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本发明提供一种通过在液体调配物中纳入山梨糖醇来抑制冷冻-融化期间所述液体调配物中的蛋白质聚集的方法。本发明还提供贮藏和制备含有蛋白质和山梨糖醇的液体调配物以使山梨糖醇的存在抑制冷冻和/或融化期间的蛋白质聚集的方法。

1.  一种贮藏液体调配物的方法，所述方法包含使所述液体调配物逐渐冷冻到低于-10℃的温度，其中所述液体调配物包含蛋白质和山梨糖醇以使山梨糖醇的存在抑制冷冻期间的蛋白质聚集。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述温度低于-30℃。

3.  根据权利要求1所述的方法，其中所述温度低于-40℃。

4.  根据权利要求1所述的方法，其中所述温度低于-50℃。

5.  根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述山梨糖醇以不大于约4.5M的浓度存在于所述液体调配物中。

6.  根据权利要求5所述的方法，其中所述山梨糖醇的浓度不大于约300mM。

7.  根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述液体调配物不含甘露糖醇。

8.  根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述冷冻的速率是约0.5℃/分钟。

9.  根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述冷冻的速率是约0.3℃/分钟。

10.  根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述冷冻的速率是约0.1℃/分钟。

11.  根据权利要求1到10中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。

12.  根据权利要求11所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

13.  根据权利要求1到11中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是医药药物。

14.  根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是中间过程。

15.  一种制备液体调配物的方法，所述方法包含使所述液体调配物从冷冻状态逐渐融化到高于0℃的温度，其中所述液体调配物包含蛋白质和山梨糖醇以使山梨糖醇的存在抑制融化期间的蛋白质聚集。

16.  根据权利要求15所述的方法，其中所述温度高于20℃。

17.  根据权利要求15所述的方法，其中所述温度高于30℃。

18.  根据权利要求15到17中任一权利要求所述的方法，其中所述山梨糖醇的浓度不大于约4.5M。

19.  根据权利要求18所述的方法，其中所述山梨糖醇的浓度不大于约300mM。

20.  根据权利要求15、16、17、18或19所述的方法，其中所述液体调配物不含甘露糖醇。

21.  根据权利要求15、16、17、18、19或20所述的方法，其中所述融化的速率是约0.5℃/分钟。

22.  根据权利要求15、16、17、18、19或20所述的方法，其中所述融化的速率是约0.3℃/分钟。

23.  根据权利要求15、16、17、18、19或20所述的方法，其中所述融化的速率是约0.1℃/分钟。

24.  根据权利要求15到23中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。

25.  根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

26.  根据权利要求15到23中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是医药药物。

27.  根据权利要求15所述的方法，其中所述方法是中间过程。

28.  一种组合物，其在通过根据权利要求15到27中任一权利要求所述的方法制备的液体调配物中包含生物有效量的蛋白质。

29.  一种在液体调配物中贮藏蛋白质的方法，所述方法包含：
(a)向所述液体调配物提供山梨糖醇；
(b)使所述液体调配物逐渐冷冻；
(c)使所述液体调配物从冷冻状态逐渐融化；且
其中山梨糖醇的存在抑制冷冻-融化期间的蛋白质聚集。

30.  根据权利要求29所述的方法，其中所述液体调配物不含甘露糖醇。

31.  一种组合物，其包含通过根据权利要求29或30所述的方法贮藏于液体调配物中的生物有效量的蛋白质。

32.  一种贮藏液体调配物的方法，所述方法包含使所述液体调配物逐渐冷却到低于-0℃的温度，其中所述液体调配物包含分子量大于约50kDa的蛋白质和山梨糖醇以使山梨糖醇的存在抑制冷却期间的蛋白质聚集。

33.  根据权利要求32所述的方法，其中所述分子量大于100kDa。

34.  根据权利要求32所述的方法，其中所述分子量大于150kDa。

35.  根据权利要求32、33或34所述的方法，其中所述温度低于-10℃。

36.  根据权利要求32、33、34或35所述的方法，其中所述山梨糖醇的浓度不大于约4.5M。

37.  根据权利要求32、33、34或35所述的方法，其中所述山梨糖醇的浓度不大于约300mM。

38.  根据权利要求32到37中任一权利要求所述的方法，其中所述液体调配物不含甘露糖醇。

39.  根据权利要求32到38中任一权利要求所述的方法，其中所述冷却的速率是约0.5℃/分钟。

40.  根据权利要求32到38中任一权利要求所述的方法，其中所述冷却的速率是约0.3℃/分钟。

41.  根据权利要求32到38中任一权利要求所述的方法，其中所述冷却的速率是约0.1℃/分钟。

42.  根据权利要求32到41中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。

43.  根据权利要求42所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

44.  根据权利要求32到41中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是医药药物。

45.  根据权利要求32所述的方法，其中所述方法是中间过程。

46.  一种抑制冷冻-融化期间液体调配物中的抗体聚集的方法，所述方法包含在所述液体调配物中使用山梨糖醇替代甘露糖醇。

47.  根据权利要求46所述的方法，其中所述山梨糖醇的浓度不大于约4.5M。

48.  根据权利要求45所述的方法，其中所述山梨糖醇的浓度不大于约300mM。

含有山梨糖醇的蛋白质调配物
相关申请案
本申请案主张2007年2月16日申请的美国临时专利申请案第60/901,811号的权益，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及贮藏和制备含有山梨糖醇的蛋白质调配物的方法。
背景技术
甘露糖醇已普遍用于蛋白质调配物中来维持调配物的稳定性和等渗性。过去，使用液氮快速冷冻蛋白质调配物以备贮藏。然而，大规模不受控冷冻液体调配物的几乎所有方法都遭受不受控凝固和熔化的负作用。已显示相变的控制不当导致由聚集、沉淀、氧化和变性引起的产品损失。已引入最新技术来控制蛋白质调配物的冷冻和融化过程。然而，这些技术的冷冻和融化速率通常非常慢。因此，在含有甘露糖醇的蛋白质调配物中，缓慢的冷冻-融化过程使得甘露糖醇结晶，这转而又诱发蛋白质聚集。
为了避免在缓慢的冷冻-融化过程期间甘露糖醇所诱发的蛋白质聚集，现有方法需要从蛋白质调配物中去除甘露糖醇并且在融化后操作期间将其添加回去。这些方法花费大且需要额外的加工时间。因此，需要贮藏和制备含有甘露糖醇的蛋白质调配物的改良方法。
发明内容
本发明提供一种贮藏和制备蛋白质调配物的改良方法。具体来说，本发明的方法在蛋白质调配物中使用山梨糖醇来抑制冷冻和融化期间的蛋白质聚集。由此，本发明消除对在例如药品贮藏和填充操作期间去除和添加甘露糖醇的需要。因此，本发明降低与贮藏和制备蛋白质调配物相关的成本且减少加工时间。
一方面，本发明提供一种贮藏液体调配物的方法，其包括使所述液体调配物逐渐冷冻到低于-10℃的温度。液体调配物包括蛋白质和山梨糖醇以使山梨糖醇的存在抑制冷冻期间的蛋白质聚集。
具体来说，本发明的方法包括使液体调配物逐渐冷冻到低于例如-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-70℃或-80℃的温度。在一个实施例中，所述温度等于或低于-30℃。在另一个实施例中，温度等于或低于-40℃。在又一个实施例中，温度等于或低于-50℃。在又一个实施例中，温度等于或低于-80℃。
山梨糖醇可以任何浓度存在。山梨糖醇通常以不大于约4.5M的浓度存在于本发明的液体调配物中。在一些实施例中，山梨糖醇的浓度不大于约300mM。在一特定实施例中，山梨糖醇的浓度为约300mM。在一些实施例中，本发明的液体调配物不含甘露糖醇。
在一些实施例中，本发明的方法包括以0.6到0.1℃/分钟范围内的速率(例如约0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1℃/分钟的速率)使液体调配物逐渐冷冻。
在一些实施例中，液体调配物含有为抗体的蛋白质。具体来说，所述抗体是单克隆抗体。在其它实施例中，液体调配物含有为医药药物的蛋白质。
在一些实施例中，贮藏本发明的液体调配物的方法是中间过程。
另一方面，本发明提供一种制备液体调配物的方法，其包括使所述液体调配物从冷冻状态逐渐融化到高于约0℃的温度。液体调配物含有蛋白质和山梨糖醇以使山梨糖醇的存在抑制融化期间的蛋白质聚集。
在一些实施例中，本发明的方法包括使液体调配物从冷冻状态逐渐融化到高于约10℃、20℃、25℃、30℃或高于30℃(例如37℃)的温度。
山梨糖醇可以任何浓度存在。山梨糖醇通常以介于约0-4.5M之间的浓度存在于本发明的液体调配物中。在一些实施例中，山梨糖醇的浓度介于约0-300mM之间。在一特定实施例中，山梨糖醇的浓度为约300mM。在一些实施例中，本发明的液体调配物不含甘露糖醇。
在一些实施例中，本发明的方法包括以0.6到0.1℃/分钟范围内的速率(例如约0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1℃/分钟的速率)使液体调配物逐渐融化。
在一些实施例中，液体调配物含有为抗体的蛋白质。具体来说，所述抗体是单克隆抗体。在其它实施例中，液体调配物含有为医药药物的蛋白质。
在一些实施例中，制备本发明的液体调配物的方法是中间过程。
在一些实施例中，根据本发明的液体调配物是水性调配物。
本发明进一步提供一种组合物，其含有如以上各种实施例中所述通过本发明的方法制备的液体调配物中的生物有效量的蛋白质。
另一方面，本发明提供一种在液体调配物中贮藏蛋白质的方法，其包括：(a)向所述液体调配物提供山梨糖醇；(b)使液体调配物逐渐冷冻；(c)使液体调配物逐渐融化；且其中山梨糖醇的存在抑制冷冻-融化期间的蛋白质聚集。
山梨糖醇可以任何浓度存在。通常向液体调配物提供山梨糖醇以达到不大于约4.5M的最终浓度。在一些实施例中，山梨糖醇的最终浓度不大于约300mM。在一特定实施例中，山梨糖醇的最终浓度为约300mM。在一些实施例中，本发明的液体调配物不含甘露糖醇。
在一些实施例中，使液体调配物逐渐冷冻或融化的速率在0.6到0.1℃/分钟的范围内，例如约0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1℃/分钟的速率。
本发明还提供一种组合物，其含有如以上各种实施例中所述通过本发明的方法贮藏于液体调配物中的生物有效量的蛋白质。
另一方面，本发明提供一种贮藏液体调配物的方法，其包括使液体调配物逐渐冷却到低于-0℃的温度。液体调配物包括分子量大于约50kDa的蛋白质和山梨糖醇以使山梨糖醇的存在抑制冷却期间的蛋白质聚集。
在一些实施例中，液体调配物包括具有大于约75kDa、100kDa、125kDa、150kDa、175kDa、200kDa、225kDa、250kDa、275kDa或300kDa的分子量的蛋白质。
在一些实施例中，本发明的这一方面的方法包括使液体调配物逐渐冷却到在-10℃到-80℃的范围内或低于-80℃(例如等于或低于约-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃)的温度。
山梨糖醇可以任何浓度存在。本发明的液体调配物通常含有浓度不大于约4.5M的山梨糖醇。在一些实施例中，山梨糖醇的浓度不大于约300mM。在一特定实施例中，山梨糖醇的浓度为约300mM。在一些实施例中，本发明的液体调配物不含甘露糖醇。
在一些实施例中，本发明的这一方面的方法包括以0.6到0.1℃/分钟范围内的速率(例如约0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1℃/分钟的速率)使液体调配物逐渐冷却。
在一些实施例中，液体调配物含有为抗体的蛋白质。具体来说，所述抗体是单克隆抗体。在其它实施例中，液体调配物含有为医药药物的蛋白质。
在一些实施例中，本发明的这一方面的贮藏液体调配物的方法是中间过程。
另一方面，本发明提供一种抑制冷冻-融化期间液体调配物中的抗体聚集的方法，其包括在所述液体调配物中使用山梨糖醇替代甘露糖醇。
山梨糖醇可以任何浓度存在。本发明的液体调配物通常含有浓度不大于约4.5M的山梨糖醇。在一些实施例中，山梨糖醇的浓度不大于约300mM。在一特定实施例中，山梨糖醇的浓度为约300mM。
如以上各种实施例中所述，本发明可用于贮藏和/或制备含有任何给定浓度的溶解蛋白质的液体调配物。举例来说，液体调配物可含有浓度等于或低于约35mg/ml、49mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml的蛋白质。在其它实施例中，液体调配物可含有浓度大于约35mg/ml、49mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml或200mg/ml的蛋白质。
如以上各种实施例中所述用于本发明中的冷冻或冷却步骤并不伴有同时干燥过程，诸如用于冻干过程中的干燥过程。
在本申请案中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。如本揭示案中所使用，术语“包含(comprise)”和这一术语的变体(诸如“包含(comprising)”和“comprises”)不欲排除其它添加剂、组分、整数或步骤。如本申请案中所使用，术语“约”和“大约”作为等效物使用。两个术语都打算涵盖所属领域的技术人员所了解的任何正常波动。
本发明的其它特征、目的和优点在以下具体实施方式中显而易见。然而，应了解，虽然具体实施方式指示本发明的实施例，但仅以说明的方式给出，而并无限制性。在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将由具体实施方式变得显而易见。
附图说明
图1说明在示范性加工规模下使用CryoPilot(CP)系统的样品产品温度迹线。
图2说明甘露糖醇诱发冷冻-融化循环期间的抗体聚集。
图3说明含有不同多元醇的液体调配物中的抗体聚集。
图4说明山梨糖醇抑制冷冻-融化期间液体调配物中的多种示范性蛋白质的聚集。
图5说明低温DSC扫描显示在冷却和升温期间含有山梨糖醇的调配物中未发生结晶。
具体实施方式
本发明提供贮藏和制备含有蛋白质的液体调配物的改良方法。具体来说，本发明提供一种通过在液体调配物中包括山梨糖醇来抑制或消除缓慢冷冻和/或融化过程期间所述液体调配物中的蛋白质聚集的方法。
本发明的各种方面更详细地描述于以下小节中。小节的使用并不打算限制本发明。各小节可适用于本发明的任一方面。
蛋白质调配物
蛋白质在水性状态下较不稳定且遭受化学和物理降解，从而导致在加工和贮藏期间生物活性丧失。冷冻-融化和冻干是保存蛋白质以备贮藏的公认方法。为了保存蛋白质构象、活性和稳定性，蛋白质调配物通常含有对此有帮助的药剂，所谓的冻干保护剂(lyoprotectant)和冷冻保护剂(cryoprotectant)。冷冻保护剂是向蛋白质提供稳定性以免受冷冻诱发的应力的药剂；然而，术语还包括例如在贮藏期间向块状药物调配物提供稳定性以免受非冷冻诱发的应力的药剂。冻干保护剂是在干燥过程中从系统去除水期间向蛋白质提供稳定性的药剂，这可能是通过经由氢键维持蛋白质的适当构象。冷冻保护剂也可具有冻干保护剂作用。经常使用的填充剂的实例包括甘露糖醇、甘氨酸、蔗糖、乳糖等。所述药剂还有助于调配物的张力。
如本文中所使用，“蛋白质”包括任何重组或经纯化的多肽，包括(但不限于)抗体，例如单克隆抗体、单链抗体和其它抗体变体；各种生长激素；和任何医药药物。本申请案中所提及的蛋白质包括任何天然存在的、经修饰的或合成的多肽。
如本文中所使用，“蛋白质调配物”、“液体调配物”或语法等效物包括任何含有多肽的液体组合物。含有多肽的液体组合物可进一步含有“缓冲剂”，包括使溶液pH值维持在可接受范围内的那些药剂，其可包括如上所述的填充剂且还可包括组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、tris、二乙醇胺等等。如果含有多肽的液体组合物是医药组合物，那么液体调配物可进一步含有“赋形剂”。术语“赋形剂”包括医药学上可接受的载剂，以及在贮藏期间提供蛋白质的适当构象以使得实质上保留生物活性和蛋白质稳定性可维持的冻干保护剂和冷冻保护剂。
甘露糖醇诱发缓慢冷冻和融化期间的蛋白质聚集：
如上文所讨论，冷冻和融化是供长期贮藏或作为中间步骤的公认方法。然而，大规模冷冻液体调配物的几乎所有方法都遭受不受控凝固和熔化的负作用。已屡次显示诸如在袋子和瓶子中冷冻等方法导致低温浓缩(cryoconcentration)和容器中的不均一温度分布。已显示相变的控制不当导致由聚集、沉淀、氧化和变性引起的产品损失。相反，受控冷冻和融化(也称为缓慢冷冻和融化)避免在不受控方法中典型发生的产品变性并且消除昂贵耗时的清洁工作。另外，整个过程从控制良好和可预测的操作中受益。
受控冷冻(或缓慢冷冻)通常包括使液体调配物以预定速率逐渐冷冻或冷却到适合于贮藏的温度。适合于贮藏的温度通常包括(但不限于)在0℃到-80℃的范围内或低于-80℃，优选地在-10℃到-80℃的范围内或低于-80℃，例如等于或低于约0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃的温度。逐渐递降冷却的速率可在0.6到0.1℃/分钟的范围内，例如约0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1℃/分钟的速率。
类似地，受控融化(缓慢融化)通常包括使液体调配物以预定速率逐渐融化或升温到所需温度。具体来说，使液体调配物从冷冻状态融化或升温。用于融化目的的所需温度通常包括(但不限于)等于或高于约0℃、10℃、20℃或30℃的温度。举例来说，一个优选温度是37℃。逐渐步进升温的速率可在0.6到0.1℃/分钟的范围内，例如约0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1℃/分钟的速率。
受控冷冻和/或融化可在诸如管子、袋子、瓶子或任何其它合适的容器等容器中执行。所述容器可为一次性的。受控冷冻和/或融化也可大规模或小规模地执行。对于典型的大规模生产来说，液体调配物可以约1L到300L(例如1L、3L、10L、20L、50L、100L、125L、250L或300L)的批量冷冻。对于典型的小规模系统来说，液体调配物可以约1ml到500ml(例如1ml、10ml、20ml、30ml、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml或500ml)的批量冷冻。
然而，在含有甘露糖醇的液体调配物中，缓慢冷冻和/或融化使得甘露糖醇结晶，这转而又诱发蛋白质聚集。如本文中所使用，“蛋白质聚集”意指形成高分子量(HMW)物质，包括通过浊度测量可检测到的不溶性物质和通过尺寸排阻色谱HPLC(SEC-HPLC)、阳离子交换-HPLC(CEX-HPLC)、X射线衍射(XRD)、调制式差示扫描量热法(mDSC)和所属领域技术人员已知的其它方法可检测到的可溶性物质。
据观察，多个冷冻和融化循环后在含有甘露糖醇的调配物中HMW物质的百分数有显著增加(参见实例部分)。调配物中增加量的甘露糖醇也导致形成较高百分数的HMW物质。与大规模(例如125L)相比，减少的加工体积似乎维持所形成的HMW物质的百分数。
在冷却期间在含有甘露糖醇的调配物中观察到放热事件。所观察到的焓是源于甘露糖醇结晶以及解冻的水，其随加工规模增加(冷冻和融化速率降低)或调配物中的甘露糖醇含量增加而增加。融化后在含有甘露糖醇的调配物中又观察到结晶事件。虽然不希望受理论的束缚，但冷冻溶液中的结晶事件表明由结晶引起的相变可能在冷冻和融化后诱发蛋白质聚集。甘露糖醇的结晶随甘露糖醇含量增加而增加，其对应于较高％HMW的形成。与较小规模相比，在较大加工规模模拟中观察到有更多甘露糖醇结晶，这也与HMW形成的较大速率有关。减少调配物中的甘露糖醇一般有利于减少冷冻和融化期间液体调配物中的HMW物质形成。
山梨糖醇抑制蛋白质聚集
为了解决甘露糖醇诱发的蛋白质聚集问题和提供在冷冻-融化期间使蛋白质稳定的液体调配物，本发明将甘露糖醇与其它多元醇(即，半乳糖醇、山梨糖醇和具有式C_nH_2n+2O_n的其它多元醇)进行比较。视立体异构体而定，最大溶解度在180mM到4.5mM的范围内。举例来说，半乳糖醇的最大溶解度是180mM。甘露糖醇的最大溶解度是1M。山梨糖醇的最大溶解度是4.5M。如实例2中所述，本发明发现在具有较低溶解度的多元醇的情况下，聚集速率显著较快。因此，与甘露糖醇和其它溶解度较小的多元醇相比，在液体调配物中使用山梨糖醇可抑制或阻止缓慢冷冻和/或融化过程期间的蛋白质聚集。具体来说，在液体调配物中可使用山梨糖醇替代甘露糖醇以抑制冷冻-融化期间的蛋白质聚集。
如本文中所使用，术语“抑制蛋白质聚集”、“阻止蛋白质聚集”或语法等效物表示与含有甘露糖醇而不是山梨糖醇的液体调配物中所形成的HMW物质的百分数相比，含有山梨糖醇的类似液体调配物中HMW物质的百分数降低。术语“抑制蛋白质聚集”或“阻止蛋白质聚集”还包括消除HMW物质的形成。
山梨糖醇可以任何浓度存在，但受其在给定液体调配物中的最大溶解度限制。山梨糖醇通常以不大于约4.5M的浓度存在于液体调配物中。举例来说，山梨糖醇的浓度可不大于约300mM。山梨糖醇的浓度优选为约300mM。
本发明发现山梨糖醇可用于各种液体调配物中以阻止冷冻和/或融化过程期间的蛋白质聚集。液体调配物可含有任何给定浓度的溶解蛋白质。举例来说，液体调配物可含有浓度等于或低于约35mg/ml、49mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml的蛋白质。或者，液体调配物可含有浓度大于约35mg/ml、49mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml或200mg/ml的蛋白质。
山梨糖醇可用于含有如上文所述或此项技术中已知的任何蛋白质或多肽的液体调配物中。举例来说，所述蛋白质可为抗体。具体来说，所述抗体可为单克隆抗体或单链抗体或其它抗体变体。蛋白质或肽也可为生长激素或医药药物。蛋白质或多肽可为天然存在的、经修饰的或合成的多肽。蛋白质或多肽可为小分子或大分子。举例来说，蛋白质或多肽可具有在25kDa到300kDa或大于300kDa的范围内的分子量，例如大于约25kDa、50kDa、75kDa、100kDa、125kDa、150kDa、175kDa、200kDa、225kDa、250kDa、275kDa或300kDa的分子量。蛋白质可为单体、二聚体或多聚体。
由此，通过在液体调配物中使用山梨糖醇，本发明允许液体调配物缓慢冷冻和/或融化而不会诱发显著蛋白质聚集。本发明尤其适用于贮藏含有药物的药品。举例来说，本发明允许在缓慢冷冻和/或融化过程期间药品中存在所有赋形剂，同时保持药物稳定和呈生物活性。因此，本发明消除对在贮藏之前从药物调配物去除甘露糖醇并在药品填充操作期间将其添加回去的需要。本发明还防止对必须将药物浓缩到高浓度以便能够在药品填充操作期间添加甘露糖醇的需要。
因此，含有蛋白质和山梨糖醇的液体调配物可直接以这一形式贮藏以备稍后使用，作为中间步骤以冷冻状态贮藏且在使用之前融化，或随后以干燥形式(诸如冻干、风干或喷雾干燥形式)制备以备稍后在使用之前重构为液体形式或其它形式。另外，含有生物活性量的蛋白质的组合物可根据本申请案直接以其液体形式制备和贮藏，以充分利用便利性、无需重构的投药简易性，和在预填充的即用型注射器中或以多剂量制剂形式(如果调配物与抑菌剂相容)供应调配物的能力。本申请案还提供在如上文所述贮藏和制备的液体调配物中含有生物活性量的蛋白质的组合物的其它形式。
应了解，上述实施例和以下实例是以说明方式给出，而无限制性。在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将由本发明的描述变得显而易见。
实例
实例1.甘露糖醇诱发缓慢冷冻和融化期间的蛋白质聚集
使用CryoPilot(CP)系统(斯特帝姆生物系统公司(Stedim Biosystems))使含有单克隆抗体(本实验中称为MAB-001)和10mM组氨酸、10mM甲硫氨酸、4％甘露糖醇和0.005％聚山梨醇酯-80(pH 6.0)的调配物冷冻和融化多次。各冷冻和融化概况包括递降冷却到-55℃和升温到32℃，同时混合溶液。
CP模拟作为全规模生产装置的CryoVessel(斯特帝姆生物系统公司)的操作。在此工作之前已开发用于各种加工体积的CP设定点概况，以模拟CryoVessel的行为。图1说明在各加工规模下使用CP系统的样品产品温度迹线。冷冻(或融化)速率定义为从0℃达到-42℃(或从-42℃达到0℃)的热电偶除以时间。
主要通过SEC-HPLC和CEX-HPLC分析融化样品以评估高分子量物质的含量(％HMW)且追踪酸性和碱性物质的含量。也使用调制式差示扫描量热法(mDSC)和X射线衍射(XRD)来评估冷冻溶液中的甘露糖醇的结晶性和多晶型物。
发现在如上所述的缓慢冷冻-融化过程期间在甘露糖醇存在下MAB-001发生聚集。图2说明在冷冻-融化循环期间形成MAB-001的HMW物质。
实例2.含有不同多元醇的液体调配物中的单克隆抗体聚集
本实验将甘露糖醇与具有不同最大溶解度的其它多元醇就其诱发冷冻-融化期间的聚集的能力进行比较。使称为MAB-002的单克隆抗体透析到分别含有各种浓度的甘露糖醇、半乳糖醇或山梨糖醇的不同液体调配物中。各调配物还含有10mM组氨酸(pH6.0)。各液体调配物中MAB-002的最终浓度是5mg/ml。接着使各调配物经受5个冷冻-融化循环，且监测HMW物质的形成。在图3中绘制HMW物质的百分数变化与多元醇浓度的关系曲线。如图3中所示，与甘露糖醇相比，具有180mM的最大溶解度的半乳糖醇在低浓度下且以更快速率诱发聚集，而与甘露糖醇相比，具有4.5M的最大溶解度的山梨糖醇并不显著诱发聚集。因此，本实验显示在具有较低溶解度的多元醇的情况下，聚集速率显著较快。含有山梨糖醇的液体调配物在冷冻-融化期间未经历显著的蛋白质聚集。
实例3.山梨糖醇抑制多种蛋白质的聚集
使包括4种不同单克隆抗体(称为mAb2、mAb3、mAb4和mAb5)、1种细胞激素和1种融合蛋白的6种不同蛋白质透析到10mM组氨酸(pH 6.0)和250mM甘露糖醇或山梨糖醇中。各蛋白质的最终浓度是1mg/ml。接着使调配物经受如上文所述的5个冷冻-融化循环，且监测HMW物质的形成。如图4中所示，与含有山梨糖醇的调配物相比，含有甘露糖醇的调配物经历显著更多的蛋白质聚集。如图5中所示，低温DSC扫描显示在冷却和升温期间含有山梨糖醇的调配物中未发生结晶。换句话说，山梨糖醇抑制冷冻-融化期间液体调配物中的多种蛋白质的聚集。本实验还显示山梨糖醇的聚集抑制作用并不限于抗体。
等效物
上文是关于本发明的某些非限制性实施例的描述。所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文中所述的本发明的特定实施例的许多等效物。所属领域的技术人员应了解，在不脱离如随附权利要求书中所界定的本发明的精神或范围的情况下，可对本描述进行各种变化和修改。
在权利要求书中，除非相反地指出或从上下文中显而易见，否则诸如“一”和“所述”等冠词可意指一个或一个以上。除非相反地指出或从上下文中显而易见，否则在一群组中的一个或一个以上成员之间包括“或”的技术方案或描述被视为满足在给定产物或方法中存在、采用一个、一个以上或全部群组成员，或者一个、一个以上或全部群组成员与给定产物或方法有关。本发明包括在给定产物或方法中存在、采用正好一个群组成员、或者正好一个群组成员与给定产物或方法有关的实施例。本发明还包括在给定产物或方法中存在、采用多于一个或全部群组成员、或者多于一个或全部群组成员与给定产物或方法有关的实施例。此外，应了解，本发明涵盖一个或一个以上技术方案或说明书的相关部分的一个或一个以上限制、要素、条款、描述性术语等引入另一技术方案中的所有变化、组合和排列。举例来说，任何附属于另一技术方案的技术方案可经修改以包括附属于同一基本技术方案的任何其它技术方案中所见的一个或一个以上限制。此外，当技术方案描述组合物时，应了解，除非另有指示或除非所属领域的技术人员可明显预见将出现矛盾或不一致，否则其包括出于本文所揭示的任何目的而使用所述组合物的方法，且包括根据本文所揭示的任何制备方法或所属领域中已知的其它方法来制备所述组合物的方法。另外，本发明涵盖根据本文所揭示的制备组合物的任何方法所制得的组合物。
当以列举形式，例如以马库什群组(Markush group)形式提供要素时，应了解也揭示所述要素的每个子群组，且可从群组中除去任何要素。还应注意术语“包含”欲为开放式词语且允许包括其它要素或步骤。应了解，一般来说，当本发明或本发明的方面被描述为包含特定要素、特征、步骤等时，本发明或本发明的方面的某些实施例由所述要素、特征、步骤等组成或基本上由所述要素、特征、步骤等组成。为简单起见，本文中未具体地陈述关于此方面的那些实施例。因此，对于本发明的包含一个或一个以上要素、特征、步骤等的每一实施例来说，本发明还提供由或基本上由那些要素、特征、步骤等组成的实施例。
当给出范围时，端点包括在内。此外，应了解，除非另有指示或另外从上下文和/或所属领域的技术人员的了解中显而易见，否则以范围形式表述的值可假定为本发明的不同实施例中规定范围内的任何特定值，除非本文另外明确规定，否则达范围下限的十分之一。还应了解，除非另有指示或另外从上下文和/或所属领域的技术人员的了解中显而易见，否则以范围表达的值可假定为给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点以与所述范围的下限的十分之一相同的精度表达。
另外，应了解，本发明的任何特定实施例可明确地从任一个或一个以上技术方案排除。本发明的组合物和/或方法的任何实施例、要素、特征、应用或方面可从任一个或一个以上技术方案排除。为了简洁起见，本文中未明确陈述排除一个或一个以上要素、特征、目的或方面的所有实施例。
以引用的方式并入
本申请案中所引用的所有公开案和专利文献都以全文引用的方式并入以用于所有目的，所引用的程度就如同各个公开案或专利文献的内容并入本文中一般。