎环结构组成，并且足以介导将异源RNA整合进HIV-1病毒粒子中。NC通过由两个锌指基元介导的相互作用而结合于包装信号。NC同样有助于反转录过程。
p6多肽区介导p55 Gag和辅助蛋白Vpr之间的相互作用，导致Vpr被整合入装配中的病毒粒子。p6区同样含有所谓的晚期结构域(latedomain)，其是出芽的病毒粒子从感染细胞中有效释放所必需的。
Pol基因编码三种具有病毒早期感染所需活性的蛋白，反转录酶RT、蛋白酶以及使病毒DNA整合入细胞DNA所需的整合酶蛋白。Pol的初级产物被病毒粒子的蛋白酶切割以产生氨基末端的RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA指导的DNA聚合酶，核糖核酸酶H)，以及羧基末端的整合酶蛋白。HIV RT是全长RT(p66)与剪切产物(p51)的异源二聚体，其缺少羧基末端核糖核酸酶整合酶结构域。
RT是反转录病毒基因组所编码的最高度保守的蛋白之一。RT的两种主要活性是DNA Pol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可互换地(interchangeably)使用RNA和DNA作为模板，而且如同所有已知的DNA聚合酶一样，无法从头启始DNA合成，而是需要预先存在的分子作为引物(RNA)。
当进行DNA合成时，所有RT蛋白所固有的核糖核酸酶H活性在复制早期去除RNA基因组的过程中发挥着基本的作用。它从所有RNA-DNA杂合体分子中选择性地降解RNA。在结构上，聚合酶和核糖核酸酶H占据了Pol中分开且不相重叠的结构域，占Pol三分之二的氨基酸。
p66的催化亚基被折叠成5个不同的亚结构域。其氨基末端23是具有具RT活性的部分。其羧基末端是核糖核酸酶H的结构域。
在感染宿主细胞后，反转录病毒的RNA基因组被反转录酶拷贝成线性的ds DNA，所述反转录酶存在于传染性颗粒中。整合酶(在Skalka AM′99Adv in Virus Res 52 271-273中综述)识别病毒DNA的末端，修整它们并陪伴病毒DNA至宿主染色体位点以催化整合。宿主DNA中的许多位点可以是整合的靶标。尽管整合酶足以催化体外整合，但它并不是唯一与病毒DNA体内结合的蛋白，从被感染的细胞中分离出来的大的蛋白-病毒DNA复合物被称为整合前复合物(preintegration complex)。这有助于通过子代病毒基因组来获取宿主细胞的基因。
整合酶由三个不同的结构域组成，N末端结构域、催化核心和C末端结构域。催化核心结构域包含了所有聚核苷酰基转移化学所需的条件。
病毒载体，特别是含有多个外源基因的腺病毒载体并非总是容易制备。可能存在载体稳定性方面的问题，以及获得插入基因有效表达方面的困难。特别是，包含一种以上或者两种以上HIV多核苷酸的腺病毒尚未被成功制备出来，所述多核苷酸可以被用于疫苗中。
非人灵长类动物腺病毒可以从黑猩猩的肠系膜淋巴结中分离。黑猩猩腺病毒与人腺病毒亚型C十分相似，使得E1缺失型病毒能够在HEK293细胞中复制。但黑猩猩腺病毒与更常见的人类血清型(Ad2和Ad5)在系统发生上不同。Pan 6与Pan′s 5、7和9相关度更低，且在血清学上不同。
存在某些大小方面的限制，其与将异源DNA插入腺病毒相关。人类腺病毒具有包装多达105％或者野生型基因组长度的能力。(Bett etal 1993，J Virol 67(10)，5911-21)。对人类腺病毒更低的包装限制已被表明为野生型基因组长度的75％(Parks et al 1995，J Virol 71(4)，3293-8)。
对于寻找对抗HIV的有效疫苗仍存在需求。
本发明提供了缺失一个或多个区域的腺病毒载体，该载体包括编码至少三种HIV抗原或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的一条或多条多核苷酸，其中所述载体能够在哺乳动物宿主中表达所述抗原或者片段或衍生物，并且其中所述缺失的大小以及所述一条或多条HIV多核苷酸的大小是这样的，其使得所述载体基因组的全长是野生型病毒基因组长度的85至105％。
在本发明的一种实施方式中，由所述一条或多条多核苷酸编码的HIV抗原可以是Gag、Nef和Pol。在进一步的实施方式中，Pol可以只包括RT部分。在本发明的另一种实施方式中，编码所述HIV抗原的一条或多条多核苷酸可以被安排为按Gag、RT、Nef的顺序进行转录，即Gag部分位于所产生的融合蛋白的N-末端。
整个载体基因组的大小可以是例如野生型病毒基因组大小的90至100％，或者野生型病毒基因组大小的95至100％。在一种实施方式中，所述载体的全部大小可以是野生型病毒基因组大小的大约96％。
用于包含在根据本发明的腺病毒载体中的特定HIV抗原是Pol、Nef和Gag或者它们的免疫原性衍生物或免疫原性片段。
此类腺病毒载体可以与药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂或者佐剂一起配制以生产免疫原性组合物，包括适于治疗和/或预防HIV感染和AIDS的药物或疫苗组合物。
本发明中所使用的腺病毒不同于人类群体中流行的天然存在的(prevalent naturally occurring)血清型，诸如Ad2和Ad5，的腺病毒。这就避免了诱发针对所述载体的强大的免疫反应，其通过中和抗体以及影响毒性而阻断了载体的摄入，从而限制了以后施用相同血清型的功效。
因此，该腺病毒载体可以是腺病毒，其并非是流行的天然存在的人类病毒血清型。从动物中分离的腺病毒含有免疫学上不同的衣壳、六邻体、五邻体和纤维组分，但它们在系统发生学上密切相关。特别地，所述病毒可以是非人类的腺病毒，诸如猿猴病毒，并且尤其是黑猩猩腺病毒，诸如Pan5、6、7或者9。此类品系的实例在WO03/000283中被描述，并可从美国典型培养物保藏中心(the American Type CultureCollection)，1080 1University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209以及其他来源获得。理想的黑猩猩腺病毒株系是Pan5[ATCC VR-591]、Pan 6[ATCC VR-592]和Pan7[ATCC VR-593]。其它合适的腺病毒包括，但不限于，黑猩猩腺病毒C1和C68(Pan9)，其在美国专利No.6,083,716中被加以描述；以及猿猴腺病毒包括，但不限于SV1[VR-195]；SV25[SV-201]；SV35；SV15；SV-34；SV-36；SV-37和狒狒腺病毒[VR-275]等。Pan5(也被称为C5)、Pan6(也被称为C6)、Pan7(也被称为C7)、SV1、SV25和SV39的序列已被加以描述[WO03/046124，2003年6月5日公布]。还参见国际专利公布号WO04/16614，其描述了杂种腺病毒载体和由猿猴腺病毒SA18构建的载体。
黑猩猩腺病毒由于缺少对目标种群中的腺病毒预先存在的免疫性，尤其是缺少交叉中和抗体而被认为是优于人类腺病毒血清型。与某些候选的人类腺病毒载体在目标种群中35％的交叉反应相比，黑猩猩腺病毒与预先存在的中和抗体反应的交叉反应在目标种群中仅为2％。所述黑猩猩腺病毒不同于更常见的人类亚型Ad2和Ad5，但与人类亚组E的Ad4更密切的相关，Ad4并非流行的亚型。Pan6与Pan5、7和9相关度更低。
本发明的腺病毒可以是复制缺陷型。这意味着其与野生型病毒相比，在非互补细胞中具有减弱的复制能力。这可以通过使病毒突变，例如通过使涉及复制的基因缺失，例如使E1a、E1b、E3或E4基因缺失而产生。
根据本发明所述的腺病毒载体可以是包括功能性E1缺失的复制缺陷型腺病毒。因此，根据本发明所述的腺病毒载体可以由于缺乏表达腺病毒E1a和E1b的能力，即在E1a和E1b中被功能性缺失而是复制缺陷型的。重组的腺病毒也可以在其它基因中包含功能性缺失[参见WO 03/000283]，例如在E3或E4基因中的缺失。腺病毒延迟早期基因(delayed early gene)E3可以从构成重组病毒一部分的猿猴腺病毒序列中被去除。E3的功能不是生产重组腺病毒颗粒所必需的。因此，替换此基因产物的功能以包装在本发明中有用的重组猿猴腺病毒并不是必需的。在一项特殊的实施方式中，该重组(猿猴)腺病毒含有功能性缺失的E1和E3基因。此类载体的构建过程在Roy et al.，Human GeneTherapy 15:519-530，2004中被加以描述。
重组腺病毒同样可以被构建为含有功能性缺失的E4基因，尽管保留E4ORF6的功能可能是理想的。根据本发明的腺病毒载体也可以含有延迟早期基因E2a的缺失。缺失同样可以在猿猴腺病毒基因组的晚期基因L1至L5的任何一个中进行。同样地，中期基因(intermediategenes)IX和Iva中的缺失可能是有用的。
其它缺失可以在其它结构性或非结构性腺病毒基因中进行。以上缺失可以被单个使用，即用于本发明的腺病毒序列可以只含有E1的缺失。作为另一种选择，能够有效破坏整个基因或者其一部分的生物学活性的缺失可以以任何组合方式使用。例如在一种示例性的载体中，腺病毒序列可以含有E1基因和E4基因的缺失，或者E1、E2a和E3基因的缺失，或者E1和E3基因的缺失(诸如E1a和E1b的功能性缺失，以及E3的至少一部分的缺失)，或者E1、E2a和E4基因的缺失，带有或不带有E3的缺失等等。此类缺失可以是这些基因的部分缺失或全部缺失，并可以与其它突变方式，诸如温度敏感型突变组合使用以取得所期望的结果。
所述腺病毒载体可以在任何合适的细胞系中制备，在该细胞系中所述病毒能够复制。特别地，可以使用互补细胞系(complementing celllines)，该细胞系提供了病毒载体中失去的因子，该失去的因子导致了受损的复制特征。例如，互补细胞系可以表达E1、或者E1和E3、或者E1、E3和E4。没有限制地，此类细胞系可以是HeLa[ATCC AccessionNo.CCL2]、A549[ATCC Accession No.CCL 185]、HEK 293、KB[CCL17]、Detroit[e.g.，Detroit 510，CCL 72]和WI-38[CCL 75]细胞等。这些细胞系均可从美国典型培养物保藏中心(the American Type CultureCollection)，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209获得。其它合适的亲代细胞系可以从其它来源获得，诸如PER.C6细胞，如通过以ECACC no.96022940保藏于应用微生物学与研究中心(theCentre for Applied Microbiology and Research，CAMR，UK)的欧洲动物细胞培养物保藏中心(the European Collection of Animal CellCultures，ECACC)的细胞所代表的。
本发明在另一方面提供了一种腺病毒载体，包含以Gag、RT、Nef顺序编码至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它们的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一条或多条多核苷酸，换言之，腺病毒载体包含编码至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它们的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一条或多条多核苷酸，其被如此排布以使得它们按Gag、RT、Nef的顺序被转录。
例如，根据本发明所述的腺病毒载体可以包括编码Gag或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的多核苷酸，其被融合于编码RT或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的多核苷酸序列，其被融合于Nef或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段，并在单个异源启动子的控制下，其中该基因的Gag部分存在于所述多核苷酸的5′末端。
在本发明的另一种备选的实施方式中，所述三种抗原中的每一种均通过其自身的启动子进行表达，每一种所述的启动子可以是相同的或不同的。在本发明的另一种实施方式中，三种抗原中的两种形成融合物，连接于单个启动子，而第三种抗原被连接于第二个启动子上，该第二个启动子可以与第一个启动子相同或不同。例如，Gag和RT可以被连接于第一启动子，而Nef可以被连接于第二启动子。
编码至少三种HIV抗原或者它们的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一条或多条多核苷酸可以被插入任何腺(Adeno)缺失区，例如插入E1缺失区。
尽管编码抗原的两条或多条多核苷酸可以连接为融合形式，但所产生的蛋白质可以表达为融合蛋白，或者可以表达为分离的蛋白产物，或者可以表达为融合蛋白，然后被分解为更小的亚基。
在一方面，本发明提供了一种由根据本发明的载体所表达的融合蛋白，例如，人体内产生的融合蛋白。
被包括在根据本发明的载体中的编码例如Nef、Gag或RT的一条或多条HIV序列可以针对哺乳动物细胞进行了密码子优化，例如使它/它们在其密码子使用方面与高表达的人类基因相类似。这些HIV序列的密码子优化在WO 03/025003中被进一步加以描述。
例如，在根据本发明的腺病毒载体中，编码Gag和/或RT的多核苷酸可以如上面所讨论的进行了密码子优化。
根据本发明的腺病毒载体中的Gag序列可以不包括Gag p6多肽编码序列。用于本发明的Gag序列的具体实例包括p17和/或p24编码序列。
RT序列可以编码突变以使任何反转录酶活性基本失活。一种具体的失活突变包括将W色氨酸229置换为K(赖氨酸)，参见WO03/025003。
如上所述，RT基因是HIV基因组中更大的Pol基因的组分。应当理解，包括在根据本发明的腺病毒载体中的RT编码序列可以存在于Pol的范围(context)中，或者是至少编码RT的Pol片段。Pol的此类片段保留了Pol的主要CTL表位。在一个具体的实例中，RT仅以RT的p51或者p66片段而被包括在内。
任选地，用于本发明的Nef序列被截短以去除编码N末端区的序列，即去除30至85个氨基酸，例如60至85个氨基酸，尤其是N末端的65个氨基酸(后一种截短方式在此被称为trNef)。备选地或额外地，Nef可以被修饰以去除一个或多个肉豆蔻酰化位点(myristylationsites)。例如，Gly 2肉豆蔻酰化位点可以通过缺失或置换而被去除。备选地或额外地，Nef可以通过缺失或置换Leu 174和Leu 175中的一个或两个而被修饰以改变此双亮氨酸基序(dileucine motif)。在CD4的下调过程中，此双亮氨酸基序的重要性在例如Bresnahan P.A.et al(1998)Current Biology，8(22):1235-8中被加以描述。
根据本发明的构建物可以包括Gag、Pol和Nef，其中存在这些天然抗原的至少75％，或至少90％或至少95％，例如96％的CTL表位。
在根据本发明的包括p17/p24 Gag、p66 RT和如上所定义的截短的Nef的构建物中，存在天然Gag、Pol和Nef抗原的96％的CTL表位。
本发明的一种实施方式提供了一种腺病毒载体，包括按Gag、RT、Nef顺序编码p17、p24(优化的)Gag、p66 RT(优化的)、截短的Nef(缺少编码末端氨基酸1-85-＂trNef＂的核苷酸)的一条或多条多核苷酸。
根据本发明的构建物包括:
1.p17，p24(密码子经优化)Gag-p66 RT(密码子经优化)-截短的Nef；
2.截短的Nef-p66 RT(密码子经优化)-p17，p24(密码子经优化)Gag；
3.截短的Nef-p17，p24(密码子经优化)Gag-p66 RT(密码子经优化)；
4.p66 RT(密码子经优化)-p17，p24(密码子经优化)Gag-截短的Nef；
5.p66 RT(密码子经优化)-截短的Nef-p17，p24(密码子经优化)Gag；
6.p17，p24(密码子经优化)Gag-截短的Nef-p66 RT(密码子经优化)。
本发明的一种或多种多核苷酸可以含有接头序列，其存在于编码Gag、RT和Nef的序列之间。此类接头序列可以是，例如，长度达20个氨基酸。在一个具体实例中，它们可以是1至10个氨基酸，或者1至6个氨基酸，例如2至4个氨基酸。
本发明的多核苷酸可以包含进一步的HIV序列。特别是，它们可以包括HIV env蛋白或者它们的免疫原性衍生物或免疫原性片段。env的适当形式是gp120、gp140和gp160。其它适当的HIV序列包括但不限于Tat、Rev、Vpu、Vpr和Vif。因此，本发明进一步提供了一种腺病毒载体，包括按Gag、RT、Nef的顺序编码HIV抗原RT、Nef和Gag或者它们的免疫原性衍生物或免疫原性片段以及HIV env蛋白或者它们免疫原性衍生物或免疫原性片段的一个或多个多核苷酸。
此外，本发明包括一种免疫原性组合物，其包括根据本发明的腺病毒载体与第二种腺病毒载体的组合，所述第二种腺病毒载体包括编码一种或多种HIV抗原的一个或多个多核苷酸。
应当理解，对于包括在本发明中的所有HIV序列而言，它们并非必须代表编码全长蛋白或天然蛋白的序列。免疫原性衍生物，诸如截短的或以其它方式改变的，例如突变的蛋白也可以被考虑，编码至少一种HIV表位，例如CTL表位(一般是至少8个氨基酸的肽)的片段，也可以被考虑。只要所编码的寡肽或多肽表现出HIV抗原性，也就是说主要的CTL表位由该寡肽或多肽保留下来，那么编码至少8个，例如8-10个氨基酸或者长度达20、50、60、70、100、150或200个氨基酸的片段的多核苷酸被认为是属于本发明的范畴。主要的CTL表位在此被定义为能够引起体内免疫反应的那些表位。由根据本发明所述的多核苷酸序列编码的HIV多肽分子可以代表至少50％天然蛋白长度的片段，该片段可以包含突变，但其保留了至少一种HIV表位并表现出HIV抗原性。此类HIV抗原性可以通过例如测量抗体或者细胞介导的反应而被加以测量。类似地，根据本发明的免疫原性衍生物必须表现出HIV抗原性。免疫原性衍生物可以提供一些超过天然蛋白的潜在优势，诸如减少或去除天然蛋白的功能，该功能在疫苗抗原中是不想要的，诸如酶活性(RT)、或者CD4下调作用(Nef)。所述多核苷酸序列可以是针对哺乳动物细胞而进行了密码子优化的，根据本文所述的本发明密码子优化的方面进行。
本发明进一步提供了一种制备根据本发明所述的载体的方法，包括步骤:
a)提供腺病毒载体；
b)提供质粒，其携带可操作地连接于适当启动子的所述HIV抗原序列；
c)用所述质粒和所述载体转染细胞；
d)经过足够的时间使重组能够发生；并
e)回收携带所述HIV抗原序列的重组病毒载体。
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物中引发免疫反应的方法，该方法包括向哺乳动物施用适当量的根据本发明的免疫原性组合物。
本发明可以特别涉及HIV-1。此处所述的构建物可以来源于任何HIV分化枝(clade)，例如分化枝B或分化枝C，尤其是分化枝B。
用于根据本发明的腺病毒载体的启动子可以是来自HCMV IE基因的启动子，例如其中，包含外显子1的所述HCMV IE基因的5′非翻译区被包括在内，如WO02/36792中所述。
所述药物组合物可以按足够的量施用，以转导靶细胞并提供足够水平的基因转移与表达，从而提供治疗益处，其无不适副作用或者具有医学上可接受的生理效应，其可以由医药领域的技术人员来确定。常规的药学上可接受的给药途径包括，但不限于，直接递送至视网膜以及其它眼内递送方法，直接递送至肝脏，吸入，鼻内、静脉内、肌内、气管内、皮下、皮内、直肠、经口的以及其它肠胃外的给药途径。如需要，给药途径可以进行组合，或者根据基因产物或病症来加以调整。给药途径主要决定于所治疗病症的性质。
所述病毒载体的剂量将主要决定于这些因素，诸如所治疗的病症、患者的年龄、体重和健康状况，因此，可以在患者之间有所变化。例如所述病毒载体的成人或兽医的治疗有效剂量一般范围是大约100μL至大约100mL的载体，其含有浓度大约1 x 10⁶至大约1 x 10¹⁵个病毒颗粒、大约1 x 10¹¹至大约1 x 10¹³个病毒颗粒、或者大约1 x 10⁹至大约1 x 10¹²个病毒颗粒。剂量范围将决定于动物的大小和给药途径。例如，对于单个部位，合适的人用或兽用肌内注射剂量(对于大约80kg的动物)是在每毫升大约1 x 10⁹至大约5 x 10¹²个颗粒。任选地，可以采用多部位的给药方式。在另一实例中，对于经口的制剂，合适的人用或兽用剂量可以是范围大约1 x 10¹¹至大约1 x 10¹⁵个颗粒。本领域的技术人员可以根据给药途径以及重组载体所应用的治疗或免疫应用来调整这些剂量。所述治疗产物的表达水平，或者对于免疫原而言，循环抗体的水平，可以被监测以确定剂量给药频率。确定给药频率的时间安排的其它方法对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。
所述药物组合物的施用可以采用一次单剂量或一次以上单剂量的形式，例如作为相同的含多核苷酸腺病毒的重复剂量，或者按异源＂激发-强化(prime-boost)＂的疫苗接种制度。异源激发-强化制度在激发和强化过程中采用了不同形式疫苗的给药，其每一种可以包括两次或多次给药。激发组合物和强化组合物通常将含有至少一种共同的抗原，尽管没有必要是同一形式的抗原，但可以是不同形式的同一抗原。
使用本发明所述载体的激发强化制度可以采用异源DNA和腺病毒载体的激发强化形式，例如裸DNA激发给药，随后以腺病毒载体强化，或者例如，腺病毒载体激发，随之以一种或多种裸DNA强化。此类DNA强化可以通过肌内或皮内DNA给药的方式，或者粒子加速技术来进行递送。备选地，此类激发强化制度可包括例如根据本发明的蛋白和腺病毒载体，其中激发剂量包括该蛋白，强化剂量包括该腺病毒载体，或者例如，其中激发剂量包括腺病毒载体，而强化剂量包括蛋白。
实施例
实施例1
E1/E3缺失的Pan 6和Pan 7腺病毒的构建
1.重组型E1-缺失SV-25载体的形成
构建一质粒，其含有除工程化的E1缺失以外的完整的SV-25基因组。在E1缺失的部位，限制性内切酶I-CeuI和PI-SceI的识别位点被插入，其使得来自穿梭质粒的转基因能够被插入，其中，这两个酶识别位点位于转基因表达盒侧翼。
含有限制性位点SwaI-SnaBI-SpeI-AfIII-EcoRV-SwaI的合成接头被克隆进用EcoRI和NdeI切开的pBR322中。通过使两种合成寡聚物
                             SV25T(5′-AATT TA AAT ACG TAGCGC ACT AGT CGC GCT AAG CGC GGA TAT CAT TTA AA-3′)和SV25B(5’-TAT TTA AAT GAT ATC CGC GCT TAA GCG CGA CTA GTG CGC TAC GTA TTTA-3′)
一起退火并将其插入用EcoRI和NdeI消化的pBR322来完成此过程。Ad SV25的左端(bp1至1057)被克隆进SnaBI和SpeI位点间的上述接头中。Ad SV25的右端(bp28059至31042)被克隆进AfIII和EcoRV位点间的接头中。然后将腺病毒E1如下所述从被克隆的左端的EcoRI位点(bp547)至XhoI(bp2031)切下。将来自pShuttle(Clontech)的由PCR生成的I-Ceul-PI-SceI盒在EcoRI和SpeI位点间插入。然后，将Ad SV-25(bp2031至12185)的10154bp XhoI片段插入SpeI位点。所产生的质粒用HindIII消化，并通过插入18344bp Ad SV-25HindIII片段(bp11984至30328)来完成此构建物(Psv25)，从而生成E1缺失的腺病毒SV25的完整分子克隆，其适合于生成重组型腺病毒。任选地，所需转基因被插入新创的pSV25载体质粒的I-CeuI和PI-SceI位点。
为生成携带标记基因的AdSV25，先前被克隆进质粒pShuttle(Clontech)的GFP(绿色荧光蛋白)表达盒用限制性酶I-CeuI和PI-SceI切开，并连接进用相同的酶消化的pSV25(或者此处所述的另一种Ad黑猩猩质粒)中。将所产生的质粒(pSV25GFP)用SwaI消化以分离细菌质粒骨架，并转染进E1互补细胞系HEK293。大约10天后，观察到细胞病理效应，表明复制型病毒的存在。表达GFP的基于Ad SV25的腺病毒载体的成功生成是通过将来自转染培养物的上清应用于新鲜细胞培养物而被证实的。第二次被感染的细胞的存在是通过观察细胞群体中的绿色荧光来确定的。
2.E3缺失的Pan-6和Pan-7载体的构建
为增强所述腺病毒载体的克隆容量，可以使E3缺失，因为此区域编码了对于培养中的病毒的繁殖所不需要的基因。为此，E3-缺失版本的Pan-5、Pan-6、Pan-7和C68已被制成。(含E31-9的3.5kbNru-AvrII片段被缺失)。
Pan6基载体中的E3缺失
E1-缺失的pPan6-pkGFP分子克隆用Sbf I和Not I消化以分离19.3kb的片段并在Sbf I位点上连接回去。所产生的构建物pPan6-Sbf I-E3用Eco 47 III和Swa I处理，生成pPan6-E3。最后，来自pPan6-pkGFP的Sbf I消化的21kb Sbf I片段被亚克隆进pPan6-E3以生成带有E3的4kb缺失的pPan6-E3-pkGFP。
E3缺失的Pan7载体
相同的策略被用于获得Pan 7中的E3缺失。首先，将跨越E3区的5.8kb Avr II片段亚克隆入pSL-1180中，随后通过Nru I消化使E3缺失。将产生的质粒用Spe I和Avr II处理以获得4.4kb的片段并将其在Avr II位点克隆进pPan7-pkGFP以分别替换出原来的含E3的AvrII片段。最终的pPan7-E3-pkGFP构建物含有3.5kb的E3-缺失。
对于这些以及其它Pan腺病毒血清型中E1、E3和E4缺失的构建过程的完整描述在WO03/0046124中给出。进一步的信息也可以在Human Gene Therapy 15:519-530(WO03/046124)中获得。
实施例2
Gag、RT、Nef序列的构建
在WO03/025003中全文描述。
质粒p73i-Tgrn
1.质粒:p73i-GRN2克隆#19(p17/p24(opt)/RT(opt)trNef)-修复型
感兴趣的基因:
来自HIV-1分化枝B株系HXB2的密码子优化的Gag的p17/p24部分、密码子优化的RT和截短的Nef基因，位于Iowa长HCMV启动子(Iowa length HCMV promoter)+外显子1的下游，并位于兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号的上游。
含有来源于质粒p17/24trNef1的trNef基因的质粒包含PCR错误，其使得Nef末端的19个氨基酸发生R到H的氨基酸变化。这是由PCR诱变加以纠正的，纠正后的Nef PCR被粘合至来自p7077-RT3的密码子优化的RT，该粘合片段用ApaI和BamHI切开，并被克隆入ApaI/BamHI切开的p73i-GRN。
引物:
PCR coRT来自p7077-RT3，使用引物:
(聚合酶＝PWO(Roche)始终。
正义:U1
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGA
AGCTGAAACCCGGGAT
AScoRT-Nef
GGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC
循环:95℃(30秒)，然后20个循环95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(180秒)，然后72℃(120秒)并保持在4℃。
1.7kb PCR产物经过凝胶纯化。
PCR5′Nef来自p17/24trNef1，使用引物:
正义:S-Nef
ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC
反义:ASNef-G:
GATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC
循环:95℃(30秒)，然后15个循环95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(60秒)，然后72℃(120秒)并保持在4℃。
PCR3′Nef来自p17/24trNef1，使用引物:
正义:SNEF-G
GAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC
反义:
AStrNef(反义)
CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC
循环:95℃(30秒)，然后15个循环95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(60秒)，然后72℃(120秒)并保持在4℃。
该PCR产物经过凝胶纯化。最初用5′(S-Nef)和3′(AstrNef)引物将两条Nef产物粘合。
循环:95℃(30秒)，然后15个循环95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(60秒)，然后72℃(180秒)并保持在4℃。
该PCR产物被PCR清洁，并使用U1和AstrNef引物将其粘合至所述RT产物:
循环:95℃(30秒)，然后20个循环95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(180秒)，然后72℃(180秒)并保持在4℃。
2.1kb产物经过凝胶纯化，并用ApaI和BamHI切开。质粒p73I-GRN同样用ApaI和BamHI切开，凝胶纯化，并与ApaI-Bam RT3trNef连接以重新生成p17/p24(opt)/RT(opt)trNef基因。
2.质粒:p73I-RT w229k(失活的RT)
感兴趣的基因:
生成失活的RT基因，位于Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游，并位于兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号的上游。
由于对活性HIV RT种类在治疗性疫苗方面的使用的顾虑，该基因的失活是令人期望的。这是通过该RT(来源于P73I-GRN2)氨基酸位置229由Trp至Lys(R7271p1-28)的PCR诱变而获得的。
引物:
PCR5′RT+突变，使用引物:
(聚合酶＝PWO(Roche)始终)
正义:RT3-u:1
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGA
AGCTGAAACCCGGGAT
反义:AScoRT-Trp229Lys
GGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCT
循环:
1 x [94℃(30秒)]
15 x [94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(60秒)]
1 x [72℃(180秒)]
PCR凝胶纯化
PCR3′RT+突变，使用引物:
反义:RT3-I:1
GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGAC
CTGCTCGTTGCCGC
反义:ScoRT-Trp229Lys
CCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG
循环:
1 x [94℃(30秒)]
15 x [94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(60秒)]
1 x [72℃(180秒)]
PCR凝胶纯化
将该PCR产物凝胶纯化，并用5′(RT3-U1)和3′(RT3-L1)引物粘合RT的5′和3′末端。
循环:
1 x [94℃(30秒)]
15 x [94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒)]
1 x [72℃(180秒)]
将此PCR产物凝胶纯化，并使用NotI和BamHI限制性位点将其克隆进p7313ie中，以生成p73I-RT w229k。(参见图13)
3.质粒:p73i-Tgrn
感兴趣的基因:
来自HIV-1分化枝B株系HXB2的密码子优化的Gag的p17/p24部分、密码子优化的RT和截短的Nef基因，位于Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游，并位于兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号的上游。
含有活性形式RT的三重融合构建物可能无法被管理当局所接受用于人类用途，因此RT的失活是通过将来自p73i-RT w229k的NheI和ApaI切割片段插入NheI/ApaI切割的p73i-GRN2#19(图14)而获得的。这导致在RT的位置229上的W→K的改变。
Tgrn质粒插入片段的全序列在图7中表示。这包含了p17p24(opt)Gag、p66RT(opt并失活)以及截短的Nef。
可选的Gag、RT和Nef构建物如下:
trNef-p66RT(opt)-p17，p24(opt)Gag，
trNef-p17，p24(opt)Gag-p66RT(opt)，
p66RT(opt)-p17，p24(opt)Gag-trNef，
p66RT(opt)-trNef-p17，p24(opt)Gag，
p17，p24(opt)Gag-trNef-p66RT(opt)。
这些构建物的全序列分别在图8至12中提供。
实施例3
Gag、RT、Nef序列插入腺病毒。
将GRN表达盒亚克隆入pShuttle质粒.
通过Sph I和EcoR I双重消化，将由启动子、cDNA和多聚腺苷酸化信号构成的完整的表达盒从pT-GRN构建物分离出来。Sph I/EcoRI片段的Sph I末端用Klenow填平，并被克隆进pShuttle质粒的EcoR I和Mlu I位点，其中Mlu I末端是平端。
在克隆过程中，一个额外的侧翼序列变得与HIV表达盒相关联。此序列已知为Cer序列，并且不具有已知的功能。
将GRN表达盒转移入Pan6和Pan7载体的E1/E3-缺失的分子克隆。
通过I-Ceu I和PI-Sce I消化，从pShuttle回收该表达盒，并将其克隆进Pan6和Pan7载体分子克隆的相同位点。重组克隆经绿/白筛选鉴定并通过大量限制性酶分析加以证实。
重组病毒的营救与繁殖。
C6和C7载体的分子克隆用适当的限制性内切酶(分别为PmeI和PacI)处理以释放出完整的线性载体基因组，并用磷酸钙法转染进293细胞。当观察到转染细胞中的全部细胞病理效应时，收获粗制病毒裂解液并逐渐扩大至293细胞的大规模感染(1 x 10e9个细胞)。通过标准的CsCl沉淀法纯化来自大规模感染物的病毒。
此外，pShuttle质粒可以通过用EcoRI和XmnI切割而被进一步修剪以去除3′接头序列并减少该质粒大小以制成pShuttleGRNc。使用上述方法，此修饰的质粒可以被用于生成额外的Pan7病毒(C7-GRNc)。
其它构建物类似地插入Pan6和Pan7腺病毒。不过带有p66RT(opt)-trNef-p17，p24(opt)Gag插入片段的Pan6未被成功制备。
实施例4
小鼠免疫原性模型
一系列含有重排的HIV抗原RT、Nef和Gag(RGN、NRG、NGR、GRN和GNR)插入片段的Pan6和Pan7载体被检测了其体内初级免疫反应。进行了三组实验以检测Pan6病毒，进行了两组实验以检测Pan7病毒。每种腺病毒按50μl体积1 x 10⁸个粒子的剂量，肌内施用于Balb/c(K2^d)小鼠的单个后肢。由于此剂量先前已被表明能诱导优良水平的细胞免疫反应(未公开)而被选用。
表1概括了在这些实验中比较的腺病毒。
表1